KR101910731B1 - 긴꼬리가루깍지벌레 또는 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레 동정용 프라이머 세트 및 이를 이용한 동정 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 가루깍지벌레(Mealybug) 종 동정용 프라이머 세트 및 이을 이용한 가루깍지벌레의 종 동정 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 유사형태의 긴꼬리가루깍지벌레(Pseudococcus longispinus) 및 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레(Pseudococcus orchidicola) 각각을 종 동정 및 구분할 수 있는 가루깍지벌레 동정용 프라이머 세트; 이를 포함하는 가루깍지벌레 동정용 조성물; 동정용 키트; 및 이를 이용한 가루깍지벌레 동정 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 프라이머 세트는 긴꼬리가루깍지벌레(P. longispinus) 및 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레(P. orchidicola) 각각의 종 특이적 PCR 산물을 증폭시켜, 증폭된 PCR 산물 분석에 의해 가루깍지벌레의 종을 동정할 수 있어, 형태적으로 아주 유사한 상기 2종의 가루깍지벌레를 정확하고 신속하게 동정할 수 있다.

Description

긴꼬리가루깍지벌레 또는 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레 동정용 프라이머 세트 및 이를 이용한 동정 방법{Primer sets for species identification of Pseudococcus longispinus or Pseudococcus orchidicola and identification method using the same}

본 발명은 가루깍지벌레(Mealybug) 종 동정용 프라이머 세트 및 이를 이용한 가루깍지벌레의 종 동정 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 유사형태의 긴꼬리가루깍지벌레(Pseudococcus longispinus) 및 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레(Pseudococcus orchidicola) 각각을 종 동정 및 구분할 수 있는 가루깍지벌레 동정용 프라이머 세트; 이를 포함하는 가루깍지벌레 동정용 조성물; 동정용 키트; 및 이를 이용한 가루깍지벌레 동정 방법에 관한 것이다.

가루깍지벌레류(Mealybug)는 일반적으로 식물체의 즙액을 빨아먹고, 감로를 분비하여 그을음병을 유발하는 심각한 피해를 일으킨다(Ben-Dov 1994; Mani & Shivaraju 2016). 그 중에서 긴꼬리가루깍지벌레(Pseudococcus longispinus)는 열대 및 아열대 지역에서는 야외, 온대지역에서는 온실에서 발생하며 78과의 식물이 기주식물로 기록될 만큼 광식성 해충이다. 주요 기주식물로는 행운목, 드라세나, 벤자민 등의 관엽식물과 감귤류, 감, 아보카도, 구아바, 배, 그리고 포도가 알려져 있다(CABI, 2007). 국내에서는 2002년 J. Asia-Pacific Entomol. 저널에서 긴꼬리가루깍지벌레의 분류 key로 처음 보고가 되었고(Kwon et al.), 그 당시 긴꼬리가루깍지벌레를 채집한 곳은 서울 서초구 양재동(기주: 파키라, 드라세나), 경기 고양시 장항동(기주: 드라세나), 성남시 상적동(폴리샤스, 드라세나), 금토동(unknown host plant), 강원도 원주시 관설동(unknown host plant), 경남 김해시 봉황동(unknown host plant) 등에서 채집했다고 보고되었다. 그러나 긴꼬리가루깍지벌레는 식물방역법상 검역병해충으로 지정되어 있어 긴급방제를 통해 박멸한 이후 추가적인 발생보고가 전혀 없다가 2015년에 Kim et al.(2015)이 호접란(팔레놉시스)에서의 발생을 보고하였다.

최근 들어 웰빙 산업에 대한 인식이 높아지면서 공기정화 식물 등 관엽식물에 대한 수요가 급격히 증가하여 묘목류 수입이 늘어나는 추세이다. 최근 몇 년 사이 중국산 묘목류에서 긴꼬리가루깍지벌레가 많이 발견됨으로써(Ji et al., 2010) 이미 국내 관엽식물 대량 재배단지에 유입이 되어 전국적인 보급현황에 따라 확산했을 가능성이 높았고 수입산 바나나, 파인애플, 오렌지, 스위티, 레몬, 포도 등의 생과실과 입국 시 휴대하고 있던 생과실에서도 발견됨으로써(PIS, 2010) 이미 국내 유입 가능성을 배제할 수 없었다. 이에, 긴꼬리가루깍지벌레의 국내 분포조사를 실시하게 되었고, 이미 전국적으로 퍼져 있음을 확인하였다.

이러한 채집 조사 과정 중, 긴꼬리가루깍지벌레와 형태가 아주 유사한 꼬리가 긴 가루깍지벌레류로서 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레(P. orchidicola)가 추가적으로 발견이 되었으나 긴꼬리가루깍지벌레와 형태적 차이점이 없어 전문가도 쉽게 구분하지 못하는 문제가 있음이 확인되었다. 따라서 형태가 유사한 상기 가루깍지벌레들의 종 동정을 확실히 할 수 있는 중합효소연쇄반응용 프라이머의 개발이 절실한 실정이다.

한국등록특허 제10-1131510호 한국등록특허 제10-1336601호

Kwon GM, Lee SH, Han MJ, Goh HG (2002) The genus Pseudococcus (Westwood) (Sternorrhyncha: Pseucococcidae) of Korea. Journal of Asia-Pacific Entomology 5: 145-154

따라서, 본 발명의 목적은 유사형태의 긴꼬리가루깍지벌레(Pseudococcus longispinus) 및 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레(Pseudococcus orchidicola) 각각을 종 동정 및 구분할 수 있는 가루깍지벌레(Mealybug) 동정용(identifying) 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 가루깍지벌레 동정용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 가루깍지벌레 동정용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 가루깍지벌레(P. longispinus 및 P. orchidicola)를 동정하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어지는 제 1 프라이머 세트; 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어지는 제 2 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 가루깍지벌레(Mealybug) 동정용(identifying) 프라이머 세트(primer set)를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 가루깍지벌레는 긴꼬리가루깍지벌레(Pseudococcus longispinus) 또는 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레(Pseudococcus orchidicola)일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 프라이머 세트는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)에 이용되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제 1 프라이머 세트는 긴꼬리가루깍지벌레 종 특이적인 PCR 산물을 증폭할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제 2 프라이머 세트는 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레 종 특이적인 PCR 산물을 증폭할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 가루깍지벌레 동정용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 가루깍지벌레 동정용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 가루깍지벌레류 시료로부터 지놈(genomic) DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 단계 (a)에서 추출된 지놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 가루깍지벌레 동정용 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)에서 중합효소연쇄반응에 의해 증폭된 산물을 확인하는 단계를 포함하는, 시료에 포함된 가루깍지벌레를 동정하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 가루깍지벌레는 긴꼬리가루깍지벌레 또는 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레일 수 있다.

본 발명에 따른 프라이머 세트는 긴꼬리가루깍지벌레(Pseudococcus longispinus) 및 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레(Pseudococcus orchidicola) 각각의 세포내 미토콘드리아 COI(cytochrome oxidase subunint I) 유전자의 종 특이적 서열 부위에 결합하여 증폭된 PCR 산물 분석에 의해 가루깍지벌레의 종을 동정할 수 있어, 형태적으로 아주 유사한 긴꼬리가루깍지벌레 및 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레를 정확하고 신속하게 동정할 수 있는 이점을 갖는다.

도 1은 형태적으로 유사한 긴꼬리가루깍지벌레(Pseudococcus longispinus) 및 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레(Pseudococcus orchidicola)의 모습을 크기별로 비교하여 나타낸 도이다; (좌) 긴꼬리가루깍지벌레, (우) 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레.
도 2는 80개의 긴꼬리가루깍지벌레 및 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레로부터 확보한 COI(cytochrome oxidase subunint I) 염기서열을 나타낸 도이다.
도 3은 80개의 긴꼬리가루깍지벌레 및 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레의 COI 염기서열 분석에 따른 계통수를 나타낸 도이다.
도 4는 긴꼬리가루깍지벌레 종 특이적인 COI 염기서열 및 이를 증폭할 수 있는 프라이머(제 1 프라이머 세트)와 대응 되는 위치를 나타낸 도이다.
도 5는 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레 종 특이적인 COI 염기서열 및 이를 증폭할 수 있는 프라이머(제 2 프라이머 세트)와 대응 되는 위치를 나타낸 도이다.
도 6은 5종의 가루깍지벌레류 샘플에 대하여 긴꼬리가루깍지벌레 프라이머 세트의 종 특이도를 분석한 결과를 나타낸 도이다. PCR은 긴꼬리가루깍지벌레(P. longispinus), 가루깍지벌레(Pseudococcus comstocki, P. comstocki), 귤가루깍지벌레(Planococcus citri, P. citri), 귤애가루깍지벌레(Pseudococcus cryptus, P. cryptus) 및 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레(P. orchidicola)에 대해 긴꼬리가루깍지벌레 특이적 프라이머 세트(제 1 프라이머 세트)를 사용하여 행한 후 아가로스겔 전기영동을 행하였다.
도 7은 5종의 가루깍지벌레류 샘플에 대하여 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레 프라이머 세트의 종 특이도를 분석한 결과를 나타낸 도이다. PCR은 긴꼬리가루깍지벌레(P. longispinus), 가루깍지벌레(P. comstocki), 귤가루깍지벌레(P. citri), 귤애가루깍지벌레(P. cryptus) 및 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레(P. orchidicola)에 대해 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레 특이적 프라이머 세트(제 2 프라이머 세트)를 사용하여 행한 후 아가로스겔 전기영동을 행하였다.
도 8은 3종의 가루깍지벌레류 샘플에 대하여 본 발명의 가루깍지벌레 동정용 프라이머 세트의 효율성을 검정한 결과를 나타낸 도이다. PCR은 긴꼬리가루깍지벌레(P. longispinus), 귤애가루깍지벌레(P. cryptus) 및 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레(P. orchidicola)에 대해 가루깍지벌레 동정용 프라이머 세트를 사용하여 행한 후 아가로스겔 전기영동을 행하였다.

본 발명에서 "가루깍지벌레(Mealybug)"라 함은 매미목 가루깍지벌레과(Pseudococcidae)의 곤충을 통칭하는 용어로 정의된다. 통상적으로, 가루깍지벌레는 몸길이가 약 1mm인 타원형의 황갈색 또는 암갈색의 몸체를 갖고, 몸 가장자리에 17쌍의 흰색 밀랍돌기가 줄지어 있다. 그의 생활사를 살펴보면, 나무껍질 밑이나 틈새 등에서 알, 약충 또는 성충으로 월동하는데, 상기 약충은 식물의 눈[芽]사이, 잎 뒷면, 가지의 교차부 등에 기생하고, 나뭇가지 사이를 이동하며, 적당한 곳이 나타나면 즙액을 빨아먹다가 다시 새로운 곳으로 이동해 피해부위를 확산시키는 것으로 알려져 있다. 상기 가루깍지벌레로 인한 피해는 과수에 집중된 것으로 보고되어 있는데, 주로 배나무 사과나무 포도나무 복숭아나무 뽕나무 등에 기생하면서, 가지와 잎에 달라붙어 수액을 빨아먹으므로 수세가 약해지고 그을음병을 일으켜 가지와 잎이 검게 변하고, 과수의 열매가 기형이 되어 상품적 가치를 떨어뜨린다고 알려져 있다.

본 발명자들은 긴꼬리가루깍지벌레의 국내 분포조사를 실시하여, 전국 수입식물 재배지 및 온실, 그리고 건물 안에 놓여 있는 관엽식물 화분과 여러 과수원 등을 대상으로 2015년에 관엽식물 167사이트와 과수(포도, 토마토, 감, 감귤, 사과, 배) 87사이트, 2016년에 관엽식물 48사이트와 과수(감, 사과, 포도, 배)에서 325사이트를 조사하였고, 그 결과 약 30사이트에서 긴꼬리가루깍지벌레가 발견되어 이미 전국적으로 퍼져 있음을 확인하였다.

이러한 채집 조사 과정 중, 긴꼬리가루깍지벌레(P. longispinus)가 귤애가루깍지벌레(Pseudococcus cryptus), 가루깍지벌레(Pseudococcus comstocki), 귤가루깍지벌레(Planococcus citri)등과 형태적으로 혼동될 우려는 없었으나, 긴꼬리가루깍지벌레와 형태가 아주 유사한 꼬리가 긴 가루깍지벌레류를 추가적으로 발견하여 그 동안 긴꼬리가루깍지벌레와 함께 혼재되어 왔음을 알게 되었고, 상기 종은 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레(Pseudococcus orchidicola)인 것으로 밝혔다. 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레(P. orchidicola)에 대하여, 종래에 알려져있지 않은 새로운 COI(cytochrome oxidase subunit I) 염기서열을 확보하였으며, NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 유전자번호(GenBank 등록 번호) KX966396.1로 등록하였다. 슬라이드 동정을 해본 결과 긴꼬리가루깍지벌레와 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레간의 차이점은 볼 수 없었으며, 형태적으로 유사하여 전문가도 쉽게 구분하지 못하는 문제가 있음을 확인하였다(도 1 참조).

이에, 본 발명자들은 온실의 수입산 관엽식물에서 주로 발견되며 형태학적 동정이 어려운 긴꼬리가루깍지벌레 및 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레를 정확하고 신속하게 동정할 수 있는 분자생물학적 방법 및 중합효소연쇄반응용 프라이머를 개발하기 위해 연구하였다. 그 결과 약 80개의 COI 염기서열을 긴꼬리가루깍지벌레 및 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레로부터 확보하였고, 이들 세포내 미토콘드리아 COI(cytochrome oxidase subunit I)의 부위를 PCR하여 시퀀싱 한 결과 9.9∼11.7%까지 엄청난 차이를 보이는 것을 확인하였다. 이를 토대로 MAFFT, MEGA 및 Geneious 프로그램을 이용하여 multiple align 및 염기서열과 아미노산의 차이가 나타나는 부분을 선발하였으며, 상기 가루깍지벌레 2종을 대상으로 종 특이적 중합효소연쇄반응용 프라이머를 개발하여 상기 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 경우, 종 동정이 가능함을 확인하고, 이로부터 본 발명을 완성하였다(실시예 2 내지 4 참조).

따라서, 본 발명은 유사형태의 긴꼬리가루깍지벌레(Pseudococcus longispinus) 및 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레(Pseudococcus orchidicola) 각각을 종 동정 및 구분할 수 있는 가루깍지벌레(Mealybug) 동정용(identifying) 프라이머 세트(primer set)를 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명의 명세서에서 용어 "프라이머(primer)"는 핵산의 증폭반응시에 증폭되는 타깃 핵산 부위의 5′말단 서열 및 3′말단 서열에 각각 상보적이며 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소)하에서 주형-지시 핵산의 중합효소반응의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥의 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변이가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성화 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B.D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

본 발명의 프라이머 세트는 깍지벌레류의 COI(cytochrome oxidase subunint I) DNA 영역을 증폭하기 위한 것으로서, 미토콘드리아내의 COI 유전자의 특정 5′말단 영역을 증폭하기 위해 설계된 프라이머 세트이다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어지는 제 1 프라이머 세트; 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어지는 제 2 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 세트를 사용할 수 있다.

본 발명의 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어지는 제 1 프라이머 세트를 이용하면 긴꼬리가루깍지벌레(Pseudococcus longispinus)를 동정할 수 있다.

본 발명의 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어지는 제 2 프라이머 세트를 이용하면 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레(Pseudococcus orchidicola)를 동정할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 프라이머 세트는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)에 이용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어지는 제 1 프라이머 세트를 이용하는 경우, 356bp의 긴꼬리가루깍지벌레 종 특이적인 PCR 산물이 증폭될 수 있고; 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어지는 제 2 프라이머 세트를 이용하는 경우, 241bp의 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레 종 특이적인 PCR 산물이 증폭될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제 1 프라이머 세트는 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 긴꼬리가루깍지벌레 미토콘드리아 COI DNA를, 상기 제 2 프라이머 세트는 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레 미토콘드리아 COI DNA를 각각 특이적으로 검출할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 가루깍지벌레를 동정하기 위한 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 가루깍지벌레를 동정하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 키트는 (a) dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP); (b) DNA 중합효소; 및 (c) 완충(buffer)용액을 더욱 포함한다.

본 발명의 검출 키트는 선택적으로, 핵산 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다.

본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 긴꼬리가루깍지벌레 및 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레를 동정하는 방법으로서, (a) 가루깍지벌레류 시료로부터 지놈(genomic) DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 단계 (a)에서 추출된 지놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 가루깍지벌레 동정용 프라이머 세트(서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어지는 제 1 프라이머 세트; 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어지는 제 2 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 세트)를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)에서 중합효소연쇄반응에 의해 증폭된 산물을 확인하는 단계를 포함하는, 시료에 포함된 가루깍지벌레를 동정하는 방법을 제공한다.

이하에서 본 발명의 방법을 각 단계로 나누어 상세히 설명한다.

단계 (a): 가루깍지벌레류 시료로부터 지놈(genomic) DNA를 추출하는 단계

동정하고자 하는 깍지벌레 시료를 채집하고, DNA 추출전까지 에탄올에 보관한다. 에탄올에 보관된 깍지벌레 시료로부터 지놈(genomic) DNA를 추출한다. 지놈 DNA의 추출 또는 분리 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 이루어질 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 프로테이나아제 케이(Proteinase K) 처리에 의한 조직의 분해 및 DNA 정제 키트(DNeasy Blood & Tissue kit, Qiagen)를 사용하여 깍지벌레로부터 지놈 DNA를 분리 정제할 수 있다.

단계 (b): 상기 단계 (a)에서 추출된 지놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 가루깍지벌레 동정용 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계

본 발명의 명세서에서 사용되는 용어 "중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)"은 핵산 중합효소의 연쇄적 반응에 의해 핵산 분자의 증폭, 특히 특정 DNA 부위를 선별적으로 증폭하는 방법으로서 이에 대한 내용은 Miller, H. I. (WO 89/06700) 및 Davey, C. et al. (EP 329,822))에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.

중합효소연쇄반응은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR (differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR, TAIL-PCR (thermal asymmetric interlaced PCR) 및 멀티플렉스 PCR이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 중합효소연쇄반응에서는 상기 단계 (a)에서 추출한 지놈 DNA가 반응의 주형 DNA로서 사용된다.

다양한 DNA 중합효소가 반응에 이용될 수 있으며, 예컨대 E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우(Klenow) 단편", 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus (Pfu)를 포함한다.

본 발명에서 중합효소연쇄 반응액에는 dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), PCR 완충액(buffer) 및 DNA 중합 효소 조인자를 포함할 수 있다.

중합효소연쇄 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 중합효소연쇄 반응에 의한 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭 반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 어닐링(annealing)은 타겟 주형 DNA의 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 서열 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 본 발명에서의 상기 중합효소연쇄반응에 의한 증폭 반응은 (i) 95℃에서 15분의 1사이클; (ⅱ) 95℃에서 20초, 60℃에서 40초 및 72에서 45초의 32사이클; 및 (ⅲ) 72℃에서 5분의 1사이클로 구성되는 열-사이클(thermo-cycle)에 의해 수행된다.

단계 (c): 상기 단계 (b)에서 중합효소연쇄반응에 의해 증폭된 산물을 확인하는 단계

본 발명의 프라이머 세트를 사용한 PCR을 이용하여 증폭된 DNA 폴리뉴클레오타이드 서열의 산물은 적합한 방법으로 분석된다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 증폭된 DNA 산물을 분석한다.

본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 본 발명의 프라이머 세트를 사용하여 증폭된 깍지벌레류의 미토콘드리아 COI 유전자 5′말단 영역이 356 bp이면 긴꼬리가루깍지벌레, 241 bp이면 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레로, 시료 깍지벌레류의 종(species)을 분류할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1> 깍지벌레 시료의 확보

긴꼬리가루깍지벌레(Pseudococcus longispinus)와 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레(Pseudococcus orchidicola)를 2015년 5월에서 2016년 11월에 걸쳐 온실에서 재배되는 해피트리, 관음죽, 호접란, 드라세나, 벤자민, 행운목, 마지타나, 파키라, 자메이카, 홍콩야자 등으로부터 수집하였다(표 1 참조). 수집한 성충은 사용 전까지 에탄올에서 보관하거나 곤충독성실험실 사육실에서 사육하였다. 대조군으로는 형태적으로 동정이 확실한 귤애가루깍지벌레(Planococcus cryptus)를 사용하였다.

상기 표 1에서 각 지역의 약어는 다음과 같다: CB, 충북(Chungbuk); CN, 충남(Chungnam); GB, 경북(Gyeongbuk); GG, 경기(Gyounggi); GN, 경남(Gyoungnam); GW, 강원(Gangwon); JB, 전북(Jeonbuk); JJ, 제주(Jeju); JN, 전남(Jeonnam).

상기 표 1에서 긴꼬리가루깍지벌레(P. longispinus) 및 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레(P. orchidicola)의 종명(sp.)을 각각 l. 및 o.로 약어 표기하였다.

< 실시예 2> DNA 추출 및 PCR 프라이머의 설계

프라이머는 몇 가지의 선발기준으로는 종(species) 특이적이며 이종배타적인 마커(marker)라야 하고, 특히 가능하면 서로 다른 길이의 PCR product가 나타날 수 있어 PCR만으로 종 구분이 가능하도록 한다는 점을 들 수 있다.

본 발명자들이 실제로 채집 조사를 수행한 결과, 긴꼬리가루깍지벌레(P. longispinus)가 귤애가루깍지벌레(Pseudococcus cryptus), 가루깍지벌레(Pseudococcus comstocki), 귤가루깍지벌레(Planococcus citri)등과 형태적으로 혼동될 우려는 없었다. 반면, 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레(P. orchidicola)는 긴꼬리가루깍지벌레와 매우 유사하여 형태학적 동정이 어려운 것을 확인하였다(도 1 참조). 따라서 상기 <실시예 1>에서 수집된 약 80개의 P, longispinus 및 P. orchidicola로부터 프로테이나아제 케이(Proteinase K) 처리에 의한 조직의 분해 및 DNeasy Tissue kit(Qiagen, Germany)를 사용하여 제조자 제공의 프로토콜에 따라 지놈(genomic) DNA를 추출하였고, 미토콘드리아내의 COI(cytochrome oxidase subunit I) 염기서열을 확보하였다.

확보된 P. longispinus 및 P. orchidicola의 COI 염기서열을 토대로 MAFFT, MEGA 및 Geneious 프로그램을 이용하여 multiple align 및 염기서열과 아미노산의 차이가 나타나는 부분을 선발하였다(도 2 참조). 도 2에 나타난 바와 같이, 종 특이적으로 나타나는 염기를 발굴하였으며, 이 염기를 포함하는 영역의 아미노산 부위를 중심으로부터 종특이적 프라이머를 개발하였다(표 2 참조).

종명	프라이머 명칭	프라이머 염기서열	서열번호	PCR 산물 크기(bp)
P. longispinus	lon-F	5'-CATAACCATACCTATTATTATCGGCAG-3'	1	356
	lon-R	5'-GGTAATTGCTCTTGATAAAATAGGAA-3'	2
P. orchidicola	orc-F	5'-TTATACCCCCCACTAATTAATCAAAAC-3'	3	241
	orc-R	5'-GGGATTACCATTTCCTATAGGATTAA-3'	4

종 특이적 프라이머를 디자인하는 경우에 종 내부 변이도 또 다른 중요한 인자이다. 이처럼 프라이머 디자인시에는 변이 가능한 부위가 이상적으로는 전혀 포함되어 있지 않아야 하고, 포함된다고 하여도 최소로 포함되어 있어야 한다. 동일한 종 내의 변이 및 유사도를 확인한 결과는 도 2 및 도 3에 나타난 바와 같다. 본 발명에서는 이러한 종 내부의 변이를 피하도록 하여 상기와 표 2에 나타난 바와 같이 lon-F(P. longispinus forward primer) 및 lon-R(P. longispinus reverse primer)을 포함하는 긴꼬리가루깍지벌레(P. longispinus) 특이적 프라이머 세트(제 1 프라이머 세트) 및 orc-F(P. orchidicola forward primer) 및 orc-R(P. orchidicola reverse primer)을 포함하는 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레(P. orchidicola) 특이적 프라이머 세트(제 2 프라이머 세트)를 디자인 하였으며, 이에 각각 대응되는 종 특이적 COI 염기서열 대한 내용을 도 4 및 도 5에 나타내었다.

< 실시예 3> 긴꼬리가루깍지벌레 및 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레 종 특이적 프 라이머를 이용한 PCR 증폭

가루깍지벌레 5종(P. longispinus, P. comstocki, P. citri , P. cryptus 및 P. orchidicola) 샘플들에 대해 DNA를 추출하고, 상기 <실시예 2>에서 제작된 긴꼬리가루깍지벌레(P. longispinus) 특이적 프라이머 세트(제 1 프라이머 세트) lon-F 및 lon-R을 이용하여 미토콘드리아 COI 부위를 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 증폭하였다. 증폭 반응은 (i) 95℃에서 15분의 1사이클; (ⅱ) 95℃에서 20초, 60℃에서 40초 및 72에서 45초의 32사이클; 및 (ⅲ) 72℃에서 5분의 1사이클로 구성되는 열-사이클(thermo-cycle)에 의해 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 아가로스젤 전기영동에 의해 확인하였다. 그 결과, 긴꼬리가루깍지벌레 샘플에서만 특이적으로 약 400 bp 크기의 DNA 단편이 증폭되었음을 확인하였다(도 6 참조).

다음은 가루깍지벌레 5종(P. longispinus, P. comstocki, P. citri , P. cryptus 및 P. orchidicola) 샘플들에 대해 DNA를 추출하고, 상기 <실시예 2>에서 제작된 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레(P. orchidicola) 특이적 프라이머 세트(제 2 프라이머 세트) orc-F 및 orc-R을 이용하여 상기 제 1 프라이머 세트를 이용한 중합효소연쇄반응(PCR)과 동일한 방법으로 미토콘드리아 COI 부위를 증폭한 후, 아가로스젤 전기영동에 의해 증폭된 PCR 산물을 확인하였다. 그 결과, 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레 샘플에서만 특이적으로 약 300 bp 크기의 DNA 단편이 증폭되었음을 확인하였다(도 7 참조).

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< 실시예 4> 종 특이적 프라이머의 디자인 및 효율성 테스트

상기 <실시예 2>에서 제작한 2종의 프라이머 세트(제 1 프라이머 세트 및 제 2 프라이머 세트)를 혼합하여 가루깍지벌레 동정용 프라이머 세트를 디자인하였고, 채집된 가루깍지벌레류가 긴꼬리가루깍지벌레인지 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레인지 한번에 동정하기 위해 PCR 증폭하였다. 각각의 프라이머 Tm값이 다르므로 적정 조건을 찾기 위해 56℃에서 62℃까지 2℃ 간격으로 gradient PCR을 실시하였다(도 8 참조). 그 결과, 귤애가루깍지벌레(P. cryptus)는 58℃ 이하에서도 밴드 크기가 거의 확인되지 않았으나, 60℃에서 긴꼬리가루깍지벌레 및 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레의 PCR 밴드와 명확하게 구분되는 것으로 나타났다. 따라서, 보다 확실한 결과를 위해서는 annealing temperature를 60℃로 하는 것이 가장 효과적임을 확인하였다. 이처럼 두 프라이머 세트를 혼합하여 사용해도 긴꼬리가루깍지벌레와 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레의 종특이적 PCR 밴드는 명확하게 이 두 종을 구별시켜주었고, 56~60℃도 사이에서 서로 다른 크기의 PCR 밴드를 나타냄을 확인하였다(도 8 참조). 결론적으로, 이 두 프라이머 세트의 혼합물은 긴꼬리가루깍지벌레와 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레처럼 형태적으로 유사한 두 종(도 1 참조)을 PCR산물의 밴드 크기만으로 종의 구분과 동정을 가능하게 한다는 것을 확인할 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그 와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Primer sets for species identification of mealybug and method for species identification of the Mealybug using the same <130> PN1702-087 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lon-F primer <400> 1 cataaccata cctattatta tcggcag 27 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lon-R primer <400> 2 ggtaattgct cttgataaaa taggaa 26 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orc-F primer <400> 3 ttataccccc cactaattaa tcaaaac 27 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orc-R primer <400> 4 gggattacca tttcctatag gattaa 26 <210> 5 <211> 649 <212> DNA <213> Pseudococcus longispinus <400> 5 aataatatat ttaatatttg gattttggtc agggctaatg ggtttatcaa taagttttat 60 tattcgtatt gaattaataa atttaaataa taatttcaat aataatataa tttactatat 120 aataattact attcatgctt ttattataat ttttttcata accataccta ttattatcgg 180 cagattaaga aattgacttc taccattaat attaatatca tcagatttaa ttttcccacg 240 tttaaataat tttagatttt gattacttat accatcatta atttttataa tattaaatat 300 attattaaat aataatatta atactggatg aactctttac cctcctttaa ttaatcaaaa 360 ttttattaca ttaaatttta ttattttttc tttacattta aatggaatct cttcaatttt 420 tagatctatt aattttattt catcaatttt tatcattaat aataataatt ttttattaaa 480 taatttatca ctatatattt gatcaattat tattactact attttattaa ttatttctat 540 tcctatttta tcaagagcaa ttaccataat tattttagat aataatttaa atataaattt 600 ttttaatcct ataggtaatg gtaatccaat tttatatcaa catttattt 649 <210> 6 <211> 649 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Pseudococcus orchidicola <400> 6 attaatatat ttattatttg gattttgatc aggtttaata ggtttatcaa taagttttat 60 tattcgtatt gaattaataa atttaaataa taactttaat aataatataa tttattatat 120 aataattaca ttacatgctt ttattataat tttttttata actataccaa tcattattgg 180 aagattaaga aattgacttt taccattaat attaatatct tcagatttaa tatttcctcg 240 tttgaataat tttagatttt gacttttatt accttcatta attttattaa taataaatat 300 attattaaat aataatatca atacaggatg aactttatac cccccactaa ttaatcaaaa 360 ctttattact ttaaatttta ttattttttc tcttcatttg aatggtctat cttcaatttt 420 tagttcaatt aattttattt catcaatttt tattattaat aataataatt ttttattaaa 480 taatttatcc ttatatattt gatctattat tattacaaca attttattaa ttatttctat 540 tccaattctt tcaagagcta ttacaataat tattcttgat aataacttaa atataaattt 600 ttttaatcct ataggaaatg gtaatcccat tttatatcaa catttattt 649

Claims (9)

1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어지는 제 1 프라이머 세트; 및
   서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어지는 제 2 프라이머 세트를 포함하는, 긴꼬리가루깍지벌레(Pseudococcus longispinus) 또는 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레(Pseudococcus orchidicola) 동정용 조성물.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)에 이용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 제 1 프라이머 세트는 긴꼬리가루깍지벌레 종 특이적인 PCR 산물을 증폭하는 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   상기 제 2 프라이머 세트는 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레 종 특이적인 PCR 산물을 증폭하는 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 긴꼬리가루깍지벌레와 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레를 분류하기 위한 동정용 조성물.
7. 상기 제1항의 조성물을 포함하는 긴꼬리가루깍지벌레 또는 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레 동정용 키트.
8. (a) 긴꼬리가루깍지벌레 또는 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레 시료로부터 지놈(genomic) DNA를 추출하는 단계;
   (b) 상기 단계 (a)에서 추출된 지놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및
   (c) 상기 단계 (b)에서 중합효소연쇄반응에 의해 증폭된 산물을 확인하는 단계를 포함하는, 시료에 포함된 긴꼬리가루깍지벌레 또는 붉은몸긴꼬리가루깍지벌레를 동정하는 방법.
9. 삭제

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