CN112094792A - 一种布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株及其构建方法和应用 - Google Patents

一种布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。提供的eryA基因缺失株相较于布鲁氏菌野生株缺失了全部eryA基因，当用作布鲁氏菌疫苗株时，可以通过检测该eryA基因来区分布鲁氏菌野生株和eryA基因缺失株，进而区分布鲁氏菌自然感染和人工免疫，实现对布鲁氏菌病进行有效净化。提供的eryA基因缺失株的构建方法中采用PCR鉴定和单菌落测序验证，可以获得纯的eryA基因缺失的布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株，结果可靠。

Description

一种布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株及其构建方法和应用。
背景技术
布鲁氏菌病是由布鲁氏菌(B.melitensis)引起的一种人兽共患传染病。布鲁氏菌感染家畜可引起母畜流产，也可引起其它症状(如子宫炎、睾丸炎和乳腺炎)，人感染该病菌后关节肿大，出现马耳他热症状且不易恢复。布鲁氏菌的主要宿主为羊、牛、猪等。
布鲁氏菌Rev.1疫苗(B.melitensis Rev.1 vaccine)已被证实对山羊具有良好的保护作用，但该疫苗不能通过常规血清学检测和诊断方法来区分自然感染(布鲁氏菌野生株)和人工免疫(布鲁氏菌疫苗株)，因而不能有效对布鲁氏菌病进行净化。
发明内容
针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明的一个方面提供一种布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株，其相较于布鲁氏菌Rev.1完全缺失了eryA基因，且能够稳定连续传代。
本发明另一方面提供了上述的布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株的构建方法，其包括以下步骤：
1)PCR扩增获得eryA基因的上下游同源臂，分别命名为：eryA-1和eryA-2；
2)PCR扩增获得自杀基因SacB；
3)将步骤1)获得的eryA-1和eryA-2以及步骤2)获得的自杀基因SacB顺序插入pBK-CMV质粒中，获得自杀质粒pBK-CMV-eryA-SacB，命名为pBK-ΔeryA-SacB；
4)将步骤3)获得的自杀质粒pBK-ΔeryA-SacB电转化至布鲁氏菌Rev.1感受态细胞中，筛选获得布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株。
上述方法中，步骤1)中用于PCR扩增获得eryA基因的上游同源臂的上下游引物核苷酸序列分别为：SEQ ID NO:1所示的eryA-1-F和SEQ ID NO:2所示的eryA-1-R，用于PCR扩增获得eryA基因的下游同源臂的上下游引物的核苷酸序列分别为：SEQ ID NO:3所示的eryA-2-F和SEQ ID NO:3所示的eryA-2-R。
上述方法中，步骤2)中用于PCR扩增获得自杀基因SacB的上下游引物的核苷酸序列分别为：SEQ ID NO:5所示的SacB-F和SEQ ID NO:6所示的SacB-F。
上述方法中，步骤4)中所述筛选获得布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株的具体操作步骤为：
41)将经电转化后的布鲁氏菌Rev.1菌液在含有卡那霉素的培养基上培养；
42)挑取培养基上形成的单菌落进行基因组提取和PCR扩增；
43)选取单条带PCR扩增产物对应的单菌落进行单菌落测序；
44)若单菌落测序结果表现出完全缺失了eryA基因，则以该单菌落菌株作为布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株；
45)若单菌落测序结果表现出含有未缺失eryA基因的布鲁氏菌Rev.1野生株，则将该单菌落在含卡那霉素的培养基上继续培养；
46)重复步骤42)-45)，直至获得布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株。
上述方法中，步骤42)中用于PCR扩增的上下游引物的核苷酸序列分别为：SEQ IDNO:7所示的eryA-F和SEQ ID NO:8所示的eryA-R。
上述的布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株在制备布鲁氏菌Rev.1疫苗中的应用也属于本发明的内容。
上述的布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株在区分布鲁氏菌野生株和疫苗株中的应用也属于本发明的内容。
基于以上技术方案提供的布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株相较于布鲁氏菌野生株缺失了全部eryA基因，并且该eryA基因缺失株的生长特性和生理特性均与布鲁氏菌野生株一致，因此当将该布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株用作布鲁氏菌疫苗株时，可以通过PCR检测该eryA基因的方法来区分布鲁氏菌野生株和布鲁氏菌eryA基因缺失株，因而可以区分布鲁氏菌自然感染和人工免疫，进而可以有效对布鲁氏菌病进行净化。另外，在布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株疫苗生产过程中，也可以用于净化原料，避免布鲁氏菌野生株的干扰。本发明还提供了该布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株的构建方法，其通过同源重组首先构建eryA基因缺失质粒，随后经电转化导入布鲁氏菌Rev.1感受态细胞中筛选并鉴定获得。其中筛选过程中采用PCR鉴定(PCR产物凝胶电泳和PCR产物测序)和单菌落测序，共同确定构建获得了纯的eryA基因缺失的布鲁氏菌Rev.1的缺失株，该方法结果可靠。
附图说明
图1为eryA基因的上下同源臂的PCR产物的凝胶电泳图像；
图2为SacB基因和eryA基因的PCR产物的凝胶电泳图像；
图3为自杀质粒酶切鉴定SacB基因的凝胶电泳图像；
图4为自杀质粒酶切鉴定eryA基因上下臂的凝胶电泳图像；
图5为自杀质粒功能验证的结果；
图6为布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株和原布鲁氏菌Rev.1的PCR产物的凝胶电泳图，用来筛选布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株；
图7为S19、Rev.1及Rev.1-ΔeryA测序后的序列比对结果；
图8为布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株的结晶紫染色图像；
图9为布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株连续传15代后的PCR产物的凝胶电泳图像；
图10为布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株与其他布鲁氏菌菌株的PCR产物的凝胶电泳图像。
具体实施方式
本发明旨在构建一种布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株，以用于作为布鲁氏菌Rev.1疫苗株时区分布鲁氏菌野生株和疫苗株，可以实现对布鲁氏菌病的有效净化。
通过以下具体实施方式详细说明本发明。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》Sambrook，J.，Russell，DavidW.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
本发明提及的所有引物用已有技术合成。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但不应作为对本发明内容的限制。
以下实施例中以羊种布鲁氏菌Rev.1为例，具体描述羊种羊种布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株的构建方法和该eryA基因缺失株的应用。实施例中涉及以下材料和仪器：
质粒pBK-CMV：购自北京华越洋生物公司，该质粒为卡那霉素抗性；
质粒pMD-19T：购自宝生物工程(大连)有限公司；
质粒pre112：购自Addgene公司，作为PCR扩增自杀基因SacB的模板；
羊种布鲁氏菌Rev.1菌株：由金宇保灵生物药品有限公司提供，购自法国诗华动物保健公司；
液体TSB-YE培养基(TSB)：购自美国BD公司，其pH为7.2；
限制性内切酶购自kpnI、XbaI、PstI、HindIII及XhoI均购自NEB公司；质粒小提取试剂盒以及琼脂糖凝胶回收试剂盒购自Thermo fisher scientific公司；基因组提取试剂盒购自QIAGEN公司；高保真酶GXL购自宝生物工程(大连)有限公司；硫堇及碱性品红购自索莱宝公司。
实施例1：布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株的构建
该实施例旨在通过基因工程技术构建布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株，具体包括以下步骤：
1.1、PCR扩增获得eryA基因的上下游同源臂以及自杀基因SacB
以羊种布鲁氏菌Rev.1菌株的基因组(通过基因组提取试剂盒提取获得)为模板，利用高保真酶(GXL)以及下表1所列的引物分别对eryA基因及其上下游同源臂(分别命名为eryA-l和eryA-2)进行PCR扩增，获得eryA基因、eryA基因的上游同源臂(eryA-l)和eryA基因的下游同源臂(eryA-2)的PCR扩增产物。以质粒pre112为模板，采用下表1所列引物扩增获得自杀基因SacB。其中PCR扩增均采用25μL反应体系：Mix 12.5μL、ddH2O 9.5μL、上游引物1μL、下游引物1μL、DNA模板1μL。反应条件为：95℃变性3min；94℃变性45s，35个循环，55℃退火45s，72℃延伸2min，最后72℃延伸10min。如图1所示，为eryA基因的上下游同源臂的PCR扩增产物的凝胶电泳图像，其中泳道1和2分别为eryA-1和eryA-2。如图2所示，为eryA基因和SacB的PCR扩增产物的凝胶电泳图像，其中泳道1和2分别表示SacB和eryA基因，各片段大小和目的片段大小一致。
表1：PCR扩增引物
Figure BDA0002677600530000041
1.2、将eryA-l和eryA-2分别插入pMD-19T中
分别将eryA-l和eryA-2的PCR扩增产物用ThermoFisher胶回收试剂盒进行胶回收后，在胶回收的产物中加入2μL的Taq Buffer、3μL dNTP及1μL的Taq酶(试剂盒中提供)，后在PCR仪中72℃延伸10～20min加A尾，对该加A尾的PCR产物进行胶回收，后用T4连接酶16℃过夜连接，后转化到DH5a感受态中，挑菌进行菌落PCR及测序鉴定，后进行摇菌提取质粒，最终分别获得质粒pMD-19T-eryA-l和pMD-19T-eryA-2。
1.3、构建自杀质粒
用限制性内切酶kpnI和XbaI分别对pMD-19T-eryA-l及pBK-CMV质粒进行双酶切并胶回收后用T4连接酶在16℃的金属浴中过夜连接后转化到DH5a感受态，进行挑菌摇菌及质粒的提取后进行酶切鉴定，将所得携带有eryA-l的质粒命名为eryA-l-pBK-CMV。随后对该质粒eryA-l-pBK-CMV及pMD-19T-eryA-2质粒分别用XhoI和HindIII进行双酶切胶回收后用T4连接酶在16℃的金属浴中过夜连接后转化到DH5a感受态，进行挑菌摇菌及质粒的提取后进行酶切鉴定，获得携带eryA-l和eryA-2的质粒，命名为pBK-CMV-eryA。随后对该质粒pBK-CMV-eryA和自杀基因SacB分别用HindIII和PstI进行双酶切胶回收后用T4连接酶在16℃的金属浴中过夜连接后转化到DH5a感受态，进行挑菌摇菌及质粒的提取后进行酶切鉴定，获得携带有eryA-l、eryA-2和SacB的质粒即为自杀质粒pBK-CMV-eryA-ScaB，命名为pBK-ΔeryA-SacB。以HindIII和pstI限制性内切酶对该质粒pBK-ΔeryA-SacB进行酶切鉴定sacB，通过琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示，其中泳道1-4分别为SacB的菌液PCR结果，其大小与预期大小一致。以KpnI和HindIII限制性内切酶对该质粒pBK-ΔeryA-SacB进行酶切鉴定eryA上臂和eryA下臂，结果如图4所示，其中泳道1和泳道2均表示eryA上臂和eryA下臂总长，约1733bp，与预期大小一致。
自杀质粒pBK-ΔeryA-SacB的验证：由于SacB基因编码的果糖蔗糖酶能将蔗糖水解为果糖并生成相对分子质量较大的果聚糖，其在G-细菌周质空间(极少数G+细菌的假周质空间结构)累积，能导致细胞停止生长或死亡。因此在该验证步骤中将构建好的质粒pBK-ΔeryA-SacB转化DH5a感受态细胞后涂于卡那霉素抗性平板培养，获得单菌落。随后将单菌落分别接种在无蔗糖的LB培养基(卡那霉素抗性)和含5％以上的蔗糖的LB培养基(卡那霉素抗性)中4h，观察两种培养基的变化。如图5所示，其中1号管为无蔗糖LB培养基，出现浑浊现象，2号管为含5％以上的蔗糖的LB培养基，培养液澄清，未发现明显变化。由此可见该试验验证了自杀质粒能在5％的蔗糖作用下对革兰氏阴性菌起到抑制，其能成功被蔗糖诱导使细菌细胞停止生长或死亡。
1.4、布鲁氏菌Rev.1感受态细胞的制备
取羊种布鲁氏菌Rev.l菌株划线培养于TSA平板上，37℃培养48h后用接种环挑取单个光滑型菌落接种于10mL液体TSB的三角烧杯进行扩增培养。37℃、250r条件下培养，保证足够的通气。培养48h后，待OD600nm约为0.4～0.6时收获细菌。5000g离心10min，弃上清，用5mL 10％甘油水溶液重悬，轻吹分散后，加入5mL 10％甘油水溶液重悬并离心。重复三次后最后将菌液用2.5mL 10％的预冷甘油溶液重悬，并100μL/管分装，获得布鲁氏菌Rev.1感受态细胞。分装后的感受态细胞置于-80℃保存备用。
1.5、构建布鲁氏菌Rev.l的eryA基因缺失株及其筛选和鉴定
取10μg步骤1.3获得的自杀质粒pBK-ΔeryA-SacB加入置于冰上的布鲁氏菌Rev.1感受态细胞中冰浴30min后移入2mm的电击杯中，以E＝2.5KV/cm电击，电击后立即将电击杯放入冰上1min然后将37℃预热的1mL TSB培养基或SOC液体培养基(宝生物工程(大连)有限公司)加入到电击杯中混匀，取出放入EP管中，37℃摇床培养24h后8000r离心2min并从上清中弃去部分液体，剩余80～100μL的液体与菌体混匀涂于50mg/mL的卡那霉素抗性平板上培养，96h后观察结果。
挑取卡那霉素抗性平板上的单菌落置于TSB液体培养基中培养48h，取菌液进行梯度稀释后选择合适的稀释梯度涂于5％的蔗糖平板96h后，从该平板上挑取单菌落，摇菌后进行基因组的提取，以该提取的基因组为模板，利用上表1所列的引物eryA-F和eryA-R进行PCR扩增鉴定，并以原始布鲁氏菌Rev.1菌株基因组作为对照，对两者的PCR产物片段大小和测序结果进行比对。
PCR产物的凝胶电泳结果如图6所示，其中泳道1-10表示以来源于平板上的单菌落的基因组为模板的PCR产物，泳道11表示以来源于原始布鲁氏菌Rev.1菌株的基因组为模板的PCR产物，可见通过PCR检测发现较原菌株的PCR产物(泳道11)，泳道1、4-7的PCR产物大小明显小于原毒株，表明其可能缺失eryA基因。经PCR产物测序后，确定这些单条带的PCR产物确实完全缺失eryA基因；2、3、9泳道的结果显示均有两条条带，原因可能是用于PCR扩增的基因组模板中可能存在布鲁氏菌野生株基因组和布鲁氏菌eryA基因缺失株基因组(经测序鉴定确实如此)，因此在筛选布鲁氏菌eryA基因缺失株时，应选择经PCR鉴定后在凝胶电泳图像上只显示单条带的单菌落。
然而，当用于PCR扩增的基因组中同时含有布鲁氏菌野生株基因组和布鲁氏菌eryA基因缺失株基因组，并且野生株基因组的含量较低时，可能会由于琼脂糖凝胶的分辨率不高导致以野生株基因组为模板的PCR产物条带不清晰或没有显示，此时在凝胶电泳图像上也会出现单条带，胶回收纯化PCR产物时就会只回收以布鲁氏菌eryA基因缺失株基因组为模板的PCR产物而忽略了以布鲁氏菌野生株基因组为模板的PCR产物，造成获得的布鲁氏菌eryA基因缺失株不纯，这对后续鉴别布鲁氏菌疫苗株和野生株以及制备布鲁氏菌eryA基因缺失株疫苗就会产生影响，因此就不能仅利用PCR产物凝胶电泳和PCR产物测序的结果作为鉴定获得布鲁氏菌eryA基因缺失株的标准，还必须通过单菌落测序来验证确实获得了纯的布鲁氏菌eryA基因缺失株。如果单菌落测序结果证实相对于布鲁氏菌Rev.1野生株确实缺失了eryA基因，则将该单菌落菌株作为纯的布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株，如果单菌落测序结果证实在单菌落中存在布鲁氏菌Rev.1野生株和布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株，则需要对该单菌落进一步纯化以筛选出纯的布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株。其中纯化的方法为挑取单菌落再次置于含有卡那霉素的布鲁氏菌固体培养基上培养96h，从该培养基上挑取单菌落，摇菌后进行基因组的提取，以该提取的基因组为模板，按照以上步骤进行PCR鉴定和单菌落测序，直至获得纯的布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株。
对图6中泳道4基因组模板来源的单菌落基因组进行测序(奥维森基因科技(天津)有限公司)，并与布鲁氏菌Rev.1野生株基因组和布鲁氏菌减毒株S19(金宇保灵生物药品有限公司保存，该减毒株S19因缺乏赤藓糖醇的702bp使其成为不能利用赤藓糖醇的菌株)基因组进行比对，比对结果如图7所示，证实了泳道4基因组模板来源的单菌落基因组中确实完全缺失了eryA基因，该基因的缺失会影响整个赤藓糖醇基因的转录表达，因此使其也不能利用赤藓糖醇。
以上结果表明，该实施例获得了纯的布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株，命名为Rev.1-ΔeryA。
1.6、布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株的传代稳定性鉴定
将构建好的布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株Rev.1-ΔeryA在含5％马血清的TSA固体培养基(BD商品化的粉末配置)上进行连续传代，每代都进行结晶紫染色，观察其是否会由光滑型变成粗糙型。并且对该基因缺失株每五代进行PCR鉴定(引物eryA-F和eryA-R)，验证其是否能稳定传代(以原布鲁氏菌Rev.1菌株作为对照)。并在培养基上传代至15代后对单菌落进行摇菌以提取基因组进行单菌测序(奥维森基因科技(天津)有限公司)，确定连续传代15代后eryA基因是否发生回复突变，并且确定单菌落是否仍为纯的布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株菌落。
结果显示，将构建的布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株Rev.1-ΔeryA在含5％马血清的TSA固体培养基上连续传代至15代，未发现其由光滑型向粗糙型的变异结果，如图8所示，为布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株在含5％马血清的TSA固体培养基上连续传代至15代时的结晶紫染色结果，可见传代15代后的布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株仍为光滑型，且不被着色。如图9所示，对传代15代的单菌落基因组以及原布鲁氏菌Rev.1的基因组进行PCR的产物的凝胶电泳图像，其中泳道1表示布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株(250bp左右)，泳道2表示原布鲁氏菌Rev.1(2000bp左右)，可见连续传代15代的布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株仍能维持eryA基因缺失状态，未发生回复突变。并且该传代至15代的基因缺失株的单菌落测序结果也表明eryA基因依然成功缺失，且自杀质粒也存在于该基因缺失株中，并且该单菌落仍为纯的布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株菌落，表明构建的布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株Rev.1-ΔeryA能够稳定连续传代。
实施例2：布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株的生理生化特性和生长特性鉴定
该实施例旨在对上述实施例1构建的布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株(Rev.1-ΔeryA)的生理生化特性和生长特性进行鉴定，并与原布鲁氏菌Rev.1(Rev.1)野生株、布鲁氏菌A19(疫苗株)、S19(疫苗株，相对于A19缺失720bp片段)、S2(疫苗株)(金宇保灵生物药品有限公司保存)的特性进行比较，具体包括以下步骤：
2.1、形态及生化特性
将布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株与其他布鲁氏菌菌株(Rev.1、A19、S19、S2)分别进行革兰氏染色及柯氏法染色后进行观察，并配置含醋酸铅的斜面试管培养基，用接种环接种两者于培养基中，后观察结果是否出现黑褐色沉淀，若出现沉淀则产生硫化氢。
形态及生化特性实验结果表明，Rev.1-ΔeryA为球杆状，单个散在，大小约为0.3～0.6μm，革兰氏染色阴性，柯氏法染色为红色。硫化氢试验为弱阳性，结果如下表2所示。
2.2、生长特性
在TSA培养基(pH值6.4～6.8的胰蛋白胨大豆琼脂)或在TSA培养基中分别配置链霉素(2.5μg/mL)、硫堇(20μg/mL)及碱性复红(20μg/mL)验证布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株是否能在相应的培养基中生长。
生长特性结果表明：该布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株在TSA培养基上生长良好。该基因缺失株为需氧菌，最适培养温度为37℃；能够在含有链霉素(2.5μg/mL)的适宜培养基中生长；适宜培养基中加入硫堇20μg/mL或碱性复红20μg/mL，均会抑制其生长。结果如下表2所示。
2.3、血清学特性
通过该实验验证布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株血清是否有与M因子血清发生凝聚、而与A及R因子血清不发生凝集。结果如下表2所示。
表2：生理生化特性和生长特性鉴定结果
Figure BDA0002677600530000081
由上表2结果可知，Rev.1-ΔeryA菌株与布鲁氏菌Rev.1野生株在生理生化特性和生长特性方面均相同，并且能够稳定连续传代，因此可以和布鲁氏菌Rev.1野生株一样用于制备疫苗，进而可以通过对该Rev.1-ΔeryA菌株的检测区分疫苗株和野生株，实现对布鲁氏菌病的有效净化。同时还可以通过对该Rev.1-ΔeryA菌株的检测区分布鲁氏菌eryA缺失株疫苗株和其他的疫苗株，例如布鲁氏菌A19、S19和S2等疫苗株。
实施例3：布鲁氏菌野生株和布鲁氏菌Rev.1-ΔeryA疫苗株的区别方法建立
eryA为布鲁氏菌的保守基因，经序列比对各菌株之间该基因的同源性高达99％，因此，该基因的缺失株疫苗可以用于有效区分布鲁氏菌野生株和疫苗株，具体包括以下步骤：
分别以布鲁氏菌S2、A19、S19、M5、M28、Rev.1(均由金宇保灵生物药品有限公司保存)及Rev.1-ΔeryA的基因组(利用基因组提取试剂盒提取获得)为模板，用上表1中所列eryA-F和eryA-R引物进行PCR扩增，反应体系为：Mix 12.5μL、ddH2O 9.5μL、上游引物(eryA-F)1μL、下游引物(eryA-R)1μL、DNA模板1μL。反应条件为：95℃变性3min；94℃变性45s，35个循环，55℃退火45s，72℃延伸2min，最后72℃延伸10min。
PCR产物的凝胶电泳结果如图10所示，其中泳道1表示Rev.1-ΔeryA，泳道2-7分别表示布鲁氏菌S2、A19、S19、M5、M28、Rev.1，可见Rev.1-ΔeryA的PCR产物片段(250bp)远远小于其他布鲁氏菌菌株的PCR产物片段大小(2000bp左右)，可以明显将Rev.1-ΔeryA与其他布鲁氏菌菌株区分开，即将布鲁氏菌疫苗株和野生株区分开，进而可以鉴别自然感染和人工免疫，对布鲁氏菌病进行有效净化。另外，基于该方法，还可以在制备布鲁氏菌Rev.1-ΔeryA疫苗时，对原料进行有效净化，以避免布鲁氏菌野生株的污染。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 金宇保灵生物药品有限公司
内蒙古农业大学
<120> 一种布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株及其构建方法和应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggggtaccat ccgacccgat cttcacg 27
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctctagacc tcccgcgact gaa 23
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccgctcgagg gaaacattga aatggctga 29
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cccaagctta tccgccgcaa cgtcttcg 28
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccaagcttgc agaccgctaa cacagta 27
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgcactgcag ccaataggat atcggca 27
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctgcgagcga cctgttttc 19
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcacaaggcg gaactcataa tat 23

Claims (8)

1.一种布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株，其特征在于，所述eryA基因缺失株相较于布鲁氏菌Rev.1完全缺失了eryA基因，且能够稳定连续传代。
2.权利要求1所述的布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株的构建方法，其包括以下步骤：
1)PCR扩增获得eryA基因的上下游同源臂，分别命名为：eryA-1和eryA-2；
2)PCR扩增获得自杀基因SacB；
3)将步骤1)获得的eryA-1和eryA-2以及步骤2)获得的自杀基因SacB顺序插入pBK-CMV质粒中，获得自杀质粒pBK-CMV-eryA-SacB，命名为pBK-ΔeryA-SacB；
4)将步骤3)获得的自杀质粒pBK-ΔeryA-SacB电转化至布鲁氏菌Rev.1感受态细胞中，筛选获得布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株。
3.根据权利要求2所述的方法，步骤1)中用于PCR扩增获得eryA基因的上游同源臂的上下游引物核苷酸序列分别为：SEQ ID NO:1所示的eryA-1-F和SEQ ID NO:2所示的eryA-1-R，用于PCR扩增获得eryA基因的下游同源臂的上下游引物的核苷酸序列分别为：SEQ IDNO:3所示的eryA-2-F和SEQ ID NO:3所示的eryA-2-R。
4.根据权利要求2或3所述的方法，步骤2)中用于PCR扩增获得自杀基因SacB的上下游引物的核苷酸序列分别为：SEQ ID NO:5所示的SacB-F和SEQ ID NO:6所示的SacB-F。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，步骤4)中所述筛选获得布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株的具体操作步骤为：
41)将经电转化后的布鲁氏菌Rev.1菌液在含有卡那霉素的培养基上培养；
42)挑取培养基上形成的单菌落进行基因组提取和PCR扩增；
43)选取单条带的PCR扩增产物对应的单菌落进行单菌落测序；
44)若单菌落测序结果表现出完全缺失了eryA基因，则以该单菌落菌株作为布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株；
45)若单菌落测序结果表现出含有未缺失eryA基因的布鲁氏菌Rev.1野生株，则将该单菌落在含卡那霉素的培养基上继续培养；
46)重复步骤42)-45)，直至获得布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株。
6.根据权利要求5所述的方法，步骤42)中用于PCR扩增的上下游引物的核苷酸序列分别为：SEQ ID NO:7所示的eryA-F和SEQ ID NO:8所示的eryA-R。
7.权利要求1所述的布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株在制备布鲁氏菌Rev.1疫苗中的应用。
8.权利要求1所述的布鲁氏菌Rev.1的eryA基因缺失株在区分布鲁氏菌野生株和疫苗株中的应用。
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