CN104611428B

CN104611428B - 一种检测胶孢炭疽菌的环介导等温扩增引物组合物及其应用

Info

Publication number: CN104611428B
Application number: CN201510030095.6A
Authority: CN
Inventors: 郑小波; 王帅帅; 陆辰晨; 田擎; 张海峰; 王源超
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2015-01-21
Filing date: 2015-01-21
Publication date: 2017-01-04
Anticipated expiration: 2035-01-21
Also published as: CN104611428A

Abstract

本发明公开了一种检测胶孢炭疽菌的环介导等温扩增引物组合物及其应用。以谷氨酰胺合成酶基因为靶标基因，设计并筛选出可用于LAMP检测胶孢炭疽菌的特异性强、灵敏度高的引物，由SEQ ID NO.2所示的正向外引物GS‑F3，SEQ ID NO.3所示的反向外引物GS‑B3，SEQ ID NO.4所示的正向内引物GS‑FIP，SEQ ID NO.5所示的反向内引物GS‑BIP，SEQ ID NO.6所示的环引物GS‑LF，SEQ ID NO.7所示的环引物GS‑LB组成。本发明引物组合物主要用于胶孢炭疽菌的快速检测，完成一次检测仅需2h。

Description

一种检测胶孢炭疽菌的环介导等温扩增引物组合物及其应用

技术领域

本发明属于生物检测领域，涉及一种检测胶孢炭疽菌的环介导等温扩增引物组合物及其应用。

背景技术

胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)寄主繁多，有2200多种植物，引起炭疽病，给农业生产造成严重的经济损失^[1]。胶孢炭疽菌侵染大豆植株时，大豆的茎、荚、叶及叶柄均可受害，并且可以导致大豆种子品质降低。发病植株茎秆病斑深灰色，黑色小点排列不规则；荚上病斑不规则形，褐色至灰白色，上面密生呈轮纹状排列的小黑点；叶部病斑褐色，产生明显凹陷，一般呈轮纹状排列^[2]。胶孢炭疽菌分生孢子产生在有黏质的分生孢子盘上，分生孢子单细胞，长椭圆形，无色，盘的四周有褐色刚毛^[3]。病原菌主要以菌丝体或分生孢子在落叶或残留的病组织中越冬，越冬病原菌于次年产生分生孢子传播扩散，传播的主要途径是昆虫和风雨传播^[4]，同时，该病菌亦可随大豆种子调运进行跨区域远距离传播。为了阻止大豆胶孢炭疽病菌传播范围的不断扩大，使大豆胶孢炭疽病菌病得到控制，需要对其进行快速、准确地检测。

近年来，随着大豆种植面积不断扩大，大豆炭疽病的发生呈扩大蔓延、加重危害的趋势，全国各大豆产区均有炭疽病的发生，对大豆生产造成很大威胁。为了减少大豆炭疽病传播范围的不断扩大，使大豆炭疽病得到控制，需要对其进行快速、准确地检测，以实现田间早期诊断。

大豆炭疽病可由多种炭疽菌侵染引起，迄今中国已报道引起大豆炭疽病的炭疽菌有胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)、平头炭疽菌(C.truncatum)、尖孢炭疽菌(C.acutatum)、辣椒炭疽菌(C.capsici)、黑线炭疽菌(C.dematium)等。其中，胶孢炭疽菌是炭疽菌属内最大的一个种^[5]，因此针对大豆胶孢炭疽菌的分子检测我们进行了一系列的研究。

传统病原菌的分类、鉴定主要基于形态学特性、致病性测定等^[6]，但炭疽菌种间甚至种内菌株间形态变异大，近似种之间的分类特征差异微小，造成该属的分类较难操作。胶孢炭疽菌作为该属内一个主要种和重要种，从形态特征来看，具有集合种群和复合种的特征，种内菌株间变异大，有多个专化型或生理小种。由于种内菌株从形态至生理特性存在较大的变异性，使该种在鉴定上常与一些近似种混淆，为此类病害的有效防治带来很多困难和问题。同时传统分类鉴定方法耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰^[7]，不能在病害潜伏期和初发期做出诊断，很难对病害发生进行及时的监测和有效控制。

随着分子生物学的发展，分子生物学技术已逐步应用到胶孢炭疽菌的研究中。上世纪80年代发展起来的普通PCR的方法已经成功用于检测胶孢炭疽菌^[8]，但普通PCR已属较陈旧的技术且具若干缺陷，例如检测耗时偏长，大概6～8h；对靶基因区段的识别位点少，误检率偏高，检测特异性与灵敏度偏低；检测过程较繁琐等，难以满足需求。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是日本的荣研株式会社的Notomi等人于2000年开发的一种新型的核酸扩增技术^[9]，其特点是针对靶基因的6个区域设计4条特异性引物，在链置换DNA酶(Bst DNA polymerase)的作用下，60～65℃恒温扩增，60min左右即可观察结果，具有操作简单、快速、特异性强、产物检测便捷等特点。LAMP反应只需进程结束后，在反应液中加入荧光染料SYBR Green I观察颜色和荧光变化便可直接判断结果，大大降低了对实验人员的伤害，并且增加了在田间的应用价值。SYBR Green I只能结合到双链DNA的小沟部位，当SYBR Green I与双链DNA结合的时候，会发出比原先强800-1000倍的荧光，在日光灯下通过肉眼即可观察到颜色变化。如果含有扩增产物，反应混合物变为黄绿色；反之，则保持SYBR Green I的橙色不变。此外，由于核酸是在恒温条件下进行扩增，因此可以在简单的水浴锅或保温瓶条件下完成实验，不需要购置昂贵的PCR仪，检测成本有所降低，易于在基层部门推广应用。随着技术的不断完善和发展，会在病害检测、食品检测、临床疾病诊断等领域有着广泛的应用前景^[10,11]。

靶标基因的选择是LAMP检测的重要因素之一。以PCR技术检测病原菌常用的靶标基因有核糖体基因转录间隔区(Internal transcribed space,ITS)^[12]，但由于核糖体序列没有足够多的位点来区分所有的病原菌，因此寻找出新的检测靶标成为检测的热点。

GS(Glutamine Synthetase)基因编码的谷氨酰胺合成酶是一种控制氮素代谢的酶。GS的分子生物学研究始于1983年，从蓝细菌Anabaena(glnA)克隆到GS并完全测序分析^[13]。在生物体代谢过程中，氮素是影响生物生命活动的重要因素之一。就生物体的生长和发育过程，无机氮必须同化为谷氨酰胺和谷氨酸等有机氮才能为生物体所吸收和利用。谷氨酰胺合成酶(GS)是参与这一同化过程中的关键酶。GS可分为三大类：GSI分布于原核生物，GSII主要分布于真菌生物和少量细菌，GSIII只在少量细菌中有发现。在胶孢炭疽菌中控制氮素调控的为GSII。

已知的胶孢炭疽菌分子检测靶标ITS不能满足LAMP引物设计的需要，现有基于普通PCR对该病原菌的分子检测技术已较落后，且具有检测耗时偏长、对靶基因区段识别位点少、误检率偏高、检测特异性与灵敏度偏低、检测过程较繁琐等缺陷。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种检测胶孢炭疽菌的环介导等温扩增引物组合物。

本发明的另一目的是提供该引物组合物的应用。

本发明的又一目的是提供一种检测胶孢炭疽菌的LAMP试剂盒。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

SEQ ID NO.1所示的胶孢炭疽菌的谷氨酰胺合成酶编码基因序列作为检测靶标在检测胶孢炭疽菌中的应用，优选在LAMP检测胶孢炭疽菌中的应用。

一种检测胶孢炭疽菌的LAMP引物组合物，由SEQ ID NO.2所示的正向外引物GS-F3，SEQ ID NO.3所示的反向外引物GS-B3，SEQ ID NO.4所示的正向内引物GS-FIP，SEQ IDNO.5所示的反向内引物GS-BIP，SEQ ID NO.6所示的环引物GS-LF，SEQ ID NO.7所示的环引物GS-LB组成。

本发明所述的LAMP引物组合物在检测胶孢炭疽菌中的应用。

本发明所述的LAMP引物组合物在制备胶孢炭疽菌检测试剂中的应用。

一种用于检测胶孢炭疽菌的LAMP试剂盒，包含本发明所述的引物组合物。

本发明所述的LAMP试剂盒，优选包含检测溶液，每毫升所述的检测溶液通过以下方法制备得到：0.8μM正向内引物GS-FIP、0.8μM反向内引物GS-BIP、0.1μM正向外引物GS-F3、0.1μM反向外引物GS-B3、0.1μM环引物GS-LF、0.1μM环引物GS-LB、1.4mM dNTPs、8mMMgSO₄、0.8M甜菜碱、0.8M Tris-HCl(pH 8.8)、0.4mM KCl、0.4mM(NH4)₂SO₄、4％Triton X-100、8U·μL^-1Bst DNA聚合酶，加入超纯水制备成1ml检测溶液。

所述的试剂盒还含有染料SYBR Green I。

一种LAMP检测胶孢炭疽菌的方法，包括取21μL所述的检测溶液，加入4μL待检DNA溶液，总体积为25μL进行LAMP反应；反应程序为：64℃，70min；扩增后加入0.25μL染料SYBRGreen I作为反应指示剂，肉眼观察，以SYBR Green I的颜色变化和荧光强弱做为结果判定标准：在常光下，黄绿色表示检测为阳性，即有胶孢炭疽菌存在，橙色表示检测结果为阴性，即不含有胶孢炭疽菌，或所含胶孢炭疽菌未达检测限。

本发明详述：

1、引物的设计及筛选

新型靶标基因的选取和引物的筛选是LAMP检测的关键因素。首先查找相关文献选取了CHS(几丁质合成酶)、SOD₂(锰氧化物歧化酶)、GS(谷氨酰胺合成酶)、ITS(核糖体基因转录间隔区)、EF1α(翻译延伸因子)、RPB1(RNA聚合酶II大亚基)、Tef1-α(转录延伸因子)等供选择性靶标。以靶标GS为例，在NCBI网站查找并下载胶孢炭疽菌及其相近种所含的GS序列，然后使用Bioedit软件进行序列比对，在胶孢炭疽菌的GS序列中选取一段其特有的的序列作为目标序列(200～400bp)，用Primer4在线设计引物，合理设置各组引物的GC含量、发夹结构形成倾向、自身配对倾向等指标，选择比较优化的组合进行设计。

通过进行通用性、特异性、灵敏度实验筛选合适的检测胶孢炭疽菌的引物。

1)通用性实验：以筛选能与所有胶孢炭疽菌反应的LAMP引物为目的。选择胶孢炭疽菌标准菌株，以及来自不同寄主的胶孢炭疽菌的DNA作为模板，取4μl DNA溶液，加入21μL不同靶标设计出的LAMP引物所配制反应液进行LAMP反应，反应程序为：64℃70min；扩增后加入0.25μL染料SYBR Green I作为反应指示剂，反应后观察反应管颜色变化。常光下，含有胶孢炭疽菌的样品在常光下应变为黄绿色，阴性对照在常光下为橙色。若反应结束后能使所有含有胶孢炭疽菌的样品变为黄绿色，则该引物符合通用性实验要求，可继续进行下一步筛选实验；若不能使所有含有胶孢炭疽菌的样品变为黄绿色，则该引物不符合实验要求，废弃。

2)特异性实验：以筛选能特异性检测胶孢炭疽菌的LAMP引物为目的。选择胶孢炭疽菌标准菌株，与其相近种平头炭疽菌和尖孢炭疽菌，以及其他不同属的病原菌(球黑孢、大豆疫霉病菌、玉蜀黍平脐蠕孢、立枯丝核菌、黑附球菌、菊池尾孢、链格孢菌、尖孢镰刀病菌、米曲霉、壳二孢、菜豆壳球孢、葡萄座腔菌、拟茎点种腐病菌、大豆茎褐腐病菌)的DNA作为模板，取4μl DNA溶液，加入21μL经1)筛选出的不同靶标设计出的LAMP引物所配制反应液进行LAMP反应，反应程序为：64℃70min；扩增后加入0.25μL染料SYBR Green I作为反应指示剂，反应后观察反应管颜色变化。若反应结束后，除胶孢炭疽菌为黄绿色，其他样本为橙色，则该引物符合特异性的实验要求，可进行下一步筛选实验；否则，该引物不符合实验要求，废弃。

3)灵敏度实验：以筛选能高灵敏度检测胶孢炭疽菌的引物为目的。将标准胶孢炭疽菌菌株基因组稀释为不同的浓度梯度，分别为：100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg。分别取不同浓度DNA 4μl作为模板，加入21μL经实验2)筛选出的不同靶标设计出的LAMP引物所配制检测溶液进行LAMP反应，反应程序为：64℃70min；扩增后加入0.25μL染料SYBR Green I作为反应指示剂，反应后观察反应管颜色变化，以确定不同引物配制的反应液所达到的灵敏度，筛选出反应灵敏度最高的引物，进行最终筛选。

4)经过依次筛选并进行体系、时间等优化，选择出一组以靶标GS设计的通用性好、特异性强、灵敏度高、能快速检测出胶孢炭疽菌的引物，即为本发明中检测胶孢炭疽菌的LAMP引物组合物，见表1。

表1

2、参试菌株本研究所使用的参试菌株如表2所示：

表2

有益效果

发明人通过GS基因序列比对发现该基因序列在Colletotrichumgloeosporioides种内不同菌株间高度保守，种间存在丰富的变化，可望作为该病菌分子检测的候选靶标基因。

引物设计是LAMP法实现扩增的关键，LAMP法的四个引物是针对靶基因GS上位于3’端的F3c区段，F2c区段、F1c区段和位于5’端的B1区段、B2区段，B3区段这六个区域进行设计的。本发明根据实验室获得的胶孢炭疽菌菌株基因组数据，同时与NCBI上收集的GS基因序列相比对，选出若干高度保守序列，根据与其他炭疽菌在序列上的差异，设计了若干组引物。比较各组引物的GC含量、发夹结构形成倾向、自身配对倾向等指标选择比较优化的组合进行筛选，最终选择四条特异性的LAMP引物和两条环引物，该引物具有高度的序列保守性和扩增特异性，在此基础上建立了检测大豆胶孢炭疽菌的LAMP体系。

本发明首次挖掘并选定GS基因为靶标基因，并基于该靶标基因设计并筛选出对该病菌具特异性强、灵敏度高、适用于LAMP快速分子检测的引物，进而建立可供该病菌快速分子检测的技术体系。本发明以GS为靶标基因设计并筛选特异性LANP引物并进行快速分子检测技术体系优化，对大豆胶孢炭疽菌进行LAMP检测，检测周期短(仅需70min)、特异性强、灵敏度高(1pg)、可用肉眼观察检测结果。

本发明与现有技术相比，其优点和积极效果表现在：

(1)实用性好。普通PCR反应对产物进行凝胶电泳，需要溴化乙锭(EB)染色并在紫光灯下观察才可判别结果，这既延长了检测所需时间同时很容易造成产物扩散，成为实验室污染的一个主要来源；而且溴化乙锭有剧毒，可累积致癌；长期观察紫外光也会对实验人员造成一定程度的伤害。而LAMP反应只需在恒温水浴锅中进行，反应结束之后通过SYBRGreen I的颜色变化便可在常光下用肉眼直接判断结果，从而增加了其在田间检测方面的应用价值。

(2)恒温扩增。不像PCR法必须要热循环，这样就摆脱了对热循环仪器的依赖，只要有稳定的热源如恒温水浴锅LAMP反应就可以完成，不需要昂贵的仪器设备，因而便于基层农业生产单位推广应用。LAMP之所以能在恒定的热源下发生反应是因为在LAMP反应液中添加了甜菜碱，使双链DNA处于解链的动态平衡中，在Bst DNA聚合酶的作用下实现扩增。

(3)准确性高。传统的胶孢炭疽菌检测技术只是根据形态特征来确定，鉴定方法耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰；而本发明选取胶孢炭疽菌特有的一段GS序列设计特异性的LAMP引物。LAMP反应通过4条引物特异性识别靶序列上的6个独立区域，相对于普通PCR引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性和灵敏度都显著提高。

附图说明

图1肉眼观测结果，左侧EP管呈黄绿色，表示为胶孢炭疽菌检测阳性(+)，右侧EP管呈橙色，表示为胶孢炭疽菌检测阴性(-)。

图2 GS-LAMP检测胶孢炭疽菌种内不同寄主和地区来源菌株的通用性

通过对6个胶孢炭疽菌种的菌株共计14个菌株进行了LAMP扩增。(1：标准大豆胶孢炭疽菌菌株；2-4：大豆胶孢炭疽菌株；5-14：胶孢炭疽菌其他寄主专化型；15：阴性对照)。检验LAMP方法的通用性，反应64℃、70min后根据反应管内颜色变化进行结果判定。1-14号反应管均为黄绿色(阳性)、15号反应管为橙色(阴性)，表示胶孢炭疽菌LAMP引物能够检测出胶孢炭疽菌。

图3 GS-LAMP技术对其他炭疽菌的检测结果

1：标准大豆胶孢炭疽菌菌株；2-3：尖孢炭疽菌；4-9：平头炭疽菌；10：阴性对照。结果限制通过对炭疽菌属2个其它种的菌株共计8个菌株进行了LAMP扩增，特异性LAMP反应只能在供试的C.gloeosporioides菌株中产生黄绿色的颜色变化(阳性)，而供试的尖孢炭疽菌和平头炭疽菌均呈橙色(阴性)。

图4 GS-LAMP技术对其他病原菌的检测结果

1：标准大豆胶孢炭疽菌菌株；2-3：尖孢炭疽菌；4-9：平头炭疽菌；10：球黑孢；11：大豆疫霉病菌；12：玉蜀黍平脐蠕孢；13：立枯丝核菌；14：黑附球菌；15：菊池尾孢；16：链格孢；17：尖孢镰刀菌；18：米曲霉；19：壳二孢；20：菜豆壳球孢；21：葡萄座腔菌；22：拟茎点种腐病菌；23：大豆茎褐腐病菌；24：阴性对照。结果显示通过对胶孢炭疽菌炭和18个其它病原菌菌株共计22个菌株进行了LAMP扩增，特异性LAMP反应只能在供试的C.gloeosporioides菌株中产生黄绿色的颜色变化。

图5 GS-LAMP检测胶孢炭疽菌的灵敏度

LAMP扩增不同浓度基因组DNA；1号为胶孢炭疽菌标准菌株基因组(阳性对照)；2～9为25μL的反应体系中分别含有100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg DNA的扩增结果；10号为阴性对照。颜色判定LAMP检测大豆胶孢炭疽菌菌的灵敏度显色图。阳性反应呈现黄绿色，阴性对照为橙色。结果表明LAMP反应的灵敏度达到1pg。

图6 GS-LAMP检测胶孢炭疽菌在实际中的应用

1：阳性对照；2：安徽市场大豆；3：江苏泰州市场大豆；4：江苏徐州市场大豆；5：黑龙江牡丹江市市场大豆；6：湖北武汉市场大豆；7：山东潍坊市场大豆；8：山东德州市场大豆；9：山东淄博市场大豆；10：浙江嘉兴市场大豆；11：辽宁大连市场大豆；12：阴性对照。结果表明通过对不同地区收集的大豆样本提取的DNA进行LAMP检测，特异性LAMP反应在10份供试样本中有1份产生了黄绿色的颜色反应。

图7 GS-LAMP检测胶孢炭疽菌实际应用中的灵敏度

自配LAMP反应体系的显色结果为：1号为大豆胶孢炭疽菌标准菌株基因组(阳性对照)，2～6号为50g大豆样本中添加孢子量为10000个，1000个，100个，50个，10个时大豆样本提取的DNA反应管均呈黄绿色，7号、8号分别为阴性对照及孢子添加量为0时大豆样本提取的DNA反应管均为橙色。上述结果表明，该技术对于市场大豆样本中胶孢炭疽菌的检测灵敏度为10个孢子/50g大豆样本。

具体实施方式

以下实施例中使用的主要试剂及仪器Bst DNA聚合酶(New England Biolabs)、MgS0₄(Sigma)、dNTPs、甜菜碱、DEPC水、分子质量标准DNA Maker(TaKaRa生物工程公司)、基因组DNA CTAB法提取所需试剂；eppendorf普通PCR扩增仪、上海精宏实验仪器厂DK-8D型电加热恒温水浴锅。

实施例1一种用于检测胶孢炭疽病菌的LAMP检测试剂盒

试剂盒反应体系：1mL检测溶液+染料SYBR Green I；

1mL检测溶液包括：0.8uM正向内引物GS-FIP、0.8uM反向内引物GS-BIP、0.1uM正向外引物GS-F3、0.1uM反向外引物GS-B3、0.1uM环引物GS-LF、0.1uM环引物GS-LB、1.4mMdNTPs、8mM MgSO₄、0.8M甜菜碱、0.8M Tris-HCl(pH 8.8)、0.4mM KCl、0.4mM(NH4)₂SO₄、4％Triton X-100、8U·μL^-1Bst DNA聚合酶，加入超纯水制备成1ml检测溶液，保存期限为1年。

实施例2本发明试剂盒通用性考察

选择胶孢炭疽菌标准菌株，以及来自不同寄主的胶孢炭疽菌(表2)的DNA作为模板，取4μl DNA溶液，加入21μL实施例1中的检测溶液进行LAMP反应，反应程序为：64℃70min；扩增后加入0.25μL染料SYBR Green I作为反应指示剂，反应后观察反应管颜色变化。常光下，含有胶孢炭疽菌的样品在常光下应变为黄绿色，阴性对照在常光下为橙色。结果见图2，由图2可见标准大豆胶孢炭疽菌菌株、大豆胶孢炭疽菌株及胶孢炭疽菌其他寄主专化型均呈阳性；阴性对照呈阴性；说明本发明引物组合物及由此制备的试剂盒具有很好的种内通用性。

实施例3本发明试剂盒特异性考察

择胶孢炭疽菌标准菌株，与其相近种平头炭疽菌和尖孢炭疽菌，以及其他不同属的病原菌(球黑孢、大豆疫霉病菌、玉蜀黍平脐蠕孢、立枯丝核菌、黑附球菌、菊池尾孢、链格孢菌、尖孢镰刀病菌、米曲霉、壳二孢、菜豆壳球孢、葡萄座腔菌、拟茎点种腐病菌、大豆茎褐腐病菌)(表2)的DNA作为模板，取4μl DNA溶液，加入21μL实施例1中的检测溶液进行LAMP反应，反应程序为：64℃70min；扩增后加入0.25μL染料SYBR Green I作为反应指示剂，反应后观察反应管颜色变化。除胶孢炭疽菌为黄绿色，其他样本为橙色，见图3和图4。

实施例4本发明试剂盒灵敏度考察

以筛选能高灵敏度检测胶孢炭疽菌的引物为目的。将标准胶孢炭疽菌菌株基因组稀释为不同的浓度梯度，分别为：100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg。分别取不同浓度DNA 4μl作为模板，加入21μL实施例1中的检测溶液进行LAMP反应，反应程序为：64℃70min；扩增后加入0.25μL染料SYBR Green I作为反应指示剂，反应后观察反应管颜色变化，结果见图5。结果表明LAMP反应的灵敏度达到1pg。

实施例5市场收集大豆中检测胶孢炭疽菌

从山东、江苏、黑龙江、武汉、浙江等地收集的大豆种子共10份，采用上述大豆胶孢炭疽菌检测试剂盒检测胶孢炭疽菌，方法包括：

1.随机取样：将市场购买的一份大豆样本混合均匀随机称取50g，选取的样本下一步备用。不同地区的样本均采取相同的处理方式。

2.样本的洗涤：将上述称取的样本倒入250ml三角瓶中，加入100ml的无菌水，滴加20％吐温3-5滴。封住瓶口，置于摇床上220rpm，30min，震荡洗涤。

3.滤液的收集：震荡洗涤后的混合液用200目钢筛过滤，并用少量无菌水钢筛上的大豆残渣，滤液收集到新的三角瓶中。

4.离心收集沉淀：将收集到的滤液装到100ml离心管中，分次离心，6500rpm，5min，弃上清，收集沉淀。

5.沉淀物处理：将沉淀物置于37℃恒温箱中晾干。

6.沉淀物总基因组的提取：由于沉淀物中含有大量土壤成分，所以实验采用美国MOBIO公司的土壤微生物DNA强力提取试剂盒DNA Isolation Kit进行提取，方法如下：取烘干的沉淀物0.25g加入到PowerBead管中，加入60ulC1，漩涡震荡10min；室温10000g、30s离心。吸取上清液400～500ul至2ml Collection Tube中，向离心管中加入250ul C2，漩涡震荡5s，置于4℃5min；室温离心10000g，1min；吸取上清600ul至新的2mlCollection Tube中；向离心管中加入200ul C3，漩涡震荡5s后，置于4℃5min；室温离心10000g，1min；吸取上清750ul至新的2ml Collection Tube中；向管中加入1.2mlC4，漩涡震荡5s；将混合液转移至Spin Fittle中，10000g、1min离心，弃滤液；向滤柱中加入500ulC5，10000g、30s，弃滤液；滤柱空转离心，10000g、1min；将滤柱放置于新的2ml CollectionTube中，37℃恒温晾干；滤柱中加入100ul C6，放置2min，10000g、1min离心。所得滤液即为提取的基因组，放置备用。

7.提取基因组中大豆胶孢炭疽菌LAMP检测：(1)大豆胶孢炭疽菌LAMP检测：取21μl检测溶液，加入4μl提取的基因组溶液，总体积为25μl。(2)反应条件：64℃，70min。

8.扩增产物检测：在扩增反应结束后加入染料SYBR Green I作为指示剂。若反应液颜色变为黄绿色表示检测为阳性，供试大豆中含有胶孢炭疽菌；若颜色保持橙色不变表示检测为阴性，供试大豆中不含胶孢炭疽菌。

结果(图6)显示10份样本中，江苏泰州、江苏徐州、山东德州、浙江嘉兴4个地区的大豆种子检测样本中出现黄绿色颜色变化(阳性)，即检测到胶孢炭疽菌，其他6份样本均为阴性。

实施例6从田间发病大豆组织中检测胶孢炭疽菌

采集不同地区的病植物组织，采用上述胶孢炭疽菌检测试剂盒检测胶孢炭疽菌，方法包括：

1.采集不同地区不同田块大豆病组织。本实验中采集的大豆样本包括江苏南京江浦农场、安徽宿州地区、安徽龙亢农场、江苏徐州地区、湖北武汉等。

2.对不同地区样本进行整理编号。

3.对上述采集样本称取被病原物侵染的大豆叶片或根茎部位0.1g，提取基因组。采用TIANGEN公司生产的DNA secure Plant Kit新型植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)提取植物基因组试剂盒提取植物基因组。

4.提取的基因组混匀后吸取4ul DNA溶液，按本发明进LAMP反应。若果存在颜色反应呈现黄绿色，则证明所检测的病组织病原物为大豆胶孢炭疽菌；如果反应液保持SYBRGreen I的橙色不变，则病组织中不含有胶孢炭疽菌。结果如下：

江苏：55个样本，检测出16个阳性结果；

湖北：54个样本，检测出36个阳性结果；

安徽：43个样本，检测出13个阳性结果；

5.对检测阳性的大豆病组织材料进行病原菌分离，分离出的病原菌经形态观察和ITS测序比对，为胶孢炭疽菌，进一步证明检测阳性结果正确可靠。

实施例7

1)随机取样

大豆及豆荚残渣样本在盘子内摇晃混匀五点取样，选取6份样本下一步备用。

2)样本的洗涤

将6份大豆大豆及豆荚残体各称取50g，倒入250ml三角瓶中，加入100ml的无菌水，滴加20％吐温3-5滴，然后分别加入10000、1000、100、50、10、0个胶孢炭疽菌的分生孢子，封住瓶口，置于摇床上220rpm，30min，震荡洗涤。

3)滤液的收集

震荡洗涤后的混合液用200目钢筛过滤，并用少量无菌水冲洗钢筛上的大豆残渣，滤液收集到原三角瓶中。

4)离心收集沉淀、

将收集到的滤液装到100ml离心管中，分次离心，6500rpm，10min，弃上清，收集沉淀。

5)沉淀物处理

将沉淀物置于37℃恒温箱中晾干。

6)沉淀物总基因组的提取

由于沉淀物中含有大量土壤成分，所以实验采用美国MOBIO公司的土壤微生物DNA强力提取试剂盒DNA Isolation Kit进行提取，方法如下：

取烘干的沉淀物0.25g加入到PowerBead管中，加入60μl C1，漩涡震荡10min；室温10000g、30s离心。吸取上清液400～500μl至2ml Collection Tube中，向离心管中加入250μl C2，漩涡震荡5s，置于4℃，5min；室温离心10000g，1min；吸取上清600μl至新的2mlCollection Tube中；向离心管中加入200μl C3，漩涡震荡5s后，置于4℃5min；室温离心10000g，1min；吸取上清750ul至新的2ml Collection Tube中；向管中加入1.2ml C4，漩涡震荡5s；将混合液转移至Spin Fittle中，10000g、1min离心，弃滤液；向滤柱中加入500ulC5，10000g、30s，弃滤液；滤柱空转离心，10000g、1min；将滤柱放置于新的2ml CollectionTube中，37℃恒温晾干；滤柱中加入100ul C6，放置2min，10000g、1min离心。所得滤液即为提取的基因组，放置备用。

7.提取基因组中大豆胶孢炭疽菌LAMP检测

(1)胶孢炭疽菌LAMP检测：取21μl检测溶液，加入4μl提取的基因组溶液，总体积

为25μl。

(2)反应条件：64℃，70min。

8.扩增产物检测：在扩增反应结束后加入染料SYBR Green I作为指示剂。若反应液颜色变为黄绿色表示检测为阳性，供试大豆中含有胶孢炭疽菌；若颜色保持橙色不变表示检测为阴性，供试大豆中不含胶孢炭疽菌。结果显示，本发明建立的LAMP技术对于大豆及豆荚残体样本中胶孢炭疽菌的检测灵敏度为10个孢子/50g大豆(图7)。

参考文献

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Claims

1.一种检测胶孢炭疽菌的LAMP引物组合物，其特征在于由SEQ ID NO.2所示的正向外引物GS-F3，SEQ ID NO.3所示的反向外引物GS-B3，SEQ ID NO.4所示的正向内引物GS-FIP，SEQ ID NO.5所示的反向内引物GS-BIP，SEQ ID NO.6所示的环引物GS-LF，SEQ ID NO.7所示的环引物GS-LB组成。

2.权利要求1所述的LAMP引物组合物在检测胶孢炭疽菌中的应用。

3.权利要求1所述的LAMP引物组合物在制备胶孢炭疽菌检测试剂中的应用。

4.一种用于检测胶孢炭疽菌的LAMP试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的LAMP引物组合物。

5.根据权利要求4所述的LAMP试剂盒，其特征在于包含检测溶液，每毫升所述的检测溶液通过以下方法制备得到：0.8μM正向内引物GS-FIP、0.8μM反向内引物GS-BIP、0.1μM正向外引物GS-F3、0.1μM反向外引物GS-B3、0.1μM环引物GS-LF、0.1μM环引物GS-LB、1.4mMdNTPs、8mM MgSO₄、0.8M甜菜碱、0.8M pH 8.8的Tris-HCl、0.4mM KCl、0.4mM(NH4)₂SO₄、4％Triton X-100、8U·μL^-1Bst DNA聚合酶，加入超纯水制备成1ml检测溶液。

6.根据权利要求4或5所述的LAMP试剂盒，其特征在于所述的试剂盒还含有染料SYBRGreen I。

7.一种LAMP检测胶孢炭疽菌的方法，其特征在于包括取21μL权利要求5所述LAMP试剂盒中的检测溶液，加入4μL待检DNA溶液，总体积为25μL进行LAMP反应；反应程序为：64℃，70min；扩增后加入0.25μL染料SYBR Green I作为反应指示剂，肉眼观察，以SYBR Green I的颜色变化和荧光强弱做为结果判定标准：在常光下，黄绿色表示检测为阳性，即有胶孢炭疽菌存在，橙色表示检测结果为阴性，即不含有胶孢炭疽菌，或所含胶孢炭疽菌未达检测限。