CN101230404A - 同时检测多种混合感染病毒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时检测多种混合感染病毒的方法，包括以下步骤：1)获取待检测病毒的核酸序列，再分别在每种病毒的保守区内设计紧密相连的两条寡核苷酸鉴别探针；2)设计通用引物以及完全互补的Zip Code和cZipCode；3)将上游探针和下游探针与待检样品靶标核酸一起进行连接酶检测反应，得连接产物；4)用互补上游通用引物和下游通用引物扩增并标记连接产物，纯化后与通用基因芯片在50℃杂交2小时；5)杂交后用芯片扫描仪扫描，经软件分析获得杂交信号强度，从而得知混合感染病毒情况。使用本发明的方法能对任何的不同科、属和种的病原物进行检测和鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及多种微生物的检测方法，尤其涉及一种用于寡核苷酸芯片检测的新型多种混合感染猪病毒核酸扩增方法。
背景技术
随着养猪业的发展，猪传染病的发生和流行成为制约养猪生产的重要因素。目前我国猪传染病流行的主要特征是：多病原混合感染，繁殖障碍性传染病和呼吸传染病普遍存在。而病毒性感染在猪繁殖障碍病和猪呼吸道疾病的发生和流行中扮演着重要角色，因此建立相关病毒的有效检测手段，对制定切实可行的疫病防治措施有重要的意义。
目前，病毒核酸的检测用于猪病毒病诊断具有快速、敏感的特点，在病毒的检测中越来越受到重视。但这些方法一次试验只能检测样品中一种病毒，尽管人们采用多重RT-PCR/PCR的方法可以对几种病原生物进行检测，但是由于PCR方法本身的局限性，目前报道的多重PCR最多只能针对10个靶标，不可能实现对病原生物高通量的检测，在遇到混合感染和样品数量较多时，显得力不从心，不能在短时间内提供检测结果。因此有必要建立一种同步检测和鉴别诊断功能的快速、灵敏、高效的诊断方法。
基因芯片(gene chip)技术在1991年的《科学》(Science)杂志上被首次提出，是20世纪90年代兴起的一项前沿生物技术，具有高通量、微型化和自动化的特点，成为后基因组时代基因功能分析的最重要技术之一。基因芯片，又称DNA芯片，DNA微阵列(DNA microarray)或寡核苷酸阵列(Oligonucleotidearray)，检测技术的原理是基于核酸碱基配对的原则，同时基因微阵列检测技术又结合了类似电子微阵列的集成原理，通常在1cm2的固相支持物上结合成千上万条探针，然后与标记的样品靶标分子杂交，通过对杂交信号的检测分析，明确目标分子的存在与否和浓度，因此基因微阵列技术可同时针对多靶标多点检测，具有其它技术所无法比拟的优势。
基因芯片技术现在已经广泛应用于基因组功能研究、基因表达、基因序列分析、药物筛选、临床诊断、农业食品卫生和环境监测等领域(Schena et al.1995，1998)。作为一种高通量的检测新技术，可以同时检测数以万计的生物分子，在病原生物的监控和诊断尤其是病毒检测方面显示了越来越多的应用；如应用于人类病毒乙肝病毒(HBV)(Kawaguchi et al.2003)、人类免疫缺陷病毒(HIV)(Anderson et al.2000)、流感病毒(Li et al.2001)严重急性呼吸系统综合征病毒(SARS-cov)(周琦等，2003；Zhang et al.2005)等医学诊断，以及应用于动物病毒如口蹄疫、禽流感(杨素等，2004)的检测和检疫。
目前的基因芯片检测体系尚不能检测出未扩增的微量样品，所以待测样品DNA或RNA在杂交前一般都要进行PCR扩增，在扩增过程中对靶标分子进行标记。
利用基因芯片对同一科或属内不同种或同一种病原微生物内亚型或亚类的检测和鉴定相对较为容易，可以在科、属或种同源性分析的基础上，在保守区设计通用引物扩增待检测靶标核酸片段，在其间变异区设计特异性探针以区分不同的属种或亚型，这方面的研究较多(Anthony et al.2000；Parket al.2001；Zhang et al.2005；Chana et al.2006)。但不同科属的病原微生物由于不存在共同的保守基因序列，对其进行检测和鉴定则较为困难。对几种(少于10种)不同的病毒同时进行扩增，目前一般利用多重PCR方法(Li et al.2001；An et al.2003；Kim et al.2003；杨银辉等，2006)，这样也难以避免PCR的局限性。
鉴于生物芯片的平行性特点，许多研究者尝试进行多种病毒的同时检测。Wang等(2002)根据多种呼吸道病毒的基因序列设计了长片段(70nt)寡核苷酸探针微阵列，利用随机引物PCR方法扩增标记样品中的病毒靶序列，有效地检测和鉴定了多种病毒，包括呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒、人鼻病毒、Kaposi肉瘤相关疱疹病毒，并能区分病毒的亚型。国内黄岩山等(2004)和孙梅生等(2005)也分别利用此方法对呼吸道病毒进行了检测，证明此微阵列基因芯片检测是可行的。
随机引物扩增标记法可同时对多种病原生物进行标记，而不需要针对每种病原生物设计特异性引物，避免了多重PCR的限制(Li et al.2001；Gharizadeh et al.2003；Cherkasova et al.2003；Talla et al.2003；Sengupta et al.2003)，这样似乎真正解决了高通量检测技术的瓶颈。但由于上述样品扩增引物是随机引物，在扩增时没有特异性，就灵敏度而言，不如采用特异引物扩增的传统芯片技术灵敏度高，也必然导致扩增效率低，因此检测灵敏度也会相应下降，而且为弥补个别探针的交叉反应或假阳性，每种病毒一般需5-10种探针，实验复杂性增加。
Busti等(2002)设计了一种特异性的连接酶检测反应(ligase detectionreaction，LDR)探针(引物)，其中每一对探针由鉴别寡核酸和通用探针组成。前者的5′端用荧光染料Cy3，后者的3′端连接有cZip Code(complementary Zip Code)；通用芯片(universal chip)上固定了与cZipCode互补的Zip探针，当检测到特定的细菌16SrDNA时，LDR的两探针在连接酶作用下连接成一条寡核苷酸探针，其5′标记有Cy3，3′端为cZip Code，则3′端再与通用芯片上相应的Zip探针杂交就能在待定位置检测到Cy3的信号，该方法能有效地分辨各菌种间16SrDNA单个碱基的差别。不过该方法在LDR之前需对多靶序列进行多次PCR扩增，因此仅适用于科属内病原物的鉴定。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用于寡核苷酸芯片检测多种混合感染病毒的新型核酸扩增方法，使用该方法能对任何的不同科、属和种的病原物进行检测和鉴定。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种同时检测多种混合感染病毒的方法，包括以下步骤：
1)、获取待检测病毒的核酸序列，利用相应软件对每种病毒的各个株系的核酸序列进行序列比对，从而获得每种病毒的保守区；再分别在每种病毒的保守区内设计紧密相连的两条寡核苷酸鉴别探针，即上游鉴别探针和下游鉴别探针，上游鉴别探针和下游鉴别探针是一对首尾相连并与各自的靶序列互补的寡聚核苷酸；
2)、设计通用引物以及完全互补的Zip Code和cZip Code，通用引物由上游通用引物和下游通用引物组成：
Zip Code和通用引物均是根据大小和空间结构设计的彼此相互之间以及与靶序列均无同源性且不形成稳定空间结构(如发夹结构和二聚体)的20个核苷酸左右的寡聚核苷酸；cZip Code 5′连接下游鉴别探针，上游通用引物连接上游鉴别探针的5′端，组称上游探针；下游通用引物连接cZip Code的3′端，组称下游探针；Zip Code和cZip Code用于检测通用引物扩增的连接产物；
3)、将上游探针和下游探针与待检样品靶标核酸一起进行连接酶检测反应，得连接产物；
4)、用互补上游通用引物和下游通用引物扩增并标记连接产物，纯化后与通用基因芯片在50℃杂交2小时；
5)、杂交后用芯片扫描仪扫描，经软件分析获得杂交信号强度，从而得知混合感染病毒情况。
作为本发明的同时检测多种混合感染病毒的方法的改进：上游通用引物为：5’＞CTCGACCGTTAGCAGCATGA＜3’，下游通用引物为：5’＞CCGAGATGTACCGCTATCGT＜3’；互补上游通用引物为与上游通用引物互补的序列。
作为本发明的同时检测多种混合感染病毒的方法的进一步改进：Zip Code为以下任意一种：
1)、5’＞TCGCCGTTGGTCTGTATGCA＜3’；
2)、5’＞CGTTCCTAAAGCTGAGTCTG＜3’；
3)、5’＞ATGCAGCGTAGGTATCGACT＜3’；
4)、5’＞TCCCGAATGACAAGGCACGA＜3’；
5)、5’＞ATTAACTCGACTGCCGCGTG＜3’；
6)、5’＞CTTCGTGGCTAGTCTGTGAC＜3’；
7)、5’＞GTCACGTATGGTTCGCTGCT＜3’；
8)、5’＞TGTGATAATTTCGACGAGGC＜3’；
9)、5’＞AATGCTCACATCGCAGGTAC＜3’；
10)、5’＞GCACTAACTGGTCTGGGTCA＜3’；
11)、5’＞ACTCCAGTGCCAAGTACGAT＜3’；
12)、5’＞CTGAATCCTCCAACCGGGTT＜3’；
13)、5’＞TTTCGGCACGCGCGGGATCA＜3’阴性对照；为与上述cZip Code1)～12)无同源性的一段序列；
cZip Code为与Zip Code互补的对应序列。
作为本发明的同时检测多种混合感染病毒的方法的进一步改进：采用醛基修饰的载玻片做为固相载体，分别向其上固定每种病毒所对应的Zip Code，作为通用基因芯片。
本发明的同时检测多种混合感染病毒的方法，具有如下优点：本发明设计的用于寡核苷酸芯片检测的新型多种混合感染猪病毒核酸扩增方法，一次扩增可以对多种不同科、属、种和亚种的病毒进行检测，而不需通过多重PCR扩增样品；新型LDR寡核苷酸芯片是一种通用芯片，使用了通用Zip Code探针，不会产生非特异性杂交，极大地简化了杂交条件优化过程，是真正意义上的快速、准确、高通量检测芯片，可以很好地用于多种猪病毒或病原微生物的高通量检测。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是本发明的同时检测多种混合感染病毒的方法的原理示意图。
具体实施方式
本发明的同时检测多种混合感染病毒的方法，具体实施方案包括以下步骤：
1)、分别对病猪的样品进行检测，确定样品感染病毒的种类。公知常见有12种猪病毒病，分别为猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪流感病毒(SIV)、猪流行性乙型脑炎病毒(JEV)、猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪水泡病病毒(SVDV)、猪水疱性口炎病毒(VSV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)；
从NCBI网站下载待检测病毒的核酸序列，并且用Cluster W软件对每一种病毒的各个株系的核酸序列进行序列比对，寻找保守区，利用Primer 5.0和DNAstar软件在保守区内设计紧密相连的两条寡核苷酸鉴别探针(一对首尾相连并与各自的靶序列互补的25bp左右的寡聚核苷酸)；
2)、设计Zip Code、cZip Code(和Zip Code完全互补)和通用引物：Zip Code和通用引物是彼此以及与靶序列没有同源性的寡聚核苷酸。cZip Code5’连接下游鉴别探针，上游通用引物连接上游鉴别探针的5’端，组称上游探针；下游通用引物连接cZip Code的3’端，组称下游探针，Zip Code和cZipCode用于检测互补通用引物扩增的连接产物，检测原理和过程如图1所示；
3)、将上游探针和下游探针与待检病毒核酸一起进行连接酶检测反应(ligase detection reaction，LDR)；只有当检测到DNA与互补的两条寡聚核苷酸接头对应处碱基完全匹配，连接反应才能进行，下游的鉴别探针和cZipCode才能进而被互补上游通用引物和下游通用引物标记扩增，然后与通用基因芯片上相应3’连接(dA)10NH2的Zip Code探针杂交；反之则不能形成连接产物，下游的鉴别探针和cZip Code不能被扩增；
4)、用互补上游通用引物和下游通用引物扩增并标记连接产物，标记扩增样品采取在PCR过程中掺入荧光素Cy5-dCTP方法(参见，兽医微生物学1998年，中国农业科学学院哈尔滨兽医研究所编著中国农业科学出版社出版690页)。纯化后与通用基因芯片在50℃杂交2小时，随后分别在0.2×SSC和0.1×SSC中冲洗5分钟，吹干；
5)、杂交后用芯片扫描仪扫描，杂交结果的检测采用本领域公知的方法。采用激光聚焦扫描仪(GenPixTM Personal 4100A，Axon Instruments)扫读，得到Cy5图像文件，通过圈点确定杂交范围，过滤背景噪声，提取杂交的荧光信号强度值，用以下两个条件作为杂交阳性的标准。Cy5阳性点的荧光信号平均值大于阴性点2倍以上；阴性荧光信号值小于800。经软件分析获得杂交信号强度，从而得知病猪样品混合感染病毒情况。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1、一种同时检测多种混合感染病毒的方法，分别对100例病猪的样品进行检测，确定样品感染的病毒种类，公知常见有12种猪病毒病，分别为猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪流感病毒(SIV)、猪流行性乙型脑炎病毒(JEV)、猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪水泡病病毒(SVDV)、猪水疱性口炎病毒(VSV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)；本发明方法具体依次进行如下步骤：
1)、从NCBI网站下载上述病毒的核酸序列，并用Cluster W软件对每一种病毒的各个株系的核酸序列进行序列比对，寻找保守区；再利用Primer 5.0和DNAstar软件分别在每种病毒的保守区内设计紧密相连的两条寡核苷酸鉴别探针，具体如表1所示。
表1、12种病毒寡核苷酸鉴别探针
| 病毒 | 上游鉴别探针(5’-3’) | 下游鉴别探针(5’-3’) |
| TGEV | GTGTGGTTCTGAAAGTAGCG | GCGTTGGAGATTGGACTGG |
| SVDV | AGCTAGTTGGTAGTCCTCCG | GCCCCTGAATGCGGCTAAT |
| VSV | AGGGTACTGTGGGATGACTG | GGCTCCATATGAAGACGTG |
| PEDV | AGGTGTTGATGCGTCAGGC | TATGCTCAGATCGCCAGTT |
| JEV | ATGCAGGCTGAAAATGGAC | AAACTGGCTCTGAAGGGCAC |
| FMDV | CGGAACATGCTTATGAGAA | CAAACGCATTGTTGTTGAGG |
| PRV | GGAGAAACCGGAAGTGACG | AATGGACCCAACTATGGCG |
| SIV | CTAATCAGGCACGAGAACAG | AATGGTAATAGCCAGCACAACA |
| PRRSV | CAATGTCCCTAACGGTTCG | GAAGAAACTGTCGGTGGTC |
| PCV2 | TGATTATTTTATTGTTGGCGAG | GAGGGTAATGAGGAAGGACG |
| CSFV | ACAGACACGGAACTGAAAGA | AATACAGGGAATGATGGATGC |
| PPV | AACCTACCACAGAAGGAGACC | AACACCCAGGAACACTACCA |
2)、设计通用引物以及完全互补的Zip Code和cZip Code：
通用引物由上游通用引物：5’＞CTCGACCGTTAGCAGCATGA＜3’和下游通用引物5’＞CCGAGATGTACCGCTATCGT＜3’组成。
所设计的Zip Code具体为：1)、5’＞TCGCCGTTGGTCTGTATGCA＜3’；
2)、5’＞CGTTCCTAAAGCTGAGTCTG＜3’；
3)、5’＞ATGCAGCGTAGGTATCGACT＜3’；
4)、5’＞TCCCGAATGACAAGGCACGA＜3’；
5)、5’＞ATTAACTCGACTGCCGCGTG＜3’；
6)、5’＞CTTCGTGGCTAGTCTGTGAC＜3’；
7)、5’＞GTCACGTATGGTTCGCTGCT＜3’；
8)、5’＞TGTGATAATTTCGACGAGGC＜3’；
9)、5’＞AATGCTCACATCGCAGGTAC＜3’；
10)、5’＞GCACTAACTGGTCTGGGTCA＜3’；
11)、5’＞ACTCCAGTGCCAAGTACGAT＜3’；
12)、5’＞CTGAATCCTCCAACCGGGTT＜3’
13)、5’＞TTTCGGCACGCGCGGGATCA＜3’Negative control，为与上述cZip Code无同源性的一段序列；
cZip Code具体为：
1)、5’＞TGCATACAGACCAACGGCGA＜3’；
2)、5’＞CAGACTCAGCTTTAGGAACG＜3’；
3)、5’＞AGTCGATACCTACGCTGCAT＜3’；
4)、5’＞TCGTGCCTTGTCATTCGGGA＜3’；
5)、5’＞CACGCGGCAGTCGAGTTAAT＜3’；
6)、5’＞GTCACAGACTAGCCACGAAG＜3’；
7)、5’＞AGCAGCGAACCAIACGTGAC＜3’；
8)、5’＞GCCTCGTCGAAATTATCACA＜3’；
9)、5’＞GTACCTGCGATGTGAGCATT＜3’；
10)、5’＞TGACCCAGACCAGTTAGTGC＜3’；
11)、5’＞ATCGTACTTGGCACTGGAGT＜3’；
12)、5’＞AACCCGGTTGGAGGATTCAG＜3’；
cZip Code 5’连接下游鉴别探针，上游通用引物连接上游鉴别探针的5’端，组称上游探针；下游通用引物连接cZip Code的3’端，组称下游探针。
3)、将上述步骤2)所得的12种上游探针和下游探针分别与上述100例样品DNA或RNA一起进行连接酶检测反应(LDR)，95℃30秒，64℃4分钟，进行40个循环；得连接产物。
4)、先制备通用基因芯片，具体内容如下：采用醛基修饰的载玻片做为固相载体，分别向其上固定本发明所选12种病毒对应的3’连接(dA)10NH2的Zip Code，作为通用基因芯片。
然后用具体为互补上游通用引物：5’＞TCATGCTGCTAACGGTCGAG＜3’和下游通用引物5’＞CCGAGATGTACCGCTATCGT＜3’PCR扩增标记连接产物，PCR扩增条件如下：95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，进行30个循环。纯化后经真空浓缩溶于10μl杂交液中，与通用基因芯片50℃杂交2小时，随后分别在0.2×SSC和0.1×SSC中冲洗5分钟；吹干后用芯片扫描仪扫描。
经软件分析，结果如下：在100个样品中，检测出病毒PCV2的有26例，PRRSV有11例，PRV有15例，PEDV有3例，CSFV有7例，PPV有8例，TGEV有2例，其中PCV2和PRRSV混合感染的6例，PCV2和PPV混合感染的1例，PCV2、PRRSV和PPV混合感染的有4例。
实施例2、一种同时检测多种混合感染病毒的方法，分别对80例病猪的样品进行检测，确定样品感染的病毒种类。公知常见有12种猪病毒，分别为猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪流感病毒(SIV)、猪流行性乙型脑炎病毒(JEV)、猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪水泡病病毒(SVDV)、猪水疱性口炎病毒(VSV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)；本发明方法具体依次进行如下步骤：
1)、同实施例1。
2)、同实施例1。
3)、将上述步骤2)所得的12种上游探针和下游探针分别与上述80例样品DNA或RNA一起进行连接酶检测反应(LDR)，95℃30秒，64℃4分钟，进行40个循环；得连接产物。
4)、同实施例1。
经软件分析，结果如下：在80个样品中，检测出病毒PCV2的有27例，PRRSV有14例，CSFV有11例，PRV有9例，PPV有6例，PEDV有5例，SIV有2例，TGEV有1例，其中PCV2和PRRSV混合感染的7例，PCV2和PPV混合感染的1例，PCV2、PRRSV和PPV混合感染的有2例。
为了充分证明本发明方法的优越性，发明人作了如下的对比实验：
1、对照例1：
采用传统PCR为基础的基因芯片方法，分别对100例与实施例1相同的病猪样品进行检测，确定样品感染的病毒种类。公知常见有12种猪病毒，分别为猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪流感病毒(SIV)、猪流行性乙型脑炎病毒(JEV)、猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪水泡病病毒(SVDV)、猪水疱性口炎病毒(VSV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)。猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)的PCR扩增(参见，叶春艳等人，2004年中国兽医科技第30卷第7-10页)，猪圆环病毒2(PCV2)的PCR扩增(参见，Huang等人，2004年，Veterinary Microbiology，第101卷209-214页)，猪瘟病毒(CSFV)的PCR扩增(参见，Li等，2007年Journal of VirologicalMethordst第143卷16-22页)，猪细小病毒(PPV)的PCR扩增(自行设计参见，李小康等人，2007年，中国预防兽医学报，第29卷227-230页)、猪伪狂犬病毒(PRV)的PCR扩增(参见，李小康等人，2007年，中国预防兽医学报，第29卷227-230页)，猪流感病毒(SIV)的PCR扩增(参见，杨焕良等人，2007年，动物医学进展第28卷42-45页)，猪流行性乙型脑炎病毒(JEV)的PCR扩增(参见，崔奕杰等人，2006年，动物医学进展，第27卷第59-62页)，猪口蹄疫病毒(FMDV)的PCR扩增(参见，祁会彩等人，传染性胃肠炎病毒(TGEV)的PCR扩增(陈芳等人，2005年，中国2006年中国动物检疫第23卷24-27)，猪水泡病病毒(SVDV)的PCR扩增(参见，钟金栋等人，2006年中国农学通报第22卷25-27)，猪水疱性口炎病毒(VSV)的PCR扩增(参见，祁会彩等人，2006年中国动物检疫第23卷24-27)，猪兽医学报第25卷第9-12页)，猪流行性腹泻病毒(PEDV)的PCR扩增(陈芳等人，2005年，中国兽医学报第25卷第9-12页)。12种病毒的常规PCR方法检测用引物具体如表2所示。
从NCBI网站下载上述12种病毒的核酸序列，在上述每一种病毒PCR扩增引物区间设计3条不同探针(表3，探针1-3)，共计36条探针，3’连接(dA)10NH2，点制于醛基化修饰的载玻片基质上，然后与10μl PCR扩增标记Cy5的样品50℃杂交2小时，随后分别在0.2×SSC和0.1×SSC中冲洗5分钟，吹干；
杂交后用芯片扫描仪扫描，经软件分析，结果如下：在100个样品中，检测出病毒PCV2的有26例，PRRSV有11例，PRV有15例，PEDV有3例，CSFV有7例，PPV有8例，TGEV有2例，其中PCV2和PRRSV混合感染的6例，PCV2和PPV混合感染的1例，PCV2、PRRSV和PPV混合感染的有4例。
与实施例1比较，对照例1采用传统的PCR为基础的基因芯片方法，上述实施例1的检测结果，与现有技术之PCR方法检测结果符合率100％，但PCR一次只检测一种病毒，检测100个样品、12种病毒需1200次PCR，操作费时长，试剂消耗多，因而对照例1的方法操作费时长(20小时)，试剂消耗多(37100￥)，，而本发明一次能同时检出多种病毒，操作总费时短(6小时)，试剂消耗少(3200￥)，具有明显的优越性。
表2、12种病毒的常规PCR方法检测用引物
| 病毒 | 正向引物(5’-3’) | 反向引物(5’-3’) |
| PRRSV | GGTAAACCTTGTCAAATATGCC | TCGCCCTAATTGAATAGGTG |
| PCV2 | TAGGTTAGGGCTGTGGCCTT | CCGCACCTTCGGATATACT |
| PRV | GCGTGTACTGCGACTGCGTGTT | CCGTAGCAGAGCTCCCG |
| PPV | AAGTTAGAATAGGATGCGAGGAA | ATCTGGCGGTGTTGGAGTT |
| CSFV | AACATGGATGGTGTAACTGGT | TTCTCTATAGTGTTGGTCATTCC |
| SIV | GCGACTACCACTAACCCACTAA | AAGACGATCAAGAATCCACAA |
| JEV | TGGAGAAGCCCACAACGA | GTGTTCAGTCCACTCCTTG |
| SVDV | CATTGGGAGCGGACCAGTTA | GAGCAACTTGCCGTGTGTTG |
| VSV | GTCAAGAGAATCATTGAC | GTTCCGTATCTCAACGA |
| FMDV | ACATCGACCCCGAACCACAC | GCGGAACAGCGCTTTGTC |
| TGEV | TTTGACTTGCAATTGGGGTAG | AAAGCTAGGGACTGGCCATAA |
| PEDV | TTTATTCTGTCACGCCATGT | CCAGATTTACAAACACCTATGTTA |
2、对照例2：
采用随机扩增为基础的基因芯片方法，分别对100例与实施例1相同的病猪样品进行检测，确定样品含有的病毒种类。公知常见有12种猪病毒，分别为猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪流感病毒(SIV)、猪流行性乙型脑炎病毒(JEV)、猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪水泡病病毒(SVDV)、猪水疱性口炎病毒(VSV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)。
从NCBI网站下载上述12种病毒的核酸序列，并且用Cluster W软件对每一种病毒的各个株系的核酸序列进行序列比对，寻找保守区，利用Primer 5.0和DNAstar软件在保守区内设计5条寡核苷酸鉴别探针(表3)，共计60条探针，3’连接(dA)10NH2，点制醛基化修饰的载玻片基质上；
病毒核酸采用Round A B C随机引物扩增、标记(参照，Wang等，2002，Proc Natl Acad Sci第99卷：15687-15692)。A步骤随机引物序列为5′-GTTTCCCAGTAGGTCTCNNNNNNNN-3′，B步骤引物为5
′-GTTTCCCAGTAGGTCTC-3′，C步骤用荧光染料Cy3或Cy5直接掺入标记，具体步骤详见参考文献(Wang等，2002，Proc Natl Acad Sci第99卷：15687-15692)。标记产物纯化后经真空浓缩溶于10μl杂交液中，把杂交混合物小心滴加到制备好的微阵列矩阵上，覆盖杂交用盖玻片，置于杂交舱中，42℃水浴避光杂交6～8h。随后分别在0.2×SSC和0.1×SSC中冲洗5分钟，吹干；
杂交后用芯片扫描仪扫描，经软件分析，结果如下：在100个样品中，检测出病毒PCV2的有22例，PRRSV有9例，PRV有13例，PEDV有2例，CSFV有6例，PPV有6例，TGEV有2例，其中PCV2和PRRSV混合感染的6例，PCV2和PPV混合感染的1例，PCV2、PRRSV和PPV混合感染的有3例。
与实施例1比较，对照例2采用随机扩增为基础的基因芯片方法。虽然随机引物扩增标记法可同时对多种病原生物进行标记，不需要针对每种病原生物设计特异性引物，避免了多重PCR或多次PCR的不足，但由于上述样品扩增引物是随机引物，在扩增时没有特异性，导致扩增效率低，灵敏度不如采用特异引物扩增的传统芯片技术高，而且为弥补个别探针的交叉反应或假阳性每种病毒一般需5-10种探针，实验复杂性增加。上述对照例2的检测结果，病毒检出率低于新型多种混合感染猪病毒核酸扩增方法13.6％。对照例2采用为基础的基因芯片方法，与对照例2比较，实施例1的方法灵敏度既高(16％)，实验又简单。
表3、12种猪病毒检测基因芯片使用的探针
| 病毒 | 探针1 | 探针2 | 探针3 | 探针4 | 探针5 |
| PRV | GACTGCGTGTTCGTGCGCTACTCC | CTCCACCATCCCCAGCTTCAACCC | CCTACGTGGTGGCCTCCGTCGTG | ATCGCCAACCCGCTCGTGCTC | ACGGGGCCATGCACCAGACG |
| TGEV | CCGCTGGCACGCTTGTAGACCTTT | CAATGGTTTGCAGATGCGGTTGTTG | TGGCCTACAATGGTTTGCAGATGCG | AGCGGCGTTGGAGATTGGACTGG | GGCGTGCGGTTATTTGTTTTGTTGC |
| SVDV | TCTGATGGTGG | GGCTCTAACC | CGCCGCAGAAACAGG | TTGTGGTGCCCGCAG | CCGATGAGTC |
| CAACTTCGCCTATT | GCCGCAGAAACA | GCACA | ACGC | ACCGCAAACCCC | |
| VSV | TCGGAATAAACATCGGGAAAGCAGG | CGGCGTACTTCCAGATGGAGTATCG | TTGTATCCTTGAAAGCCCTGGACGG | CCGATTAGGTGGGAGGCTGTTTCA | GACCTTACGGTTGACATCGCCAGAG |
| PEDV | ACAATACTAGGGAGTTGCCTGGTTTCTTC | GGTTTCTTCTACCATTCTAATGACGGCTC | TCTTCTACCATTCTAATGACGGCTCCA | GCCGAACACGATTTCTTCACTTGGA | GTCAGCGGGCTTTACGATTTGGG |
| JEV | TTGGGAGAACAATCCAGCCAGAAAA | CAATGCTCCTTCGGTAGCCCTCAA | TGGGGCAACGGATGTGGATTTT | CTGGAAGCACGCTGGGCAAGG | TGGTGCCTTCAGAACACTCTTTGGG |
| FMDV | GGGCCTGCTGCCTTGTCCAAC | CAACCCTGAATTTGGGCCTGCTG | CCTCGATGAAGTCATCTTCTCCAAGC | TCCGTCCGATGTTCTGGTGTTTG | CCCGCCTGACCTTGACCACTT |
| SIV | ATGGTGCAGGCGATGAGGACAATT | CGAGTGAGCAGGCAGCGGAAGC | TCGTTGTTGCAGCAAGTATCATTGGG | TGAGGGAGGAGTATCGGCAGGAGC | GAGCGAGGACTGCAACGTAGACGG |
| PPV | TTAGCCTTGGAGCCGTGGAGCG | AACTCCAACACCGCCAGATTCAGCA | TCAGTGAAAACTTCGCCAGCGGACA | ATGGCAGCGGGAAACACTTACTCGG | TCGACAGCCTCACAAAACGGCAAGT |
| PCV2 | ACGAGAAGGGCTGGGTTATGGTATGG | TCGGGGAGCAGGGCCAGAA | GGCGGGAGGAGTAGTTTACATAGGGG | TATTGTTGGCGAGGAGGGTAATGAGG | CACATCGAGAAAGCGAAAGGAACTGA |
| PRRSV | ATCGCCCAACAAAACCAGTCCAGA | CCAAATAACAACGGCAAGCAGCAA | TGATGGGCTGGCATTCTTTGGC | CGGCGAATCAGACAACCGAACAA | TAACGGTTCGGAAGAAACTGTCGGTG |
| CSFV | GGCAGTTTACTCCAGGACACGGCTCT | CCGACATCAACGTGGTCACCCA | CGGCCAAGGAGTGCGCTGTG | GCTGGGGAGTGAGACTGCGTTCG | CACAACCTAAGTTACGAGCCGCAATG |
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
SEQ ID No：1
ctcgaccgtt agcagcatga 20
SEQ ID No：2
ccgagatgta ccgctatcgt 20
SEQ ID No：3
tcgccgttgg tctgtatgca 20
SEQ ID No：4
cgttcctaaa gctgagtctg 20
SEQ ID No：5
atgcagcgta ggtatcgact 20
SEQ ID No：6
tcccgaatga caaggcacga 20
SEQ ID No：7
attaactcga ctgccgcgtg 20
SEQ ID No：8
cttcgtggct agtctgtgac 20
SEQ ID No：9
gtcacgtatg gttcgctgct 20
SEQ ID No：10
tgtgataatt tcgacgaggc 20
SEQ ID No：11
aatgctcaca tcgcaggtac 20
SEQ ID No：12
gcactaactg gtctgggtca 20
SEQ ID No：13
actccagtgc caagtacgat 20
SEQ ID No：14
ctgaatcctc caaccgggtt 20
SEQ ID No：15
tttcggcacg cgcgggatca 20
Claims (4)
1.一种同时检测多种混合感染病毒的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)、获取待检测病毒的核酸序列，利用相应软件对每种病毒的各个株系的核酸序列进行序列比对，从而获得每种病毒的保守区；再分别在每种病毒的保守区内设计紧密相连的两条寡核苷酸鉴别探针，即上游鉴别探针和下游鉴别探针，所述上游鉴别探针和下游鉴别探针是一对首尾相连并与各自的靶序列互补的寡聚核苷酸；
2)、设计通用引物以及完全互补的Zip Code和cZip Code，所述通用引物由上游通用引物和下游通用引物组成：
所述Zip Code和通用引物均是根据大小和空间结构设计的彼此相互之间以及与靶序列均无同源性且不形成稳定空间结构的寡聚核苷酸；cZip Code 5′连接下游鉴别探针，上游通用引物连接上游鉴别探针的5′端，组称上游探针；下游通用引物连接cZip Code的3′端，组称下游探针；
3)、将上游探针和下游探针与待检样品靶标核酸一起进行连接酶检测反应，得连接产物；
4)、用互补上游通用引物和下游通用引物扩增并标记连接产物，纯化后与通用基因芯片在50℃杂交2小时；
5)、杂交后用芯片扫描仪扫描，经软件分析获得杂交信号强度，从而得知混合感染病毒情况。
2.根据权利要求1所述的一种同时检测多种混合感染病毒的方法，其特征在于：所述上游通用引物为：5’＞CTCGACCGTTAGCAGCATGA＜3’，所述下游通用引物为：5’＞CCGAGATGTACCGCTATCGT＜3’；所述互补上游通用引物为与上游通用引物互补的序列。
3.根据权利要求1或2所述的一种同时检测多种混合感染病毒的方法，其特征在于：所述Zip Code为以下任意一种：
1)、5’＞TCGCCGTTGGTCTGTATGCA＜3’；
2)、5’＞CGTTCCTAAAGCTGAGTCTG＜3’；
3)、5’＞ATGCAGCGTAGGTATCGACT＜3’；
4)、5’＞TCCCGAATGACAAGGCACGA＜3’；
5)、5’＞ATTAACTCGACTGCCGCGTG＜3’；
6)、5’＞CTTCGTGGCTAGTCTGTGAC＜3’；
7)、5’＞GTCACGTATGGTTCGCTGCT＜3’；
8)、5’＞TGTGATAATTTCGACGAGGC＜3’；
9)、5’＞AATGCTCACATCGCAGGTAC＜3’；
10)、5’＞GCACTAACTGGTCTGGGTCA＜3’；
11)、5’＞ACTCCAGTGCCAAGTACGAT＜3’；
12)、5’＞CTGAATCCTCCAACCGGGTT＜3’；
13)、5’＞TTTCGGCACGCGCGGGATCA＜3’阴性对照，为与上述cZip Code1)～12)无同源性的一段序列；
所述cZip Code为与Zip Code互补的对应序列。
4.根据权利要求3所述的一种同时检测多种混合感染病毒的方法，其特征在于：采用醛基修饰的载玻片做为固相载体，分别向其上固定每种病毒所对应的Zip Code，作为通用基因芯片。
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