CN102230021B - 烟草环斑病毒rt-lamp检测试剂及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了烟草环斑病毒RT-LAMP检测试剂及制备方法和应用，系选择烟草环斑病毒特异且各株系之间比较保守的CP编码基因片段为靶目标序列，经过精心设计并合成，包含三对特异性引物，目标片段长度为217bp，引物序列为：Acatggggcccgtcattgattttttccacaaatcaagtaacgatggc、Gagttaaataatccaactatgacgtggcttttcattgatagatattatgaggcgaaaga，Ccagcccacgttgtacttt、Ttgatgggtcaacttccat，Ggcagtgtattgttaccatgc、Attcaattgggtgatactttcgc；本发明克服了常规RT-PCR费时、设备昂贵以及扩增后需电泳检测等缺点，可对样品中的TRSV进行快速准确的定性检测，具有成本低廉、简单易操作、结果直观、敏感性高和重复性好等优点。

Description

烟草环斑病毒RT-LAMP检测试剂及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及检测烟草环斑病毒的生物制剂，具体涉及烟草环斑病毒RT-LAMP检测试剂及制备方法和应用。

背景技术

烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus，TRSV)属于豇豆花叶病毒科(Comoviridaex)线虫传多面体病毒属(Nepovirus)，病毒粒体球形，直径28nm。TRSV分布于日本、澳大利亚、丹麦、新西兰、法国、德国、荷兰、英国、美国等30多个国家。该病毒寄主范围广，可侵染52科246种植物，是果树、蔬菜、花卉等经济作物的重要病害之一，发生严重时可导致绝产。进口的植物种球茎和苗木中携带该病毒的风险很大，是中国进境检疫法规中明确规定禁止入境的危害性有害生物。

TRSV的检测方法主要有血清学检测(DAS-ELISA)、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术和实时荧光RT-PCR(IC-RT-PCR技术)，如公开号为CN101705309的的发明专利申请，就采用实时荧光RT-PCR检测烟草环斑病毒，检测时间需3小时。相比传统的电镜观察和生物学鉴定，这三种方法在检测灵敏度、检测周期方面具有明显的优势，但是对设备和人员技术能力的要求较高。

逆转录环介导等温扩增技术(Reverse transcript loop-mediated isothermalamplification，RT-LAMP)的反应试剂包括反应缓冲液(内含引物)、反应酶液和显色剂等，由该反应试剂组成的试剂盒中还包括RNA提取液、阳性对照液和阴性对照液等，该反应试剂依赖于能够识别靶序列上6～8个特异区域的引物和一种具解旋功能且呈瀑布式扩增的Bst DNA聚合酶，在等温条件下可高效、快速和特异地扩增靶序列。由于LAMP呈瀑布式扩增，因此其扩增效率非常高；同时，LAMP识别靶序列上的6～8个特异性位点，其特异性也很强；LAMP只在60℃～65℃进行恒温扩增，只要水浴锅即可，无需特殊的仪器，操作非常简单；而且LAMP的整个检测反应只需1.5h～2.5h，检测周期非常短。

因此，研究建立特异、灵敏以及操作简单的烟草环斑病毒RT-LAMP检测的方法，在现场快速检疫及病原诊断等方面具有重要的实际应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种对烟草环斑病毒具有特异性高、检测周期短、成本低廉和操作简单的RT-LAMP检测试剂。

本发明还提供了该检测试剂的制备方法和应用。

本发明系选择烟草环斑病毒外壳蛋白(coat protein，CP)编码基因的保守片段为靶目标，应用primer Express 3.0软件，设计合成引物。将设计的多对引物反应时间和反应温度进行优化试验，得到最合适的反应条件。

本发明所述的烟草环斑病毒RT-LAMP检测试剂，包括反应缓冲液，所述反应缓冲液包含三对特异性引物，特异性引物序列为：

FIP：5′-acatggggcccgtcattgattttttccacaaatcaagtaacgatggc-3′

BIP：5′-gagttaaataatccaactatgacgtggcttttcattgatagatattatgaggcgaaaga-3′

F3：5′-ccagcccacgttgtacttt-3′

B3：5′-ttgatgggtcaacttccat-3′

Loop1：5′-ttggcagtgtattgttaccatgc-3′

Loop2：5′-attcaattgggtgatactttcgc-3′

本发明所述的烟草环斑病毒RT-LAMP检测试剂的制备方法由下述步骤组成：

一、选择烟草环斑病毒CP编码基因的保守片段为靶目标，目标片段长度为217bp，该保守片段的核苷酸序列为：

ccagcccacg ttgtactttt ttgttgcgtc cacaaatcaa gtaacgatgg  50

ctgctgattg gcagtgtatt gttaccatgc acgtggacat ggggcccgtc  100

attgatcgtt ttgagttaaa tccaactatg acgtggccta ttcaattggg  150

tgatactttc gccattgata gatattatga ggcgaaagag attaaagctt  200

gatgggtcaa cctccat                                      217

二、应用primer Express 3.0软件，设计合成引物；

三、引物的合成采用β-乙腈磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成；

四、经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，并经过大量实际样品的检测应用评估，得到扩增效率和特异性好的上述三对特异性引物。

本发明的烟草环斑病毒RT-LAMP检测是构建出上述扩增效率和特异性好的三对引物，克服了常规RT-PCR费时，对设备要求高等缺点，可对样品中的TRSV进行快速准确的定性检测，具有特异性好、简单易操作、结果直观和成本低廉等优点。具体优点如下：

1、本发明与常规RT-PCR的检测试剂相比，具有特异、敏感的优点；RT-LAMP技术的关键是针对靶基因的6～8个区域设计三对特异引物，当引物完全识别靶序列结合区并匹配的情况下才能顺利进行，这一点实现了该技术的高度特异性。

2、本发明与常规RT-PCR的检测试剂相比，操作简单，无需昂贵设备。RT-LAMP反应只需要一个简单的恒温水浴锅，不需要昂贵的PCR仪，操作简单，成本低廉，易于在现场操作或基层推广应用。

3、本发明与常规RT-PCR的检测试剂相比，具有检测周期短的优点。该方法采用一种具有解旋功能且呈瀑布式扩增的Bst DNA聚合酶，呈恒温扩增，不需要PCR仪升降温的时间，也无需DNA凝胶电泳观察，所以检测时间非常短，扩增效率非常高。常规RT-PCR的样品检测时间一般4小时以上，而本发明的检测时间只在1.5h～2.5h左右。

4、本发明与常规RT-PCR的检测试剂相比，结果无需PCR电泳等复杂的后处理程序，只要加入染色剂，根据反应体系是否出现变色现象，用肉眼就可以快速定性判断RT-LAMP结果，具有结果直观、判定难度小的优点。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

1、设计引物

本发明选择TRSV外壳蛋白编码基因的保守片段为靶目标，通过GenBank中报道的TRSV各株系的CP编码基因序列进行同源性分析比较，选定TRSV特征基因的保守片段(217bp)，应用primer Express3.0软件，设计引物(包括所述FIP、BIP，F3、B3，Loop1、Loop2三对引物)，引物的合成采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法。将设计合成的多对引物进行反应时间和温度优化实验后，确定扩增效率和特异性最好的反应条件。

2、RNA提取

取100μL体积的研磨匀浆样品上清液，加入700μL Trizol试剂，200μL氯仿，室温振荡充分混匀10min，12000r/min(4℃)离心10min，小心吸取上清，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后室温静置10min，12000r/min(4℃)离心10min，弃上清，沉淀用70％乙醇洗涤一次，干燥后溶于20μL经焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的双蒸水中，得到RNA模板。

3、烟草环斑病毒RT-LAMP扩增温度的优化试验

烟草环斑病毒RT-LAMP采用20μL体积反应体系，反应体系如下：含有引物的2×LAMPMix 10μL，其中引物F3和B3的终浓度各为0.26μM，Loop1和Loop2的终浓度各为1.04μM，FIP和BIP的终浓度各为2.08μM；BstDNA聚合酶(8U/μL)1.5μL，AMV RNA聚合酶(5U/μL)1μL，模板RNA 1μL，用ddH₂O补充至总体积20μL。在水浴锅中，以南烟草环斑病毒RNA为模板，按照RT-LAMP检测方法，分别在60℃、63℃和65℃三个温度条件下进行扩增，反应时间为1h，结果：在60℃温度条件下扩增效果最好。每次检测时，设立空白对照和阴性对照，每个样品检测做3管平行试验，在空白对照、阴性对照为阴性，烟草环斑病毒样品出现阳性结果时，整个试验有效，可进一步判断结果。

4、烟草环斑病毒RT-LAMP扩增时间的优化试验

以烟草环斑病毒RNA为模板，按照上述RT-LAMP反应体系检测方法，分别在30min、60min和90min三个时间条件下进行扩增，反应温度为60℃，反应体积为20μL，结果：在60min条件下扩增效果最好。每次检测时，设立空白对照和阴性对照，每个样品检测做3管平行试验，在空白对照、阴性对照为阴性，烟草环斑病毒RNA样品出现阳性结果时，整个试验有效，可进一步判断结果。

5、烟草环斑病毒RT-LAMP的特异性和敏感性试验

烟草环斑病毒RT-LAMP的特异性试验，采用烟草环斑病毒、番茄环斑病毒、香石竹环斑病毒、黄瓜绿斑驳病毒、南芥菜花叶病毒以及马铃薯V病毒等样本的RNA进行特异性比较检测。对感染TRSV的大豆样品，采用Trizol试剂方法提取得到含有TRSV核酸的总RNA，进行10倍系列稀释，用常规RT-PCR和RT-LAMP检测，比较它们的敏感性，常规RT-PCR采用的引物与RT-LAMP的B₃、F₃引物一致，常规RT-PCR的检测条件和方法参照文献所述(闻伟刚等，大豆科学，2007，26(5)：748～751)。结果：结果分析：对烟草环斑病毒样本和感染TRSV的大豆样品，本发明的RT-LAMP和常规RT-PCR检测都呈阳性，而对番茄环斑病毒、香石竹环斑病毒、黄瓜绿斑驳病毒、南芥菜花叶病毒以及马铃薯V病毒的检测都呈阴性，说明上述三对引物具有很好的特异性。对10倍系列稀释的TRSV核酸进行扩增，结果显示RT-LAMP检测灵敏度要比常规RT-PCR方法的检测灵敏度高出10倍。

6、烟草环斑病毒RT-LAMP的稳定性和重复性试验

在评估RT-LAMP检测TRSV方法中的组内和组间试验的重现性、稳定性时，用阳性样品和阴性样品，在同样反应条件下，反复进行RT-LAMP检测，每次试验的每个样品做6个平行的反应管，重复12次，结果：上述三对引物的扩增样品平行试验阳性结果稳定，重复性好。我们获得了特异、敏感、稳定的上述F3、B3，FIP、BIP，Loop1、Loop2三对引物。

7、对样品的检测、对比试验和验证试验

对表现顶芽卷曲、变色并且矮化等症状的植物叶片样品以及烟草环斑病毒、番茄环斑病毒、香石竹环斑病毒、黄瓜绿斑驳病毒、南芥菜花叶病毒以及马铃薯V病毒感染的植物组织和健康大豆提取液等样本进行RT-LAMP检测，结果表明，TRSV阳性样品均发生明显的颜色变化，呈现黄绿色，阴性对照及阴性样品均呈橘红色。三个平行试验的结果稳定一致。证明RT-LAMP检测TRSV的特异性强、敏感度高和重复性好。

8、烟草环斑病毒RT-LAMP标准化试剂和检测程序

8.1标准化试剂盒组份(20μL反应×100次)：

溶液I	35mL×2瓶
		溶液II	1.25mL×2支
溶液III	150μL
		溶液IV	100μL
溶液V	1.25mL×2支
		溶液VI	100μL
溶液VII	100μL
		溶液VIII	100μL

按照优化的反应条件配制：溶液I为RNA提取液(Trizol)，溶液II为反应缓冲液：含有F3、B3(浓度各为0.26μM)，Loop1、Loop2(浓度各为1.04μM)，FIP、BIP(浓度各为2.08μM)共三对引物的2×LAMP反应缓冲液，溶液III为含有8U/μL的Bst DNA酶溶液，溶液IV为含5U/μL的AMV酶溶液，溶液V为焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水，溶液VI为阳性对照液(含有TRSV阳性RNA)，溶液VII为阴性对照液，不含有TRSV阳性RNA，溶液VIII为显色剂，由SYBR green I原液按照1∶10体积比例溶于双蒸水配制。上述RNA提取液、SYBR green I和焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水购自上海生物工程公司，Bst DNA酶、AMV酶和LAMP反应缓冲液购自大连Takara公司。

8.2操作方法

8.2.1总RNA提取

(1)取0.1～10克组织样品，按1∶10(克∶mL)加入蒸馏水，充分研磨匀浆，2000r/min，4℃，离心10min；

(2)取100μL上清液加入700μL溶液I和200μL氯仿，小心盖上帽盖，充分振荡混匀，室温静置5min，彻底裂解。12000r/min，4℃，离心10min；

(3)小心吸取上层水相，转移至一新的1.5mL管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后室温静置10min。12000r/min，4℃，离心10min，弃上清液；

(4)沉淀用70％乙醇洗涤一次，晾干后，溶于20μL经焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的双蒸水中。可直接用于检测或-70℃保存备用；

8.2.2反应组份配制

(1)取一支200μL PCR反应管，反应总体积为20μL，向反应管中加入下列反应物：

(2)设立对照

阳性对照和阴性对照各设2管；

8.2.3扩增

在水浴锅中，按下列反应参数进行：60℃恒温反应60min；

8.2.4结果分析和判定

(1)结果分析条件设定

在扩增结束后的PCR管中加入1μL的溶液VIII，混匀之后观察颜色变化；

(2)质控标准

——阴性对照PCR管内溶液呈橘红色；

——阳性对照PCR管内溶液呈黄绿色；

(3)结果描述及判定

——阴性

PCR管内溶液呈橘红色，表明样品中无烟草环斑病毒；

——阳性

PCR管内溶液呈黄绿色，表明样品中存在烟草环斑病毒。

<110>宁波检验检疫科学技术研究院

 

<120>烟草环斑病毒RT-LAMP检测试剂及制备方法和应用

<160> 7

<170> PatentIn version 3.1

 

<210> 1

<211> 47

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根据TRSV外壳蛋白编码基因设计的特异性引物

 

<400> 1

Acatggggcc cgtcattgat tttttccaca aatcaagtaa cgatggc    47

 

<210>2

<211> 59

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根据TRSV外壳蛋白编码基因设计的特异性引物

 

<400>2

Gagttaaata atccaactat gacgtggctt ttcattgata gatattatga ggcgaaaga    59

 

<210>3

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根据TRSV外壳蛋白编码基因设计的特异性引物

 

<400>3

Ccagcccacg ttgtacttt   19

 

<210>4

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根据TRSV外壳蛋白编码基因设计的特异性引物

<400>4

Ttgatgggtc aacttccat   19

 

<210>5

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根据TRSV外壳蛋白编码基因设计的特异性引物

 

<400>5

Ggcagtgtat tgttaccatg c   21

 

<210>6

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根据TRSV外壳蛋白编码基因设计的特异性引物

 

<400>6

Attcaattgg gtgatacttt cgc   23

 

<210>7

<211> 217

<212> RNA

<213>烟草环斑病毒

 

<400>7

ccagcccacg ttgtactttt ttgttgcgtc cacaaatcaa gtaacgatgg   50

ctgctgattg gcagtgtatt gttaccatgc acgtggacat ggggcccgtc  100

attgatcgtt ttgagttaaa tccaactatg acgtggccta ttcaattggg   150

tgatactttc gccattgata gatattatga ggcgaaagag attaaagctt   200

gatgggtcaa cctccat                               217

 

Claims (2)

1.烟草环斑病毒RT-LAMP检测试剂，包括反应缓冲液，所述反应缓冲液包含3对特异性引物，其特征在于特异性引物序列为：

FIP：5'-acatggggcccgtcattgattttttccacaaatcaagtaacgatggc -3′

BIP：5′-gagttaaataatccaactatgacgtggcttttcattgatagatattatgaggcgaaaga-3′

F3：5′- ccagcccacgttgtacttt -3′

B3：5′- ttgatgggtcaacttccat -3′

Loop1：5′- ttggcagtgtattgttaccatgc -3′

Loop2：5′- attcaattgggtgatactttcgc -3′。

2.权利要求1所述的烟草环斑病毒RT-LAMP检测试剂在制备TRSV 的RT-LAMP标准化试剂盒中的应用。