CN102534017A - 一种兰花胶孢炭疽菌分子检测引物及快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种兰花胶孢炭疽菌分子检测引物及其用法，专用于兰花胶孢炭疽菌特异分子检测，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术的领域。主要采用设计了一对兰花胶孢炭疽菌的特异引物（上游引物P1:5‘-GGCCTCCCGCCTCCGGGCGGGTC-3’和下游引物P2:5‘-TGAGGGCCTACATCAGCT-3’），经过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，可在兰花胶孢炭疽菌纯DNA、带菌的植株和栽培基质中特异性地扩增出片段长度为304bp的特异扩增产物。所发明的特异分子检测引物及其用法可被用于生产实践中兰花胶孢炭疽菌感染的植株和栽培基质中兰花胶孢炭疽菌的快速、灵敏、特异的检测，同时可用于田间病害的早期诊断和病菌的监测和鉴定，为兰花胶孢炭疽菌引起的病害的防治提供可靠的技术和理论依据。

Description

一种兰花胶孢炭疽菌分子检测引物及快速检测方法

技术领域

本发明涉及一种兰花胶孢炭疽菌分子检测引物及其用法，专用于兰花胶孢炭疽菌的快速分子检测，同时可用于田间兰花胶孢炭疽菌的早期诊断和病菌的监测与鉴定，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术的领域。

背景技术    

兰花是福建省出口创汇的主要花卉产品之一，给种植户带来了巨大收益。福建的建兰（Cymbidium ensifolium）是国兰之祖，与墨兰（Cymbidium sinense），寒兰（ Cymbidium kanran），春兰 （Gymbidium goeringii ），蕙兰（Cymbidium faberi）属兰科（Orchidaceae）兰属（Cymbidium）多年生单子叶草本植物，是珍贵的园林观赏植物。在我国民间有着悠久的栽培历史，因其品种多，价格高，且花期较长可多次开花，近年来，种植面积逐步扩大。

据报道，兰花炭疽病是由胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起的，是生产中的最主要病害。一旦受炭疽病菌侵染后，在叶片或花瓣上出现大小不等的斑点，甚至造成植株不开花，大大降低或失去观赏或商品价值，严重时植株枯死，给生产造成极大的威胁。目前，国内学者对兰花胶孢炭疽菌研究涉及的较少，特别是病菌的分子检测方面。

兰花炭疽病可危害叶片、花瓣、根，不但造成当年生产减产和品质降低，同时也是次年的初侵染来源，其中潜存于植株和土壤中的炭疽病菌是来年炭疽病发生的最主要的初侵染源。病菌主要以菌丝体在病叶、病残体和枯萎的叶基苞片上越冬，分生孢子经越冬，其萌发率大为降低。次年春末、夏初天气潮湿多雨，病菌开始侵染，有伤口和急风暴雨更易感染。病菌可借助昆虫传播和风雨传播而侵染附近植株的叶片，进而使地上部表现症状，形成发病中心，致该病由点到面，迅速蔓延扩大。该病的发生和流行受品种和气象条件的影响较大，其中又以气象条件为主。在适宜的温、湿度条件下，炭疽病菌产生的孢子能迅速繁殖，多次再侵染，很快引致流行。老叶一般于4月份开始发病，新叶则从7-8月份开始发病，高温多雨季节发病严重。如果整株受害严重，幼芽刚萌发时亦受侵染发病。若兰圃中花盆放置过密，杂草多，叶片相互交错，相对湿度过高，病菌易再次侵染。当年不换盆、分盆，盆土粘重板结，透气性差，排水不良，会使病害加重。因此建立兰花胶孢炭疽病原菌分子检测方法，对早期发病植株进行胶孢炭疽菌快速检测，进而监测炭疽病菌的发生情况，对防止该病从发病区向未发病区扩散蔓延以及兰花胶孢炭疽菌早期预测预报和有效防治策略的制定都具有重要的理论和实际意义。

兰花胶孢炭疽菌具有很强的传染性，一旦扩散蔓延则难以控制。目前对兰花胶孢炭疽菌的检测大多仍沿用传统的培养及鉴定方法，但该病在按常规方法分离的过程中，由于胶孢炭疽菌生长速度稍慢，经常被包括腐霉在内的其它杂菌所掩盖，给该菌的成功分离和病害的准确诊断造成很大困难。因此，以形态特征为基础的常规病害诊断技术，由于其耗时长，效率和灵敏度均较低，难以满足对兰花炭疽病诊断的实际需要，很容易错过病害防治的最佳时期。因此，建立一套结果可靠、易于操作、灵敏度高的兰花胶孢炭疽菌快速检测诊断技术不仅非常必要，而且十分迫切。

随着科学技术的发展，许多新的技术方法不断引入该领域，其中PCR技术以其快速、灵敏和准确等优点已广泛应用于植物病害的研究。核糖体转录间隔区是20世纪90年代发展起来的全新的分子标记。利用核糖体rDNA序列在物种进化过程中的保守性和异变性设计引物进行PCR扩增已在棉花、番茄、西瓜等作物的病害检测中得到了广泛的应用。随着炭疽病菌不同种ITS序列数据的积累，以该区域为靶标序列设计特异引物用于炭疽病菌的检测已有成功报道，随着PCR技术的不断改进，后来发展起来的巢式PCR在植物病原菌的检测方面已得到了广泛应用。巢式PCR的灵敏度比常规PCR提高100-10000倍，在植物病害的症状还未显现出来之前，就能对植物体内病原菌进行准确快速的检测，这对制订病害防治最佳时期至关重要。

发明内容

针对现有技术中兰花胶孢炭疽菌的生物学检测方法所需周期长、兰花胶孢炭疽菌还没有系统的分子检测方法的现状，本发明提供了一种兰花胶孢炭疽菌分子检测引物以及兰花胶孢炭疽菌的快速检测方法。

为了实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：

本发明首先提供了一种兰花胶孢炭疽菌分子检测引物，引物序列为：

上游引物P1: 5‘-GGCCTCCCGCCTCCGGGCGGGTC-3’

下游引物P2: 5‘-TGAGGGCCTACATCAGCT -3’。

所述引物P1和 P2对兰花胶孢炭疽菌特异性扩增出304bp的产物。

本发明还提供了一种兰花胶孢炭疽菌的快速检测方法，包括以下步骤：

（1）提取植株或栽培基质DNA；

（2）PCR扩增；PCR反应体系25μl，包括 Taq PCR Master Mix 12.5μL，2×10^-5～200ng模板DNA，10 umol/ L所述的上游引物P1和下游引物 P2各1μL，加ddH₂O至总体积达25μL； PCR反应条件为：94℃ 预变性5min；94℃变性60sec，70℃退火60 sec，72℃延伸60 sec，共35个循环；72 ℃延伸7 min；

（3）PCR扩增产物用琼脂糖电泳分离，根据扩增产物的大小判定结果，如果能特异性地扩增出304 bp的产物，即判断所述的植株或栽培基质中存在兰花胶孢炭疽菌。

为了获得兰花胶孢炭疽菌的特异引物序列，本发明以福建省福州，漳州等地的25个兰花胶孢炭疽菌，10种不同真菌，3个兰花枯萎病菌为供试材料，采用CTAB法提取供试菌株基因组DNA，具体方法如下：取50mg 冷冻干燥后的菌丝粉于1.5ml离心管中，加入900μl CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取液（2% CTAB；100 m mol/L Tris-HCl, PH 8.0；20mmol/L EDTA,pH8.0；1.4 mol/L NaCl）和90μl 10% SDS（十二烷基苯磺酸钠）后混匀,于65℃水浴1.0-1.5 h,每10 min振荡混匀一次,水浴后离心（12,000rpm）10min，取上清液加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）,离心(12,000rpm)10 min，取上清液（水相），加入等体积氯仿抽提一次（12,000rpm离心10min），吸上清，加0.1倍体积的3 mol/L NaAC溶液和2倍体积的冰无水乙醇,-20℃下沉淀2h后12,000rpm离心10 min,轻轻地倒去上清液，加入700μl冰的70%乙醇进行洗涤（稍离心，倾掉上清），在超净工作台上自然晾干无酒精味后用1×TE（10mmol/LTris-HCL,0.1mmol/LEDTA,pH8.0）溶液进行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至100 ng/μl待用。在兰花胶孢炭疽菌特异DNA片段序列的基础上应用ClustalX软件比对设计特异引物P1/ P2，经对供试菌株和25个兰花胶孢炭疽菌的特异性进行PCR验证（PCR反应体系25μl，Taq PCR Master Mix 12.5μL，200ng模板DNA，引物P1/ P2各1μL（10 umol/ L），加ddH2O至总体积达25μL。PCR反应条件为： 94℃ 预变性5min；94℃变性60sec，70℃退火60 sec ，72℃延伸60sec，共35个循环；72 ℃延伸7 min。此特异引物在兰花胶孢炭疽菌中特异性地扩增出304bp的产物。这说明该引物可被用于生产实践中发病植株中兰花胶孢炭疽菌快速可靠的检测和鉴定。

本发明有益效果：本发明方法适用于植株中兰花胶孢炭疽菌的快速可靠的检测和鉴定，对于农业生产中兰花胶孢炭疽菌引起的病害防治具有重要的实用价值。该方法结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高，对于兰花胶孢炭疽菌引起病害显症之前的早期监测，确定病害防治最佳时期具有十分重要的意义。

本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：

1、特异性强：本发明检测方法是利用核糖体内转录间隔区（rDNA-ITS）序列在真菌种间高度变异和种内稳定性设计兰花胶孢炭疽菌特异引物进行检测。已经对来自福建福州和漳州等地的兰花胶孢炭疽菌，兰花枯萎病菌和其它不同真菌进行验证，结果具有很强的特异性。

2、实用性好：本发明所设计出的一对特异性引物，可用于带兰花胶孢炭疽菌的植株或栽培基质的高灵敏度快速分子检测，因此本方法的实用性强，可满足对带菌植株中存在的兰花胶孢炭疽菌进行快速可靠的检测和鉴定的需要。

3、操作简便快速：应用本发明方法，对植株进行DNA提取、PCR扩增和常规的琼脂糖电泳后即可判定结果，无需对扩增产物进行限制性内切酶酶切。一般整个检测过程可在数小时内完成。

附图说明：

图1为本发明所要检测的兰花胶孢炭疽菌的特异PCR扩增图；其中图A中： M：DL 2000bp DNA Marker，泳道1-15为兰花胶孢炭疽菌；图B中： M：DL 2000bp DNA Marker，泳道16-25为兰花胶孢炭疽菌，泳道26为阴性对照，27-29为兰花枯萎病菌，泳道30为黄瓜炭疽病菌，泳道31为菜豆炭疽病菌，泳道32为辣椒炭疽病菌，泳道33为山茶花炭疽病菌，泳道34为大豆炭疽病菌，泳道35为文心兰炭疽病菌，泳道36香蕉枯萎病菌，泳道37为辣椒疫霉菌，泳道38为草莓疫霉菌，泳道39 为茄子疫霉菌。

图2为本发明兰花胶孢炭疽菌的灵敏性检测扩增结果图（巢式PCR）；图A ：巢式PCR第一轮反应,引物为ITS1和ITS4，其中M，DL 2000 DNA Marker，泳道1为200ng，泳道2为20ng，泳道3为2ng，泳道4为200pg，泳道5为20pg，泳道6为2pg，泳道7为200fg，泳道8为20fg，泳道9为阴性对照；图B：巢式第二轮反应，引物P1和P2，其中M，DL 2000 DNA Marker，泳道10为阴性对照，泳道11为200ng，泳道12为20ng，泳道13为2ng，泳道14为200pg，泳道15为20pg，泳道16为2pg，泳道17为200fg，泳道18为20fg。

图3为本发明发病植株的检测结果图；图中： M：DL 2000 DNA Marker，泳道1为阴性对照，泳道2为阳性对照，泳道3-8为发病的兰花炭疽病植株。

图4为本发明栽培基质的检测结果图；图中： M：DL 2000 DNA Marker，泳道1为阴性对照，泳道2为阳性对照，泳道3-6为采集的栽培基质。

具体实施方式

本发明的技术内容包括兰花胶孢炭疽菌的特异检测引物，根据兰花胶孢炭疽菌核糖体内转录间隔区（rDNA-ITS）序列在真菌种间高度变异和种内稳定性，设计了对兰花胶孢炭疽菌具有特异扩增作用的一对PCR引物，即特异分子检测引物的序列为：

上游引物P1: 5‘-GGCCTCCCGCCTCCGGGCGGGTC-3’

下游引物P2: 5‘-TGAGGGCCTACATCAGCT -3’

2．兰花胶孢炭疽菌特异分子检测方法的建立

（1）从植株或栽培基质中提取DNA；

（2）PCR扩增：PCR反应体系25μl，包括 Taq PCR Master Mix 12.5μL，200ng模板DNA，引物P1/ P2各1μL（10 umol/ L），加ddH2O至总体积达25μL。 PCR反应条件为：94℃ 预变性5min；94℃变性60sec，70℃退火60 sec，72℃延伸60 sec，共35个循环；72 ℃延伸7 min。

①当在用于植株中可能存在兰花胶孢炭疽菌时，采用NaOH快速裂解法提取兰花胶孢炭疽菌的DNA，按如下的PCR反应体系和反应条件用所设计的引物进行PCR扩增： PCR反应体系25μl，包括Taq PCR Master Mix 12.5μL，200ng模板DNA，引物P1/ P2各1μL（10 umol/ L），加ddH2O至总体积达25μL。PCR反应条件为： 94℃ 预变性5min；94℃变性60sec，70℃退火60 sec，72℃延伸60 sec，共35个循环；72 ℃延伸7 min。

②当在用于栽培基质中可能存在兰花胶孢炭疽菌时，采用CTAB法提取栽培基质中兰花胶孢炭疽菌的DNA，按按如下的PCR反应体系和反应条件用所设计的引物进行PCR扩增： PCR反应体系25μl，包括Taq PCR Master Mix 12.5μL，200ng模板DNA，引物P1/ P2各1μL（10 umol/ L），加ddH₂O至总体积达25μL。PCR反应条件为： 94℃ 预变性5min；94℃变性60sec，70℃退火60 sec，72℃延伸60 sec，共35个循环；72 ℃延伸7 min。

③然后将上述10μl PCR产物于含0.5μg/mL EB的1.5%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上检测并拍照，根据扩增产物的大小判定结果。

④如果能特异性地扩增出304bp产物时，即可判断所述的植株样品或栽培基质中存在兰花胶孢炭疽菌；否则所述的植株样品或栽培基质中未存在兰花胶孢炭疽菌。

实施例1：引物对兰花胶孢炭疽菌的特异性扩增

1．兰花胶孢炭疽菌的特异检测

PCR反应体系25μl，包括 Taq PCR Master Mix 12.5μL，200ng模板DNA，引物P1/ P2各1μL（10 umol/ L），加ddH2O至总体积达25μL，在PE 2400 PCR仪上扩增。 PCR反应条件为：94℃ 预变性5min；94℃变性60sec，70℃退火60 sec，72℃延伸60 sec，共35个循环；72 ℃延伸7 min。电泳检测扩增产物。

2．检测结果

检测的特异性：如图1所示，除了25个来自我省福州和漳州等地的兰花胶孢炭疽菌DNA可特异地扩增出304 bp的产物外，检测了3个兰花枯萎病菌和10种不同真菌DNA均未能扩增出任何产物，具有很强的特异性。

实施例2：引物对兰花胶孢炭疽菌的灵敏性检测

1．DNA浓度稀释：提取的兰花胶孢炭疽菌基因组DNA，经分光光度计测定浓度后，采用系列浓度稀释。

2．兰花胶孢炭疽菌的灵敏性检测

PCR反应体系25μl，包括 Taq PCR Master Mix 12.5μL，系列浓度模板DNA，引物P1/ P2各1μL（10 umol/ L），加ddH2O至总体积达25μL，在PE 2400 PCR仪上扩增。 PCR反应条件为：94℃ 预变性5min；94℃变性60sec，70℃退火60 sec，72℃延伸60 sec，共35个循环；72 ℃延伸7 min。电泳检测扩增产物。

3．检测结果：如图2所示，在25μl反应体系中，20fg兰花胶孢炭疽菌基因组DNA可获得明显扩增条带，检测灵敏度可达20fg。

实施例3：发病植株中兰花胶孢炭疽菌的检测。

1．样品采集：植物组织样品采自福建省福州和漳州兰花种植基地。

2．DNA提取及检测

发病植物组织采用CTAB法提取DNA，按上述实施的方法进行PCR扩增，PCR反应体系25μl，包括 Taq PCR Master Mix 12.5μL，200ng模板DNA，引物P1/ P2各1μL（10 umol/ L），加ddH2O至总体积达25μL在PE 2400 PCR仪上扩增。 PCR反应条件为：94℃ 预变性5min；94℃变性60sec，70℃退火60 sec，72℃延伸60 sec，共35个循环；72 ℃延伸7 min。电泳检测扩增产物。

3．检测结果

结果见图3，泳道2，5，6,7,8见到一条清晰的分子量为304bp的特异条带，而泳道1,3,4均没有条带，因而判断5,6,7,8号样品感染兰花胶孢炭疽菌。

实施例4：兰花栽培基质中兰花胶孢炭疽菌的检测。

1．样品采集：兰花栽培基质采自福建省福州兰花生产基地。

2．DNA提取及检测

（1）从可能发病土壤样品中提取DNA：

（2）兰花胶孢炭疽菌的PCR检测

PCR扩增，PCR反应体系25μl，包括 Taq PCR Master Mix 12.5μL，200ng模板DNA，引物P1/ P2各1μL（10 umol/ L），加ddH2O至总体积达25μL，在PE 2400 PCR仪上扩增。 PCR反应条件为：94℃ 预变性5min；94℃变性60sec，70℃退火60 sec，72℃延伸60 sec，共35个循环；72 ℃延伸7 min。电泳检测扩增产物。

3．检测结果

结果见图4，泳道2-5均见到一条清晰的分子量为304bp的特异条带，而泳道1和6均没有条带，判断采集的3，4，5号栽培基质感染兰花胶孢炭疽菌。

<110>  福建省农业科学院植物保护研究所

 

<120>  一种兰花胶孢炭疽菌分子检测引物及快速检测方法

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

ggcctcccgc ctccgggcgg gtc   23

 

 

<210>  2

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

tgagggccta catcagct  18

 

Claims (3)

1.一种兰花胶孢炭疽菌分子检测引物，其特征在于，引物序列为：

上游引物P1: 5‘-GGCCTCCCGCCTCCGGGCGGGTC-3’

下游引物P2: 5‘-TGAGGGCCTACATCAGCT -3’。

2.根据权利要求1所述的兰花胶孢炭疽菌分子检测引物，其特征在于，所述引物P1和 P2对兰花胶孢炭疽菌特异性扩增出304bp的产物。

3.一种兰花胶孢炭疽菌的快速检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）提取植株或栽培基质DNA；

（2）PCR扩增；PCR反应体系25μl，包括 Taq PCR Master Mix 12.5μL，2×10^-5～200ng模板DNA，10 umol/ L权利要求1所述的上游引物P1和下游引物 P2各1μL，加ddH₂O至总体积达25μL； PCR反应条件为：94℃ 预变性5min；94℃变性60sec，70℃退火60 sec，72℃延伸60 sec，共35个循环；72 ℃延伸7 min；

（3）PCR扩增产物用琼脂糖电泳分离，根据扩增产物的大小判定结果，如果能特异性地扩增出304 bp的产物，即判断所述的植株或栽培基质中存在兰花胶孢炭疽菌。

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