CN108761074A - 塞内卡病毒elisa抗体检测试剂盒及制备方法、应用 - Google Patents

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白满元
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魏衍全
张韵
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Abstract

本发明公开了一种塞内卡病毒ELISA抗体检测试剂盒及制备方法、应用，所述塞内卡病毒ELISA抗体检测试剂盒包括预包被塞内卡病毒VP1蛋白的酶标板、封闭液、样品稀释液、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物溶液和终止液。本发明首次用塞内卡病毒的VP1蛋白作为包被抗原，建立了可检测塞内卡病毒的试剂盒，可对血清中的塞内卡病毒的抗体水平进行快速检测；本发明检测试剂盒敏感性高、特异性和可重复性好，结果稳定。可应用于塞内卡病毒的抗体水平监测，了解整个猪群塞内卡病毒病抗体的状况；另外本发明检测试剂盒应用大肠杆菌表达系统，具有经济、廉价的优点。

Description

塞内卡病毒ELISA抗体检测试剂盒及制备方法、应用
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种塞内卡病毒ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法、应用。
背景技术
塞内卡病毒病是由微RNA病毒科塞内卡病毒属的A型塞内卡病毒(Senecavirus A，SVA)引起的动物传染病，主要感染猪，不同年龄阶段的猪均易感，但不同毒株的致病力明显不同，引起的临床症状也不尽相同。早期的分离株多导致亚临床感染，近年来的分离株通常引起口蹄疫样的临床症状，病猪口鼻部、蹄部出现水疱、溃疡，新生仔猪死亡率显著增加。目前，该病主要流行于加拿大、巴西和美国等国家；2015年夏季，我国广东省某些猪场首次被证实暴发SVA疫情，病猪出现水疱症状、新生仔猪大量死亡。2016年3月，湖北省某些猪场也被确诊发生SVA疫情。因此及早做好相关防控预案和检测技术储备是当务之急。
SVA病毒粒子呈二十面体结构，无囊膜，直径为25～30nm。基因组为单股正链RNA，全长7.3kb左右，由5’端非编码区(5’UTR)、一个编码多聚蛋白的开放阅读框(ORF)和3’端非编码区(3’UTR)组成。SVA唯一的ORF翻译成“多聚蛋白”，然后在病毒编码的特定蛋白酶的作用下，多聚蛋白首先裂解成先导蛋白(L)和P1、P2、P3三个蛋白中间体，其中P1又进一步裂解成1A、1B、1C和1D(分别对应于VP4、VP2、VP3和VP1)四种结构蛋白，而P2裂解成2A、2B和2C三种非结构蛋白，P3则裂解成3A、3B、3C和3D四种非结构蛋白。SVA衣壳蛋白则由VP1、VP2、VP3和VP4四种结构蛋白组成，其中VP1和VP3是主要的抗原表位区域，而VP1蛋白的抗原性更强、相对保守，并且可以刺激机体产生中和抗体，为塞内卡病毒病的诊断提供了重要保障。
目前，世界动物卫生组织(OIE)尚未将塞内卡病毒病列入法定报告疾病名录，国内外针对该病尚无任何检疫标准可供参考。主要的血清学诊断方法包括间接免疫荧光(IFA)、病毒中和实验等。国内目前尚无相应的ELISA方法建立。
因此，现有技术有待于进一步发展。
发明内容
本发明申请的目的在于解决现有技术的缺陷和不足，提供一种特异性强、敏感性高、稳定性好的检测塞内卡病毒ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法、应用。
为实现上述发明目的，本发明提供一种塞内卡病毒ELISA抗体检测试剂盒，其中，包括预包被塞内卡病毒VP1蛋白的酶标板、封闭液、样品稀释液、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物溶液和终止液。
所述的塞内卡病毒ELISA抗体检测试剂盒，其中，所述塞内卡病毒VP1蛋白通过以下步骤制得：
1)基于塞内卡病毒毒株结构蛋白VP1基因序列，根据大肠杆菌密码子偏爱性，对SVA-VP1基因序列进行密码子优化合成，制备含有VP1的质粒；
2)利用含有VP1的质粒和pET30a载体质粒构建重组质粒pET30a-VP1；
3)将重组质粒pET30a-VP1转化大肠杆菌并诱导表达得到VP1蛋白。
所述的塞内卡病毒ELISA抗体检测试剂盒，其中，塞内卡病毒毒株结构蛋白VP1基因序列进行密码子优化合成，合成后核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述的塞内卡病毒ELISA抗体检测试剂盒，其中，利用含有VP1的质粒和pET30a载体质粒构建重组质粒pET30a-VP1具体为：
1)将含有VP1的质粒按照如下酶切体系进行酶切：含有VP1质粒35μL，Xho I和BamHI各2.5μL，Cutsmart buffer 5μL，ddH2O 5μL；
将pET30a载体质粒按照以下体系进行酶切：pET30a质粒35μL，Xho I和BamH I各2.5μL，Cutsmart buffer 5μL，ddH2O 7.5μL；
上述两酶切体系通过琼脂糖凝胶电泳确认含有VP1的质粒和pET30a载体质粒切开后，回收基因VP1目的片段和pET30a表达载体；
2)将基因VP1目的片段和pET30a表达载体两种胶回收产物按照以下反应体系进行连接，反应体系为：VP1目的片段4μL、pET30a表达载体1μL、5μL Solution I，混匀后16℃连接反应4h或者4℃过夜连接；
3)将连接产物转化Trans5a克隆菌；
4)将Trans5a克隆菌接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm振荡培养16h，将过夜培养后的菌液通过全菌PCR法和酶切凝胶电泳分析，鉴定出重组质粒pET30a-VP1。
所述的塞内卡病毒ELISA抗体检测试剂盒，其中，所述将连接产物转化Trans5a克隆菌具体为：
1)将5μL连接产物加入100μL Trans5a感受态细胞中，柔和混匀后冰浴30min；
2)42℃热激90s后，立即冰浴3min；
3)加入42℃预热后的LB液体培养基800μL，于37℃震荡培养1h；
4)离心机4500rpm离心3min；
5)弃除部分上清，留100～300μL涂布在于含有50mg/L卡那霉素的LB琼脂平板上；
6)37℃恒温培养箱中倒置培养16～18h。
所述的塞内卡病毒ELISA抗体检测试剂盒，其中，所述将过夜培养后的菌液通过全菌PCR法和酶切凝胶电泳分析，鉴定出重组质粒pET30a-VP1具体为：将过夜培养后的菌液接种于10μL PCR缓冲液体系中，利用全菌PCR法进行鉴定，将PCR反应鉴定为阳性的菌落，利用小量质粒提取试剂盒提取对应扩增菌的质粒，并进行双酶切鉴定，其双酶切体系如下：pET30a-VP1重组质粒6μL，Xho I 1.5μL，BamH I 1.5μL，Cutsmart 1μL，37℃酶切3h；重组质粒pET30a-VP1双酶切反应结束后取酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，将鉴定阳性的质粒进行测序，测序结果正确的阳性质粒命名为重组质粒pET30a-VP1。
所述的塞内卡病毒ELISA抗体检测试剂盒，其中，所述将重组质粒pET30a-VP1转化大肠杆菌并诱导表达得到VP1蛋白具体为：
1)将测序结果正确的阳性质粒转化入BL(DE3)plysS感受态细胞，37℃恒温培养1h后，取200μL均匀涂布于含有50mg/L卡那霉素和34mg/L氯霉素的双抗性固体LB平板中，并置于37℃、220rpm恒温培养箱培养12～16h；
2)挑取单个菌落于含有50mg/L卡那霉素和34mg/L氯霉素双抗性的液体培养基中，37℃培养过夜，然后以1:100的接种量转接于含50mg/mL卡那霉素和34mg/mL氯霉素的LB液体培养基，于37℃、220rpm培养至菌液OD600值在0.7左右时加入异丙基硫代半乳糖苷至终浓度为0.6mM，16℃诱导表达18h左右，随后以4500rpm离心30min收集菌体沉淀；
用10-20mL冰浴处理的缓冲液C重悬细菌沉淀，冰上超声破碎菌体细胞；4℃条件下，将超声裂解的菌液12000rpm离心30min，取上清液；蛋白通过亲和层析进行纯化，将上清液转移至由缓冲液C预平衡的镍离子螯合树脂亲和层析柱中，4℃条件下过夜结合，轻摇确保树脂与靶蛋白结合；上清液过滤两次，然后用10-20倍柱体积的缓冲液D洗涤柱子，接着用10-20倍柱体积的缓冲液E洗涤柱子，然后用10-20倍柱体积的缓冲液F洗脱蛋白，每次洗脱1mL，将洗脱的蛋白通过尿素浓度递减复性的办法将目标蛋白复性；其中，缓冲液C的pH8.0，由10mM Tris-HCl，100mM NaH2PO4，8M尿素组成；缓冲液D的pH 6.3，由10mM Tris-HCl，100mM NaH2PO4，8M尿素组成；缓冲液E的pH 5.9，由10mM Tris-HCl，100mM NaH2PO4，8M尿素组成；缓冲液F的pH 4.5，由10mM Tris-HCl，100mM NaH2PO4，8M尿素组成。
一种如上所述的塞内卡病毒ELISA抗体检测试剂盒的制备方法，其中，
封闭液为1％牛血清白蛋白；
酶标板的制备：
将VP1蛋白按包被量为每孔0.5ug/mL均匀的包被在酶标板孔上，4℃过夜；然后每孔加入300μL洗涤液洗板3次，甩干，每孔加入100μL的1％牛血清白蛋白37℃封闭1h；
所述酶结合物为辣根过氧化物酶-小鼠抗猪IgG酶结合物；
所述样品稀释液为含有体积浓度0.1％Tween-20的0.01mol/L及pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液；
浓缩洗涤液通过在1000mL的0.01M磷酸盐缓冲液中加1mL Tween-20制得；
酶底物溶液为四甲基联苯胺溶液；
终止液：取54.34mL浓度为98％的浓硫酸加蒸馏水至1000mL制得2N H2SO4。
一种如上所述的塞内卡病毒ELISA抗体检测试剂盒的应用，其中，所述塞内卡病毒ELISA抗体检测试剂盒应用于血清中塞内卡病毒的抗体水平检测。
所述的塞内卡病毒ELISA抗体检测试剂盒的应用，其中，所述塞内卡病毒ELISA抗体检测试剂盒的操作步骤如下：
将待检测样本用样本稀释液1：200稀释，每孔加100μL，，同时加入阳性和阴性对照液，置于37℃孵育30min，每孔加入300μL洗涤液洗板3次，甩干，每孔按1：20000加入酶标二抗100μL，置于37℃孵育30min；洗涤液洗板3次，甩干，加入酶底物溶液，每孔50μL，37℃避光显色15min，加入终止液50μL，。利用酶标仪在450nm测定光吸收值OD450；
当血清OD450值大于0.61时，判定为阳性；血清OD450值小于0.52时，判定为阴性；血清OD450值介于0.52-0.61之间时，判定为可疑。
本发明的有益效果：
本发明首次用塞内卡病毒的VP1蛋白作为包被抗原，建立了可检测塞内卡病毒的试剂盒，可对血清中的塞内卡病毒的抗体水平进行快速检测；
本发明检测试剂盒敏感性高、特异性和可重复性好，结果稳定。可应用于塞内卡病毒的抗体水平监测，了解整个猪群塞内卡病毒病抗体的状况；
本发明检测试剂盒应用大肠杆菌表达系统，具有经济、廉价的优点。
附图说明
图1为本发明具体实施例中对表达的塞内卡病毒VP1蛋白的SDS-PAGE检测结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是用于限制本发明。本说明书所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
本发明提供一种用于检测猪细小病毒抗体的ELISA检测试剂盒，同时提供塞内卡病毒VP1蛋白的制备方法及ELISA检测试剂盒的制备和使用方法。
本发明的塞内卡病毒ELISA抗体检测试剂盒，包括预包被塞内卡病毒VP1蛋白的酶标板、封闭液、样品稀释液、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物溶液和终止液。
其中、塞内卡病毒VP1蛋白的制备步骤如下：
1、SVA主要免疫性基因VP1的人工修饰合成
基于SVA毒株结构蛋白VP1基因序列(如SEQ ID NO.1所示)，根据大肠杆菌密码子偏爱性，对SVA-VP1基因序列进行密码子优化合成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。含有VP1质粒的甘油菌由金唯智生物科技有限公司制备。
2、重组质粒pET30a-VP1的构建
a.含VP1的质粒的抽提
将含有VP1质粒的甘油菌液以1：100接种于5mL含Kana(100mg/L)的新鲜LB培养基中，37℃、220rpm振荡培养过夜，然后提取质粒。
b.载体及目的片段的酶切
将含有VP1的质粒和pET30a载体质粒分别按照如下酶切体系进行酶切：含有VP1质粒35μL，Xho I和BamH I各2.5μL，Cutsmart buffer 5μL，ddH2O 5μL。将pET30a质粒按照以下体系进行酶切：pET30a质粒35μL，Xho I和BamH I各2.5μL，Cutsmart buffer 5μL，ddH2O7.5μL。上述酶切体系在37℃条件下水浴3h，使用10g/L琼脂糖凝胶电泳确认含有VP1的质粒和pET30a载体质粒切开后。采用TransGen公司EasyPureQuick Gel Extraction kit回收基因VP1目的片段和pET30a表达载体。
c.连接反应
将VP1目的片段和pET30a表达载体两种胶回收产物按照以下反应体系进行连接。反应体系为：目的片段4μL、载体1μL、5μL Solution I，混匀后16℃连接反应4h或者4℃过夜连接。
d.转化Trans5a克隆菌
(1)将5μL连接产物加入100μL Trans5α感受态细胞中，柔和混匀后冰浴30min。
(2)42℃热激90s后，立即冰浴3min。
(3)加入42℃预热后的LB液体培养基800μL，于37℃震荡培养1h。
(4)离心机4500rpm离心3min。
(5)弃除部分上清，留100～300μL涂布在于含有卡那霉素(50mg/L)的LB琼脂平板上。
(6)37℃恒温培养箱中倒置培养16～18h。
e.重组质粒pET30a-VP1鉴定
用无菌枪尖或接种针挑取生长在LB平皿上大小均匀的单一菌落接种于含有卡那霉素(50mg/L)的LB液体培养基中并进行编号，37℃、220rpm振荡培养16h。将不同编号过夜培养后的菌液接种于10μL PCR缓冲液体系中，利用全菌PCR法进行鉴定。将PCR反应鉴定为阳性的菌落，利用小量质粒提取试剂盒提取对应编号扩增菌的质粒，并进行双酶切鉴定。双酶切体系如下：pET30a-VP1重组质粒6μL，Xho I 1.5μL，BamH I 1.5μL，Cutsmart 1μL，37℃酶切3h。重组质粒pET30a-VP1双酶切反应结束后取酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，将鉴定阳性的质粒进行测序，测序结果正确的阳性质粒命名为pET30a-VP1。
f.重组质粒转化BL21(DE3)plysS感受态细胞
将测序结果正确的阳性质粒按步骤d的方法转化入BL(DE3)plysS感受态细胞，37℃恒温培养1h后，取200μL均匀涂布于含有卡那霉素(50mg/L)和氯霉素(34mg/L)双抗性的固体LB平板中，并置于37℃、220rpm恒温培养箱培养12～16h。
g.VP1的表达以及纯化
挑取单个菌落于含有卡那霉素(50mg/L)和氯霉素(34mg/L)双抗性的液体培养基中，37℃培养过夜，然后以1:100的接种量转接于含卡那霉素(50mg/mL)和氯霉素(34mg/mL)的LB液体培养基，于37℃、220rpm培养至菌液OD600值在0.7左右时加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.6mM，16℃诱导表达18h左右，随后以4500rpm离心30min收集菌体沉淀。用10～20mL(50～100倍浓缩菌液)冰浴处理的缓冲液C(10mM Tris-HCl，100mMNaH2PO4，8M尿素，pH 8.0)重悬细菌沉淀，冰上超声破碎菌体细胞(超声时间3s，间隔时间3s，共6min，功率200W)。4℃条件下，将超声裂解的菌液12000rpm离心30min，取上清液。蛋白通过亲和层析进行纯化，将上清液转移至由缓冲液C预平衡的镍离子螯合树脂亲和层析柱中，4℃条件下过夜结合，轻轻摇动确保树脂与靶蛋白充分结合。上清液过滤两次，用10-20倍柱体积的缓冲液D(10mM Tris-HCl，100mM NaH2PO4，8M尿素，pH 6.3)洗涤柱子，接着用10-20倍柱体积的缓冲液E(10mM Tris-HCl，100mM NaH2PO4，8M尿素，pH 5.9)洗涤柱子，然后用10-20倍柱体积的缓冲液F(10mM Tris-HCl，100mM NaH2PO4，8M尿素，pH 4.5)洗脱蛋白，每次洗脱1mL。将洗脱的蛋白通过尿素浓度递减复性的办法将目标蛋白复性。最后通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定目的蛋白的纯化效果和免疫原性。SDS-PAGE结果如图1所示，其中，图中各条带：M，Marker；1,总菌体裂解液；2，复性前目的蛋白；3，复性后目的蛋白；4，复性且浓缩后目的蛋白；*箭头所指为目标蛋白。
猪细小病毒VLPs ELISA抗体检测试剂盒的制备
1)ELISA方法的建立及条件优化：
a.应用Bradford蛋白定量试剂盒检测浓缩蛋白的浓度：
首先将标准品BSA稀释为0、1、2、3、4、6、8、10μg/μL，每孔加入100μL，混匀后室温放置5-10min。用酶标仪测定595nm的吸光值，绘制标准曲线。然后将待测蛋白样品用去离子水稀释至适当浓度，测定样品吸收值OD595。
b.ELISA方法的建立及条件优化过程：
抗原包被量及一抗稀释度的优化：
用0.05％pH 9.6的碳酸盐包被缓冲液将定量的SVA VP1蛋白稀释为0.1、0.5、1.0、1.5、2μg/mL，一抗阴、阳性血清稀释为1：50、1：100、1：200、1：400，经方阵法在其他条件相同的情况下，根据P/N值确定抗原最佳包被量为0.5μg/mL，一抗最佳稀释度为1：200。
抗原最佳包被时间的优化：
将抗原用最佳包被量分别于37℃2h、37℃1h、4℃过夜包被酶标板，在其他条件相同的情况下，根据P/N值确定抗原最佳包被时间为4℃过夜。
封闭剂的优化：
用5％milk+5％小牛血清、5％milk+0.5％BSA、5％milk、10％milk、5％小牛血清、10％小牛血清、0.5％牛血清白蛋白(BSA)和1％BSA对包被的酶标板分解进行封闭，在其他条件相同的情况下，根据P/N值确定最佳封闭剂为1％BSA。
封闭时间的优化：
用最佳封闭剂对包被好的酶标板分别封闭37℃2h、37℃1h、37℃2h+4℃过夜、37℃1h+4℃过夜，在其他条件相同的情况下，根据P/N值确定最佳封闭时间为37℃1h。
一抗作用时间的优化：
将阴、阳性对照血清分别按最佳浓度稀释后，37℃分别作用15、30、45、60min，在其他条件相同的情况下，根据P/N值确定最佳一抗作用时间为30min。
二抗最佳稀释度的优化：
将HRP标记的二抗作1：6000、1：8000、1：10000、1：15000、1：20000、1：22000稀释，在其他条件相同的情况下，根据P/N值确定二抗最佳稀释度为1：20000。
二抗作用时间的优化：
将最佳稀释度的酶标二抗37℃分别作用15、30、45、60、90min，在其他条件相同的情况下，根据P/N值确定二抗最佳作用时间为30min。
显色时间的确定：
将TMB溶液在其他条件相同的情况下，加入反应体系，分别在37℃条件下避光显色5、10、15、30min，根据P/N值确定最佳显色时间为37℃显色15min。
c.ELISA方法阴阳性判定标准的建立：
用建立的ELISA方法对30份阴性猪血清分别检测3次，计算出阴性血清OD450值的平均值和标准差。确定血清OD450值大于0.61时，可判定为阳性；血清OD450值小于0.52时，可判定为阴性，当介于两者之间时为可疑。
d.交叉反应试验：
用包被好的酶标板同时检测塞内卡病毒阴性、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、塞内卡病毒阳性血清，结果显示本方法与其他的猪病毒没有交叉反应。
e.敏感性、特异性和符合率分析：
用建立的ELISA方法检测90份不同抗体效价的血清样本，其敏感性为94.49％、特异性为99％。
f.批内、批间重复性试验：
分别用同一批次组建的试剂盒和3个不同批次组建的试剂盒检测同样的10份血清，根据计算的标准差和变异系数，结果显示其变异系数分别小于10％、15％，表明本试剂盒具有很好的可重复性。
2)酶标板的制备：
将VP1蛋白按包被量为每孔0.5ug/mL均匀的包被在酶标板孔上，4℃过夜；然后每孔加入300μL洗涤液洗板3次，甩干，每孔加入100μL的1％BSA37℃封闭1h。包被缓冲液为0.05M，pH9.6的碳酸盐缓冲液，即1L溶液中含1.59g Na2CO3，2.93g NaHCO3；
3)获得辣根过氧化物酶(HRP)-小鼠抗猪IgG酶结合物：
本发明中使用的辣根过氧化物酶(HRP)-小鼠抗猪IgG酶结合物购自SIGMA公司。
4)试剂盒其他溶液配制：
①样品稀释液：含有体积浓度0.1％Tween-20的0.01mol/L及pH 7.2-7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)；②洗涤液：在1000mL的0.01M PBS溶液中加1mL Tween-20；③酶底物：四甲基联苯胺溶液；④终止液:取54.34mL浓度为98％的浓硫酸加蒸馏水至1000mL即可得2N H2SO4。
3.塞内卡病毒ELISA抗体检测试剂盒的操作步骤：
1)操作过程：
将待检测样本用样本稀释液1：200稀释，每孔加100μL，同时加入阳性和阴性对照液，每孔建议设置2孔。置于37℃孵育30min，每孔加入300μL洗涤液洗板3次，甩干，每孔按1：20000加入酶标二抗100μL，置于37℃孵育30min；洗涤液洗板3次，甩干，加入酶底物溶液，每孔50μL，37℃避光显色15min，加入终止液50μL。利用酶标仪在450nm测定光吸收值OD450。
2)结果判定：
当血清OD450值大于0.61时，可判定为阳性；血清OD450值小于0.52时，可判定为阴性；血清OD450值介于两者之间时，可判定为可疑。
本发明具有如下优点：
本发明首次用塞内卡病毒的VP1蛋白作为包被抗原，建立了可检测塞内卡病毒的试剂盒，可对血清中的塞内卡病毒的抗体水平进行快速检测。
本发明检测试剂盒敏感性高、特异性和可重复性好，结果稳定。可应用于塞内卡病毒的抗体水平监测，了解整个猪群塞内卡病毒病抗体的状况。
本发明检测试剂盒应用大肠杆菌表达系统具有经济、廉价的优点。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 塞内卡病毒ELISA抗体检测试剂盒及制备方法、应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 792
<212> DNA
<213> A型塞内卡病毒的vp1 基因(vp1 gene of Senecavirus A )
<400> 1
tccaccgaca acgccgagac tggggttatt gaggcaggta acactgacac cgatttctct 60
ggtgaactgg cggctcctgg ctctaaccat actaacgtca aattcctgtt tgaccgatct 120
cgactactga atgtaattaa ggtactggag aaggacgccg tcttcccccg tccattcccc 180
acagcaacag gtacacagca ggacgatggt tacttttgtc ttctaacacc ccgcccaaca 240
gtcgcttccc gacccgccac tcgtttcggc ctgtacgtca acccgtctga cagtggcgtt 300
ctcgctaata cttcactgga tttcaatttt tacagtttgg cctgtttcac ttactttaga 360
tcagaccttg aagtcacggt ggtctcactg gagccagatt tggaattcgc cgtggggtgg 420
ttcccctctg gcagtgagta ccaggcttct agctttgtct atgaccaact gcatgtaccc 480
taccactttt ctgggcgcac tccccgcgct ttcaccagca agggtggaaa ggtatctttc 540
gtgctccctt ggaactctgt ctcttccgtg cttcccgtgc gctggggggg cgcttccaag 600
ctttcttctg ccacgcgggg tctgccggct catgctgact gggggaccat ttacgccttt 660
atcccccgtc ctaacgagaa gaaaagcacc gctgtaaagc acgtggcggt gtacgttcgg 720
tacaagaacg cgcgtgcttg gtgccccagc atgcttccct ttcgcagcta taagcagaag 780
atgctgatgc aa 792
<210> 2
<211> 792
<212> DNA
<213> 人工合成序列(Synthetic sequence )
<400> 2
tccaccgaca acgccgagac cggtgtgatc gaagcgggca acaccgacac cgatttcagc 60
ggcgagctgg cggcgccggg cagcaaccac accaacgtga agttcctgtt tgaccgtagc 120
cgtctgctga acgttattaa ggtgctggaa aaagatgcgg tttttccgcg tccgtttccg 180
accgcgaccg gtacccagca agacgatggc tatttctgcc tgctgacccc gcgtccgacc 240
gttgcgagcc gtccggcgac ccgttttggt ctgtacgtga acccgagcga cagcggcgtt 300
ctggcgaaca ccagcctgga tttcaacttt tacagcctgg cgtgcttcac ctattttcgt 360
agcgacctgg aagtgaccgt ggttagcctg gagccggatc tggaattcgc ggttggttgg 420
tttccgagcg gcagcgaata ccaggcgagc agcttcgtgt atgaccaact gcacgttccg 480
taccacttca gcggtcgtac cccgcgtgcg tttaccagca agggtggcaa agttagcttt 540
gtgctgccgt ggaacagcgt tagcagcgtg ctgccggttc gttggggtgg cgcgagcaaa 600
ctgagcagcg cgacccgtgg tctgccggcg catgcggatt ggggtaccat ctatgcgttc 660
attccgcgtc cgaacgagaa gaaaagcacc gcggtgaagc acgtggcggt ttacgtgcgt 720
tataaaaacg cgcgtgcgtg gtgcccgagc atgctgccgt ttcgtagcta caagcagaag 780
atgctgatgc aa 792

Claims (10)

1.一种塞内卡病毒ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，包括预包被塞内卡病毒VP1蛋白的酶标板、封闭液、样品稀释液、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物溶液和终止液。
2.根据权利要求1所述的塞内卡病毒ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述塞内卡病毒VP1蛋白通过以下步骤制得：
1)基于塞内卡病毒毒株结构蛋白VP1基因序列，根据大肠杆菌密码子偏爱性，对SVA-VP1基因序列进行密码子优化合成，制备含有VP1的质粒；
2)利用含有VP1的质粒和pET30a载体质粒构建重组质粒pET30a-VP1；
3)将重组质粒pET30a-VP1转化大肠杆菌并诱导表达得到VP1蛋白。
3.根据权利要求2所述的塞内卡病毒ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，塞内卡病毒毒株结构蛋白VP1基因序列进行密码子优化合成，合成后核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求2所述的塞内卡病毒ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，利用含有VP1的质粒和pET30a载体质粒构建重组质粒pET30a-VP1具体为：
1)将含有VP1的质粒按照如下酶切体系进行酶切：含有VP1质粒35μL，Xho I和BamH I各2.5μL，Cutsmart buffer 5μL，ddH2O 5μL；
将pET30a载体质粒按照以下体系进行酶切：pET30a质粒35μL，Xho I和BamH I各2.5μL，Cutsmart buffer 5μL，ddH2O 7.5μL；
上述两酶切体系通过琼脂糖凝胶电泳确认含有VP1的质粒和pET30a载体质粒切开后，回收基因VP1目的片段和pET30a表达载体；
2)将基因VP1目的片段和pET30a表达载体两种胶回收产物按照以下反应体系进行连接，反应体系为：VP1目的片段4μL、pET30a表达载体1μL、5μL Solution I，混匀后16℃连接反应4h或者4℃过夜连接；
3)将连接产物转化Trans5a克隆菌；
4)将Trans5a克隆菌接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm振荡培养16h，将过夜培养后的菌液通过全菌PCR法和酶切凝胶电泳分析，鉴定出重组质粒pET30a-VP1。
5.根据权利要求4所述的塞内卡病毒ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述将连接产物转化Trans5a克隆菌具体为：
1)将5μL连接产物加入100μL Trans5a感受态细胞中，柔和混匀后冰浴30min；
2)42℃热激90s后，立即冰浴3min；
3)加入42℃预热后的LB液体培养基800μL，于37℃震荡培养1h；
4)离心机4500rpm离心3min；
5)弃除部分上清，留100～300μL涂布在于含有50mg/L卡那霉素的LB琼脂平板上；
6)37℃恒温培养箱中倒置培养16～18h。
6.根据权利要求4所述的塞内卡病毒ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述将过夜培养后的菌液通过全菌PCR法和酶切凝胶电泳分析，鉴定出重组质粒pET30a-VP1具体为：将过夜培养后的菌液接种于10μL PCR缓冲液体系中，利用全菌PCR法进行鉴定，将PCR反应鉴定为阳性的菌落，利用小量质粒提取试剂盒提取对应扩增菌的质粒，并进行双酶切鉴定，其双酶切体系如下：pET30a-VP1重组质粒6μL，Xho I 1.5μL，BamH I 1.5μL，Cutsmart 1μL，37℃酶切3h；重组质粒pET30a-VP1双酶切反应结束后取酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，将鉴定阳性的质粒进行测序，测序结果正确的阳性质粒命名为重组质粒pET30a-VP1。
7.根据权利要求6所述的塞内卡病毒ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述将重组质粒pET30a-VP1转化大肠杆菌并诱导表达得到VP1蛋白具体为：
1)将测序结果正确的阳性质粒转化入BL(DE3)plysS感受态细胞，37℃恒温培养1h后，取200μL均匀涂布于含有50mg/L卡那霉素和34mg/L氯霉素的双抗性固体LB平板中，并置于37℃、220rpm恒温培养箱培养12～16h；
2)挑取单个菌落于含有50mg/L卡那霉素和34mg/L氯霉素双抗性的液体培养基中，37℃培养过夜，然后以1:100的接种量转接于含50mg/mL卡那霉素和34mg/mL氯霉素的LB液体培养基，于37℃、220rpm培养至菌液OD600值在0.7左右时加入异丙基硫代半乳糖苷至终浓度为0.6mM，16℃诱导表达18h左右，随后以4500rpm离心30min收集菌体沉淀；
用10-20mL冰浴处理的缓冲液C重悬细菌沉淀，冰上超声破碎菌体细胞；4℃条件下，将超声裂解的菌液12000rpm离心30min，取上清液；蛋白通过亲和层析进行纯化，将上清液转移至由缓冲液C预平衡的镍离子螯合树脂亲和层析柱中，4℃条件下过夜结合，轻摇确保树脂与靶蛋白结合；上清液过滤两次，然后用10-20倍柱体积的缓冲液D洗涤柱子，接着用10-20倍柱体积的缓冲液E洗涤柱子，然后用10-20倍柱体积的缓冲液F洗脱蛋白，每次洗脱1mL，将洗脱的蛋白通过尿素浓度递减复性的办法将目标蛋白复性；其中，缓冲液C的pH 8.0，由10mM Tris-HCl，100mM NaH2PO4，8M尿素组成；缓冲液D的pH 6.3，由10mM Tris-HCl，100mMNaH2PO4，8M尿素组成；缓冲液E的pH 5.9，由10mM Tris-HCl，100mM NaH2PO4，8M尿素组成；缓冲液F的pH 4.5，由10mM Tris-HCl，100mM NaH2PO4，8M尿素组成。
8.一种如权利要求1-7任一项所述的塞内卡病毒ELISA抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，
封闭液为1％牛血清白蛋白；
酶标板的制备：
将VP1蛋白按包被量为每孔0.5ug/mL均匀的包被在酶标板孔上，4℃过夜；然后每孔加入300μL洗涤液洗板3次，甩干，每孔加入100μL的1％牛血清白蛋白37℃封闭1h；
所述酶结合物为辣根过氧化物酶-小鼠抗猪IgG酶结合物；
所述样品稀释液为含有体积浓度0.1％Tween-20的0.01mol/L及pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液；
浓缩洗涤液通过在1000mL的0.01M磷酸盐缓冲液中加1mL Tween-20制得；
酶底物溶液为四甲基联苯胺溶液；
终止液：取54.34mL浓度为98％的浓硫酸加蒸馏水至1000mL制得2N H2SO4。
9.一种如权利要求8所述的塞内卡病毒ELISA抗体检测试剂盒的应用，其特征在于，所述塞内卡病毒ELISA抗体检测试剂盒应用于血清中塞内卡病毒的抗体水平检测。
10.根据如权利要求9所述的塞内卡病毒ELISA抗体检测试剂盒的应用，其特征在于，所述塞内卡病毒ELISA抗体检测试剂盒的操作步骤如下：
将待检测样本用样本稀释液1：200稀释，每孔加100μL，，同时加入阳性和阴性对照液，置于37℃孵育30min，每孔加入300μL洗涤液洗板3次，甩干，每孔按1：20000加入酶标二抗100μL，置于37℃孵育30min；洗涤液洗板3次，甩干，加入酶底物溶液，每孔50μL，37℃避光显色15min，加入终止液50μL，。利用酶标仪在450nm测定光吸收值OD450；
当血清OD450值大于0.61时，判定为阳性；血清OD450值小于0.52时，判定为阴性；血清OD450值介于0.52-0.61之间时，判定为可疑。
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