CN113215310A - 一种通过荧光定量pcr快速检测犬细小病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种通过荧光定量PCR快速检测犬细小病毒的方法，属于分子检测技术领域。为了克服现有检测方法敏感性不够高的技术不足，本发明提供一种通过荧光定量PCR快速检测犬细小病毒的方法。本发明利用提取试剂盒提取样品DNA后，通过设计特异性引物，利用普通PCR技术对CPV编码基因进行分片段扩增，然后对目标片段进行荧光定量PCR扩增检测，从而可以在DNA水平上检测和诊断犬细小病毒。该方法操作简单，结果直观，对于调查CPV的流行情况并针对性建立有效的疫病防控措施有重要意义。

Description

一种通过荧光定量PCR快速检测犬细小病毒的方法
技术领域
本发明涉及一种犬细小病毒的分子生物学检测方法，具体涉及一种通过荧光定量PCR快速检测犬细小病毒的方法，属于分子检测技术领域。
背景技术
犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV)是无囊膜的单链DNA病毒，临床上主要引起幼犬发生胃肠炎和心肌炎等典型症状。CPV主要的自然感染途径是经口传播，病毒侵入机体2天后首先结合宿主细胞转铁蛋白受体，然后通过包涵素介导的内吞作用快速进入并感染宿主细胞。CPV流行主要表现为散发，特别是同窝犬有较高的发病几率，在犬场主要呈现为地方流行，并且可以长时间持续。CPV基因组全长约为5200bp，其中包括3个结构蛋白和2个非结构蛋白，其中占整个衣壳蛋白的90％的VP2结构蛋白是该病毒的主要抗原蛋白。
犬细小病毒病是由犬细小病毒(CPV)引起的以急性出血性肠炎和心肌炎为主要特征的一种高度接触性传染病，具有发病率高和传染性强的特征，是对犬类危害较为严重的疫病。由于胶体金试纸条检测方法的敏感性不够高，可能会存在漏检误检问题。为了快速明确CPV病原，分子诊断技术成为敏感性强和特异性高的确诊手段。采用普通PCR和实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time PCR)已被用于监测CPV感染。特别是基于VP2基因建立的qPCR检测方法具有敏感性强和特异性高的优点，可以用来准确检测我国目前流行的CPV毒株序列。因此，本发明旨在提供一种分子检测技术，以为CPV快速确诊提供较为可靠的诊断工具。
发明内容
为了克服现有检测方法敏感性不够高，可能会存在漏检误检的技术不足，本发明提供一种通过荧光定量PCR快速检测犬细小病毒的方法。本发明利用提取试剂盒提取样品DNA后，通过设计特异性引物，利用普通PCR技术对CPV编码基因进行分片段扩增，然后对目标片段进行荧光定量PCR扩增检测，从而可以在DNA水平上检测和诊断犬细小病毒。该方法操作简单，结果直观，对于调查CPV的流行情况并针对性建立有效的疫病防控措施有重要意义。
本发明通过下述技术方案实现上述技术效果：
一种通过荧光定量PCR快速检测犬细小病毒的方法，其包括如下步骤：
(1)样品采集处理：利用TaKaRa生物技术有限公司的DNA提取试剂盒提取样品DNA；
(2)PCR检测：将步骤1获得的DNA采用ABI
Figure BDA0003008642080000011
9700型PCR仪进行PCR扩增，扩增反应结束后取10μL的PCR反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，通过全自动紫外凝胶成像分析系统进行结果检验，确定扩增获得产物是否与目标片段一致；
(3)荧光定量PCR扩增检测：将经过步骤2确定扩增产物与目标片段一致的DNA产物，使用全自动荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR扩增反应，实时监测相对荧光强度依据设定的判定标准确定样本中是否包含犬细小病毒。
优选地，所述PCR反应体系的体积为20μL，其组成包括FastPfu Buffer(5×)4μL，2.5mM dNTPs 2μL，5μM Forward Primer 0.2μL，5μM Reverse Primer 0.2μL，FastPfuPolymerase0.4μL，Template DNA 10ng，补加双蒸水至20μL。
优选地，利用DNA提取试剂盒提取DNA包括如下步骤：
a)用2mL离心管收集组织样品的匀浆液，12,000×g离心30s，弃上清后用150μL已加入RNase A的Buffer悬浮沉淀；向其中加入30μL 0.25M EDTA，混合均匀，冰浴5min后向其中加入450μL Buffer G-A,旋涡振荡15s，65℃水浴10min；
b)向其中加入400μL Buffer G-B和1mL Buffer DV(4℃预冷)，混合均匀后12,000×g离心2min，丢弃上相，向其中加入1mL 4℃预冷Buffer DV，混合均匀后12,000×g离心2min；丢弃上相，将下相转移至滤器，将滤器置于2mL离心管中，在12,000×g离心1min；向滤液中加入400μL Buffer BV，混合均匀；
c)将制备管置于2mL离心管中，将步骤8中的混合液移入制备管中，12,000×g离心1min；弃滤液，将制备管置回到原2mL离心管中，加入500μL Buffer W1，12,000×g离心1min；弃滤液，将制备管置回到原2mL离心管中，加入700μL Buffer W2，12,000×g离心1min；以同样的方法再用700μL Buffer W2洗涤一次；弃滤液，将制备管置回到原2mL离心管中，12,000×g离心1min；
d)将制备管置于另一洁净的1.5mL离心管中，在silica膜中央加100-200μLEluent或去离子水，室温静置1min，12,000×g离心1min洗脱DNA；然后采用紫外分析仪进行浓度和纯度检测，质量合格的DNA置于-20℃保存。
优选地，所述荧光定量PCR扩增检测包括如下步骤：配制荧光定量PCR扩增反应总体系，盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到PCR反应仪并设定PCR反应程序为：预变性阶段94℃：2分钟；PCR扩增阶段：94℃15秒，60℃30秒40个循环，扩增产生的荧光信号在Applied Biosystems全自动荧光定量PCR仪上进行检测。其中荧光定量PCR扩增反应总体系为20μL，包括如下体积的组分：正向引物1μL，反向引物1μL，荧光染料0.6μL，无引物水合缓冲液9.5μL，模板标准品1μL，分子级双蒸水6.9μL。
其中样本判定标准为：阳性：标本检测结果Ct值≤35或有明显指数增长期；可疑：标本检测结果Ct值在35～38范围内，此时应对标本进行重复检测，如重复实验结果Ct值仍在35～38范围内，有明显指数增长期，则判定为阳性，否则为阴性；阴性：标本检测结果Ct值＞38或无Ct值。
本发明中普通PCR引物根据GenBank中CPV(KT382542)保守的基因片段设计，分别设计了5对特异性引物(见表1)。荧光定量PCR引物根据编码CPV结构蛋白的VP2基因核苷酸序列设计,分别设计了1对特异性引物(见表2)。所有引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。
本发明利用提取试剂盒提取样品DNA后，通过设计特异性引物，利用普通PCR技术对CPV编码基因进行分片段扩增，然后对目标片段进行荧光定量PCR扩增检测，从而可以在DNA水平上检测和诊断犬细小病毒。该方法操作简单，结果直观，对于调查CPV的流行情况并针对性建立有效的疫病防控措施有重要意义。
附图说明
图1CPV基因片段1的PCR扩增结果。
图2CPV基因片段1的PCR扩增结果。
图3CPV基因片段3的PCR扩增结果。
图4CPV基因片段4的PCR扩增结果。
图5CPV基因片段5的PCR扩增结果。
图6采用VP2-3引物组合进行荧光定量PCR扩增结果。
图7采用VP2-3引物组合进行荧光定量PCR特异性检测结果。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步描述本发明，但所述实施例并不以任何方式限定本发明专利保护的范围。
实施例1利用本发明方法检测养殖场犬细小病毒的方法
病料样品：所有样品均于2019年10月从中国浙江省某养狗场采集得到，该犬场并未使用过任何CPV疫苗及相关产品,所有样品保存在-80℃冰箱待检测。
引物设计：普通PCR引物根据GenBank中CPV(KT382542)保守的基因片段设计，分别设计了5对特异性引物(见表1)。荧光定量PCR引物根据编码CPV结构蛋白的VP2基因核苷酸序列设计,分别设计了1对特异性引物(见表2)。所有引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。
表1根据CPV基因片段设计的普通PCR引物
Figure BDA0003008642080000031
Figure BDA0003008642080000041
表2根据CPV(VP2)基因片段设计的荧光定量PCR引物
Figure BDA0003008642080000042
本实施例中样品总DNA提取利用TaKaRa生物技术有限公司的DNA提取试剂盒，按照以下步驟提取DNA:
1.用2mL离心管收集组织样品的匀浆液，12,000×g离心30s，弃尽上清。用150μL已加入RNase A的Buffer悬浮沉淀。
2.加入30μL 0.25M EDTA(pH 8.0)，混合均匀，冰浴5min。
3.加入450μL Buffer G-A,旋涡振荡15s，65℃水浴10min。
4.加入400μL Buffer G-B和1mL Buffer DV(4℃预冷)，用力混合，12,000×g离心2min。
5.尽可能丢弃上相，保留相间沉淀和下相。加入1mL 4℃预冷Buffer DV，用力混合，12,000×g离心2min。
6.丢弃上相，将下相转移至滤器(滤器置于2mL离心管中)。12,000×g离心1min。
7.弃滤器，在滤液中加入400μL Buffer BV，混合均匀。
8.将制备管置于2mL离心管中，将步骤8中的混合液移入制备管中，12,000×g离心1min。
9.弃滤液，将制备管置回到原2mL离心管中，加入500μL Buffer W1，12,000×g离心1min。
10.弃滤液，将制备管置回到原2mL离心管中，加入700μL Buffer W2，12,000×g离心1min。
11.以同样的方法再用700μL Buffer W2洗涤一次。
12.弃滤液，将制备管置回到原2mL离心管中，12,000×g离心1min。
13.将制备管置于另一洁净的1.5mL离心管中，在silica膜中央加100-200μLEluent或去离子水，室温静置1min。12,000×g离心1min洗脱DNA。然后采用紫外分析仪进行浓度和纯度检测，质量合格的DNA置于-20℃保存。
普通PCR检测
根据引物设计和合成的特异性引物，扩增CPV基因组DNA片段，扩增时尽可能使用低循环数来保证后续数据分析的准确性及可靠性，尽可能确保每个样本扩增的循环数相同。采用20μL的TransStart Fastpfu DNA Polymerase PCR反应体系：
FastPfu Buffer(5×)............4μL
2.5mM dNTPs....................2μL
5μM Forward Primer.............0.2μL
5μM Reverse Primer.............0.2μL
FastPfu Polymerase.............0.4μL
Template DNA...................10ng
再补加双蒸水至.................20μL
每个样本设置3个重复，然后采用ABI
Figure BDA0003008642080000051
9700型PCR仪进行扩增，扩增反应结束后取10μL的PCR反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，通过全自动紫外凝胶成像分析系统进行结果检验。
荧光定量PCR检测：
荧光定量PCR扩增反应总体系为20μL，包括如下体积的组分：正向引物1μL，反向引物1μL，荧光染料0.6μL，无引物水合缓冲液9.5μL，模板标准品1μL，分子级双蒸水6.9μL，盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心。然后转移到PCR反应仪，设定PCR反应程序为：预变性阶段94℃：2分钟；PCR扩增阶段：94℃15秒，60℃30秒40个循环。扩增产生的荧光信号在Applied Biosystems全自动荧光定量PCR仪上进行检测。
实验结果如下所示：
1、普通PCR检测结果
普通PCR检测结果显示,CPV基因片段1的PCR扩增产物电泳后可见553bp的条带，与预期片段大小相符(图1)。
普通PCR检测结果显示,CPV基因片段2的PCR扩增产物电泳后可见2022bp的条带，与预期片段大小相符(图2)。
普通PCR检测结果显示,CPV基因片段3的PCR扩增产物电泳后可见1618bp的条带，与预期片段大小相符(图3)。
普通PCR检测结果显示,CPV基因片段4的PCR扩增产物电泳后可见1474bp的条带，与预期片段大小相符(图4)。
普通PCR检测结果显示,CPV基因片段5的PCR扩增产物电泳后可见100bp的条带，与预期片段大小相符(图5)。
2、荧光定量PCR检测结果
通过实时监测相对荧光强度依据设定的判定标准确定样本中是否包含犬细小病毒。其中样本判定标准为：阳性：标本检测结果Ct值≤35或有明显指数增长期；可疑：标本检测结果Ct值在35～38范围内，此时应对标本进行重复检测，如重复实验结果Ct值仍在35～38范围内，有明显指数增长期，则判定为阳性，否则为阴性；阴性：标本检测结果Ct值＞38或无Ct值。
采用构建的CPV阳性质粒为待检样品，结果显示引物VP2-3扩增后的Ct值在10～35之间，属于阳性结果(图6)，表明该引物和反应体系的具有很好的扩增效果。
采用构建的CPV阳性质粒为阳性样品，与其他常见的犬病毒进行交叉反应检验。结果显示阳性质粒样品的Ct值为12.85，其他样品的Ct值为在30～35之间(图7)，表明该引物和反应体系的具有很好特异性。

Claims (6)

1.一种通过荧光定量PCR快速检测犬细小病毒的方法，其包括如下步骤：
(1)样品采集处理：利用TaKaRa生物技术有限公司的DNA提取试剂盒提取样品DNA；
(2)PCR检测：将步骤1获得的DNA采用ABI
Figure RE-FDA0003112821770000011
9700型PCR仪进行PCR扩增，扩增反应结束后取10μL的PCR反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，通过全自动紫外凝胶成像分析系统进行结果检验，确定扩增获得产物是否与目标片段一致；
(3)荧光定量PCR扩增检测：将经过步骤2确定扩增产物与目标片段一致的DNA产物，使用全自动荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR扩增反应，实时监测相对荧光强度依据设定的判定标准确定样本中是否包含犬细小病毒。
2.根据权利要求1所述的一种通过荧光定量PCR快速检测犬细小病毒的方法，其特征在于，其中PCR反应体系的体积为20μL，其组成包括FastPfu Buffer(5×)4μL，2.5mM dNTPs 2μL，5μM Forward Primer 0.2μL，5μM Reverse Primer 0.2μL，FastPfu Polymerase 0.4μL，Template DNA 10ng，补加双蒸水至20μL。
3.根据权利要求1所述的一种通过荧光定量PCR快速检测犬细小病毒的方法，其特征在于，利用DNA提取试剂盒提取DNA包括如下步骤：
a)用2mL离心管收集组织样品的匀浆液，12,000×g离心30s，弃上清后用150μL已加入RNase A的Buffer悬浮沉淀；向其中加入30μL 0.25M EDTA，混合均匀，冰浴5min后向其中加入450μL Buffer G-A,旋涡振荡15s，65℃水浴10min；
b)向其中加入400μL Buffer G-B和1mL Buffer DV，混合均匀后12,000×g离心2min，丢弃上相，向其中加入1mL 4℃预冷Buffer DV，混合均匀后12,000×g离心2min；丢弃上相，将下相转移至滤器，将滤器置于2mL离心管中，在12,000×g离心1min；向滤液中加入400μLBuffer BV，混合均匀；
c)将制备管置于2mL离心管中，将步骤8中的混合液移入制备管中，12,000×g离心1min；弃滤液，将制备管置回到原2mL离心管中，加入500μL Buffer W1，12,000×g离心1min；弃滤液，将制备管置回到原2mL离心管中，加入700μL Buffer W2，12,000×g离心1min；以同样的方法再用700μL Buffer W2洗涤一次；弃滤液，将制备管置回到原2mL离心管中，12,000×g离心1min；
d)将制备管置于另一洁净的1.5mL离心管中，在silica膜中央加100-200μL Eluent或去离子水，室温静置1min；12,000×g离心1min洗脱DNA；然后采用紫外分析仪进行浓度和纯度检测，质量合格的DNA置于-20℃保存。
4.根据权利要求1所述的一种通过荧光定量PCR快速检测犬细小病毒的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR扩增检测包括如下步骤：配制荧光定量PCR扩增反应总体系，盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到PCR反应仪并设定PCR反应程序为：预变性阶段94℃：2分钟；PCR扩增阶段：94℃15秒，60℃30秒40个循环，扩增产生的荧光信号在AppliedBiosystems全自动荧光定量PCR仪上进行检测。
5.根据权利要求4所述的一种通过荧光定量PCR快速检测犬细小病毒的方法，其特征在于，所述的荧光定量PCR扩增反应总体系为20μL，包括如下体积的组分：正向引物1μL，反向引物1μL，荧光染料0.6μL，无引物水合缓冲液9.5μL，模板标准品1μL，分子级双蒸水6.9μL。
6.根据权利要求4所述的一种通过荧光定量PCR快速检测犬细小病毒的方法，其特征在于，所述的判定标准为：阳性：标本检测结果Ct值≤35或有明显指数增长期；可疑：标本检测结果Ct值在35～38范围内，此时应对标本进行重复检测，如重复实验结果Ct值仍在35～38范围内，有明显指数增长期，则判定为阳性，否则为阴性；阴性：标本检测结果Ct值＞38或无Ct值。
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