CN111534612A - 用于检测产毒炭疽芽孢杆菌的荧光定量pcr方法及相应的试剂盒 - Google Patents

用于检测产毒炭疽芽孢杆菌的荧光定量pcr方法及相应的试剂盒 Download PDF

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CN111534612A CN201911100923.3A CN201911100923A CN111534612A CN 111534612 A CN111534612 A CN 111534612A CN 201911100923 A CN201911100923 A CN 201911100923A CN 111534612 A CN111534612 A CN 111534612A
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bacillus
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张智闵
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Abstract

本发明公开了一种用于检测产毒炭疽芽孢杆菌的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒。本发明巧妙的应用了特异性的基因检测区分炭疽芽孢杆菌与其它杆菌属，以及产毒和非产毒的炭疽芽孢杆菌属，通过综合判断，得出准确的菌属信息。本发明与现有的主流检测试剂盒相比，本发明用于检测产毒炭疽芽孢杆菌的试剂盒具有灵敏度高、快捷方便、特异型好、判断严谨准确等优势，具有良好的应用前景和市场价值。

Description

用于检测产毒炭疽芽孢杆菌的荧光定量PCR方法及相应的试 剂盒
技术领域
本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种通过特异性基因对产毒炭疽芽孢杆菌进行荧光定量PCR检测的方法和相应的检测试剂盒。
背景技术
芽孢杆菌属为革兰氏阳性的一种，其中多含非致病性的枯草芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌等近50种，而少数菌种仍具有致病性，例如：炭疽杆菌引起的炭疽病几乎遍及世界各地，四季均可发生，对社会公共卫生和经济发展的危害，迄今仍占相当大的比重。
炭疽杆菌菌体粗大、两端平截或凹陷，是致病菌中最大的细菌。体型似竹节状、无鞭毛、无动力且本菌在氧气充足、温度适宜(25～30℃)及pH(7.2～7.4)的适当条件下容易进行培养。但繁殖体抵抗力不强，易被一般消毒剂杀灭，而芽胞抵抗力强，在干燥的室温环境中可存活20年以上。另炭疽芽胞对碘特别敏感，对青霉素、先锋霉素、链霉素等高度敏感。
炭疽杆菌其致病机制主要来自于本菌的荚膜和产生的毒素引起致病。荚膜由D-谷氨酸多肽组成，能抑制抗体和抵抗吞噬细胞的吞噬作用，促进该菌入侵后扩张繁殖。其毒素可增加微血管的通透性，改变血液正常循环、损害肝脏功能、干扰糖代谢，最后可导致死亡。其中人类受感染在本身抵抗力低时，接触污染物导致疾病的发生，常见如下：(1)屠宰、制革或毛刷工人及饲养员易常见的皮肤炭疽，炭疽杆菌由体表破损处进入体内，开始在入侵处形成水疖、水疱、脓疱、中央部呈黑色坏死，如不及时治疗，细菌可进一步侵入局部淋巴结或侵入血流，引起败血症死亡。(2)皮毛工人经由吸入病菌芽胞导致纵隔障炭疽，病死率高。发病初期似感冒，进而出现严重的支气管肺炎，可在2～3天内死于中毒性休克。(3)食入病兽肉制品所导致的肠炭疽，以全身中毒症状为主，并有胃肠道溃疡、出血及毒血症，发病后2～3日内死亡。
炭疽杆菌引起的炭疽病几乎遍及世界各地，四季均可发生。因此，准确快速地检测炭疽杆菌对于制定疾病预防、治疗和控制方案具有重大意义。目前，国内外对炭疽杆菌进行了大量研究，建立了很多有效的检测方法，其中细菌纯培养、Ascoli试验、噬菌体裂解、青霉素敏感性试验及生化试验已广泛应用，但仍然存在耗时、灵敏度低等问题。近年来，分子生物学技术以其高灵敏度、高特异性、实验周期短、易操作等优势逐步应用于炭疽杆菌的检测。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种用于检测产毒炭疽芽孢杆菌的荧光定量PCR方法。
具体地，上述方法包括如下步骤：
S1、收集样品；
S2、提取基因组DNA；
S3、检测炭疽芽孢杆菌属特异性基因rpoB和gene4以及产毒特异性基因gene1、gene2和gene3；
S4、读取扩增Ct值；当所述炭疽芽孢杆菌属特异性基因中至少1个基因和所述产毒特异性基因中至少1个基因的Ct值均小于35时，产毒炭疽芽孢杆菌的检测结果为阳性；当所述炭疽芽孢杆菌属特异性基因rpoB、gene4的Ct值大于35和/或所述产毒特异性基因gene1、gene2和gene3的Ct值大于35时，产毒炭疽芽孢杆菌的检测结果为阴性。
作为一种优选技术方案，所述炭疽芽孢杆菌属特异性基因rpoB
(NCBI Accession Number：AY169514.1)的检测引物如SEQ ID NO:1～2所示：SEQID NO:1(5'-AACTTGCGCACATGGTTGAC-3')；
SEQ ID NO:2(5'-CTGTCCACCGAACTGAGCTT-3')。
所述炭疽芽孢杆菌属特异性基因gene4的检测引物如SEQ ID NO:3～4所示：SEQID NO:3(5'-TGACGGTTTGAATGCTTCGG-3')(NCBI Accession Number：BBB70691.1)；
SEQ ID NO:4(5'-TCCCAGACTGATATTGCGCC-3')(NCBI Accession Number：BBB70692.1)。
所述炭疽芽孢杆菌属特异性基因gene1的检测引物如SEQ ID NO:5～6所示：SEQID NO:5(5'-ACATGGATTATTGCGGTAGATGC-3')(NCBI Accession Number：BBB71883.1)；
SEQ ID NO:6(5'-TATATAGCCGCGCCATGGTG-3')(NCBI Accession Number：BBB71884.1)。
所述炭疽芽孢杆菌属特异性基因gene2(NCBI Accession Number：
BBB71889.1)的检测引物如SEQ ID NO:7～8所示：
SEQ ID NO:7(5'-TGCTGATGAGTGTGTAGACCC-3')；
SEQ ID NO:8(5'-CCCCTTCCACTGCTTCCAAT-3')。
所述产毒特异性基因gene3(NCBI Accession Number：BBB74179.1)的检测引物如SEQ ID NO:9～10所示：
SEQ ID NO:9(5'-ATGTTGGGGTTGGTCACAGC-3')；
SEQ ID NO:10(5'-GCGAGTCCCTAACAGCCTTT-3')。
本发明另一目的是提供一种用于检测产毒炭疽芽孢杆菌的荧光定量PCR试剂盒，其包含上述的炭疽芽孢杆菌属特异性基因rpoB和gene4的检测引物和产毒特异性基因gene1、gene2和gene3的检测引物。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明通过前期对炭疽芽孢杆菌属和其他杆菌属，产毒和非产毒杆菌属的微生物的大量研究数据中，挖掘出能够区分炭疽芽孢杆菌属和其他杆菌属，产毒和非产毒杆菌属的特异性的杆基因，通过对特异性基因的检测，准确的判断出菌类样品和环境样品中是否含有产毒的炭疽芽孢杆菌，具有前期大数据的挖掘和不同种属之间比对基础，选择的特异性基因具有物种和菌属的特异性。
(2)本发明中，通过对设计条件和实验条件的优化，选取针对于每个基因检测扩增条件处于最优化的引物作为检测引物，提高引物扩增的效率，能够达到稳定、高效、高灵敏度和重现性的检测引物，实现微量样品的正确检出。
(3)本发明检测方法与市面上其他的检测方法相比，本发明的两部分检测策略，能够分步判断炭疽芽孢杆菌属和其他杆菌属、产毒和非产毒杆菌属，判断必须两项同时阳性检出才最终判断为产毒炭疽芽孢杆菌，结果更加严谨和准确。
(4)本发明能够实现从10个阳性菌到10000个阳性菌的检测范围，灵敏度高，应用范围广，更高浓度的样品可以通过稀释折算同样被检测出来，检测结果稳定，具有很好的重现性。
(5)本发明检测方法能够应用于对于环境的水体样品、淤泥样品、食品抽检等各个领域来源样品筛查和检测，精准地判断出样品中是否含有产毒炭疽芽孢杆菌，操作方便、快速、灵敏。本发明检测试剂盒能够应用于水产养殖，生活用水监控，食品安全等各个方面的快速检验，无需额外进行微生物培养，使基因检验在日常民生中得到应用，具有灵敏度高、操作性强、快速、高效等优点。
附图说明
图1是rpoB基因检测引物标准曲线。
图2的gene1基因检测引物标准曲线。
图3是gene2基因检测引物标准曲线。
图4是gene3基因检测引物标准曲线。
图5是gene4基因检测引物标准曲线。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
本发明所用的以下试剂可通过常规途径购买得到。
表1
Figure BDA0002269841350000061
Figure BDA0002269841350000071
在一些实施方案中，使用扩增产物构建阳性标准品质粒，并进行引物的扩增标准曲线检测和绘制，得到每对检测引物的扩增效率，本发明所提供的引物序列其扩增效率和置信程度均在最优化的水平。
在一些实施方案中，通过对不同的阳性菌株检测特异性的基因，能够正确的区分出炭疽芽孢杆菌属和其他杆菌属，产毒和非产毒杆菌属，从而准确检测并判断出产毒炭疽芽孢杆菌。
在一些实施方案中，通过对10个、100个、1000个和10000个阳性菌进行提取和检测，能够精确区分出炭疽芽孢杆菌属和其他杆菌属，产毒和非产毒杆菌属，从而准确检测并判断出产毒炭疽芽孢杆菌。并且能够保证低至10个阳性菌仍然能够准确检出，而更高滴度的微生物样品可以通过稀释至检测区间，同样可以准确检出。
在一些实施方案中，采集养血清、皮肤分泌物、痰液、生活污水和过滤水的样品，通过对特异性基因的检测，能够快速和准确的检验出样品中是否含有产毒炭疽芽孢杆菌，方便快捷。
本领域技术人员应能理解，本方法中检测的基因和设计的特异性引物，同样可以通过相同检测对象的其他区段的设计达到相应的检测目的。
本发明所描述的用于检测产毒炭疽芽孢杆菌荧光定量PCR的方法及试剂盒可以广泛应用于医疗卫生监控、水体监控、饮用水监控和食品安全监控等多个检验检疫范畴，能够为日常民生提供方便、快捷、准确、高效的基于基因检测的监控产品。
实施例1检测引物扩增标准曲线
1.微生物培养
使用碱性蛋白胨水作为炭疽芽孢杆菌的培养基，pH8.8～9.0的碱性蛋白胨水或平板中生长良好。在碱性平板上菌落直径为2mm，圆形，光滑，透明。选取处于生长旺盛的微生物样品进行后续的实验。
2.基因组DNA提取
按照Qiagen的QIAamp DNA Mini Kit说明书指示进行基因组DNA的提取。
3.扩增产物标准品质粒制作
使用源自炭疽芽孢杆菌提取的DNA，分别以rpoB基因、gene1基因、gene2基因、gene3和gene4基因的引物进行扩增，扩增产物经过加A处理后，使用T4连接酶连入T载体，并且通过转导感受态细胞后，质粒得到大规模扩增。5个基因的引物序列如SEQ ID NO:1～10所示，具体如表2。
表2
Figure BDA0002269841350000091
4.质粒的提取和标准曲线梯度的配置
分别涂板扩增rpoB基因、gene1基因、gene2基因、gene3基因和gene4基因对应的引物扩增产物的标准品克隆菌，收集单克隆的菌斑，并通过LB培养摇菌过夜扩增，最后得到5ml指数生长期的质粒阳性菌株，按照QIAGEN Plasmid Midi Kit说明书指示进行质粒DNA的提取。提取后检测质粒DNA的浓度，并通过10倍稀释的方法，配置6个浓度梯度的标准品，浓度梯度分别为1μg/μL，100ng/μL，10ng/μL，1ng/μL，100pg/μL，10pg/μL。
5.检测引物标准曲线绘制
按照BioRad iQ SYBR Green SuperMix说明书指示进行浓度梯度标准曲线的qPCR扩增，并且绘制对应的扩增曲线，得到每对引物的扩增效率。每一个qPCR的反应设置3个生物学重复及3个技术重复，qPCR反应体系和扩增反应条件如表3所示。
表3
Figure BDA0002269841350000101
6.结果分析
检测引物扩增标准曲线结果显示，rpoB基因、gene1基因、gene2基因、gene3基因和gene4基因对应的引物均为经过优化的引物设计和反应体系。其中线性的标准曲线可信度R2>0.990，高扩增效率在94-110％，证明引物设计和反应体系是最优状态。分析5个基因的扩增曲线的相关性系数和可信度，以及6个浓度梯度下的扩增效率，均达到最优状态的要求，5对引物在该反应条件下能够满足检测要求。
表4
基因名 斜率 截距 扩增效率 可信度R<sup>2</sup>
rpoB -3.2043 31.91 105.15％ 0.9909
gene1 -3.1046 36.236 109.94％ 0.9956
gene2 -3.4031 36.769 96.72％ 0.9924
gene3 -3.4017 33.903 96.78％ 0.9901
gene4 -3.4603 35.686 94.53％ 0.9984
实施例2阳性及阴性样品检测情况
1.微生物培养
同实施例1。
2.基因组DNA提取
同实施例1。
3.5个目标基因的qPCR检测
按照BioRad iQ SYBR Green SuperMix说明书指示进行样品的qPCR扩增，并且得到每对引物对应的Ct值读数。每一个qPCR的反应设置3个生物学重复及3个技术重复，qPCR反应体系和扩增反应条件如表5所示。
表5
Figure BDA0002269841350000121
4.结果分析
5对引物的qPCR扩增结果显示，炭疽芽孢杆菌属呈现rpoB基因、gene4基因的阳性结果，而其他杆菌属均显示阴性结果。因此，对于炭疽芽孢杆菌属和其他杆菌属，进行rpoB基因、gene4基因的检测，能够较好的区分炭疽芽孢杆菌属和其他杆菌属。同时，gene1基因、gene2基因和gene3基因的检测结果，产毒的炭疽芽孢杆菌属呈现检测结果阳性，而其他非产毒炭疽芽孢杆菌属和其他杆菌属呈现阴性。因此，进行gene1基因、gene2基因和gene3基因的检测，能够较好的区分产毒和非产毒的杆菌属。综上所述，rpoB基因和gene4基因的对应引物，能够满足杆菌属中炭疽芽孢杆菌属的检测判断，gene1基因、gene2基因和gene3基因的对应引物，能够满足产毒和非产毒杆菌属的检测判断。
表6
Figure BDA0002269841350000131
表7
Figure BDA0002269841350000141
实施例3检测体系的灵敏度
1.微生物培养
使用碱性蛋白胨水作为炭疽芽孢杆菌的培养基，pH8.8～9.0的碱性蛋白胨水或平板中生长良好。在碱性平板上菌落直径为2mm,圆形，光滑，透明。选取处于生长旺盛的微生物样品进行后续的实验，收集菌体后进行浓度计算，并且10稀释得到10个菌/ml，100个菌/ml，1000个菌/ml和10000个菌/ml，对不同浓度梯度的菌液进行后续的DNA提取实验。
2.基因组DNA提取
同实施例1。
3.5个目标基因的qPCR检测
同实施例2。
4.结果分析
5对引物的qPCR扩增结果显示，从10个菌至10000个菌的范围内，炭疽芽孢杆菌属呈现rpoB基因、gene4基因的一个或两个基因的阳性结果。因此，通过进行rpoB基因和gene4基因的检测，能够较好的达到从10个菌至10000个菌的范围内炭疽芽孢杆菌属的检出。同时，从10个菌至10000个菌的范围内，gene1基因、gene2基因和gene3基因的检测结果，产毒的炭疽芽孢杆菌属呈现检测结果阳性，而其他非产毒炭疽芽孢杆菌属呈现阴性。因此，进gene1基因、gene2基因和gene3基因的检测，能够较好的达到从10个菌至10000个菌的范围内产毒和非产毒的杆菌属的检测和区分。综上所述，可以通过rpoB基因、gene4基因、gene1基因、gene2基因和gene3基因的搭配检测，较好的完成产毒炭疽芽孢杆菌的检测，检测范围可以从10个菌株至10000个菌株，更高的菌株浓度也可以通过稀释的方法稀释至最佳检测范围内，能够达到预期的检测要求。
表8
Figure BDA0002269841350000151
Figure BDA0002269841350000161
表9
Figure BDA0002269841350000162
Figure BDA0002269841350000171
实施例4环境样品的检测
1.环境样品收集和基因组DNA的提取
分别收集不同的血清、皮肤分泌物、痰液、生活污水和过滤水，按照Qiagen的QIAamp DNA Mini Kit说明书指示进行基因组DNA的提取。
2.5个目标基因的qPCR检测
同实施例2。
3.结果分析
5对引物的qPCR扩增结果显示，除了生活污水、过滤水，其他样品均检出rpoB基因、gene4基因中的一个或两个，证明相应的样品来源中含有炭疽芽孢杆菌。除了生活污水、过滤水、皮肤分泌物、皮肤分泌物、血清3、血清4、和痰液2外，其他样品均检出gene1基因、gene2和gene3基因的一个及以上，证明对应的样品来源中含有产毒的炭疽芽孢杆菌。最终判断为产毒炭疽芽孢杆菌阳性的准则为，rpoB基因和gene4基因中的一个或两个检测得到Ct值小于35个循环，同时gene1基因、gene2基因和gene3基因中的一个及以上检测得到Ct值小于35个循环。如果rpoB基因、gene4基因均检测得到Ct值大于35个循环，或者，gene1基因、gene2基因和gene3基因均检测得到Ct值大于35个循环，则判断为产毒炭疽芽孢杆菌阴性未检出。
表10
Figure BDA0002269841350000181
表11
Figure BDA0002269841350000182
Figure BDA0002269841350000191
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广东美格基因科技有限公司
<120> 用于检测产毒炭疽芽孢杆菌的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aacttgcgca catggttgac 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgtccaccg aactgagctt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgacggtttg aatgcttcgg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcccagactg atattgcgcc 20
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acatggatta ttgcggtaga tgc 23
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tatatagccg cgccatggtg 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgctgatgag tgtgtagacc c 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccccttccac tgcttccaat 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgttggggt tggtcacagc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcgagtccct aacagccttt 20

Claims (7)

1.一种用于检测产毒炭疽芽孢杆菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、收集样品；
S2、提取基因组DNA；
S3、检测炭疽芽孢杆菌属特异性基因rpoB和gene4，以及产毒特异性基因gene1、gene2和gene3；
S4、读取扩增Ct值；当所述炭疽芽孢杆菌属特异性基因中至少1个基因和所述产毒特异性基因中至少1个基因的Ct值均小于35时，产毒炭疽芽孢杆菌的检测结果为阳性；当所述炭疽芽孢杆菌属特异性基因rpoB、gene4的Ct值大于35和/或所述产毒特异性基因gene1、gene2和gene3的Ct值大于35时，产毒炭疽芽孢杆菌的检测结果为阴性。
2.根据权利要求1所述的用于检测产毒炭疽芽孢杆菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述炭疽芽孢杆菌属特异性基因rpoB的检测引物如SEQ ID NO:1～2所示。
3.根据权利要求1所述的用于检测产毒炭疽芽孢杆菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述炭疽芽孢杆菌属特异性基因gene4的检测引物如SEQ ID NO:3～4所示。
4.根据权利要求1所述的用于检测产毒炭疽芽孢杆菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述产毒特异性基因gene1的检测引物如SEQ ID NO:5～6所示。
5.根据权利要求1所述的用于检测产毒炭疽芽孢杆菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述产毒特异性基因gene2的检测引物如SEQ ID NO:7～8所示。
6.根据权利要求1所述的用于检测产毒炭疽芽孢杆菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述产毒特异性基因gene3的检测引物如SEQ ID NO:9～10所示。
7.一种用于检测产毒炭疽芽孢杆菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包含所述的炭疽芽孢杆菌属特异性基因rpoB和gene4的检测引物和产毒特异性基因gene1、gene2和gene3的检测引物。
CN201911100923.3A 2019-11-12 2019-11-12 用于检测产毒炭疽芽孢杆菌的荧光定量pcr方法及相应的试剂盒 Pending CN111534612A (zh)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080146455A1 (en) * 2003-09-11 2008-06-19 Hall Thomas A Methods for identification of sepsis-causing bacteria

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ELIZABETH BODE等: "Real-time PCR assay for a unique chromosomal sequence of Bacillus anthracis", 《J CLIN MICROBIOL.》 *
JOAKIM ÅGREN等: "In silico and in vitro evaluation of PCR-based assays for the detection of Bacillus anthracis chromosomal signature sequences", 《COMPARATIVE STUDY》 *
于威等主编: "《医学微生物学》", 30 April 2009 *
刘东立等: "ＴａｑＭａｎ－ＬＮＡ探针多重实时荧光定量ＰＣＲ检测炭疽芽胞杆菌的研究", 《中国病原生物学杂志》 *
李伟等: "应用Taq Man荧光PCR定性定量检测炭疽芽孢杆菌", 《中国人兽共患病杂志》 *
李文涓等: "炭疽与蜡样芽胞杆菌rpoB基因交叉反应的分子分析", 《现代预防医学》 *
杜清春等: "快速检测炭疽杆菌的实时荧光定量PCR 方法的建立及评价", 《中国动物传染病学报》 *
汪仕奎等: "炭疽芽孢杆菌特异性基因序列双重TaqMan聚合酶链反应快速检测体系的建立", 《中华检验医学杂志》 *

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