CN103468827A - 一种鉴别鸭甲肝病毒与新型鸭呼肠孤病毒感染的试剂盒 - Google Patents
一种鉴别鸭甲肝病毒与新型鸭呼肠孤病毒感染的试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种鉴别鸭甲肝病毒与新型鸭呼肠孤病毒感染的试剂盒。该发明利用鸭甲肝病毒与新型鸭呼肠孤病毒特异性引物（如SEQ NO.1-4）建立双重PCR检测方法，并组装成试剂盒。所述试剂盒不仅能在同一体系中鉴别鸭甲肝病毒与新型鸭呼肠孤病毒，还能鉴别两者的混合感染。所述试剂盒具有快速准确、敏感性高、特异性好等特点，很好地解决了鸭甲肝病毒与新型鸭呼肠孤病毒感染在临床上难以区分的问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种鉴别鸭甲肝病毒与新型鸭呼肠孤病毒感染的试剂盒，专用于鸭甲肝病毒与新型鸭呼肠孤病毒感染的鉴别诊断，属于生物技术领域。
背景技术
鸭病毒性肝炎（Duck viral hepatitis）又称鸭肝炎，俗称“背脖病”。5周龄以下的雏鸭对该病易感，其中3周龄内的雏鸭最易感且死亡率高，部分可达90%以上。该病波及面广、发病率高、危害严重，是影响我国养鸭业发展的主要疾病之一。该病由鸭甲肝病毒（Duck hepatitisA virus，DHAV）引起，分为A、B、C三个基因型，目前在我国流行的主要是A型和C型。
新型鸭呼肠孤病毒（Novel duck reovirus，NDRV）感染是近几年发生的一种严重危害我国养鸭业的新型疾病。该病可感染不同品种、不同日龄的鸭群，但以3周龄内的雏鸭感染最为常见，也最为严重，死亡率可达50%以上。新型鸭呼肠孤病毒与禽呼肠孤病毒（Avian reovirus，ARV）以及传统的番鸭呼肠孤病毒（Muscovy duck reovirus，MDRV）在基因序列、生物学特性、抗原相关性方面均存在较大差异。
鸭甲肝病毒和新型鸭呼肠孤病毒在发病特点、临床症状、病变特征等方面十分相似，具有以侵害雏鸭为主、发病快、死亡率高、病变以肝脏出血为主等共同特点，在临床上很难区分。而这两种疾病的治疗都以抗体注射为主，因此只有将两者区分开，给予相应的抗体，才能取得很好的疗效。利用PCR技术快速、准确、敏感性高的特点，研制鸭甲肝病毒和新型鸭呼肠孤病毒检测试剂盒来区分这两种疾病，这在实际生产中是急需的。但是目前还没有相关的报道。
发明内容
本发明的目的是利用双重PCR技术建立一种鉴别鸭甲肝病毒与新型鸭呼肠孤病毒感染的试剂盒，该试剂盒具有快速、准确、敏感性高、特异性好等特点，很好地解决了鸭甲肝病毒与新型鸭呼肠孤病毒感染在临床上难以区分的问题。
本发明的技术方案是：一种鉴别鸭甲肝病毒与新型鸭呼肠孤病毒感染的试剂盒，其特征是，包括以下组分（50次量）：
1）TRIZol（总RNA抽提试剂）：50ml；
2）RT反应液：900μL，包括10mmol/L dNTP50μL、5×RT缓冲液200μL、20pmol/μL检测引物DHA1、DHA2、NDR1、NDR2各50μL、40U/μL RNA酶抑制剂25μL、DEPC水425μL；
3）反转录酶M-MLV：50μL，浓度为200U/μL；
4）PCR反应液4500μL：ddH2O4000μL、10×PCR缓冲液450μL、5U/μL Taq DNA聚合酶50μL；
5）阳性质粒：重组质粒T-DHA和T-NDR混合物250μL，终浓度均为0.1ng/μL；
6）DEPC处理水：2ml。
上述试剂均购自大连宝生物（TAKARA）公司。
所述检测引物DHA1、DHA2、NDR1、NDR2依次为：
DHA1（上游引物）：5'-CTTTCYATCAATGACCARCG-3'（SEQ NO.1）
DHA2（下游引物）：5'-GHADTTGMTCCATAACATCCTG-3'（SEQ NO.2）
（R＝A或者G；M＝A或者C；Y＝C或者T；H＝A、T或者C；D=G、A或者T）
上述引物用于检测鸭甲肝病毒，扩增片段大小为304bp；
NDR1（上游引物）：5'-GTAAGCAACCTCAGGATATCG-3'（SEQ NO.3）
NDR2（下游引物）：5'-TCATGTCGCGCGTCGTAT-3'（SEQ NO.4）
上述引物用于检测新型鸭呼肠孤病毒，扩增片段大小为148bp。
所述重组质粒T-DHA的详细制备方法：
按照TRIZol试剂说明提取A型鸭甲肝病毒RNA，利用引物DHA1/DHA2进行RT-PCR，扩增目的条带，反应条件如下：
RT反应体系（20μL）：10mmol/L dNTP1.0μL、5×RT缓冲液4.0μL、20pmol/μL的引物DHA21.0μL、40U/μL RNA酶抑制剂0.5μL、RNA模板1μL、DEPC水11.5μL；置于PCR扩增仪进行反应，200U/μL反转录酶M-MLV1μL于70℃5min后加入；反应程序：70℃5min，42℃30min，95℃2min。
PCR反应体系（50μL）：ddH2O39μL、20pmol/μL引物DHA11.0μL、10×PCR缓冲液4.5μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL、RT产物5.0μL；置于PCR扩增仪进行反应，反应程序：95℃2min预变性；94℃变性15sec、55℃退火15sec、72℃延伸20sec，共30个循环；72℃延伸5min。
回收目的条带，与载体pMD18-T连接，转化DH5α感受态细胞，提取质粒，PCR鉴定阳性后送上海博尚生物工程有限公司测序。序列正确的质粒标记为T-DHA作为鸭甲肝病毒的阳性对照。
所述重组质粒T-NDR的详细制备方法：
按照TRIZol试剂说明提取新型鸭呼肠孤病毒RNA，利用引物NDR1/NDR2进行RT-PCR，扩增目的条带，反应条件如下：
RT反应体系（20μL）：10mmol/L dNTP1.0μL、5×RT缓冲液4.0μL、20pmol/μL引物NDR1、NDR2各1.0μL、40U/μL RNA酶抑制剂0.5μL、RNA模板1μL、DEPC水10.5μL。置于PCR扩增仪进行反应，200U/μL反转录酶M-MLV1μL于70℃5min后加入；反应程序：70℃5min，42℃30min，95℃2min。
PCR反应体系（50μL）：ddH2O40μL、10×PCR缓冲液4.5μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL、RT产物5.0μL。置于PCR扩增仪进行反应，反应程序：95℃2min预变性；94℃变性15sec、55℃退火15sec、72℃延伸20sec，共30个循环；72℃延伸5min。
回收目的条带，与载体pMD18-T连接，转化DH5α感受态细胞，提取质粒，PCR鉴定阳性后送上海博尚生物工程有限公司测序。序列正确的质粒标记为T-NDR作为新型鸭呼肠孤病毒的阳性对照。
所述检测试剂盒的操作步骤：
1）RNA提取：取200μL待测鸭的病料匀浆液，加入1ml TRIZol，充分震荡，静置10min后加入200μL氯仿，充分混匀，静置5min后，12000rpm离心10min，取上清加入等体积的异丙醇，充分混匀后，放-20℃静置至少1h。然后12000rpm离心15min，弃掉上清，加入75%酒精500μL，12000rpm离心5min，弃掉上清，RNA沉淀干燥后加入10μL DEPC处理水，备用；
2）RT反应：取RT反应液18μL，加入上述RNA1μL，混匀后放PCR仪中70℃作用5min，然后加入反转录酶M-MLV1μL，混匀后，放PCR仪中42℃30min，95℃2min，结束后取出进行后续的PCR反应；
3）PCR反应：取PCR反应液45μL，加入上述RT产物5μL，混匀后按下面的程序进行反应：95℃2min预变性；94℃变性15sec、55℃退火15sec、72℃延伸20sec，共30个循环；72℃延伸5min；
4）阳性对照：取PCR反应液45μL，加入阳性质粒5μL，混匀后按下面的程序进行反应：95℃2min预变性；94℃变性15sec、55℃退火15sec、72℃延伸20sec，共30个循环；72℃延伸5min；
5）电泳观察：取5μL PCR产物加入1.5℅琼脂糖凝胶中进行电泳观察，若出现约300bp的条带，可判断为鸭甲肝病毒阳性；若出现约150bp的条带，可判断为新型鸭呼肠孤病毒阳性；若300bp和150bp的条带均出现，则可判断为鸭甲肝病毒和新型鸭呼肠孤病毒混合感染。
本发明具有下列优点：
1.本发明利用设计的两对特异性引物在同一个体系中能区分鸭甲肝病毒和新型鸭呼肠孤病毒，具有省时、省力、成本低等优点；
2.本发明对鸭甲肝病毒和新型鸭呼肠孤病毒RNA的最低检出量均为1pg，具有敏感性高、特异性好等优点；
3.本发明的检测试剂盒不仅能鉴别出是鸭甲肝病毒感染还是新型鸭呼肠孤病毒感染，还能检测出两者混合感染，这在临床上具有重要的应用价值。
附图说明
图1是检测试剂盒对于A型鸭甲肝病毒的敏感性检测结果。其中M.DNA Marker DL2000；1-7所对应的病毒RNA的含量分别为1ng、100pg、10pg、1pg、0.1pg、0.01pg、0.001pg。
图2是检测试剂盒对于B型鸭甲肝病毒的敏感性检测结果。其中M.DNA Marker DL2000；1-7所对应的病毒RNA的含量分别为1ng、100pg、10pg、1pg、0.1pg、0.01pg、0.001pg。
图3是检测试剂盒对于C型鸭甲肝病毒的敏感性检测结果。其中M.DNA Marker DL2000；1-7所对应的病毒RNA的含量分别为1ng、100pg、10pg、1pg、0.1pg、0.01pg、0.001pg。
图4是检测试剂盒对于新型呼肠孤病毒的敏感性检测结果。其中M.DNA Marker DL2000；1-7所对应的病毒RNA的含量分别为1ng、100pg、10pg、1pg、0.1pg、0.01pg、0.001pg。
图5是检测试剂盒的特异性检测结果。其中M.DNA Marker DL2000；1-9所对应的病毒分别为A型鸭甲肝病毒、B型鸭甲肝病毒、C型鸭甲肝病毒、新型鸭呼肠孤病毒、A型鸭甲肝病毒和新型鸭呼肠孤病毒混合物、番鸭呼肠孤病毒、鸭坦布苏病毒、鸭瘟病毒、鸭副粘病毒。
图6是检测试剂盒对于鸭甲肝病毒和新型鸭呼肠孤病毒混合物的检测结果。其中M.DNAMarker DL2000；1-4所对应的分别是A型鸭甲肝病毒和新型鸭呼肠孤病毒混合物、B型鸭甲肝病毒和新型鸭呼肠孤病毒混合物、C型鸭甲肝病毒和新型鸭呼肠孤病毒混合物、阴性对照。
图7是检测试剂盒对于A型鸭甲肝病毒的重复性试验。其中M.DNA Marker DL2000；1-3所对应的三次重复检测。
图8是检测试剂盒对于新型鸭呼肠孤病毒的重复性试验。其中M.DNA Marker DL2000；1-3所对应的三次重复检测。
具体实施方式
1.检测引物的设计
根据Genbank中已登录的DHAV的3D基因和NDRV的3S基因的保守序列利用Primer5.0软件分别设计一对引物，用于鸭甲肝病毒和新型鸭呼肠孤病毒的检测；
用于DHAV检测的简并引物是：
正链引物DHA1（上游引物）：5'-CTTTCYATCAATGACCARCG-3'（SEQ NO.1）
负链引物DHA2（下游引物）：5'-GHADTTGMTCCATAACATCCTG-3'（SEQ NO.2）
（R＝A或者G；M＝A或者C；Y＝C或者T；H＝A、T或者C；D=G、A或者T）
扩增片段大小为304bp。
用于NDRV检测的引物是：
正链引物NDR1（上游引物）：5'-GTAAGCAACCTCAGGATATCG-3'（SEQ NO.3）
负链引物NDR2（下游引物）：5'-TCATGTCGCGCGTCGTAT-3'（SEQ NO.4）
扩增片段大小为148bp。
2.反应条件的优化
通过调整引物浓度、退火温度、反应时间等方面对反应条件进行优化。优化后的反应条件为：
RT反应体系（20μL）：10mmol/L dNTP1.0μL、5×RT缓冲液4.0μL、20pmol/μL检测引物DHA1、DHA2、NDR1、NDR2各1.0μL、40U/μL RNA酶抑制剂0.5μL、RNA模板1μL、DEPC水8.5μL。置于PCR扩增仪进行反应，200U/μL反转录酶M-MLV1μL于70℃5min后加入；反应程序：70℃5min，42℃30min，95℃2min。
PCR反应体系（50μL）：ddH2O40μL、10×PCR缓冲液4.5μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL、RT产物5.0μL。置于PCR扩增仪进行反应，反应程序：95℃2min预变性；94℃变性15sec、55℃退火15sec、72℃延伸20sec，共30个循环；72℃延伸5min。
3.双重PCR的特异性
按照TRIZol试剂说明分别提取鸭甲肝病毒（A、B、C三种基因型）、新型鸭呼肠孤病毒、番鸭呼肠孤病毒、鸭瘟病毒、鸭坦布苏病毒、鸭副粘病毒以及新型鸭呼肠孤病毒与鸭甲肝病毒（A、B、C三种基因型）混合物的RNA，并以此为模板利用上述反应条件分别RT-PCR，反应结束后，取5μL PCR产物加入1.5℅琼脂糖凝胶中进行电泳观察。结果：该双重PCR方法能从A型、B型和C型鸭甲肝病毒中扩增到304bp的目的条带，从新型鸭呼肠孤病毒中扩增到148bp的目的条带，从新型鸭呼肠孤病毒与鸭甲肝病毒（A、B、C三种基因型）混合物中扩增到304bp和148bp两条目的条带，而对番鸭呼肠孤病毒、鸭瘟病毒、鸭坦布苏病毒、鸭副粘病毒扩增不出任何条带，如图5-6所示。
4.双重PCR的敏感性
按照TRIZol试剂说明分别提取鸭甲肝病毒（A、B、C三种基因型）和新型鸭呼肠孤病毒的RNA，利用分光光度计测定RNA的含量，并将这些RNA都稀释至1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、0.1pg/μL、0.01pg/μL、0.001pg/μL等七个浓度（即RT-PCT体系检测的RNA含量分别为1ng、100pg、10pg、1pg、0.1pg、0.01pg、0.001pg），然后进行RT-PCR。反应结束后，各取5μL PCR产物加入1.5℅琼脂糖凝胶中进行电泳观察。结果：A、B、C型鸭甲肝病毒RNA的最低检出量均为1pg，新型鸭呼肠孤病毒RNA的最低检出量也为1pg，如附图1-4所示。
5.双重PCR的重复性
利用该双重PCR方法分别对A型DHAV阳性和NDRV阳性的病料进行扩增，各重复三次，确定其重复性。结果：三次重复均能扩增出目的条带，且条带的亮度基本一致。如附图7-8所示。
6.鉴别鸭甲肝病毒与新型鸭呼肠孤病毒感染的试剂盒（50次），包括以下成分：
1）TRIZol：50ml；
2）RT反应液：900μL，包括10mmol/L dNTP50μL、5×RT缓冲液200μL、20pmol/μL检测引物DHA1、DHA2、NDR1、NDR2各50μL、40U/μL RNA酶抑制剂25μL、DEPC水425μL；
3）反转录酶M-MLV：50μL，浓度为200U/μL；
4）PCR反应液4500μL：ddH2O4000μL、10×PCR缓冲液450μL、5U/μL Taq DNA聚合酶50μL；
5）阳性质粒：重组质粒T-DHA和T-NDR混合物250μL，终浓度均为0.1ng/μL；
6）DEPC处理水：2ml。
7.试剂盒操作步骤：
1）RNA提取：取200μL待测鸭的病料匀浆液，加入1ml TRIZol，充分震荡，静置10min后加入200μL氯仿，充分混匀，静置5min后，12000rpm离心10min，取上清加入等体积的异丙醇，充分混匀后，放-20℃静置至少1h。然后12000rpm离心15min，弃掉上清，加入75%酒精500μL，12000rpm离心5min，弃掉上清，RNA沉淀干燥后加入10μL DEPC处理水，备用；
2）RT反应：取RT反应液18μL，加入上述RNA1μL，混匀后放PCR仪中70℃作用5min，然后加入反转录酶M-MLV1μL，混匀后，放PCR仪中42℃30min，95℃2min，结束后取出进行后续的PCR反应；
3）PCR反应：取PCR反应液45μL，加入上述RT产物5μL，混匀后按下面的程序进行反应：95℃2min预变性；94℃变性15sec、55℃退火15sec、72℃延伸20sec，共30个循环；72℃延伸5min；
4）阳性对照：取PCR反应液45μL，加入阳性质粒5μL，混匀后按下面的程序进行反应：95℃2min预变性；94℃变性15sec、55℃退火15sec、72℃延伸20sec，共30个循环；72℃延伸5min；
5）电泳观察：取5μL PCR产物加入1.5℅琼脂糖凝胶中进行电泳观察，若出现约300bp的条带，可判断为鸭甲肝病毒阳性；若出现约150bp的条带，可判断为新型鸭呼肠孤病毒阳性；若300bp和150bp的条带均出现，则可判断为鸭甲肝病毒和新型鸭呼肠孤病毒混合感染。
8.临床应用
临床应用检验的样品为不同时期不同鸭场送检的样品50份。应用本试剂盒和病毒分离鉴定同时检测送检样品，比较两种方法的符合率。
本试剂盒检出鸭甲肝病毒阳性病料为27份，阳性检出率为54%，而病毒分离鉴定检出阳性病料25份，阳性检出率为50%，两种方法的符合率为96%（如表1所示）。
表1试剂盒与病毒分离鉴定比较（鸭甲肝病毒）
注：检出符合率=（共同阳性数+共同阴性数）/总样品数×100%
本试剂盒检出新型鸭呼肠孤病毒阳性病料为7份，阳性检出率为14%，而病毒分离鉴定检出阳性病料4份，阳性检出率为8%，两种方法的符合率为94%（如表2所示）。
表2试剂盒与病毒分离鉴定比较（新型鸭呼肠孤病毒）
注：检出符合率=（共同阳性数+共同阴性数）/总样品数×100%
Claims (4)
1.一种鉴别鸭甲肝病毒与新型鸭呼肠孤病毒感染的试剂盒，其特征是，该试剂盒不仅能鉴别出是鸭甲肝病毒感染还是新型鸭呼肠孤病毒感染，还能检测出两者混合感染；它包括下述引物，其中用于鸭甲肝病毒DHA检测的引物为：
上游引物DHA1：5'-CTTTCYATCAATGACCARCG-3'；
下游引物DHA2：5'-GHADTTGMTCCATAACATCCTG-3'，
其中R＝A或者G；M＝A或者C；Y＝C或者T；H＝A、T或者C；D=G、A或者T；
扩增片段大小为304bp；
用于新型鸭呼肠孤病毒NDRV检测的引物为：
上游引物NDR1：5'-GTAAGCAACCTCAGGATATCG-3'；
下游引物NDR2：5'-TCATGTCGCGCGTCGTAT-3'；
扩增片段大小为148bp。
2.如权利要求1所述的一种鉴别鸭甲肝病毒与新型鸭呼肠孤病毒感染的试剂盒，其特征是，按50次量计包括以下组分：
1）TRIZol：50ml；
2）RT反应液：900μL，包括10mmol/L dNTP50μL、5×RT缓冲液200μL、20pmol/μL检测引物DHA1、DHA2、NDR1、NDR2各50μL、40U/μL RNA酶抑制剂25μL、DEPC水425μL；
3）反转录酶M-MLV：50μL，浓度为200U/μL；
4）PCR反应液4500μL：ddH2O4000μL、10×PCR缓冲液450μL、5U/μL Taq DNA聚合酶50μL；
5）阳性质粒：重组质粒T-DHA和T-NDR混合物250μL，终浓度均为0.1ng/μL；
6）DEPC处理水：2ml。
3.如权利要求2所述的一种鉴别鸭甲肝病毒与新型鸭呼肠孤病毒感染的试剂盒，其特征是，所述重组质粒T-DHA的制备方法为：提取A型鸭甲肝病毒RNA，利用引物DHA1/DHA2进行RT-PCR，扩增目的条带，反应条件如下：
RT反应体系：10mmol/L dNTP1.0μL、5×RT缓冲液4.0μL、20pmol/μL的引物DHA21.0μL、40U/μL RNA酶抑制剂0.5μL、RNA模板1μL、DEPC水11.5μL；置于PCR扩增仪进行反应，200U/μL反转录酶M-MLV1μL于70℃5min后加入；反应程序：70℃5min，42℃30min，95℃2min；
PCR反应体系：ddH2O39μL、20pmol/μL引物DHA11.0μL、10×PCR缓冲液4.5μL、5U/μLTaq DNA聚合酶0.5μL、RT产物5.0μL；置于PCR扩增仪进行反应，反应程序：95℃2min预变性；94℃变性15sec、55℃退火15sec、72℃延伸20sec，共30个循环；72℃延伸5min。
回收目的条带，与载体pMD18-T连接，转化DH5α感受态细胞，提取质粒，PCR鉴定阳性后测序，序列正确的质粒标记为T-DHA作为鸭甲肝病毒的阳性对照。
4.如权利要求2或3所述的一种鉴别鸭甲肝病毒与新型鸭呼肠孤病毒感染的试剂盒，其特征是，所述重组质粒T-NDR的制备方法为：提取新型鸭呼肠孤病毒RNA，利用引物NDR1/NDR2进行RT-PCR，扩增目的条带，反应条件如下：
RT反应体系：10mmol/L dNTP1.0μL、5×RT缓冲液4.0μL、20pmol/μL引物NDR1、NDR2各1.0μL、40U/μL RNA酶抑制剂0.5μL、RNA模板1μL、DEPC水10.5μL；置于PCR扩增仪进行反应，200U/μL反转录酶M-MLV1μL于70℃5min后加入；反应程序：70℃5min，42℃30min，95℃2min；
PCR反应体系：ddH2O40μL、10×PCR缓冲液4.5μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL、RT产物5.0μL；置于PCR扩增仪进行反应，反应程序：95℃2min预变性；94℃变性15sec、55℃退火15sec、72℃延伸20sec，共30个循环；72℃延伸5min；
回收目的条带，与载体pMD18-T连接，转化DH5α感受态细胞，提取质粒，PCR鉴定阳性后测序，序列正确的质粒标记为T-NDR作为新型鸭呼肠孤病毒的阳性对照。
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