CN111518922A

CN111518922A - 用于检测产毒副溶血性弧菌的荧光定量pcr方法及相应的试剂盒

Info

Publication number: CN111518922A
Application number: CN201910824215.8A
Authority: CN
Inventors: 曹亮; 喻志红; 张新帅; 王萌萌; 王璋; 赵亮; 郝祎琪; 蒋华; 束文圣
Original assignee: Guangdong Magigene Technology Co ltd
Current assignee: Guangdong Magigene Technology Co ltd
Priority date: 2019-09-02
Filing date: 2019-09-02
Publication date: 2020-08-11

Abstract

本发明公开了一种用于检测产毒副溶血性弧菌的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒。本发明巧妙的应用了特异性的基因检测区分副溶血性弧菌属与其它弧菌属，以及产毒和非产毒的副溶血性弧菌，通过综合判断，得出准确的菌属信息。本发明与现有的主流检测试剂盒相比，本发明用于检测产毒副溶血性弧菌试剂盒具有灵敏度高、快捷方便、特异型好、判断严谨准确等优势，具有良好的应用前景和市场价值。

Description

用于检测产毒副溶血性弧菌的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒

技术领域

本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种通过特异性基因对产毒副溶血性弧菌进行荧光定量PCR检测的方法及相应的检测试剂盒。

背景技术

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种革兰氏阴性、嗜盐性杆菌，属于弧菌科弧菌属，呈弧状、杆状、丝状等多种形状，无芽孢。本菌最适宜的培养条件：温度为30℃—37℃，含盐2.5％—3％(若盐浓度低于0.5％则不生长)，pH值为8.0—8.5。本菌对酸较敏感，当pH6以下即不能生长，在普通食醋中1—3分钟即死亡。本菌对常用消毒剂抵抗力很弱，可被低浓度的酚和煤酚皂溶液杀灭。

副溶血性弧菌分布极广，主要分布在海水和水产品中。除了海产品以外，畜禽肉、咸菜、咸蛋、淡水鱼等都发现有副溶血性弧菌的存在。海水是本菌的污染源，海产品、海盐、带菌者等都有可能成为传播本菌的途径，另外有肠道病史的居民、渔民带菌率偏高，也是传染源之一。由副溶血性弧菌引起的食物中毒一般表现为急发病，潜伏期2～24h，一般为10h发病。主要的症状为腹痛，优势腹痛在脐部附近剧烈。腹痛是本病的特点，多为阵发性绞痛，并有腹泻、恶心、呕吐、畏寒发热，大便似水样。便中混有黏液或脓血，部分病人有里急后重，重症患者因脱水，使皮肤干燥及血压下降造成休克。少数病人可出现意识不清、痉挛、面色苍白或发绀等现象，若抢救不及时，呈虚脱状态，可导致死亡。

常用的微生物学检查方法包括分离培养和血清学检测，存在灵敏性差、试验过程复杂等特点。因此，寻找一种快速、灵敏并且适用于临床诊断的检测方法已显得非常紧要。近年来，丰富的基因组数据为分子诊断技术锁定副溶血性弧菌特异性序列提供了参考数据库。当前，分子生物学技术正以其高灵敏度、高特异性、实验周期短、易操作等优势逐步应用于副溶血性弧菌的诊断检测。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种用于检测产毒副溶血性弧菌的荧光定量PCR方法。

具体地，上述方法包括如下步骤：

S1、收集样品；

S2、提取基因组DNA；

S3、检测副溶血性弧菌属基因rpoB、gene1、gene2以及产毒特异性基因gene3和gene4；

S4、读取扩增Ct值；当所述副溶血性弧菌属特异性基因中至少1个基因和所述产毒特异性基因中至少1个基因的Ct值均小于35时，产毒副溶血性弧菌的检测结果为阳性；当所述副溶血性弧菌属特异性基因rpoB、gene1和gene2的Ct值大于35和/或所述产毒特异性基因gene3和gene4的Ct值大于35时，产毒副溶血性弧菌的检测结果为阴性。

作为一种优选技术方案，所述副溶血性弧菌属特异性基因rpoB(NCBI AccessionNumber：EU652307.1)的检测引物如SEQ ID NO:1～2所示；

SEQ ID NO:1(5'-TCGTCACGGTAACAAGGGTG-3')；

SEQ ID NO:2(5'-TTCGCTGCCAGACCTAAGTG-3')。

所述副溶血性弧菌属特异性基因gene1(NCBI Accession Number：AYO03931.1)的检测引物如SEQ ID NO:3～4所示；

SEQ ID NO:3(5'-GATTTCACGACAAGGCACGC-3')；

SEQ ID NO:4(5'-GAGCATGCCGAAACCAAACC-3')。

所述副溶血性弧菌属特异性基因gene2(NCBI Accession Number：AZV70103.1)的检测引物如SEQ ID NO:5～6所示；

SEQ ID NO:5(5'-GCCGTTACACACTCTGCCT-3')；

SEQ ID NO:6(5'-TCAGCGGTGATGTGACTTGG-3')。

所述产毒特异性基因gene3的检测引物如SEQ ID NO:7～8所示；

SEQ ID NO:7(5'-TCGGGTCTTAGCGCAAAGTT-3')(NCBI Accession Number：AYF21401.1)；

SEQ ID NO:8(5'-TCCAGTCGACGTGCTTCAC-3')(NCBI Accession Numbe：AYF21402.1)。

所述产毒特异性基因gene4(NCBI Accession Number：AZV70391.1)的检测引物如SEQ ID NO:9～10所示。

SEQ ID NO:9(5'-TGTCGATGAAGGCTACGCTC-3')；

SEQ ID NO:10(5'-CATCACTTGCCAACTCACGC-3')。

本发明另一目的是提供一种用于检测产毒副溶血性弧菌的荧光定量PCR试剂盒，其包含上述的副溶血性弧菌属特异性基因rpoB、gene1、gene2的检测引物和产毒特异性基因gene3和gene4的检测引物。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明通过前期对副溶血性弧菌属和其他弧菌属，产毒和非产毒弧菌属的微生物的大量研究数据中，挖掘出能够区分副溶血性弧菌和其他弧菌属，产毒和非产毒弧菌属的特异性基因的孤儿基因，通过对特异性基因的检测，准确的判断出菌类样品和环境样品中是否含有产毒的副溶血性弧菌，具有前期大数据的挖掘和不同种属之间比对基础，选择的特异性基因具有物种和菌属的特异性。

(2)本发明中，通过对设计条件和实验条件的优化，选取针对于每个基因检测扩增条件处于最优化的引物作为检测引物，提高引物扩增的效率，能够达到稳定、高效、高灵敏度和重现性的检测引物，实现微量样品的正确检出。

(3)本发明检测方法与市面上其他的检测方法相比，本发明的两部分检测策略，能够分步判断副溶血性弧菌属和其他弧菌属、产毒和非产毒弧菌属，判断必须两项同时阳性检出才最终判断为产毒副溶血性弧菌，结果更加严谨和准确。

(4)本发明能够实现从10个阳性菌到10000个阳性菌的检测范围，灵敏度高，应用范围广，更高浓度的样品可以通过稀释折算同样被检测出来，检测结果稳定，具有很好的重现性。

(5)本发明检测方法能够应用于对于环境的水体样品、淤泥样品、食品抽检等各个领域来源样品筛查和检测，精准地判断出样品中是否含有产毒副溶血性弧菌，操作方便、快速、灵敏。本发明检测试剂盒能够应用于水产养殖，生活用水监控，食品安全等各个方面的快速检验，无需额外进行微生物培养，使基因检验在日常民生中得到应用，具有灵敏度高、操作性强、快速、高效等优点。

附图说明

图1是rpoB基因检测引物标准曲线。

图2的gene1基因检测引物标准曲线。

图3是gene2基因检测引物标准曲线。

图4是gene3基因检测引物标准曲线。

图5是gene4基因检测引物标准曲线。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

本发明所用的以下试剂可通过常规途径购买得到。

表1

在一些实施方案中，使用扩增产物构建阳性标准品质粒，并进行引物的扩增标准曲线检测和绘制，得到每对检测引物的扩增效率，本发明所提供的引物序列其扩增效率和置信程度均在最优化的水平。

在一些实施方案中，通过对不同的阳性菌株检测特异性的基因，能够正确的区分出副溶血性弧菌属和其他弧菌属，产毒和非产毒弧菌属，从而准确检测并判断出产毒副溶血性弧菌。

在一些实施方案中，通过对10个、100个、1000个和10000个阳性菌进行提取和检测，能够精确区分出副溶血性弧菌属和其他弧菌属，产毒和非产毒弧菌属，从而准确检测并判断出产毒副溶血性弧菌。并且能够保证低至10个阳性菌仍然能够准确检出，而更高滴度的微生物样品可以通过稀释至检测区间，同样可以准确检出。

在一些实施方案中，采集塘泥、河道水体、底泥和生活用水的样品，通过对特异性基因的检测，能够快速和准确的检验出样品中是否含有产毒副溶血性弧菌，方便快捷。

本领域技术人员应能理解，本方法中检测的基因和设计的特异性引物，同样可以通过相同检测对象的其他区段的设计达到相应的检测目的。

本发明所描述的用于检测产毒副溶血性弧菌荧光定量PCR的方法及试剂盒可以广泛应用于水体监控、饮用水监控和食品安全监控等多个检验检疫范畴，能够为日常民生提供方便、快捷、准确、高效的基于基因检测的监控产品。

实施例1检测引物扩增标准曲线

1.微生物培养

使用碱性蛋白胨水作为副溶血性弧菌的培养基，pH8.8～9.0的碱性蛋白胨水或平板中生长良好。在碱性平板上菌落直径为2mm，圆形，光滑，透明。选取处于生长旺盛的微生物样品进行后续的实验。

2.基因组DNA提取

按照Qiagen的QIAamp DNA Mini Kit说明书指示进行基因组DNA的提取。

3.扩增产物标准品质粒制作

使用源自副溶血性弧菌提取的DNA，分别以rpoB基因、gene1基因、gene2基因、gene3基因和gene4基因的引物进行扩增，扩增产物经过加A处理后，使用T4连接酶连入T载体，并且通过转导感受态细胞后，质粒得到大规模扩增。5个基因的引物序列如SEQ ID NO:1～10所示，具体如表2。

表2

4.质粒的提取和标准曲线梯度的配置

分别涂板扩增rpoB基因、gene1基因、gene2基因、gene3基因和gene4基因对应的引物扩增产物的标准品克隆菌，收集单克隆的菌斑，并通过LB培养摇菌过夜扩增，最后得到5ml指数生长期的质粒阳性菌株，按照QIAGEN Plasmid Midi Kit说明书指示进行质粒DNA的提取。提取后检测质粒DNA的浓度，并通过10倍稀释的方法，配置5个浓度梯度的标准品，浓度梯度分别为1μg/μL，100ng/μL，10ng/μL，1ng/μL，100pg/μL，10pg/μL。

5.检测引物标准曲线绘制

按照BioRad iQ SYBR Green SuperMix说明书指示进行浓度梯度标准曲线的qPCR扩增，并且绘制对应的扩增曲线，得到每对引物的扩增效率。每一个qPCR的反应设置3个生物学重复及3个技术重复，qPCR反应体系和扩增反应条件如表3所示。

表3

6.结果分析

检测引物扩增标准曲线结果显示，rpoB基因、gene1基因、gene2基因、gene3基因和gene4基因对应的引物均为经过优化的引物设计和反应体系。其中线性的标准曲线可信度R²>0.980，高扩增效率在90-105％，证明引物设计和反应体系是最优状态。分析5个基因的扩增曲线的相关性系数和可信度，以及6个浓度梯度下的扩增效率，均达到最优状态的要求，5对引物在该反应条件下能够满足检测要求。

表4

基因名	斜率	截距	扩增效率	可信度R<sup>2</sup>
					rpoB	-3.3014	32.247	100.86％	0.9978
gene1	-3.4423	36.861	95.21％	0.9921
					gene2	-3.4509	36.878	94.89％	0.9963
gene3	-3.3937	33.105	97.09％	0.9905
					gene4	-3.5737	35.298	90.47％	0.9985

实施例2阳性及阴性样品检测情况

1.微生物培养

同实施例1。

2.基因组DNA提取

同实施例1。

3.5个目标基因的qPCR检测

按照BioRad iQ SYBR Green SuperMix说明书指示进行样品的qPCR扩增，并且得到每对引物对应的Ct值读数。每一个qPCR的反应设置3个生物学重复及3个技术重复，qPCR反应体系和扩增反应条件如表5所示。

表5

4.结果分析

如表6和表7所示，5对引物的qPCR扩增结果显示，副溶血性弧菌属呈现rpoB基因、gene1基因和gene2基因的一个到多个基因的阳性结果，而其他弧菌属均显示阴性结果。因此，对于副溶血性弧菌和其他弧菌属，进行rpoB基因、gene1基因和gene2基因的检测，能够较好的区分副溶血性弧菌属和其他弧菌属。同时，gene3基因和gene4基因的检测结果，产毒的副溶血性弧菌呈现检测结果阳性，而其他非产毒副溶血性弧菌和其他弧菌属呈现阴性。因此，进行gene3基因和gene4基因的检测，能够较好的区分产毒和非产毒的弧菌属。综上所述，rpoB基因、gene1基因和gene2基因的对应引物，能够满足弧菌属中副溶血性弧菌属的检测判断，gene3基因和gene4基因的对应引物，能够满足产毒和非产毒弧菌属的检测判断。

表6

表7

实施例3检测体系的灵敏度

1.微生物培养

使用碱性蛋白胨水作为副溶血性弧菌的培养基，pH8.8～9.0的碱性蛋白胨水或平板中生长良好。在碱性平板上菌落直径为2mm，圆形，光滑，透明。选取处于生长旺盛的微生物样品进行后续的实验，收集菌体后进行浓度计算，并且10稀释得到10个菌/ml，100个菌/ml，1000个菌/ml，和10000个菌/ml，对不同浓度梯度的菌液进行后续的DNA提取实验。

2.基因组DNA提取

同实施例1。

3.5个目标基因的qPCR检测

同实施例2。

4.结果分析

如表8～表9所示，5对引物的qPCR扩增结果显示，从10个菌至10000个菌的范围内，副溶血性弧菌属呈现rpoB基因、gene1基因和gene2基因的一个到多个基因的阳性结果。因此，通过进行rpoB基因、gene1基因和gene2基因的检测，能够较好的达到从10个菌至10000个菌的范围内副溶血性弧菌属的检出。同时，从10个菌至10000个菌的范围内，gene3基因和gene4基因的检测结果，产毒的副溶血性弧菌呈现检测结果阳性，而其他非产毒副溶血性弧菌属呈现阴性。因此，进行gene3基因和gene4基因的检测，能够较好的达到从10个菌至10000个菌的范围内产毒和非产毒的弧菌属的检测和区分。综上所述，可以通过rpoB基因、gene1基因、gene2基因、gene3基因和gene4基因的搭配检测，较好的完成产毒副溶血性弧菌的检测，检测范围可以从10个菌株至10000个菌株，更高的菌株浓度也可以通过稀释的方法稀释至最佳检测范围内，能够达到预期的检测要求。

表8

表9

实施例4环境样品的检测

1.环境样品收集和基因组DNA的提取

分别收集不同的厨余样品、河道污水和对应底泥，以及生活污水和过滤水，按照Qiagen的QIAamp DNA Mini Kit说明书指示进行基因组DNA的提取。

2.5个目标基因的qPCR检测

同实施例2。

3.结果分析

如表10～表11所示，5对引物的qPCR扩增结果显示，除了河道污水和过滤水，其他样品均检出rpoB基因、gene1基因和gene2基因中的1个及以上，证明相应的样品来源中含有副溶血弧菌。而除了河道污水、过滤水和一个生活污水和一个河道底泥样品外，其他样品均检出gene3基因和gene4基因的一个或者两个，证明对应的样品来源中含有产毒的副溶血弧菌。最终判断为产毒副溶血弧菌阳性的准则为，rpoB基因、gene1基因和gene2基因中的1个及以上检测得到Ct值小于35个循环，同时gene3基因和gene4基因中的一个及以上检测得到Ct值小于35个循环。如果rpoB基因、gene1基因和gene2基因均检测得到Ct值大于35个循环，或者，gene3基因和gene4基因均检测得到Ct值大于35个循环，则判断为产毒创伤弧菌阴性未检出。

表10

表11

以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广东美格基因科技有限公司

<120> 用于检测产毒副溶血性弧菌的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcgtcacggt aacaagggtg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttcgctgcca gacctaagtg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gatttcacga caaggcacgc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagcatgccg aaaccaaacc 20

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gccgttacac actctgcct 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcagcggtga tgtgacttgg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcgggtctta gcgcaaagtt 20

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tccagtcgac gtgcttcac 19

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgtcgatgaa ggctacgctc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

catcacttgc caactcacgc 20

Claims

1.一种用于检测产毒副溶血性弧菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、收集样品；

S2、提取基因组DNA；

S3、检测副溶血性弧菌属特异性基因rpoB、gene1和gene2，以及产毒特异性基因gene3和gene4；

2.根据权利要求1所述的用于检测产毒副溶血性弧菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述副溶血性弧菌属特异性基因rpoB的检测引物如SEQ ID NO:1～2所示。

3.根据权利要求1所述的用于检测产毒副溶血性弧菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述副溶血性弧菌属特异性基因gene1的检测引物如SEQ ID NO:3～4所示。

4.根据权利要求1所述的用于检测产毒副溶血性弧菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述副溶血性弧菌属特异性基因gene2的检测引物如SEQ ID NO:5～6所示。

5.根据权利要求1所述的用于检测产毒副溶血性弧菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述产毒特异性基因gene3的检测引物如SEQ ID NO:7～8所示。

6.根据权利要求1所述的用于检测产毒副溶血性弧菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述产毒特异性基因gene4的检测引物如SEQ ID NO:9～10所示。

7.一种用于检测产毒副溶血性弧菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包含所述的副溶血性弧菌属特异性基因rpoB、gene1、gene2的检测引物和产毒特异性基因gene3和gene4的检测引物。