CN106967850A - 手足口病混合感染中柯萨奇a组16型病毒的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种手足口病混合感染中柯萨奇A组16型病毒的检测方法，该方法通过提取病毒RNA，用肠道病毒A组通用引物EntAF和 EntARo进行RT‑PCR扩增，然后用引物EntAF和EntARi进行半巢式PCR扩增，再根据肠道病毒A组通用引物和CV‑A16序列设计特异CV‑A16上游引物CA16AFO和下游引物CA16ARi，以RT‑PCR产物为模板进行巢式PCR扩增，取扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，即可鉴定。本发明所述方法具有操作简便、检测速度快、准确率高、成本低等优点，特别适用于大规模流行病调查。

Description

手足口病混合感染中柯萨奇A组16型病毒的检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种手足口病临床样品中柯萨奇A组16型肠道病毒的检测方法。

背景技术

柯萨奇A组16型（coxsackievirus A16，CV-A16）是引起手足口病( Hand-foot-mouth disease, HFMD) 主要病原体之一。HFMD是严重危害儿童的一种常见传染病, 多数患者以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要特征，预后良好, 少数患者可并发呼吸道感染、肺水肿、心肌炎和无菌性脑膜炎等,甚至死亡。HFMD的流行会成为重大公共卫生问题之一。

目前已经明确引起手足口病的病原体有二十多种,主要为小RNA病毒科肠道病毒属的柯萨奇病毒A组16、4、5、7、9、10型, B 组2、5、13型、埃可病毒( ECHO viruses)以及人肠道病毒71 型（enterovirus 71，EV-A71）, 其中以EV-A71 和柯萨奇A组16型（Coxsackievirus A16，CV-A16）最为常见。研究发现，HFMD流行期间，多种肠道病毒的共感染和/或混合感染普遍存在，多种肠道病毒的共感染和/或混合感染可加重疾病和/或延长病程。因此对混合感染监测有助于HFMD预防和治疗。

肠道病毒的VP1 蛋白直接决定病毒的抗原性，而VP1蛋白N-末端的BC-环（90 ～107 位氨基酸）不仅具有高度变异性，而且还存在型特异的中和抗体和体抗原表位，获得该区域序列信息对确定病毒的型别非常重要，在不同肠道病毒之间的抗原差异主要是由于VP1 中的BC-环发生氨基酸的改变。在HFMD病原学调查中，根据该位置而设计肠道病毒通用引物进行巢式或半巢式RT-PCR、测序，并在NCBI BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 比对，以确定为何种肠道病毒感染。如果通过以上检测未显示CV-A16，为了进一步鉴定是否还存在CV-A16的感染，目前的做法是必须先用CV-A16的特异引物进行RT-PCR，然后巢式或半巢式PCR，1%琼脂糖电泳以确定其片段大小而确定为CV-A16感染。这需要进行两次RT-PCR，不但增加了成本，还需要较长时间，对于大规模流行病调查，花费巨大，故而有必要改进肠道病毒混合感染中CV-A16检测方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上所述缺陷，提供一种检测速度快、准确率高、减少费用的CV-A16病毒的检测方法。

为了解决以上所述技术问题，本发明所述手足口病混合感染中柯萨奇A组16型病毒的检测方法，所述方法包括以下步骤：

（1）提取病毒RNA，根据肠道病毒VP1的特点设计肠道病毒A组通用引物进行巢式或半巢式PCR；首先用引物EntAF(5’TNCARGCWGCNGARACNGG 3’)和EntARo（5’ANGGRTTNGTNGMWGTYTGCCA 3’）进行第一步的RT-PCR扩增，然后再用引物EntAF和EntARi（5’GGNGGNACRWACATRTAYTG 3’）进行第二步半巢式PCR扩增，测序并进行NCBI BLAST比对，如果该核苷酸序列与GenBank数据库中肠道病毒参考株核苷酸序列同源性大于75%，即认为是同一血清型，检测出手足口病患者感染的肠道病毒种类；

（2）经过所述步骤（1）的鉴定，如果未检测出柯萨奇A组16型病毒，根据肠道病毒A组通用引物和CV-A16序列设计特异CV-A16上游引物CA16AFO（5’TACAAGCCGCGGAGACAGG3’）和下游引物CA16ARi（5’GGTGGGACATACATGTACTG 3’），以所述步骤（1）中RT-PCR产物为模板进行巢式PCR扩增，取扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，即可鉴定。

本发明的有益效果：相比于现有技术，本发明省略一步RT-PCR法，就可完成该样品的CV-A16鉴定，一个样品可节约成本近30元人民币，时间也从原来4小时缩短到1.5小时，而且只需一次RT-PCR即可完成，因此该方法能够快速、简便、而且大幅度降低成本，为大规模的肠道病毒混合感染中CV-A16分子流行病学监测提供了保障。

附图说明

图1为所述实施例的肠道病毒1%琼脂糖凝胶电泳图；

图2为所述实施例的CV-A16 1%琼脂糖凝胶电泳图；

图3为所述实施例所测一个样本的CV-A16 序列；

图4为CV-A16部分VP1的引物设计和扩增示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。

本发明所述手足口病混合感染中柯萨奇A组16型病毒的检测方法，所述方法包括以下步骤：

（1）提取病毒RNA，根据肠道病毒VP1的特点设计肠道病毒A组通用引物进行巢式或半巢式PCR；首先用引物EntAF(5’TNCARGCWGCNGARACNGG 3’)和EntARo（5’ANGGRTTNGTNGMWGTYTGCCA 3’）进行第一步的RT-PCR扩增，然后再用引物EntAF和EntARi（5’GGNGGNACRWACATRTAYTG 3’）进行第二步半巢式PCR扩增，测序并进行NCBI BLAST比对，如果该核苷酸序列与GenBank数据库中肠道病毒参考株核苷酸序列同源性大于75%，即认为是同一血清型，检测出手足口病患者感染的肠道病毒种类；

（2）经过所述步骤（1）的鉴定，如果未检测出柯萨奇A组16型病毒，根据肠道病毒A组通用引物和CV-A16序列设计特异CV-A16上游引物CA16AFO（5’TACAAGCCGCGGAGACAGG3’）和下游引物CA16ARi（5’GGTGGGACATACATGTACTG 3’），以所述步骤（1）中RT-PCR产物为模板进行巢式PCR扩增，取扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，即可鉴定。

本发明所述方法，从临床病人的粪便中提取病毒RNA，用肠道病毒A组通用引物EntAF和EntARo先进行RT－PCR，然后以其产物为模板进行巢式和半巢式PCR，通过测序并在NCBI BLAST（美国国家生物技术信息中心的一套在蛋白质数据库或DNA数据库中进行相似性比较的分析工具，BLAST程序能迅速与公开数据库进行相似性序列比较，http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 比对，确定为不是CV-A16感染，再用所设计引物做巢式PCR即可。举例如下：

实施例：

1、样品处理

取1克粪便标本，加入5mLPBS充分振荡混匀，3000r/min离心30min，取上清液，保存于-80℃；

2、病毒RNA提取

病毒RNA的提取按试剂盒（Qiamp viral RNA mini Kit）说明书操作，具体如下：取560AVL 加入1.5mL离心管，再加入140μL上清液，颠倒混合15sec，室温放置10min；加入560μL无水乙醇，颠倒混合15sec；将上述溶液630μL加入Qiamp吸附柱中，8000rpm 离心1min，倒掉收集管中的废液；加入500μLAW1，8000rpm 离心1 min，倒掉收集管中的废液；加入500μLAW2，14000rpm 离心3 min，倒掉收集管中的废液；将吸附柱放入空收集管中，14000rpm 离心1min；将吸附柱放入一个干净的离心管中，加AVE洗脱缓冲液，室温放置1min，8000rpm离心1min；-20℃贮存；

3、扩增与测序

RT-PCR根据Super one step RT-PCR Kit操作说明，具体如下：2х reaction buffer25μL，RT-PCR MIX 1μL，EntAF 20pmol，EntARo 20pmol，RNA 10μL加水至50μL，混匀离心后50℃逆转录40min，按94℃ 2min,94℃ 0.3min,52℃0.3min,72℃ 0.3min,30个循环；72℃延伸10min，此为第一步；然后再取RT-PCR 产物10μL，用2хTaq PCR Master MIX 25μL，以EntAF和EntARi引物按以上第一步的条件（即94℃ 2min,94℃ 0.3min,52℃ 0.3min,72℃0.3min,30个循环；72℃延伸10min）扩增，取扩增产物5μL 1%琼脂糖凝胶电泳（所得到的电泳图见附图1）。有相应大小的特异片段（约328bp）用基于Sanger双脱氧终止法的ABI3730XL高自动化测序仪测序。

以上测序结果均通过用NCBIBLAST比对后，确定为何种肠道病毒。

4、非CV-A16的样品再次PCR

随机抽取14个通过以上步骤未检测出CV-A16感染的样品，用步骤3中第一步得到的RT-PCR产物10μL，用2хTaq PCR Master MIX 25μL，以CA16AFO和CA16ARi引物，按以上步骤3中第一步的条件（即94℃ 2min,94℃ 0.3min,52℃0.3min,72℃ 0.3min,30个循环；72℃延伸10min）扩增，取扩增产物2μL 1%琼脂糖凝胶电泳（所得到的电泳图见附图2）。

从电泳图（附图2）上可看到，凡是感染了CV-A16的样本均有约335bp特异片段显示，再将该片段用ABI3730XL高自动化测序仪测序（基于Sanger双脱氧终止法），序列通过NCBIBLAST比对，所用阳性样品的序列（见附图3，以一个样品为例）与CV-A16同源大于75%，均为CV-A16感染。这说明通过特异引物扩增的片段，测序结果与电泳图是相吻合的，在以后的工作中，只需通过1%琼脂糖凝胶电泳，不需要再测序，即可判断为CV-A16感染，这大大简化了工作步骤，程序简易，缩短时间，减少费用，对大规模流行病的调查意义重大。

Claims (1)

1.手足口病混合感染中柯萨奇A组16型病毒的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）提取病毒RNA，根据肠道病毒VP1的特点设计肠道病毒A组通用引物进行巢式或半巢式PCR；首先用引物EntAF(5’TNCARGCWGCNGARACNGG 3’)和EntARo（5’ANGGRTTNGTNGMWGTYTGCCA 3’）进行第一步的RT-PCR扩增，然后再用引物EntAF和EntARi（5’GGNGGNACRWACATRTAYTG 3’）进行第二步半巢式PCR扩增，测序并进行NCBI BLAST比对，如果该核苷酸序列与GenBank数据库中肠道病毒参考株核苷酸序列同源性大于75%，即认为是同一血清型，检测出手足口病患者感染的肠道病毒种类；

（2）经过所述步骤（1）的鉴定，如果未检测出柯萨奇A组16型病毒，根据肠道病毒A组通用引物和CV-A16序列设计特异CV-A16上游引物CA16AFO（5’TACAAGCCGCGGAGACAGG3’）和下游引物CA16ARi（5’GGTGGGACATACATGTACTG 3’），以所述步骤（1）中RT-PCR产物为模板进行巢式PCR扩增，取扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，即可鉴定。