CN102676662B

CN102676662B - 沙门氏菌内标逆转录荧光定量快速检测的方法和试剂盒及应用

Info

Publication number: CN102676662B
Application number: CN 201210129384
Authority: CN
Inventors: 史贤明; 杨捷琳; 周敏; 潘良文; 杨柳
Original assignee: Shanghai Jiaotong University; Shanghai Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of PRC
Current assignee: Shanghai Jiaotong University; Shanghai Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of PRC
Priority date: 2012-04-27
Filing date: 2012-04-27
Publication date: 2013-09-11
Anticipated expiration: 2032-04-27
Also published as: CN102676662A

Abstract

本发明公开了一种带有内标的，以沙门氏菌sigD/sigE基因为靶标的逆转录荧光定量PCR快速检测方法，其中包括经三次PCR扩增得到的RNA内标。另外，本发明还提供了相应试剂盒以及应用。本发明可广泛用于实验室研究、食品安全、医药卫生等众多领域，不但能避免假阴性漏检的现象以有效监控PCR扩增，而且沙门氏菌属的检测特异性强，可有效区分死细菌和活细菌，快速，检测灵敏度高，并可以应用于食品中沙门氏菌的高通量筛检。

Description

沙门氏菌内标逆转录荧光定量快速检测的方法和试剂盒及应用

技术领域

本发明属于食品安全领域的核酸检测方法。具体而言，本发明涉及沙门氏菌sigD/sigE基因带内标逆转录荧光定量快速检测的方法和试剂盒以及应用。

背景技术

沙门氏菌(Salmonella spp.)是重要的食源性致病菌之一，主要通过肉类、奶类、蛋类等食品传播、感染人体，引发伤寒、败血症、急性胃肠炎等病症。在世界各国细菌性食物中毒病例中，沙门氏菌引起的食物中毒案例常列榜首或第二位。建立一种行之有效的食源性沙门氏菌的定量检测方法，以提高对该菌的检测速度和准确性，使受污染的食品得到及时处理，在公共卫生、食品卫生和口岸检疫等中都有重要意义。

然而，传统的检测方法耗时、操作繁琐，而基于免疫学原理的产品存在检测限高、特异性不强等问题。尤其是常规的分子生物学检测方法大多以细菌的DNA为模板，无法区分死菌和活菌。而很多研究又表明，细菌中的rRNA和tRNA分子是相当稳定的，与细菌的活性没有直接关系。只有mRNA是微生物在存活状态下产生的一类核酸大分子物质，其表达量的多少和质量的高低(完整性)与细胞的状态密切相关，从mRNA的检测结果中就可以直接获得食品中存活微生物的信息。且mRNA的丰度和活性又与所选择的基因及其在基因内扩增的位置及检测的难易度相关。传统生化检测方法可以区分死菌和活菌，但其耗费时间长；而运用实时荧光定量PCR(real-time PCR，简称RT-PCR)方法，目前还没有有效的方法能消除抑制剂引起的假阴性问题，因此开发有效监测假阴性现象以避免漏检的产品显得十分必要。

为此，本发明人经过长期研究，令人意外地研究出了一种沙门氏菌pipC/sigD/E内标逆转录快速检测的方法，不但能避免假阴性漏检的现象以有效监控PCR扩增，而且沙门氏菌属的检测特异性强，可有效区分死细菌和活细菌，快速，检测灵敏度高，并可以应用于食品中沙门氏菌的高通量筛检。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一在于提供一种沙门氏菌内标逆转录荧光定量快速检测的方法。

本发明要解决的技术问题之二在于提供一种沙门氏菌内标逆转录荧光定量快速检测试剂盒。

本发明要解决的技术问题之三在于提供上述试剂盒在制备用于检测样品中活的沙门氏菌的检测试剂产品中的应用。

具体而言，在第一方面，本发明提供了一种沙门氏菌内标逆转录荧光定量快速检测的方法，其包括如下步骤：

(1)提取样品中的RNA；

(2)制备内标，包括如下步骤：

A.以原壳小球藻的cDNA或GenBank登录号GU269622.1所示的核酸为模板，用引物zds-F：5’-GTTGGTGGGCGTGCCTGTGA-3’(SEQ ID NO.1)和zds-R：5’-AAGTACGGGTCGGCGGGTGT-3’(SEQ ID NO.2)进行第一次PCR扩增，得到初始PCR产物；

B.以初始PCR产物为模板，用引物s45-F/zds-F：5’-TGGCATAAAGGGACAGCACGTTGGTGGGCGTGCCTGTGA-3’(SEQ ID NO.3)和s45-R/zds-R：5’-AGCGGCAAAGATCGTACAGAAGTACGGGTCGGCGGGTGT-3’(SEQ ID NO.4)进行第二次PCR扩增，得到第二次PCR产物；

C.以第二次PCR产物为模板，用引物T7/s45-F：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGATGGCATAAAGGGACAGCAC-3’(SEQ ID NO.5)和S45-R：5’-AGCGGCAAAGATCGTACAG-3’(SEQ IDNO.6)，进行第三次PCR扩增，得到第三次PCR产物；

D.将第三次PCR产物转录成RNA，作为内标，该内标RNA序列如SEQ ID NO.9所示；

(3)将步骤(1)获得的RNA与步骤(2)获得的内标RNA混合，进行逆转录实时荧光定量PCR(reverse-transcriptase real-time PCR)检测。

在本发明中，步骤(1)所述的样品是潜在含有活的沙门氏菌的离体样品，如食品、血液、血液制品、唾液、医疗用品或药品等。由于沙门氏菌是食源性致病菌，因此优选样品来自于食品，如样品是食品，或者样品是食品的细菌平板培养物等。需要指出的是，检测来自于食品的样品，属于食品安全检测领域。

提取RNA以及实时荧光定量PCR(即RT-PCR)检测中所用的试剂和仪器已经为本领域技术人员所掌握，而且目前有大量商品化的试剂和仪器可供选用。例如，在本发明的具体实施方式中，可以使用RNAprep pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒来提取RNA，可以使用PremixEx Taq^TM试剂以及ABI7500荧光定量PCR仪来进行RT-PCR检测。但是，这些试剂不提供RT-PCR的引物。优选在本发明中，RT-PCR的引物为S45-F和S45-R，S45-F的序列为5’-TGGCATAAAGGGACAGCAC-3’(SEQ ID NO.7)，S45-R 的序列为5’-AGCGGCAAAGATCGTACAG-3’(SEQ ID NO.8)。

PCR和RT-PCR的反应过程是本领域技术人员所能掌握的，每个循环一般包括在92-96℃的变性、低温退火和72℃左右的延伸过程，其中最多变的是退火的温度。根据本发明人研究，最优选的RT-PCR的过程为40个循环，其中每个循环为95℃/45s，58℃/45s，72℃/45s。另外，根据本发明人研究，在步骤(2)制备内标中，最优选的第一次、第二次和第三次PCR的退火温度均为60℃，如也可以进行40个循环，其中每个循环为95℃/45s，60℃/45s，72℃/45s。

内标在RT-PCR的反应体系中的含量对RT-PCR检测的结果有一定的影响。根据本发明人研究，最优选的内标在RT-PCR的反应体系中的含量为3fg/μl。

在第二方面，本发明提供了检测试剂盒，其包括由如下方法制成的内标序列及制成该内标的引物序列：

以原壳小球藻的cDNA或GenBank登录号GU269622.1所示的核酸为模板，用引物zds-F5’-GTTGGTGGGCGTGCCTGTGA-3’(SEQ ID NO.1)和zds-R 5’-AAGTACGGGTCGGCGGGTGT-3’(SEQ ID NO.2)进行第一次PCR扩增，得到初始PCR产物；

以初始PCR产物为模板，用引物s45-F/zds-F 5’-TGGCATAAAGGGACAGCACGTTGGTGGGCGTGCCTGTGA-3’(SEQ ID NO.3)和s45-R/zds-R 5’-AGCGGCAAAGATCGTACAGAAGTACGGGTCGGCGGGTGT-3’(SEQ ID NO.4)进行第二次PCR扩增，得到第二次PCR产物。

以第二次PCR产物为模板，用引物T7/s45-F 5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGATGGCATAAAGGGACAGCAC-3’(SEQ ID NO.5)和S45-R 5’-AGCGGCAAAGATCGTACAG-3’(SEQ ID NO.6)，进行第三次PCR扩增，得到第三次PCR产物，以及

将第三次PCR产物转录成RNA，作为内标，该内标RNA序列如SEQ ID NO.9所示。

然而，RNA不容易保存，因此优选检测试剂盒包括制成上述内标的原料，即包括：原壳小球藻的cDNA或GenBank登录号GU269622.1所示的核酸，引物zds-F(SEQ ID NO.1)和zds-R(SEQ ID NO.2)，引物s45-F/zds-F(SEQ ID NO.3)和s45-R/zds-R(SEQ ID NO.4)，引物T7/s45-F(SEQ ID NO.5)和S45-R(SEQ ID NO.6)。另外，优选检测试剂盒还进一步包括PCR试剂和/或体外转录试剂。例如，在本发明的具体实施方式中，体外转录试剂来自T7体外转录试剂盒。

检测试剂盒还可以包括提取RNA和/或RT-PCR检测中所用的试剂。这些试剂可以通过市场渠道购买，如可以将现有的提取RNA和/或RT-PCR检测试剂盒中的试剂进行分装。优选检测试剂盒还包括引物S45-F和S45-R，S45-F的序列为5’-TGGCATAAAGGGACAGCAC-3’(SEQID NO.7)，S45-R的序列为5’-AGCGGCAAAGATCGTACAG-3’(SEQ ID NO.8)。

在第三方面，本发明提供了本发明第二方面的检测试剂盒在制备用于检测样品中活的沙门氏菌的方法的检测试剂产品中的应用。检测试剂产品包括检测试剂盒、检测试剂等，进一步地，还可以包括记载检测样品中活的沙门氏菌的方法的说明书。

优选该应用用于本发明第一方面的方法，即本发明提供了本发明第二方面的检测试剂盒在制备用于本发明第一方面的方法的检测试剂产品中的应用。

本发明取得的有益效果在于：有效避免了沙门氏菌属检测中的假阴性漏检，有效监控RT-PCR扩增过程；沙门氏菌属的检测特异性强，对沙门氏菌属各菌种的检测适应性广；可有效区分死和活的沙门氏菌，使得检测结果更能满足实际食品安全检测的需求；检测方法快速、灵敏度高，适用于高通量筛选。

为了便于理解，以下将通过具体的附图、实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。

附图说明

图1显示了实施例1.3内标制备过程中各步骤的PCR产物的电泳图谱；其中，图1(A)显示了第一次PCT产物的电泳图谱；图1(B)显示了第二次PCT产物的电泳图谱；图1(C)显示了第三次PCT产物的电泳图谱。

图2显示了实施例1.5未加以及加入不同内标量的RT-PCR图谱及其融解曲线分析图谱。

具体实施方式

以下本文将通过具体的实施例来描述发明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子可隆实验指南》(第三版)(Cold Spring Harbor laboratory Press)、《细胞实验指南》(科学出版社，北京，中国，2001年)、《RNA实验技术手册》(科学出版社，北京，中国，2004年)、《免疫检测技术》(科学出版社，北京，中国，1991)等实验手册以及本文所引用的参考文献中所列方法来实施。

1.1主要试剂和仪器

β-巯基乙醇，2.46mol/l，异硫氰酸胍抽提缓冲液，购自上海柏汇申生物科技有限公司；蛋白酶K，20mg/ml，天根生物科技(北京)有限公司；异丙醇(Cat.No.80109218)、乙醇(Cat.No.10009218)、三氯甲烷(Cat.No.10006818)购自上海国药集团；RNAprep pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒，购自天根生物公司；胶回收试剂盒

SV Gel and PCR Clean-UpSystem(Promega Cat.No.A9281)；

RT-PCR Kit(Perfect Real Time)(TAKARA公司)琼脂糖试剂盒反转录试剂盒，TaKaRa PrimeScript^TM RT reagent Kit(Cat.No.DRR037S)及实时荧光PCR试剂盒Premix Ex Taq^TM(Cat.No.DRR039S)，购自大连宝生物工程有限公司；DNA凝胶回收试剂盒，购自美国Axygen公司；紫外核酸与蛋白质分析仪，购自美国Beckman公司；T7体外转录试剂盒(北京天恩泽基因科技有限公司，Cat.No.91106A-50)；ABI7500荧光定量PCR仪，购自ABI公司。

1.2菌株以及RNA的抽提

菌株均可以购自于中国科学院微生物研究所和中国医学微生物菌种保藏中心以及美国典型微生物保藏中心，菌株编号如表1所示。培养方法可以按照上述菌株提供单位推荐的方法进行，参照厂商说明，用RNAprep pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，Cat.No.DP430)来提取。

表1沙门氏菌及非沙门氏菌标准菌株菌株以及用本发明的PCR方法检测的结果

*注：+表示PCR扩增结果为阳性；-表示PCR扩增结果为阴性

1.3内标的制备

以原壳小球藻的cDNA或人工合成的核酸GenBank登录号GU269622.1为模板，进行第一次PCR扩增，得到初始PCR产物(电泳检测图谱如图1(A)所示)。其中，PCR退火温度为60℃，所用引物为zds-F 5’-GTTGGTGGGCGTGCCTGTGA-3’(SEQ ID NO.1)，zds-R 5’-AAGTACGGGTCGGCGGGTGT-3’(SEQ ID NO.2)。

以初始PCR产物为模板，进行第二次PCR扩增，得到第二次PCR产物(电泳检测图谱如图1(B)所示)。其中，PCR退火温度为60℃，所用引物为s45-F/zds-F 5’-TGGCATAAAGGGACAGCACGTTGGTGGGCGTGCCTGTGA-3’(SEQ ID NO.3)，s45-R/zds-R 5’-AGCGGCAAAGATCGTACAGAAGTACGGGTCGGCGGG TGT-3’(SEQ ID NO.4)。

以第二次PCR产物为模板，进行第三次PCR扩增，得到第三次PCR产物(电泳检测图谱如图1(C)所示)。其中，PCR退火温度为60℃，所用引物为T7/s45-F 5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGATGGCATAAAGGGACAG CAC-3’(SEQ ID NO.5)，S45-R 5’-AGCGGCAAAGATCGTACAG-3’(SEQ ID NO.6)。

第三次PCR产物使用Promega Cat.No.A9281试剂盒纯化回收，测定回收的产物浓度为578ug/ml。取50ng作为转录模板，根据T7体外转录试剂盒的产品说明书进行操作，转录成RNA，测定转录后RNA的浓度为297ug/ml，作为内标，该内标RNA序列如SEQ ID NO.9所示。1.4实时荧光定量PCR(RT-PCR)反应(即采用本发明试剂盒进行检测)

PCR反应体系(本文中PCR体系均参照此)：Premix Ex Taq^TM，10.8μl；引物S45-F(5’TGGCATAAAGGGACAGCAC-3’，SEQ ID NO.7)(10μmol/l)，0.4μl；引物S45-R(5’AGCGGCAAAGATCGTACAG-3’，SEQ ID NO.8)(10μmol/l)，0.4μl；ROX荧光校正试剂(50×)，0.4μl；cDNA，2.0μl；超纯水，6.0μl；总体积，20μl；加入5.0μL模板(即，上述1.2各自抽提的菌株RNA，并添加入上述1.3制得的内标)。在ABI7500荧光定量PCR仪上进行PCR扩增和荧光检测，扩增条件为：40个循环：95℃/45s，58℃/45s，72℃/45s。在本实施例中，本发明含内标的沙门氏菌实时荧光定量PCR检测试剂盒包含：上述1.2各自抽提的菌株RNA，上述1.3制得的内标(或者制成上述内标的原料，即包括：原壳小球藻的cDNA或GenBank登录号GU269622.1所示的核酸，引物zds-F(SEQ ID NO.1)和zds-R(SEQ ID NO.2)，引物s45-F/zds-F(SEQ ID NO.3)和s45-R/zds-R(SEQ ID NO.4)，引物T7/s45-F(SEQ ID NO.5)和S45-R(SEQ ID NO.6))，以及引物S45-F(SEQ ID NO.7)和引物S45-R(SEQ ID NO.8)。

1.5内标添加量的选择

首先进行预试验，即将已知拷贝数的扩增内标标准品作5倍梯度稀释后进行PCR检测，将出现肉眼可见扩增条带的最后3个浓度作为进一步考察的内标添加量。然后，将沙门氏菌ATCC14028的RNA 10倍梯度稀释，稀释为4个不同的浓度。每反应体系中内标加入量分别为24fg/μl，12fg/μl，6fg/μl，3fg/μl。比较加入内标前后沙门氏菌检测的特异性和灵敏度是否改变，以判断内标最适加入量。

定量PCR仪的检测输出图谱如图2所示。结果表明，添加24fg/μl，12fg/μl内标时体系检测限与未添加内标比高约1/3个数量级；添加6fg/μl的内标时，扩增曲线重合性较差；加入3fg/μl的内标不会抑制沙门氏菌的扩增，且融解曲线分析时，靶基因和内标的Tm值可以区分开(PCR测定靶基因的Tm值为83℃，内标的Tm值为88.9℃)。因此，设定3fg/μl为体系中的内标添加量。

1.6方法特异性

将表1所列菌株培养后提取总RNA，进行1.4节所述的RT-PCR法，其中内标的添加量为1.5节确定的量。结果如表1所示，所有沙门氏菌菌株均能得出阳性的检测结果，即融解曲线分析时，阳性扩增产物的Tm值在83.0℃左右，内标的Tm值在88.9℃左右，两者的Tm值相差达5℃以上；而所有非沙门氏菌菌株检测结果均为阴性，仅能扩增出内标片段，即融解曲线分析时，仅在88.9℃左右有融解曲线峰。

1.7方法灵敏度

沙门氏菌ATCC14028在LB平板上划线后，挑取单克隆接种于1ml LB液体培养基培养18～24小时，培养物10倍梯度稀释，每个稀释梯度取1ml抽提总RNA，逆转录后1.4节所述的RT-PCR法，其中内标的添加量为1.5节确定的量。另各取1ml进行平板计数。

当沙门氏菌纯培养物稀释后得到的平板计数浓度为10²CFU/mL时，PCR检测的Ct值为33.4；而浓度为10CFU/mL时，Ct值为36.8，超越仪器分辨极限，即检测限为10²CFU/mL。

1.8灭活细菌的检测

沙门氏菌ATCC14028、ATCC9150挑取单克隆接种于LB液体培养基培养18～24小时，培养物经121℃高压灭菌，冷却后取1mL用于总RNA抽提，逆转录后进行实时荧光定量PCR检测，另取1mL涂布平板，确认细菌是否存活。

PCR检测结果与平板培养结果一致，均未检出，但是PCR检测的速度较之快得多。

Claims

1.一种沙门氏菌内标逆转录荧光定量快速检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）提取样品中的RNA，所述样品来自于食品；

（2）制备内标，包括如下步骤：

A．以原壳小球藻的cDNA或GenBank登录号GU269622.1所示的核酸为模板，用引物zds-F：5’-GTTGGTGGGCGTGCCTGTGA-3’（SEQ ID NO.1）和zds-R：5’-AAGTACGGGTCGGCGGGTGT-3’（SEQ ID NO.2）进行第一次PCR扩增，得到初始PCR产物；

B．以初始PCR产物为模板，用引物s45-F/zds-F：5’-TGGCATAAAGGGACAGCACGTTGGTGGGCGTGCCTGTGA-3’（SEQ ID NO.3）和s45-R/zds-R：5’-AGCGGCAAAGATCGTACAGAAGTACGGGTCGGCGGGTGT-3’（SEQ ID NO.4）进行第二次PCR扩增，得到第二次PCR产物；

C．以第二次PCR产物为模板，用引物T7/s45-F：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGATGGCATAAAGGGACAGCAC-3’（SEQ ID NO.5）和S45-R：5’-AGCGGCAAAGATCGTACAG-3’（SEQID NO.6），进行第三次PCR扩增，得到第三次PCR产物；

D．将第三次PCR产物转录成RNA，作为内标，该内标RNA序列如SEQ ID NO.9所示；

（3）将步骤（1）获得的RNA与步骤（2）获得的内标RNA混合，进行逆转录实时荧光定量PCR检测；步骤（3）中，实时荧光定量PCR的引物为S45-F和S45-R，S45-F的序列为5’-TGGCATAAAGGGACAGCAC-3’（SEQ ID NO.7），S45-R的序列为5’-AGCGGCAAAGATCGTACAG-3’（SEQ ID NO.8），所述内标在实时荧光定量PCR的反应体系中的含量为3fg/μl。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，实时荧光定量PCR的条件为95℃/45s,58℃/45s,72℃/45s，40个循环。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，第一次、第二次和第三次PCR扩增的退火温度均为60℃。

4.一种含内标的沙门氏菌实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括由如下方法制成的内标序列及制成该内标的引物序列：

以原壳小球藻的cDNA或GenBank登录号GU269622.1所示的核酸为模板，用引物zds-F：5’-GTTGGTGGGCGTGCCTGTGA-3’（SEQ ID NO.1）和zds-R：5’-AAGTACGGGTCGGCGGGTGT-3’（SEQ ID NO.2）进行第一次PCR扩增，得到初始PCR产物；

以初始PCR产物为模板，用引物s45-F/zds-F：5’-TGGCATAAAGGGACAGCACGTTGGTGGGCGTGCCTGTGA-3’（SEQ ID NO.3）和s45-R/zds-R：5’-AGCGGCAAAGATCGTACAGAAGTACGGGTCGGCGGGTGT-3’（SEQ ID NO.4）进行第二次PCR扩增，得到第二次PCR产物；

以第二次PCR产物为模板，用引物T7/s45-F：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGATGGCATAAAGGGACAGCAC-3’（SEQ ID NO.5）和S45-R：5’-AGCGGCAAAGATCGTACAG-3’（SEQ ID NO.6），进行第三次PCR扩增，得到第三次PCR产物，以及

将第三次PCR产物转录成RNA，作为内标，该内标RNA序列如SEQ ID NO.9所示，所述内标在实时荧光定量PCR的反应体系中的含量为3fg/μl；

还包括实时荧光定量PCR的引物S45-F和S45-R，S45-F的序列为5’-TGGCATAAAGGGACAGCAC-3’（SEQ ID NO.7），S45-R的序列为5’-AGCGGCAAAGATCGTACAG-3’（SEQ ID NO.8）。

5.如权利要求4所述的检测试剂盒在制备用于检测样品中活的沙门氏菌的检测试剂产品中的应用，所述样品来自于食品。