CN105886654B - 一种区别鸭和鹅三种常见致病菌的引物及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于区别鸭和鹅三种常见致病菌的引物及方法根据鸭疫里默氏菌外膜蛋白A基因、禽源多杀性巴氏杆菌KMT1基因、大肠杆菌glyceraldehyde‑3‑phosphate dehydrogenase A基因的保守序列设计三对特异性引物，分别标记于猪线粒体基因片段的两端形成三种不同的捕获探针，将捕获探针与待检测菌的基因组杂交、补平缺口、环化后，采用1对引物反向扩增捕获探针，鸭疫里默氏菌、禽源多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌的扩增大小分别为504 bp、422 bp和328 bp。目前尚未见仅用一对引物就能区别鸭疫里默氏菌、禽源多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌的PCR方法。

Description

一种区别鸭和鹅三种常见致病菌的引物及方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于区别鸭和鹅三种常见致病菌的引物及方法，具体为一种区别鸭和鹅的鸭疫里默氏菌病、禽霍乱和大肠杆菌病的引物及方法。
背景技术
鸭疫里默氏菌感染常引起雏鸭和雏鹅大批发病和死亡，降低饲料转化率，增加胴体淘汰率，增加治疗费用，病变主要表现为纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎和脑膜炎。禽霍乱是由禽源多杀性巴氏杆菌引起的危害鸭和鹅的一种慢性或急性接触性、败血性传染病，病变的主要特征为心冠脂肪出血、肝脏坏死和肠道粘膜出血。大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起鸭和鹅全身或局部感染的一种细菌性传染病，临床上最常见的病型是败血症，病变主要表现为心包炎、腹膜炎和气囊炎。三种细菌病的病变特征有很大的相似之处，临床上容易混淆。由于三种细菌的耐药特点差异较大，一旦误诊，导致用药不当，会造成严重的经济损失。实际生产中迫切需要建立一种快速区别三种细菌的方法以指导疾病的诊断和药物的选择从而减少经济损失。目前已有检测鸭疫里默氏菌的PCR方法、检测禽源多杀性巴氏杆菌的PCR方法、检测大肠杆菌的PCR方法、检测鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的双重PCR方法，但目前尚未见仅用一对引物就能区别鸭疫里默氏菌、禽源多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌的PCR方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于区别鸭和鹅三种常见致病菌的引物及方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
用于区别三种细菌的引物，所述的引物包括如下：
鸭疫里默氏菌捕获探针的引物：
RTZF：ATGGACTTAAGGTTCCAACGCATTAACTGCTAGTCCCCAT，
RTZR：CATATCAGCACAGAGTTTATCTGCCGGATCATGAGTTCC；
禽源多杀性巴氏杆菌捕获探针的引物：
FTZF：AGATGATTCGATGGGCGAAGCATTAACTGCTAGTCCCCAT，
FTZR：GTATTTCGAGTGTACCGAGTGCCGGATCATGAGTTCC；
大肠杆菌捕获探针的引物：
ETZF：GTGAGTGCCGGCAAAGCTGGCATTAACTGCTAGTCCCCAT，
ETZR：TTACGCTGGCTATGCCGGTTGCCGGATCATGAGTTCC；
能同时检测鸭和鹅三种致病菌的检测引物：
TZTF：CGTCAAAGGCCCTAACACAGT，
TZTR：GGTGATACGCATGTTGACTGG。
具体方法为：
1）捕获探针的制备：提取猪精肉的DNA，配成100 ng/μL的浓度做为模板，分别与鸭疫里默氏菌捕获探针的引物（RTZF/ RTZR）、禽源多杀性巴氏杆菌捕获探针的引物（FTZF/FTZR）和大肠杆菌捕获探针的引物（TZTF/ TZTR）配制PCR反应体系，总量为50 μL：25 μLDream Taq Green PCR Master Mix（2×）、浓度为10 μM的上游引物1 μL、浓度为10 μM的下游引物1 μL、1 μL模板、22 μL ddH2O；PCR反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，52℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min；分别凝胶回收PCR产物，制成不同细菌的捕获探针；
2）检测引物的设计：设计检测引物，鸭疫里默氏菌应扩增出540 bp的特异性片段，禽源多杀性巴氏杆菌应扩增出422 bp的特异性片段，大肠杆菌应扩增出328 bp的特异性片段，序列如下：
TZTF：CGTCAAAGGCCCTAACACAGT，
TZTR：GGTGATACGCATGTTGACTGG；
3）鸭疫里默氏菌、禽源多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌的PCR检测：配制PCR反应体系，总量为30 μL：3 μL连接酶buffer、3 μL Taq 酶buffer、1 μL连接酶、1 μL Taq 酶、浓度为10 mM dNTP2 μL、浓度为10 μM的检测上游引物即TZTF 1 μL、浓度为10 μM的检测下游引物即TZTR 1 μL、浓度为1 pg/μL的鸭疫里默氏菌捕获探针 2 μL、浓度为1 pg/μL的禽源多杀性巴氏杆菌捕获探针2 μL、浓度为1 pg/μL的大肠杆菌捕获探针2 μL、含100 ng DNA的模板、补足ddH2O至30 μL。反应程序为94℃预变性5 min；94℃变性50 s ，50℃退火10 min，6个循环，然后94℃变性30 s，50℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环，最后72 ℃延伸10min。
本发明的优点在于：
与检测鸭疫里默氏菌的PCR方法、检测多杀性巴氏杆菌的PCR方法、检测大肠杆菌的PCR方法相比，本方法能在一个PCR反应体系和一次PCR反应中同时检测三种细菌，减轻工作量并节省时间，达到快速的目的。与检测鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的双重PCR方法相比，特异性更好，准确度更高，因为双重PCR方法设计时比普通PCR难度更高，必须考虑引物和引物之间、引物本身、产物和产物之间不能有错配，相对而言，双重PCR方法的特异性较差，假阳性或假阴性的概率较大。三重PCR方法对引物设计的要求、PCR反应体系的优化等提出更高的要求，所以目前没有这三种细菌的三重PCR检测方法。
附图说明
图1鸭疫里默氏菌的PCR检测，其中1、DNA分子量标准DL2000；2、鸭疫里默氏菌；3、ddH2O。
图2禽源多杀性巴氏杆菌的PCR检测，其中1、DNA分子量标准DL2000；2、禽源多杀性巴氏杆菌；3、ddH2O。
图3大肠杆菌的PCR检测，其中1、DNA分子量标准DL2000；2、大肠杆菌；3、ddH2O。
图4鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的PCR检测，其中1、DNA分子量标准DL2000；2、鸭疫里默氏菌、禽源多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌；3、鸭疫里默氏菌；4、禽源多杀性巴氏杆菌；5、大肠杆菌；6、ddH2O。
具体实施方式
实施例1
1捕获探针的制备 将猪精肉剪碎，加适量水研磨，按试剂盒的方法提取基因组DNA，用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定核酸浓度，配成100 ng/μL的浓度。用鸭疫里默氏菌捕获探针的引物、禽源多杀性巴氏杆菌捕获探针的引物和大肠杆菌捕获探针的引物（见表1）分别配制PCR反应体系，总量为50 μL：25 μL Dream Taq Green PCR Master Mix（2×）、1 μL上游引物（10 μM）、1 μL下游引物（10 μM）、1 μL模板、22 μL ddH2O。PCR反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，52℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环，最后72℃延伸10 min。分别凝胶回收PCR产物，用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定核酸浓度，配成1 pg/μL的浓度，冰冻保存备用。
表1 制作探针的引物
2检测引物的设计 设计检测引物，鸭疫里默氏菌应扩增出540 bp的特异性片段，禽源多杀性巴氏杆菌应扩增出422 bp的特异性片段，大肠杆菌应扩增出328 bp的特异性片段，序列如下：
TZTF：CGTCAAAGGCCCTAACACAGT
TZTR：GGTGATACGCATGTTGACTGG
3鸭疫里默氏菌的PCR检测 挑取鸭疫里默氏菌菌落10个左右，按试剂盒的方法提取基因组DNA，用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定核酸浓度，配成100 ng/μL的浓度。配制PCR反应体系，总量为30 μL：3 μL连接酶buffer、3 μL Taq 酶buffer、1 μL连接酶、1 μL Taq 酶、2 μL dNTP（10 mM）、1 μL检测上游引物（10 μM）、1 μL检测下游引物（10 μM）、2 μL鸭疫里默氏菌捕获探针（1 pg/μL）、15 μL ddH2O 、模板用1 μL鸭疫里默氏菌核酸（100ng/μL）或1 μL ddH2O为空白对照。反应程序为94℃预变性5 min；94℃变性50 s ，50℃退火10 min，6个循环，然后94℃变性30 s，50℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环，最后72 ℃延伸10 min。凝胶检测，空白对照无PCR产物，鸭疫里默氏菌核酸可扩增出特异性PCR产物，片段大小约为540 bp，见图1。
4禽源多杀性巴氏杆菌的PCR检测 挑取禽源多杀性巴氏杆菌菌落10个左右，按试剂盒的方法提取基因组DNA，用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定核酸浓度，配成100ng/μL的浓度。配制PCR反应体系，总量为30 μL：3 μL连接酶buffer、3 μL Taq 酶buffer、1μL连接酶、1 μL Taq 酶、2 μL dNTP（10 mM）、1 μL检测上游引物（10 μM）、1 μL检测下游引物（10 μM）、2 μL禽源多杀性巴氏杆菌捕获探针（1 pg/μL）、15 μL ddH2O 、模板用1 μL禽源多杀性巴氏杆菌核酸（100 ng/μL）或1 μL ddH2O为空白对照。反应程序为94℃预变性5min；94℃变性50 s ，50℃退火10 min，6个循环，然后94℃变性30 s，50℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环，最后72 ℃延伸10 min。凝胶检测，空白对照无PCR产物，禽源多杀性巴氏杆菌核酸可扩增出特异性PCR产物，片段大小约为422 bp，见图2。
5大肠杆菌的PCR检测 挑取大肠杆菌菌落10个左右，按试剂盒的方法提取基因组DNA，用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定核酸浓度，配成100 ng/μL的浓度。配制PCR反应体系，总量为30 μL：3 μL连接酶buffer、3 μL Taq 酶buffer、1 μL连接酶、1 μL Taq 酶、2 μL dNTP（10 mM）、1 μL检测上游引物（10 μM）、1 μL检测下游引物（10 μM）、2 μL大肠杆菌捕获探针（1 pg/μL）、15 μL ddH2O、模板用1 μL大肠杆菌核酸（100 ng/μL）或1 μL ddH2O为空白对照。反应程序为94℃预变性5 min；94℃变性50 s ，50℃退火10 min，6个循环，然后94℃变性30 s，50℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环，最后72 ℃延伸10 min。凝胶检测，空白对照无PCR产物，大肠杆菌核酸可扩增出特异性PCR产物，片段大小约为328 bp，见图3。
6鸭疫里默氏菌、禽源多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌的PCR检测 配制PCR反应体系，总量为30 μL：3 μL连接酶buffer、3 μL Taq 酶buffer、1 μL连接酶、1 μL Taq 酶、2 μLdNTP（10 mM）、1 μL检测上游引物（10 μM）、1 μL检测下游引物（10 μM）、2 μL鸭疫里默氏菌捕获探针（1 pg/μL）、2 μL禽源多杀性巴氏杆菌捕获探针（1 pg/μL）、2 μL大肠杆菌捕获探针（1 pg/μL）、9 μL ddH2O、模板用1 μL鸭疫里默氏菌核酸（100 ng/μL）、1 μL禽源多杀性巴氏杆菌核酸（100 ng/μL）和1 μL大肠杆菌核酸（100 ng/μL）或1 μL鸭疫里默氏菌核酸（100ng/μL）和2 μL ddH2O或1 μL禽源多杀性巴氏杆菌核酸（100 ng/μL）和2 μL ddH2O或1 μL大肠杆菌核酸（100 ng/μL）和2 μL ddH2O或3 μL ddH2O为空白对照。反应程序为94℃预变性5min；94℃变性50 s ，50℃退火10 min，6个循环，然后94℃变性30 s，50℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环，最后72 ℃延伸10 min。凝胶检测，空白对照无PCR产物，三种核酸可扩增出三个片段，大小约为540 bp、422 bp和328 bp，一种核酸只能扩增出相应大小的片段，见图4。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 一种区别鸭和鹅三种常见致病菌的引物及方法
<130> 8
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggacttaa ggttccaacg cattaactgc tagtccccat 40
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
catatcagca cagagtttat ctgccggatc atgagttcc 39
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agatgattcg atgggcgaag cattaactgc tagtccccat 40
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gtatttcgag tgtaccgagt gccggatcat gagttcc 37
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gtgagtgccg gcaaagctgg cattaactgc tagtccccat 40
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ttacgctggc tatgccggtt gccggatcat gagttcc 37
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cgtcaaaggc cctaacacag t 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ggtgatacgc atgttgactg g 21

Claims (2)

1.一种区别鸭和鹅三种常见致病菌的引物，其特征在于：所述的引物包括如下：
鸭疫里默氏菌捕获探针的引物：
RTZF：ATGGACTTAAGGTTCCAACGCATTAACTGCTAGTCCCCAT，
RTZR：CATATCAGCACAGAGTTTATCTGCCGGATCATGAGTTCC；
禽源多杀性巴氏杆菌捕获探针的引物：
FTZF：AGATGATTCGATGGGCGAAGCATTAACTGCTAGTCCCCAT，
FTZR：GTATTTCGAGTGTACCGAGTGCCGGATCATGAGTTCC；
大肠杆菌捕获探针的引物：
ETZF：GTGAGTGCCGGCAAAGCTGGCATTAACTGCTAGTCCCCAT，
ETZR：TTACGCTGGCTATGCCGGTTGCCGGATCATGAGTTCC；
能同时检测鸭和鹅三种致病菌的检测引物：
TZTF：CGTCAAAGGCCCTAACACAGT，
TZTR：GGTGATACGCATGTTGACTGG；
制备捕获探针时采用的扩增模板为猪源模板。
2.如权利要求1所述的引物在制备检测鸭疫里默氏菌、禽源多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌的试剂盒中的应用。
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鸭疫里默氏杆菌PCR快速检测方法的建立与应用;林树乾等;《山东农业科学》;20091231;107-110 *
鸭疫里默氏菌病和大肠杆菌病鉴别诊断双重PCR方法的建立和应用;覃宗华等;《畜牧兽医学报》;20081231;517-521 *

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