CN109576393B - 硬叶兜兰基因组ssr分子标记引物组及其开发方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了硬叶兜兰基因组SSR分子标记引物组及其开发方法和应用，属于SSR分子标记技术领域。硬叶兜兰基因组SSR分子标记引物组，包括核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1～58所示的29对引物。所述29对引物经过试验验证能扩增出清晰稳定条带。经过微卫星开发试验挑选出了240个阳性克隆并进行测序，其中180个(75.0％)克隆含有微卫星序列；根据引物设计的原则，共设计并合成了102对引物。根据PCR扩增及筛选，共有29对引物成功扩增出清晰稳定的条带。本发明提供的引物组能大大丰富硬叶兜兰遗传研究的手段，为将来对硬叶兜兰进行进一步的遗传分析和品种鉴定的研究提供技术基础。
Description
技术领域
本发明属于SSR分子标记技术领域，具体涉及硬叶兜兰基因组SSR分子标记引物组及其开发方法和应用。
背景技术
硬叶兜兰(Paphiopedilum micranthum)兰科，兜兰属，地生或半附生植物。叶基生；数枚至多枚，叶片带形、革质。花葶从叶丛中长出，花苞片非叶状；子房顶端常收狭成喙状；花大而艳丽，有种种色泽；中萼直立，花粉粉质或带粘性，退化雄蕊扁平；柱头肥厚，下弯，柱头面有乳突，果实为蒴果。兜兰花比较雅致，色彩比较庄重，带有不规则斑点或条纹。花瓣较厚，花朵开放期比较长，具有较好的观赏价值。同时硬叶兜兰全草入药，味苦、性凉，具有清热解毒、补脑安神的功能，可用于麻疹、肺炎、神经衰弱的治疗中。
近年来，硬叶兜兰研究主要开展了种群生态和空间遗传结构等研究，例如Li和Quiros采用RAPD分子标记对4个居群的遗传结构进行初步研究，表明硬叶兜兰在物种水平的遗传多样性高于居群水平，经分子方差分析有20.3％的遗传多样性来自于居群间的分化。SSR分子标记具有使用简便、快速、稳定性高、等位基因多样性高以及可做共显性的等位基因分析等特点，目前已成为一种主要的分子标记技术，被广泛应用于植物遗传分析及品种鉴定等多方面研究领域。目前还没有利用SSR分子标记分析硬叶兜兰等位基因多样性的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供硬叶兜兰基因组SSR分子标记引物组及其开发方法和应用，丰富这硬叶兜兰遗传研究的手段，为将来对硬叶兜兰进一步遗传分析和品种鉴定提供技术基础。
本发明提供的硬叶兜兰基因组SSR分子标记引物组，包括以下29对引物：核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1～58所示的引物。
本发明提供了所述硬叶兜兰基因组SSR分子标记引物组的开发方法，包括以下步骤：
1)提取硬叶兜兰的基因组DNA；
2)用限制性内切酶对步骤1)中所述基因组DNA进行酶切，所得酶切产物和MseI接头连接，得到连接产物；
3)以步骤2)中所述连接产物为模板，用Mse I-N引物预扩增，得到预扩增产物；所述Mse I-N引物的核苷酸序列如SEQ ID No.59所示；
4)将步骤3)中所述预扩增产物用探针组进行杂交，得到杂交产物；
所述探针组包括(AC)15生物素探针、(AG)15生物素探针和(AAG)10生物素探针；
5)将步骤4)中所述杂交产物经磁分离，纯化，得到纯化的DNA片段；
6)将步骤5)中纯化的DNA片段用Mse I-N引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物以重组载体的形式转入原核表达系统中，经诱导培养，筛选阳性克隆；
7)对所述阳性克隆进行测序，对得到的阳性克隆的序列进行微卫星分析，按照筛选标准筛选得到SSR分子标记；
8)以步骤7)中所述SSR分子标记为模板设计引物，筛选，得到硬叶兜兰基因组SSR分子标记引物组。
优选的，步骤7)中所述筛选标准包括选择AC、AG和AAG中一种式样、所述式样连续分布和所述式样重复次数在6次以上。
优选的，步骤7)中微卫星重复序列的位置应处于序列的中部，两端的非重复碱基数应该在20个以上。
优选的，步骤3)和步骤6)中用Mse I-N引物扩增的反应体系如下：
优选的，步骤3)和步骤6)中用Mse I-N引物扩增的反应程序如下：
95℃，3min；94℃，30s；53℃，60s；35个循环；72℃，60s。
优选的，所得酶切产物和MseI接头连接的反应体系：
优选的，步骤2)中所得酶切产物和MseI接头连接的反应条件：37℃，2h；所述连接完成后，在65℃灭活10min。
优选的，杂交时的反应体系如下：
反应体系1：PCR产物 30μL
150～300pmol探针组 1.5μL
反应体系2：20×SSC 52.5μL
质量浓度10％SDS 1.75μL
ddH2O 164.25μL；
杂交时的反应条件：95℃变性5min，48℃保温2h。
本发明提供了所述的硬叶兜兰基因组SSR分子标记引物组或所述的开发方法得到的硬叶兜兰基因组SSR分子标记引物组在植物遗传分析或品种鉴定中的应用。
本发明提供的硬叶兜兰基因组SSR分子标记引物组，包括以下29对引物：核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1～58所示的引物。所述29对引物经过试验验证能扩增出清晰稳定条带。经过微卫星开发试验挑选出了240个阳性克隆并进行测序，其中180个(75.0％)克隆含有微卫星序列；根据引物设计的原则，共设计并合成了102对引物。根据PCR扩增及筛选，共有29对引物成功扩增出清晰稳定的条带。本发明提供的引物组能大大丰富硬叶兜兰遗传研究的手段，为将来对硬叶兜兰进行进一步的遗传分析和品种鉴定的研究提供技术基础。
附图说明
图1为本发明利用H169SSR引物对鉴别三种兜兰DNA材料的电泳图。
具体实施方式
本发明提供的硬叶兜兰基因组SSR分子标记引物组，包括以下29对引物：核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1～58所示的引物。所述引物组的来源可以委托基因合成公司合成得到。所述引物组中各引物对的序列信息及退火温度见表1：
本发明提供了所述硬叶兜兰基因组SSR分子标记引物组的开发方法，包括以下步骤：
1)提取硬叶兜兰的基因组DNA；
2)用限制性内切酶对步骤1)中所述基因组DNA进行酶切，所得酶切产物和MseI接头连接，得到连接产物；
3)以步骤2)中所述连接产物为模板，用Mse I-N引物预扩增，得到预扩增产物；所述Mse I-N引物的核苷酸序列如SEQ ID No.59所示；
4)将步骤3)中所述预扩增产物用探针组进行杂交，得到杂交产物；
所述探针组包括(AC)15生物素探针、(AG)15生物素探针和(AAG)10生物素探针；
5)将步骤4)中所述杂交产物经磁分离，纯化，得到纯化的DNA片段；
6)将步骤5)中纯化的DNA片段用Mse I-N引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物以重组载体的形式转入原核表达系统中，经诱导培养，筛选阳性克隆；
7)对所述阳性克隆进行测序，对得到的阳性克隆的序列进行微卫星分析，按照筛选标准筛选得到SSR分子标记；
8)以步骤7)中所述SSR分子标记为模板设计引物，筛选，得到硬叶兜兰基因组SSR分子标记引物组。
本发明提取硬叶兜兰的基因组DNA。
在本发明中，所述提取硬叶兜兰的基因组DNA的方法是在改良CTAB法的基础上，在加入4×CTAB裂解液之前，先加入去糖缓冲液进行抽提，将多糖和色素尽可能去除，最终得到质量较好的DNA。
提取得到基因组DNA后，对所述DNA的浓度测定以及去除RNA。所述去除RNA的方法优选为采用RNA酶法降解。
得到基因组DNA，本发明用限制性内切酶对步骤1)中所述基因组DNA进行酶切，所得酶切产物和MseI接头连接，得到连接产物。
在本发明中，所述限制性内切酶优选为限制性内切酶-MseI。所述酶切的反应体系如下：
所述酶切的反应条件：37℃，3h，酶切结束后，65℃，10min将内切酶灭活。
酶解后，优选将得到的酶解产物进行电泳检测：1.5％琼脂糖，100V电泳20min，点样8μL，剩余15μL用于连接。
在本发明中，所得酶切产物和MseI接头连接的反应体系优选如下：
所得酶切产物和MseI接头连接的反应条件优选如下：37℃，2h；所述连接完成后，在65℃灭活10min。
得到连接产物后，本发明以所述连接产物为模板，用Mse I-N引物预扩增，得到预扩增产物；所述Mse I-N引物的核苷酸序列如SEQ ID No.59所示。
在本发明中，用Mse I-N引物扩增的反应体系优选如下：
用Mse I-N引物扩增的反应程序优选如下：
95℃，3min；94℃，30s；53℃，60s；35个循环；72℃，60s。
在本发明中，用Mse I-N引物预扩增得到预扩增产物能够得到单链DNA片段，便于后续与探针组杂交。所述Mse I-N引物：5‘-gatgagtcctgagtaan-3’，其中N表示A、G、T或C。
得到扩增产物后，本发明将所述预扩增产物用探针组进行杂交，得到杂交产物；所述探针组包括(AC)15生物素探针、(AG)15生物素探针和(AAG)10生物素探针。
在本发明中，所述杂交时的反应体系优选如下：
反应体系1：PCR产物 30μL
150～300pmol探针组 1.5μL
反应体系2：20×SSC 52.5μL
质量浓度10％SDS 1.75μL
ddH2O 164.25μL；
杂交时的反应条件：95℃变性5min，48℃保温2h。在本发明中，所述杂交是将探针组中(AC)15生物素探针、(AG)15生物素探针和(AAG)10生物素探针与扩增产物的序列互补配对。所述探针组中(AC)15生物素探针、(AG)15生物素探针和(AAG)10生物素探针的数量比为1：1：1。所述(AC)15生物素探针、(AG)15生物素探针和(AAG)10生物素探针的来源委托上海生工生物工程股份有限公司合成。
得到杂交产物后，本发明将所述杂交产物经磁分离，纯化，得到纯化的DNA片段。
在本发明中，所述磁分离的方法优选如下：将所有杂交产物与600μL TEN100混合，加入磁珠中，室温温育30min。温育结束后用磁力柱吸附磁珠。多次洗涤后加入50μLTE，95℃水浴5min洗脱，将洗脱液迅速转移至另一洁净的EP管中。
在本发明中，所述纯化的方法优选包括以下步骤：将以上所得洗脱加入10％体积3MNaAc(pH＝5.2)，混匀，再加入等体积预冷异丙醇，沉淀过夜；然后13000rpm，4℃离心30min，小心倒去上清，加入75％乙醇500μL，混匀，再4℃离心15min，小心倒去上清，干燥后，加入16μL水。
得到纯化后的DNA片段后，本发明将纯化的DNA片段用Mse I-N引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物以重组载体的形式转入原核表达系统中，经诱导培养，筛选阳性克隆。
在本发明中，所述用Mse I-N引物进行PCR扩增的反应体系和反应程序同上，在此不做赘述。
在本发明中，所述PCR扩增产物以重组载体的形式转入原核表达系统中将PCR产物连接到PGEM-T载体上转入到大肠杆菌感受态细胞中。
在本发明中，筛选阳性克隆的方法优选为蓝白斑筛选和菌落PCR扩增。
得到阳性克隆后，本发明对所述阳性克隆进行测序，对得到的阳性克隆的序列进行微卫星分析，按照筛选标准筛选得到SSR分子标。
在本发明中，所述微卫星分析用软件优选为Tandem Repeats Finder 4.0软件。所述筛选标准包括选择AC、AG和AAG中一种式样、所述式样连续分布和所述式样重复次数在6次以上。微卫星重复序列的位置应处于序列的中部，两端的非重复碱基数应该在20个以上，便于引物的设计。
得到SSR分子标记后，本发明以所述SSR分子标记为模板设计引物，筛选，得到硬叶兜兰基因组SSR分子标记引物组。
在本发明中，所述引物设计的用软件优选为Primer 5.0软件。
在本发明中，所述引物的设计主要遵守以下几点原则：
(1)引物长度一般为18-22bp，以20bp最为常用；
(2)GC含量一般为40-60％，以50％为最优；
(3)Tm值一般为45-65℃,以55℃为最佳；
(4)正反向引物间GC含量之差应控制在10％内，Tm值之差应控制在5℃内；
(5)产物长度一般为200-400bp。
在本发明中，所述筛选的方法优选将设计得到的引物对硬叶兜兰2个居群共24个个体DNA进行PCR扩增。将扩增产物在1.5～2％的琼脂糖凝胶上电泳进行预检测，紫外灯下观察。理想的扩增产物在琼脂糖凝胶电泳检测中应该只有一条带，而且带要细而清晰，否则在后续的聚丙烯凝胶电泳下检测到的非特异条带会很多。
本发明提供了所述的硬叶兜兰基因组SSR分子标记引物组或所述的开发方法得到的硬叶兜兰基因组SSR分子标记引物组在植物遗传分析或品种鉴定中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的硬叶兜兰基因组SSR分子标记引物组及其开发方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.材料与方法
1.1实验材料
采用采集硬叶兜兰新鲜叶片为材料进行微卫星引物的开发。
1.2硬叶兜兰总DNA提取
硬叶兜兰叶片较厚，叶片寿命较长，因此叶片组织中含有较多的酚类、色素及多糖类物质，在抽提过程中经常会出现粘稠的胶状物质，对上清液的吸出造成很大的困难。而且最终提出来的总DNA色素及多糖较多，经常呈现果冻状凝块。电泳检测时，胶孔发亮，主带不明显。因此，本研究在改良CTAB法的基础上，在加入4×CTAB裂解液之前，先加入去糖缓冲液进行抽提，将多糖和色素尽可能去除，最终得到质量较好的DNA。具体步骤如下：
1、取硬叶兜兰新鲜叶片，液氮急冻3～4次，急速研磨，取2勺粉末于5mL管中，放于冰块中。
2、加2mL去糖Buffer(内含0.1％的DTT)，混匀，冰浴10min。
3、离心(10000～12000rpm)5-10min，倒掉上清液。
5、取出管子，自然冷却至室温，加入2mL的氯仿和异戊乙醇体积比24：1的混合液混匀，不断轻轻摇晃5～10min。
6、离心(10000～12000rpm)10min，吸取上清液1.8mL。加入2mL的24：1混匀，不断轻轻摇晃5～10min。离心(10000～12000rpm)10min，吸取上清液1.6mL。
7、加入70％(体积比)异丙醇1.1mL，混匀，置于－20度冰箱中30min(沉降DNA)。
8、离心(10000～12000rpm)10min，倒掉上清液，加入70％乙醇清洗1遍，转入2mL的管子，再加入70％乙醇清洗1遍(每次倒掉清洗液前可进行离心(10000～12000rpm)10min)。
9、离心(10000－12000rpm)10min，倒掉70％乙醇，加入无水乙醇清洗2遍，每次倒掉清洗液前可进行离心(10000～12000rpm)10min。
10、冷冻干燥5min，用ddH2O溶解，加入1μLRNA酶温育30min(37℃)，用紫外分光光度计uV—240检测DNA纯度与浓度，按比例稀释到所需浓度后置于-20℃冰箱保存备用。
1.3硬叶兜兰微卫星分子标记开发
主要操作规程如下：
1、取质量较好的硬叶兜兰总DNA，浓度在250ng左右，并去除RNA，用限制性内切酶-MseI酶切。
反应条件：37℃,3h，酶切结束后，65℃，10min将内切酶灭活。
电泳检测：1.5％琼脂糖，100V电泳20min，点样8μL，剩余15μL用于连接。
2、将酶切产物用Fermentas连接酶连接到MseI接头上。
反应条件：37℃，2h。连接完成后，65℃，10min灭活。
3、连接产物用Mse I-N进行预扩增，然后电泳检测。理想的扩增产物应该是200～800bp均匀弥散分布，没有主带。扩增循环次数的不同就会导致产物的浓度以及均匀度不同，也就是在最优的循环次数下，产物是均匀弥散分布，而且亮度适中，而那些非最优循环次数的产物会产生主带，或者产物不够。
反应条件：95℃,3min；94℃,30s；53℃，60s；72℃，60s；
4、上述扩增产物用(AC)15、(AG)15和(AAG)10生物素探针进行杂交。加入探针的量可以根据PCR产物的量适当的调整，一般在整个体系中加入150～300pmol。
反应体系1：PCR产物 30μL
(AC)15/(AG)15/(AAG)10(100pmol/μL) 1.5μL
反应体系2：20×SSC 52.5μL
SDS(10％) 1.75μL
ddH2O 164.25μL
反应条件：体系1+体系2＝250μL，95℃变性5min，48℃，2h。
5、将所有杂交产物与600μL TEN100混合，加入磁珠中，室温温育30min。温育结束后用磁力柱吸附磁珠。多次洗涤后加入50μL TE，95℃水浴5min洗脱，将上清液(里面包括DNA)迅速转移至另一洁净的EP管中。
6、将以上所得上清液加入10％体积3MNaAc(pH＝5.2)，混匀，再加入等体积－20℃预冷异丙醇，沉淀过夜。然后13000rpm，4℃离心30min，小心倒去上清，加入75％乙醇500μL，混匀，再4℃离心15min，小心倒去上清，干燥后，加入16μL水。
7、用Mse I-N引物进行杂交产物扩增，纯化，按照说明书操作，将PCR产物连接到PGEM-T载体上转入到大肠杆菌感受态细胞中。
8、将复苏的菌涂布于LB(氨卞浓度为100μg/mL)固体培养基上。放置于37℃恒温培养9h，待菌落长出后放置4℃数h，使蓝斑充分显色。白色或浅蓝色为阳性克隆，蓝色为阴性克隆。
9、挑取白色菌斑(阳性克隆)，经液体培养基培养后，进行PCR扩增，跑胶，确定是否为阳性克隆。
10、对阳性克隆进行测序
11、利用Tandem Repeats Finder4.0软件对序列进行微卫星分析，尽量选择只含有一种式样的微卫星，并且连续分布，重复次数在6次以上的序列。微卫星重复序列的位置应处于序列的中部，两端的非重复碱基数应该在20个以上，便于引物的设计。
12、用Primer 5.0软件来设计引物，引物的设计主要遵守以下几点原则：
(1)引物长度一般为18-22bp，以20bp最为常用；
(2)GC含量一般为40-60％，以50％为最优；
(3)Tm值一般为45-65℃,以55℃为最佳；
(4)正反向引物间GC含量之差应控制在10％内，Tm值之差应控制在5℃内；
(5)产物长度一般为200～400bp。
实施例2
1.4微卫星分子标记筛选
1.4.1微卫星分子标记PCR扩增
通过上海生工生物工程技术服务有限公司合成微卫星引物。挑选硬叶兜兰2个居群共24个个体DNA进行PCR扩增。
PCR反应体系：主要包括：7.5μL MasterMix(Tiangen)；20～50ng总DNA；引物对各1μL，加无菌ddH2O至15μL。
PCR反应程序如下：94℃预变性3min，94℃变性30s，48～56℃复性(引物不同退火温度不同，具体见表1)40s，72℃延伸1min，共35个循环，最后在72℃延伸8min。
扩增产物在1.5-2％的琼脂糖凝胶上电泳进行预检测，紫外灯下观察。理想的扩增产物在琼脂糖凝胶电泳检测中应该只有一条带，而且带要细而清晰，否则在后续的聚丙烯凝胶电泳下检测到的非特异条带会很多。
1.4.2聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
在硬叶兜兰SSR引物开发中采用8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测微卫星PCR扩增产物，制胶具体配方如下：
每块胶25mL；5倍TBE缓冲液5mL；40％丙烯酰胺溶液5mL；去离子水15mL；混匀后加入10％过硫酸铵180μL；TEMED(四甲基乙二胺)16μL，混匀后灌胶。其他流程包括银染过程与2.2.1.2相同。电泳仪采用北京六一仪器厂生产的DYCZ-30型双板夹心式垂直板电泳仪。电压为180V，电泳90min。
实施例3
利用H169SSR引物对鉴别不同的兜兰种类材料。
1、材料：硬叶兜兰、带叶兜兰和麻栗坡兜兰叶片。
2、采用实施例1记载的方法进行三种材料DNA提取，每种提取4个个体的DNA样本。
3、PCR反应体系：主要包括：7.5μL MasterMix(Tiangen)；20～50ng总DNA；引物对各1μL，加无菌ddH2O至15μL。
4、PCR反应程序如下：94℃预变性3min，94℃变性30s，48～56℃复性(引物不同退火温度不同，具体见表1)40s，72℃延伸1min，共35个循环，最后在72℃延伸8min。
5、采用8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测微卫星PCR扩增产物，制胶具体配方如下：每块胶25mL；5倍TBE缓冲液5mL；40％丙烯酰胺溶液5mL；去离子水15mL；混匀后加入10％过硫酸铵180μL；TEMED(四甲基乙二胺)16μL，混匀后灌胶。电泳仪采用北京六一仪器厂生产的DYCZ-30型双板夹心式垂直板电泳仪。电压为180V，电泳90min。
电泳结果如图1所示。由图1可知，三种兜兰的DNA电泳条带位置不同，可以很容易把该三种兜兰的DNA材料区别开。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国科学院昆明植物研究所
<120> 硬叶兜兰基因组SSR分子标记引物组及其开发方法和应用
<160> 59
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acattcttag agggctggat 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtgtaaagg tcgtagcg 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctccatttac tcaccctg 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tctacctcca ctcttcca 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cttcaggagt cgagatat 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tataaggata gaggccag 18
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gataacccag gcatctac 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctttcagtct tcgcactt 18
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cggaacatga actggttt 18
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggaggtcatc gcagagta 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gttctgcggc cataacaa 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccactgcacc gagcttct 18
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gcccataaac gatcacta 18
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cttcagtctt ggcactcg 18
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
agaccaccaa tagaggct 18
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tttgttgacc cagagttt 18
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tgtatggtcc cagaagg 17
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ctcccaagat ttagaatg 18
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
caccttcagt cacccaaac 19
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
caagtacctg ctggcaaa 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gatccaaacc tcccttaa 18
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cacccaaata gccttctg 18
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
agagggttta cactttgtg 19
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cagaggctca ggagttag 18
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
agtaaggtcc tccgtgcta 19
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
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<400> 26
cttcaagtgg tccatctc 18
<210> 27
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ccaggtagat gagggttt 18
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
agaggaagaa gagggttg 18
<210> 29
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gttgtcaccg tgaagaag 18
<210> 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
caatggtagg ctgttagat 19
<210> 31
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttagaggaag gagcagag 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gttgtgaata acatgccaa 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
cgttcgtgag caggagac 18
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<212> DNA
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<212> DNA
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<400> 35
tgtaagtccc atccctct 18
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<212> DNA
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgcttttggt cattggat 18
<210> 38
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
cagatgccta ctgggtgc 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gaagatccaa agctcctt 18
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
actgccctct ataaatgc 18
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<211> 18
<212> DNA
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ggtcagggag tagagcag 18
<210> 42
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ccagggccta ttgggaaa 18
<210> 43
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
atttattacc tccgttgc 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
agtctccctg tctattcg 18
<210> 45
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
tgggtggtgg gatgtagt 18
<210> 46
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
tgctgtcctc ctttagtt 18
<210> 47
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
tattatgagc ctcacctc 18
<210> 48
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
ctactagggt aaatgaatg 19
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tagatttcgg gttagaag 18
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<211> 18
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gaaccacatc agccaaat 18
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<211> 18
<212> DNA
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<400> 52
ggcagtgcta gtccctct 18
<210> 53
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
attatggaag accaaagg 18
<210> 54
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
ttcttcaatg gagtttct 18
<210> 55
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
ctaatcttta cttgggtg 18
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<211> 19
<212> DNA
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
gatgagtcct gagtaan 17
Claims (1)
1.硬叶兜兰基因组SSR分子标记引物对H169在硬叶兜兰品种鉴定中的应用，其特征在于，所述H169正向引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.23所示，所述H169反向引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.24所示。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN201910049147.2A CN109576393B (zh) | 2019-01-18 | 2019-01-18 | 硬叶兜兰基因组ssr分子标记引物组及其开发方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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|---|---|
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ID=65917147
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Family Cites Families (2)
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| CN102533727B (zh) * | 2011-12-23 | 2013-10-09 | 武汉市蔬菜科学研究所 | 一种磁珠富集法开发菜豆ssr引物的制备方法 |
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-
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- 2019-01-18 CN CN201910049147.2A patent/CN109576393B/zh active Active
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