CN105462890A - 越南槐内生细菌b22在防治三七根腐病中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种越南槐内生细菌B22，越南槐内生菌B22的分类命名为微杆菌(Microbacterium？sp.)B22，菌株的16S？rDNA基因序列表如SEQ？ID？NO.1所述，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2015年09月29日，保藏号：CGMCC？No.11463。本发明首次从药用植物越南槐的根中分离筛选到一株越南槐内生细菌(Microbacterium？sp.)B22，该菌对三七根腐病菌具有很强的抑制作用，为三七真菌病害的生物防治领域带来广阔的应用前景。

Description

越南槐内生细菌B22在防治三七根腐病中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种越南槐内生细菌B22在防治三七根腐病中的应用。
背景技术
现代农业对植物病害的防治过度依赖于化学农药的使用，大量化学农药的施放不仅对生态环境具有长期的破坏作用，也引起农产品品质下降，农药残留超标、病原菌的耐药性以及对人畜有害等诸多问题。寻找更为安全、有效的病害防治方法具有重大的意义，利用生物的方法来防治植物病害可以有效解决上述问题。
三七(PanaxnotoginsengF.H.chen)又名田七、金不换等，具有显著的活血化瘀、消肿定痛功效，是一种中国传统名贵药材。以三七为主要原料制成的中成药如“云南白药”和“片仔癀”等广为流传。近年来，对三七原材料的需求日益增长。但是栽培过程中的真菌病害严重影响了三七生长。目前，在三七种植上，防治真菌病害过度依赖化学农药，大量化学农药的使用不仅影响了三七的品质，也造成了三七药材的大量农药残留。
三七根腐病为三七主要病害之一，在产区俗称“绿臭”，主要症状为苗期的芽腐及其芦头和芽基结合处的褐色水渍状病变直至蔓延至整个茎杆基部。该病出苗期就有发生，4、5月病害停滞，6-9月进入多雨季节，进入发病高峰期。根腐病有多种类型，据报道其症状大都由三七根腐病菌(Fusariumsolani)(简称F.solani)引起。
这个真菌病害是造成多年来三七产品质量和产量下降的主要原因之一。在广西三七的传统道地产区，由于低海拔及高温多湿的气象条件，这种病害往往是同时发生的，造成了三七的大量减产甚至绝收，给种植户带来了巨大的经济损失。为了控制这个真菌病害，大量的化学农药被使用，造成了三七产品的大量农药残留，严重的污染了环境，大大的威胁了人们的健康。因此，开展生物防治三七真菌病害对三七产业的可持续发展是非常迫切和必要的。为此筛选出能同时拮抗这种病害的拮抗菌具有重大意义，筛选进而开发利用拮抗菌也是有效控制三七真菌病害最具发展潜力的防治措施之一。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种越南槐内生细菌B22在防治三七根腐病中的应用，从而能有效的防治三七种植过程中出现的三七根腐病，从而提高三七的产量以及质量。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一种越南槐内生细菌B22，越南槐内生菌B22的分类命名为微杆菌(Microbacteriumsp.)B22，菌株的16SrDNA基因序列表如SEQIDNO.1所述，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2015年09月29日，保藏号：CGMCCNo.11463。
优选的是，所述越南槐内生细菌B22代谢产物的制备方法为：将越南槐内生细菌B22接种于NB液体培养基中，置于温度为28℃、转速为130r/min条件下发酵培养10天，所得发酵物经减压浓缩干燥后，加入发酵物2倍的甲醇并超声40min，然后离心，取上清液减压浓缩得到菌株发酵物的甲醇粗提物，即为越南槐内生细菌B22代谢产物。
优选的是，所述越南槐内生细菌B22接种于含1000mlNB液体培养基。
优选的是，所述的NB液体培养基含牛肉浸膏3g，酵母膏1g，蛋白胨5g，蔗糖10g，培养基pH值为7.0。
如上述制备所得越南槐内生细菌B22的代谢产物在防治三七根腐病中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明首次从药用植物越南槐的根中分离筛选到一株越南槐内生细菌(Burkholderiasp.)B22，该菌对三七根腐病菌具有很强的抑制作用，为三七真菌病害的生物防治领域带来广阔的应用前景。
附图说明
图1是本发明越南槐内生细菌B22与三七根腐病的平板对峙培养，其中F为三七根腐病菌(Fusariumsolani)，a为空白对照，b为实验组。
图2是本发明越南槐内生细菌B22菌株形态特征，其中，a1为菌落形态，b1为菌体形态。
图3为越南槐内生细菌B22菌株基于16SrDNA基因序列构建的系统发育树。
图4是根据本发明菌株越南槐内生细菌B22的代谢产物对三七根腐病菌的菌丝生长的抑制效果；其中第1、第5个为空白对照即不含药的PDA平板；第2、第3、第4个为阳性对照多菌灵粉剂；第6、第7、第8为B22菌株的代谢产物，且浓度分别为2mg/ml，4mg/ml，8mg/ml；F为三七根腐病菌Fusariumsolani。
具体实施方式
下面结合具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。甲醇为市购分析纯甲醇。2XTagMasterMix购自宝生物工程有限公司(Takara)，Primer-1、Primer-2由华大基因合成。
实施例1
菌株的分离、筛选及鉴定
一、菌株的分离
供试材料：采自广西天等县石灰岩地区的野生越南槐。
供试菌株：由广西大学植物病理研究所提供。
培养基：1000mlNA培养基：牛肉浸膏3g，酵母膏1g，蛋白胨5g，蔗糖10g，琼脂15g，pH7.0。
表面消毒:将长为6-8cm、宽为1-2cm新鲜健康的越南槐根用流水冲洗30min以冲干净泥沙，然后将洗净的越南槐根用无菌水漂洗2次，风干表面水分，移到超净工作台，在无菌条件下，将越南槐根用体积浓度为75％乙醇浸泡1min，无菌水漂洗2次，次氯酸钠(有效氯1％)浸泡2min，无菌水洗3次，无菌吸水纸吸干表面备用。
菌株的分离、纯化：表面消毒好的越南槐根，无菌条件下，用无菌木片刮去表皮，用无菌枝剪剪去越南槐根的两端，余下部分用无菌小刀和无菌镊子分开木质部和韧皮部，分别取0.5cm长的组织块，用无菌枝剪剪碎并加无菌水研磨，研磨充分后加无菌水定容至5ml并静置10min，取0.5ml上清液梯度稀释10～105倍，分别取100μL稀释液涂布到NA平板上，每个稀释浓度重复3次，取最后一次漂洗液涂布在NA平板上，作为阴性对照。NA平板置于培养箱28℃恒温培养24～96h，挑取不同形态菌落反复划线纯化，将纯化的菌株，即越南槐内生细菌用20％甘油保存。
将分离到的越南槐内生细菌接种于LA平板上，28℃下培养24h后待用。将三七根腐病菌接种于PDA平板，28℃下培养3天后待用。
二、筛选
采用平板对峙法对供试越南槐内生细菌进行菌体抑菌活性的初筛。
首先，无菌条件下，用灭菌打孔器将三七根腐病菌制成6mm菌饼；在处理中，将三七根腐病菌菌饼转接到含NA的培养皿中央，然后在距离菌饼2cm的位置，将分离到的越南槐内生细菌菌株接上一条细菌线，每株内生细菌重复3皿；在对照组中，只接三七根腐病菌菌饼，不接越南槐内生细菌，重复3皿。然后，在28℃下培养，定期观测。待对照组中真菌长满培养皿时，在处理组中，测量三七根腐病菌菌饼中心到越南槐内生细菌线中心之间三七根腐病菌的生长半径为处理生长半径；在对照组中，三七根腐病菌的生长半径为对照生长半径。最后，根据以下公式，计算抑菌率：
对照生长量＝对照生长半径-菌饼半径
处理生长量＝处理生长半径-菌饼半径
结果共得到3株对三七根腐病菌抑制作用都很强的拮抗越南槐内生细菌菌株，其中一株名称为B22，对三七根腐病菌的抑制率为71％。
三、鉴定
(一)菌株形态特征
菌落形态特征观察：将待鉴定的菌株接种在NA培养基上，置于28℃培养24h，观察菌株的菌落形态特征。
菌体形态特征观察：取上述在NA培养基上培养24h的菌株进行革兰氏染色并镜检，将所观察到的形态结果显微照相，如图2所示。
(二)菌株16SrDNA序列及其系统发育学分析
DNA模板的制备：
试剂：(1)裂解缓冲液：Tris-Ac(pH7.8)40mM，NaAc20mM，EDTA1mM，SDS1％(w/v)；
(2)5MNaCl溶液。
DNA提取：
(a)将1.5ml细菌过夜培养液培养物置于微量离心管(EP管)内，12000rpm离心0.5min，弃去上清液，保留沉淀物；
(b)在沉淀物中加入400μl裂解缓冲液，用吸管反复吹打使之重悬；
(c)加入200ul5MNaCl，充分混匀，12000rpm离心10min，取600μl上清液；
(d)加入等体积的酚/氯仿(1:1)，混匀，离心(12000rpm，10min)，将上清液转入另一干净的EP管中；
(e)向步骤(d)中获得的上清液中加入等体积氯仿，混匀，离心(12000rpm，10min)，将上清液转入另一干净的EP管中；
(f)向步骤(e)中所得上清液中加入等体积的异丙醇，混匀，置于室温10min，离心(12000rpm，15min)，弃去上清液，保留沉淀物；
(g)用体积浓度为70％乙醇洗涤步骤(f)所得沉淀物，晾干，即为DNA；
(h)将步骤(g)中已干的DNA溶于30μl双蒸水(ddH2O)中，-20℃保存。
PCR扩增16SrDNA序列：
(1)PCR仪：ABI3730-XLDNA测序仪(AppliedBiosystems，USA)；
(2)扩增引物：27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)如SEQIDNO.2所示，和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACT-3′)如SEQIDNO.3所示；
(3)扩增体系：
16SrDNA序列PCR扩增体系如表1所示：
表1.
反应物 加样量
2X TagMasterMix 25μL
Primer-1 1μL
Primer-2 1μL
Template DNA 0.5μL
ddH2O 22.5μL
反应总体积 50μL
注：表1中的TemplateDNA为上述步骤(h)所得DNA制成DNA模板。
PCR反应条件如表2所示：
表2.
注：表2中步骤2进行30个循环。
PCR扩增产物的电泳检测：
电泳条件为1％的琼脂糖凝胶(含Goldview5μl/100ml)，1×TBE电泳缓冲液，90V电压电泳1小时，PCR产物上样量为3μL，与1μLLoadingdye混匀后点样。在254nm紫外下观察结果，以TaKaRa公司的DL1000DNAMarker为核酸标准分子量参照物，确定扩增片段长度。扩增产物带应在标准物400-700bp的位置上。
PCR产物纯化和测序：由深圳华大基因科技有限公司进行。
系统进化树的构建：
将所测的16SrDNA序列与GenBank基因库中已测定的细菌的16SrDNA序列进行比对，根据比对结果下载相关序列。通过MEGA6.0的邻接算法(Neighbor-joiningNJ)进行系统分析并构建系统进化树，如图3所示。
结果：
(一)菌株形态特征
菌落形态特征：菌株菌落在NA平板上呈淡黄色，表面光滑，隆起，边缘整齐，圆形，NA平板上培养5天直径为3-4mm如图2中a1所示。
菌体形态特征：革兰氏阴性染色阴性，无芽孢，菌体直杆状，大小为(0.32～0.64)μm×(0.84～1.30)μm，如图2中b1所示。
(二)菌株16SrDNA序列及其系统发育学分析
利用引物27F和1492R，从菌株基因组DNA中扩增出一条1300-1400bp大小的片段，经测序并将测序结果通过GenBank中BLASTn比对。结果表明，菌株越南槐内生菌B22与Microbacteriu中的细菌有很高的碱基序列相似性，因此下载所有GenBank中Microbacteriu的参考菌株序列，用于系统发育分析，以Agromyces中的Agromycesindicus(NR108908)和Agromycesmediolanus(NR117879)作为外群。在构建的系统进化树中，越南槐内生菌B22与Microbacteriumsp.FSBSY9(KJ184984)聚在一起形成支持强度为100％的末端分支。碱基相似性比较结果表明，越南槐内生菌B22与Microbacteriumsp.FSBSY9(KJ184984)有15个碱基的差异，序列相似性为98.9％。综合形态学和分子生物学特征，将菌株初步鉴定为Microbacteriumsp.。
实施例2
菌株代谢产物对三七根腐病菌的抑制作用
一、菌株B22的发酵培养和菌株B22代谢产物的提取
将越南槐内生菌B22接种于含1000mlNB液体培养基(牛肉浸膏3g，酵母膏1g，蛋白胨5g，蔗糖10g，pH7.0)的2升锥形瓶中，置于温度为28℃、转速为130r/min的摇床发酵培养10天，所得发酵物经减压浓缩干燥后，加入发酵物2倍的甲醇并用超声波超声40min，超声进行离心，取离心后所得上清液减压浓缩得到菌株发酵物的甲醇粗提物，即为越南槐内生细菌B22代谢产物。
二、越南槐内生细菌B22代谢产物对三七根腐病菌的菌丝生长的抑制作用
用菌丝生长法测定菌株的B22代谢产物对三七根腐病菌菌丝生长的抑制活性。将菌株的B22代谢产物和多菌灵粉剂(阳性对照)分别制成含2mg/mL，4mg/mL，8mg/mL浓度B22代谢产物的含药平板。在无菌条件下，用打孔器将病原真菌制成6mm菌饼，把三七根腐病菌菌饼接到各含药平板中央为处理，以不含药平板中央接的三七根腐病菌菌饼为阴性对照，所有处理和对照重复三次，所有平板置于28℃培养。药物浓度按多菌灵粉剂的田间应用浓度设置。待阴性对照长满培养皿时，分别测量对照菌落和处理菌落的生长直径，并根据以下公式，计算抑制率：
阴性对照生长量＝阴性对照生长直径-菌饼直径
处理生长量＝处理生长直径-菌饼直径
三、越南槐内生细菌B22代谢产物对三七根腐病菌的最小抑菌浓度
用肉汤稀释法测定菌株的B22代谢产物对三七根腐病菌的最小抑菌浓度。将PDA培养5天的三七根腐病菌菌饼接种于含0.2％吐温80(v/v)的PDB液体培养基中，28℃，150r/min摇床培养7天，然后将培养物转到三角瓶，并倒入含0.2％吐温80的无菌双蒸水，用磁性棒搅拌30min，将溶液用无菌纱布过滤，得到孢子溶液，并用血球计数板将孢子浓度调节到每毫升104个孢子备用。将菌株B22的代谢产物用1％DMSO溶解成80mg/mL的代谢产物处理浓度，取5支无菌试管依次排列在试管架上，分别编号为1、2、3、4、5，每管分别加入1ml含0.2％吐温80的无菌双蒸水，然后将1ml80mg/mL的菌株甲醇粗提物溶液加入编号为1的试管中并依次在各管中进行两倍连续稀释。1ml上述所得孢子溶液(104个/ml)分别加入各管中，从而获得最终的B22代谢产物处理浓度：20mg/ml(编号1试管)，10mg/ml(编号2试管)，5mg/ml(编号3试管)，2.5mg/ml(编号4试管)，1.25mg/ml(编号5试管)。1ml的1％DMSO和1ml的8mg/mL氟硅唑乳油分别代替B22代谢产物执行上述处理过程而作为阴性对照和阳性对照，所有处理和对照重复三次。最后，各管28℃，150r/min摇床培养5天。B22代谢产物的MIC值为完全抑制三七根腐病菌可见生长的最小粗提物浓度。
结果：
菌株越南槐内生菌B22代谢产物对三七根腐病菌菌丝生长的百分抑制率如表3中所示：
表3.
注：表3中阳性对照多菌灵粉剂含50％多菌灵；表中*表示数据通过单因素方差分析的LSD比较后，菌株B22代谢产物和阳性对照多菌灵粉剂在相同浓度下，在P0.05水平上具显著性差异。
菌株越南槐内生菌B22的代谢产物对三七根腐病菌菌丝生长的抑制结果表明，菌株越南槐内生菌B22的代谢产物对三七根腐病菌的菌丝生长均具有非常好的抑制效果，从表3可以看出越南槐内生菌B22的代谢产物对三七根腐病菌F.solani菌丝生长的百分抑制率为63.71-93.84％。与阳性对照多菌灵粉剂比较，菌株越南槐内生菌B22的代谢产物，对三七根腐病菌F.solani菌丝生长的抑制效果略低于对照。
菌株B22的代谢产物对三七根腐病菌生长的最小抑菌浓度如表4所示：
表4.
处理 MIC(mg/ml)
F.solani
氟硅唑 0.88
B22 10
注：表中阳性对照氟硅唑为纯化合物，纯度为99.99％。
菌株越南槐内生菌B22的代谢产物对三七根腐病菌生长的最小抑菌浓度测试结果表明，菌株越南槐内生菌B22的代谢产物对三七根腐病菌均具有较强的抑制作用，从表4可以看出越南槐内生菌B22的代谢产物对三七根腐病菌F.solani的最小抑菌浓度为10mg/ml，是阳性对照的11倍。
从表3和表4可知，菌株越南槐内生菌B22的代谢产物中含有很强的抑真菌或杀真菌的成分，因此，在三七根腐病菌的生态防治上，菌株越南槐内生菌B22具有突出的潜力。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (5)

1.一种越南槐内生细菌B22，其特征在于：越南槐内生菌B22的分类命名为微杆菌(Microbacteriumsp.)B22，保藏号：CGMCCNo.11463。
2.一种如权利要求1所述越南槐内生细菌B22的代谢产物的制备方法，其特征在于：将越南槐内生细菌B22接种于NB液体培养基中，置于温度为28℃、转速为130r/min条件下发酵培养10天，所得发酵物经减压浓缩干燥后，加入发酵物2倍的甲醇并超声40min，然后离心，取上清液减压浓缩得到菌株发酵物的甲醇粗提物，即为越南槐内生细菌B22代谢产物。
3.根据权利要求2所述代谢产物的制备方法，其特征在于：所述越南槐内生细菌B22接种于含1000mlNB液体培养基。
4.根据权利要求2所述代谢产物的制备方法，其特征在于：所述的NB液体培养基含牛肉浸膏3g，酵母膏1g，蛋白胨5g，蔗糖10g，培养基pH值为7.0。
5.一种如权利要求2制备所得越南槐内生细菌B22的代谢产物在防治三七根腐病中的应用。
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