CN109423527A

CN109423527A - 采用反转录环介导等温扩增技术检测李属坏死环斑病毒（pnrsv）的方法

Info

Publication number: CN109423527A
Application number: CN201710770652.7A
Authority: CN
Inventors: 冯超红; 任应党; 杨琳琳; 马晓静; 南文浩; 王光华; 张金虎
Original assignee: Institute of Plant Protection of Henan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Henan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-08-23
Filing date: 2017-08-23
Publication date: 2019-03-05

Abstract

本发明涉及采用反转录环介导等温扩增技术检测李属坏死环斑病毒的方法，其中该方法包括李属坏死环斑病毒总RNA提取，RT‑LAMP反应和电泳检测，确定样品是否带有PNRSV病毒。本发明根据李属坏死环斑病毒的基因保守区设计了RT‑LAMP引物，采用一步法反转录环介导等温扩增技术建立了一种快速、灵敏的检测李属坏死环斑病毒的方法。为李属坏死环斑病毒的快速检测提供了新的手段。

Description

采用反转录环介导等温扩增技术检测李属坏死环斑病毒 (PNRSV)的方法

技术领域

本发明属于植物病毒学技术领域，特别是涉及一种采用反转录环介导等温扩增技术检测李属坏死环斑病毒的方法。

背景技术

李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus，PNRSV)为雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)等轴不稳环斑病毒属(Ilarvirus)的一种病毒，可侵染多种果树、花卉等经济作物，寄主遍及21科，主要危害李属和蔷薇属植物，如樱桃、苹果、桃、月季等是我国二类进境检疫性有害生物。该病毒在李属果树上的一般症状为植株叶片出现褪绿斑或褐色坏死斑，后来枯斑脱落造成叶穿孔，少数叶背出现耳突，春季发芽延迟、萌发之前花芽和叶芽坏死、节间处产生溃疡症状，树势减弱，产量可降低30％-57％。目前，该病的发生已遍及欧洲、亚洲、非洲、南美和北美洲及大洋洲的40多个国家和地区，是影响核果类生产的最为严重的一类病毒。关于该病毒的检测方法，目前普遍采用的主要有DAS-ELISA、RT-PCR、IC-RT-PCR和实时荧光PCR法等。但上述方法均存在不同的缺点，例如，所需试验周期较长、操作繁琐、灵敏度不高、特异性不强、准确性较低、易受检测材料限制等。

环介导等温核酸扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是由T.Notomi发明的一种新型核酸扩增技术，该技术依赖四条特异引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下快速、高效、高特异、高灵敏地扩增靶序列(Notomietal，2000)。迄今已建立了针对多种病原性细菌、病毒、真菌、寄生虫等的LAMP检测方法，在耐药性基因检测、家畜早期胚胎性别判定等方面也有相关报道。该方法应用范围广泛，适于基层实验室进行快速检测。本发明根据李属坏死环斑病毒基因保守区设计了LAMP引物，采用一步法反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)建立了一种快速、灵敏的检测李属坏死环斑病毒的方法。为李属坏死环斑病毒的快速检测提供了新的手段。

发明内容

本发明提供了一种采用反转录环介导等温扩增技术检测李属坏死环斑病毒的方法，其中该方法包括李属坏死环斑病毒总RNA提取，RT-LAMP反应和电泳检测，确定样品是否带毒，所述RT-LAMP反应采用的引物组如下：

引物组，用于PNRSV病毒的RT-LAMP反应：

外引物(F3和B3)：

SEQ ID NO.1：5’-ATCCGAATGATGCTCTGGTC-3’；

SEQ ID NO.2：5’-CCTCTCGGTGACTATGTGCT-3’；

内引物(FIP和BIP)：

SEQ ID NO.3：5’-CTGCTCGAAACCCTATTCGGGTCCACTCAGGGCTCAACAAAG-3’；

SEQ ID NO.4：5’-ACCACAACCGGTCGTGAAGACACCCTTAGGAATTCGGGGAG-3’；

在一个具体的实施方案中，本发明所述的采用反转录环介导等温扩增技术检测李属坏死环斑病毒的方法，其包括如下步骤：

1)病毒总RNA的提取：

提取待测样品的总RNA；

2)RT-LAMP反应：

使用外引物(F3和B3)和内引物(FIP和BIP)对病毒总RNA进行RT-LAMP反应，得到扩增产物；

3)浊度检测：

对扩增产物进行浊度观察，确定样品是否感染所述病毒；

4)电泳检测：

对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，获得病毒基因扩增产物条带，确定样品是否感染PNRSV病毒。

在一个具体的实施方案中，本发明所述的采用环介导等温扩增技术检测李属坏死环斑病毒的方法，其包括如下步骤：

1)病毒总RNA的提取：

提取待测样品的总RNA；

2)RT-LAMP反应：

3)浊度观察：

对扩增产物进行浊度观察，确定样品是否感染所述病毒；

4)电泳检测：

在一个具体的实施方案中，在本发明上述的方法中，RT-LAMP反应中使用的引物浓度比例为：外引物(F3和B3)∶内引物(FIP和BIP)＝0.2-0.4∶1.2-1.6；优选地，外引物(F3和B3)∶内引物(FIP和 BIP)＝1∶4。

在一个具体的实施方案中，在本发明上述的方法中，RT-LAMP反应中的反应温度优选为50-62℃；使用的反应温度更优选为60℃。

在一个具体的实施方案中，在本发明上述的方法中，RT-LAMP反应中的Mg²⁺浓度优选为高于或等于 6mM，更优选为6mM。

本发明经过优化和摸索实验条件建立了李属坏死环斑病毒的RT-LAMP检测方法，极大地提高检测效率，降低检测成本。本发明的方法具有快速、灵敏的特点。本发明的方法已经成功地应用于室内和田间李属坏死环斑病毒的检测。本发明证明了RT-LAMP是一种检测植物病毒的有效手段。

附图说明

图1：RT-LAMP反应结果琼脂糖凝胶电泳图，M1：Marker IV，1：感病样品，2：阴性对照，M2：Marker I。

图2：RT-LAMP荧光染料结果图，绿色为感病，褐色为阴性对照。

图3：RT-PCR灵敏性结果电泳图，1-7分别为用pMD18-T-PNRSV质粒稀释101-107倍做模板，8为阴性对照。

图4：RT-LAMP灵敏性结果图，1-7分别为用pMD18-T-PNRSV质粒稀释101-107倍做模板，8为阴性对照。

具体实施方式

为了理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但下述实施例并不限制本发明。

材料与试剂

樱桃病株材料分别采自陕西蓝田，采集叶片保存于-80℃冰箱中。主要试剂：

Bst DNApolymerase购自NEB公司；

Betaine，MgSO₄购自Sigma公司；

RNA提取试剂盒购自TaKaRa公司；

M-MLV反转录酶购自Promega公司；

Taq DNA聚合酶购自TaKaRa公司；

SYBR Green I购自Invitrogen公司；

大肠杆菌(Escherichia.coli)JM109，DNA标准Marker I和Marker IV购自Voson公司；

胶回收试剂盒购自Bioteke公司。

实施例1

1.引物设计

首先本发明人从NCBI上下载了李属坏死环斑病毒的全基因组序列，使用Primer4.0(http：//primerexlorer.jp；EikenChemicalCo.Ltd，Japan)设计了多组引物，然后根据引物所在序列区域的保守性、引物的发夹结构、二聚体GC含量以及Tm值等综合因素选择了引物。引物组有4条引物，包括2条外引物(F3和B3)和2条内引物(FIP和BIP)。所述引物参见SEQ ID NO.1-4。RT-PCR的引物，本发明使用朱良俊等(2009)的引物，参见SEQ IDNO.5-6。所有引物的信息见表1。

表1引物序列SEQ ID NO.1-4的信息：

2、RNA抽提

使用多糖多酚植物总RNA快速提取试剂盒(离心柱形)，按照操作说明，分别提取病株样品和健康样品的总RNA，最后溶于30μl洗脱缓冲液中，保存于-80℃冰箱中。

3、RT-LAMP反应体系

反应体系(25μl)如下：10×ThermoPol缓冲液2.5μl(20mM Tris-HCl，10mM KCl，2mM MgSO₄，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％Triton X-100)，引物(F3和B3)0.4μM，引物(FIP和BIP)1.6μM，dNTPs 1mM， MgSO₄ 6mM，betaine 1M，M-MLV 10u，Bst DNApolymerase(NEB)10u，模板RNA 2μl。反应条件为：对 60℃恒温1h。

反应结果通过2％的琼脂糖凝胶电泳和加入SYBRGreen1后直接用肉眼观察两种方法来进行分析。

实施例2、RT-PCR和RT-LAMP检测灵敏性比较：

为了比较RT-LAMP与RT-PCR灵敏性，本发明设计了一对特异的克隆PNRSV的CP基因的引物(前引物PNRSV-F，后引物PNRSV-R扩增产物681bp)。

RT-PCR过程如下：

RT-PCR反应体系为12.5μl，包含3.5μL DEPC处理水、0.5μL下游引物、1μL RNA，然后70℃水浴5分钟，接着冰置5分钟，然后加入1.75μLDEPC处理水、2.5μL dNTPs(10mM)、2.5μL 5×M-MLV 缓冲液(50mM Tris-HCL、75mM KCL、3mM MgCl₂、10mM DTT)、0.5μL M-MLV反转录酶、0.25μL RNA酶抑制剂，然后42℃反应1h，接着95℃反应5分钟。取2μL反应产物进行PCR反应。

然后RT-PCR扩增产物用Bioteke凝胶回收试剂盒回收后用DNA Ligation Kit(TaKaRa)连接到pMD18-T 载体上，得到pMD18-T-PNRSV。将pMD18-T-PNRSV转入大肠杆菌(Escherichia.coli)JM109中，培养后提取质粒，得到pMD18-T-PNRSV质粒。测得pMD18-T-PNRSV质粒初始浓度为95ng/μl。

将pMD18-T-PNRSV质粒分别稀释10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷倍用来做RT-PCR与RT-LAMP 的模板。

RT-PCR结果用2％的琼脂糖凝胶电泳分析，RT-LAMP结果用2％的琼脂糖凝胶电泳以及直接用肉眼观察浊度等方法进行分析。

结果显示，LAMP反应灵敏性比PCR灵敏性高100倍。

实施例3、RT-PCR和RT-LAMP检测田间样品：

分别用RT-PCR和RT-LAMP两种方法检测了多个田间样品，结果两种方法的检测结果是一致的。

RT-LAMP检测方法不需要昂贵的仪器设备、操作程序简单，而且有快速高效、高特异性、高灵敏性的特点，其应用范围越来越广泛，已经在病原微生物检测中发挥出极大的优势，并成功应用于肿瘤基因的相关研究中。用本实验中描述的RT-LAMP方法与RT-PCR方法同时检测了多个病株样品，其结果一致，很明显的是用RT-LAMP方法可以节省大量的时间，而且操作简单。

总之，本发明建立了一套快速、简便、灵敏的检测李属坏死环斑病毒的方法。因此，有理由相信 RT-LAMP作为一种分子生物学的快速检测方法，将会有更广阔的应用前景。

本发明的方法已经通过具体的实施例进行了描述。本领域技术人员可以借鉴本发明的内容适当改变原料、工艺条件等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为包括在本发明的范围之内。

1朱良俊，商晗武，姜永厚，周京花.2009.四个李属坏死环斑病毒分离物的检测鉴定及CP基因序列分析.植物保护学报，2009，36(5)：403-409

2 Hammond R W.Phylogeny of isolates of Prunus necrotic ringspot virusfrom the Ilarvirus Ring test and identification ofgroup-specificfeartures.Archives of Virology，2003，148：1195-1210

3韩丽娟，刘文洪.侵染百合的李属坏死环斑病毒病(PNRSV)的研究，中国农业科学，2007，40(9)： 1943-1951

4 Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop-mediated isothermalamplification of DNA[J].Nucleic Acids Research，2000，28(12)：63.

5 Pine T S.Influnce of necrotic ringspot virus on growth and yield ofpeach tree.Phytopathology，1964，54： 604-605.

6 Liu Y H，Wang Z D，Qian Y M，et al.Rapid detection of tobacco mosaicvirus using the reverse transcription loop-mediated isothermal amplificationmethod Archives of Virology，2010，155：1681-1685

7李刚，范晓娟，李伟.快速检测小反刍兽疫病毒RT-LAMP方法的建立，中国预防兽医学报，2009， Vol.31，No.5

8李健，陈沁，熊炜.口蹄疫病毒RT-LAMP检测方法的建立病毒学报2009，Vol.25，No.2

Claims

1.一种采用反转录环介导等温扩增技术检测李属坏死环斑病毒(PNRSV)的方法，其特征在于包括下述步骤：1)扩增步骤：使用引物，从待检查标本提取RNA后，以所提取的RNA为模板，通过环介导等温扩增法进行RNA的扩增反应；2)判断步骤：检视反应液浊度变化，从分子水平检查所述扩增步骤中是否包含李属坏死环斑病毒碱基序列，以判断是否存在李属坏死环斑病毒。所述RT-LAMP反应采用的引物组如下：

引物组，用于PNRSV病毒的RT-LAMP反应：

外引物(F3和B3)：

SEQ ID NO.1：5’-ATCCGAATGATGCTCTGGTC-3’；

SEQ ID NO.2：5’-CCTCTCGGTGACTATGTGCT-3’；

内引物(FIP和BIP)：

SEQ ID NO.3：5’-CTGCTCGAAACCCTATTCGGGTCCACTCAGGGCTCAACAAAG-3’；

SEQ ID NO.4：5’-ACCACAACCGGTCGTGAAGACACCCTTAGGAATTCGGGGAG-3’。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述引物组包含所述全部4组引物SEQID NO.1-4。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述RT-LAMP反应中使用的引物浓度比例为：外引物(F3和B3)∶内引物(FIP和BIP)＝0.2-0.4∶1.2-1.6。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，其中所述RT-LAMP反应中的引物浓度为外引物(F3和B3)∶内引物(FIP和BIP)＝1∶4。

5.权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述RT-LAMP反应中的反应温度为50-62℃。

6.权利要求5所述的方法，其特征在于，其中所述RT-LAMP反应中，PNRSV引物使用的反应温度为60℃。

7.权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述RT-LAMP反应中的Mg²⁺浓度为高于或等于6mM。

8.权利要求7所述的方法，其中RT-LAMP反应中的Mg²⁺浓度为6mM。