JP3343396B2 - ウイルス性及びサブウイルス性病原体の検出及び同定方法 - Google Patents
ウイルス性及びサブウイルス性病原体の検出及び同定方法Info
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
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- C12Q1/701—Specific hybridization probes
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はウイルス性病原体(viral
pathogen)及びサブウイルス性（亜ウイルス性）病原体
(subviral pathogen) を検出しかつ同定する方法に関す
る。
pathogen)及びサブウイルス性（亜ウイルス性）病原体
(subviral pathogen) を検出しかつ同定する方法に関す
る。
【０００２】
【発明の目的】本発明は、ウイルス性病原体及びサブウ
イルス性（亜ウイルス性）病原体を検出し(detect)かつ
同定する(identify)方法において、マイクロタイトレー
ションプレート(microtitration plate)のカップ−(cu
p) の内部表面に結合させた(attached)抗体による病原
体の固定(immobilization)と、ウイルスゲノム(viralge
nom)の断片(fragment)の酵素増幅(enzymatic amplicati
on) と、酵素増幅の生成物の分光光度分析による定量又
は酵素増幅の生成物の電気泳動による同定とを組合せて
行うことを特徴とする、ウイルス性又はイルス性病原体
の新規な検出及び同定方法を提供することを目的とす
る；ウイルス性病原体は、プロトプラスト（原形質
体）、分化している(differentiated)か又は分化してい
ない原核細胞又は真核細胞内で、かかるプロトプラスト
又は細胞のある種の酵素を消費して復製する(replicat
e) ウイルスであると解釈され、一方、サブウイルス性
（亜ウイルス性）病原体は、分化しているか又は分化し
ていない植物細胞又はそのプロトプラスト内で、かかる
細胞又はプロトプラストのある種の酵素を消費して復製
するウイロイド(viroid)、ウイルソイド(virusiod)、サ
テライトウイルス(satellitevirus)又はウイルス性サテ
ライト RNAと定義される；“生物的試料”("biological
sample") という用語は、原核細胞、プロトプラスト
（原形質体）、分化しているか又は分化していない真核
細胞、菌糸体(mycelia) 、植物又は動物組織、植物又は
動物器官、上記した細胞、菌糸体、組織及び器官のいず
れかの“生体外”培養媒体 ("in vitro" cultivation m
edia) 、植物又は動物系統(system)及び植物又は動物体
を意味する；この用語は上記したごとき生物的試料の分
泌物(product of secretion)、排出物(product of excr
etion)又は変換物(product of transformation) を表す
のにも使用される。
イルス性（亜ウイルス性）病原体を検出し(detect)かつ
同定する(identify)方法において、マイクロタイトレー
ションプレート(microtitration plate)のカップ−(cu
p) の内部表面に結合させた(attached)抗体による病原
体の固定(immobilization)と、ウイルスゲノム(viralge
nom)の断片(fragment)の酵素増幅(enzymatic amplicati
on) と、酵素増幅の生成物の分光光度分析による定量又
は酵素増幅の生成物の電気泳動による同定とを組合せて
行うことを特徴とする、ウイルス性又はイルス性病原体
の新規な検出及び同定方法を提供することを目的とす
る；ウイルス性病原体は、プロトプラスト（原形質
体）、分化している(differentiated)か又は分化してい
ない原核細胞又は真核細胞内で、かかるプロトプラスト
又は細胞のある種の酵素を消費して復製する(replicat
e) ウイルスであると解釈され、一方、サブウイルス性
（亜ウイルス性）病原体は、分化しているか又は分化し
ていない植物細胞又はそのプロトプラスト内で、かかる
細胞又はプロトプラストのある種の酵素を消費して復製
するウイロイド(viroid)、ウイルソイド(virusiod)、サ
テライトウイルス(satellitevirus)又はウイルス性サテ
ライト RNAと定義される；“生物的試料”("biological
sample") という用語は、原核細胞、プロトプラスト
（原形質体）、分化しているか又は分化していない真核
細胞、菌糸体(mycelia) 、植物又は動物組織、植物又は
動物器官、上記した細胞、菌糸体、組織及び器官のいず
れかの“生体外”培養媒体 ("in vitro" cultivation m
edia) 、植物又は動物系統(system)及び植物又は動物体
を意味する；この用語は上記したごとき生物的試料の分
泌物(product of secretion)、排出物(product of excr
etion)又は変換物(product of transformation) を表す
のにも使用される。
【０００３】
【従来の技術】生きている(living)細胞生物 (cellular
beings)においては、ウイルス性及びサブウイルス性病
原体の検出と同定は、健康管理、疫学的研究及びかかる
病原体に対する抵抗性を付与する遺伝子についての調査
プログラムにおいて通常実施されていることである。こ
れらの３つの場合、多数の試料を明確な結果が得られる
かつ安価な方法で短時間内に処理し得ることが必要であ
る。従って、次のごとき特徴；即ち、感度(sensitivit
y) 、精度(precision) 及び再現性、実施速度、装置、
器具及び材料の単純性と経済性の点で優れた方法を使用
すること及び進歩した技術的訓練を受けた検査員を必要
としない方法を使用するがこと望ましい［Academic Pre
ss発行 Matthews,R.E.F.(1991), Method for Assay, De
tectionand Diagonosis in Plant Virology, 第 3版、
第11頁参照］。
beings)においては、ウイルス性及びサブウイルス性病
原体の検出と同定は、健康管理、疫学的研究及びかかる
病原体に対する抵抗性を付与する遺伝子についての調査
プログラムにおいて通常実施されていることである。こ
れらの３つの場合、多数の試料を明確な結果が得られる
かつ安価な方法で短時間内に処理し得ることが必要であ
る。従って、次のごとき特徴；即ち、感度(sensitivit
y) 、精度(precision) 及び再現性、実施速度、装置、
器具及び材料の単純性と経済性の点で優れた方法を使用
すること及び進歩した技術的訓練を受けた検査員を必要
としない方法を使用するがこと望ましい［Academic Pre
ss発行 Matthews,R.E.F.(1991), Method for Assay, De
tectionand Diagonosis in Plant Virology, 第 3版、
第11頁参照］。
【０００４】ウイルス性及びサブウイルス性病原体の検
出と同定を行う方法は、これらの病原体と宿主(host)と
の相互反応、病原体粒子の物理的特性又はその蛋白質及
び/又は核酸の性質の分析に基づくものであり得る。
出と同定を行う方法は、これらの病原体と宿主(host)と
の相互反応、病原体粒子の物理的特性又はその蛋白質及
び/又は核酸の性質の分析に基づくものであり得る。
【０００５】宿主−病原体相互反応は、通常、遅く、装
置に費用を要ししかも得られる結果が媒体(medium)によ
って大きく変動しかつ、しばしば、完全に主観的である
(subjective)。
置に費用を要ししかも得られる結果が媒体(medium)によ
って大きく変動しかつ、しばしば、完全に主観的である
(subjective)。
【０００６】ウイルス性及びサブウイルス性病原体の R
NA粒子及び分子の物理的性質の研究においては分析用超
遠心分離又は電子顕微鏡分析のごとき遅くかつ複雑な方
法が使用され、これらの方法では高価でかつ複雑な装置
と高度の適格性を有する研究員とを必要とする。
NA粒子及び分子の物理的性質の研究においては分析用超
遠心分離又は電子顕微鏡分析のごとき遅くかつ複雑な方
法が使用され、これらの方法では高価でかつ複雑な装置
と高度の適格性を有する研究員とを必要とする。
【０００７】上記したごとき制約が存在する結果、これ
らの方法はウイルス性及びサブウイルス性病原体の検出
と同定を行うのに日常的に使用するのには不適当である
ことは明らかである。
らの方法はウイルス性及びサブウイルス性病原体の検出
と同定を行うのに日常的に使用するのには不適当である
ことは明らかである。
【０００８】ウイルス性及びサブウイルス性病原体の蛋
白質の性質の研究に基づくこれらの病原体の検出及び同
定方法としては，ELISA 法として知られる免疫学的方法
が一般的に使用されている［Clark,M.F.及び Adams,A.
N.(1977), J.Gen.Virol.34:475 −483 参照］。多くの
場合、この方法は日常的検出法について要求される条件
を満足させている。しかしながら、この方法には次のご
とき制約がある：−サブウイルス性病原体のゲノムは、
大部分の場合、構造蛋白質をコード化(codify)しないの
で、この方法はサブウイルス性病原体の同定には容易に
適用し得ない。
白質の性質の研究に基づくこれらの病原体の検出及び同
定方法としては，ELISA 法として知られる免疫学的方法
が一般的に使用されている［Clark,M.F.及び Adams,A.
N.(1977), J.Gen.Virol.34:475 −483 参照］。多くの
場合、この方法は日常的検出法について要求される条件
を満足させている。しかしながら、この方法には次のご
とき制約がある：−サブウイルス性病原体のゲノムは、
大部分の場合、構造蛋白質をコード化(codify)しないの
で、この方法はサブウイルス性病原体の同定には容易に
適用し得ない。
【０００９】−低い感染速度を有するある種のウイルス
を検出する場合には、この方法では感度の問題が生ず
る。かかるウイルスの例は、その存在が師部(phloem)に
限定されている植物ウイルス［ゲミニウイルス(geminiv
irus) 、ルテオウイルス(luteovirus)又はクロステロウ
イルス(closterovirus) ］、又は、 HIV(AIDS)又はその
存在が器官又は組織に限定されている他のウイルス［肝
炎ウイルス(hepatitisvirus)、神経組織ウイルス等］の
ごときある種のレトロウイルス(retrovirus)である。
を検出する場合には、この方法では感度の問題が生ず
る。かかるウイルスの例は、その存在が師部(phloem)に
限定されている植物ウイルス［ゲミニウイルス(geminiv
irus) 、ルテオウイルス(luteovirus)又はクロステロウ
イルス(closterovirus) ］、又は、 HIV(AIDS)又はその
存在が器官又は組織に限定されている他のウイルス［肝
炎ウイルス(hepatitisvirus)、神経組織ウイルス等］の
ごときある種のレトロウイルス(retrovirus)である。
【００１０】−ポリクローナル抗体を使用する場合に
は、種々のロットの抗体の間に存在する変動により、得
られる結果は再現性に欠ける。
は、種々のロットの抗体の間に存在する変動により、得
られる結果は再現性に欠ける。
【００１１】−感度が制限されるため、感染の早期の検
出が阻害される。
出が阻害される。
【００１２】ウイルス性及びサブウイルス性病原体の核
酸の構造と機能についての知識が進歩したことにより、
これらの病原体の特徴化に適用し得る多数の方法が提案
されている。理論的には、少なくとも、ウイルス性及び
サブウイルス性病原体の検出と同定に最も適当な方法
は、分子ハイブリダイゼーション(molecular hybridi-s
ation）［Muller, R.他 (1991), J.of Virol. Meth. 3
4: 141−148; Robinson,D.I.及びRomero,J.(1991), J.o
f Virol.Meth. 34: 209 −219; Kanematsu,S. 他(199
1),J.of Virol.Meth. 35: 189 −197]、及び、ポリメラ
ーゼ鎖反応(polymerase chain reaction)(PCR)[Erlich,
H.A.他, EP 258,017; Cohen,S.N.U.S.特許4,293,652; M
ullis,K.B., EP 201,184; Mullis, 他, EP 200,362;Sai
ki,R.K.他, Science 239: 487−491(1988); Mullis,K.
B.,Meth. Enzymol. 155: 335−350 (1987); Scharf,R.
K. 他, Science 233: 1076 −1079(1986)参照］であ
る。
酸の構造と機能についての知識が進歩したことにより、
これらの病原体の特徴化に適用し得る多数の方法が提案
されている。理論的には、少なくとも、ウイルス性及び
サブウイルス性病原体の検出と同定に最も適当な方法
は、分子ハイブリダイゼーション(molecular hybridi-s
ation）［Muller, R.他 (1991), J.of Virol. Meth. 3
4: 141−148; Robinson,D.I.及びRomero,J.(1991), J.o
f Virol.Meth. 34: 209 −219; Kanematsu,S. 他(199
1),J.of Virol.Meth. 35: 189 −197]、及び、ポリメラ
ーゼ鎖反応(polymerase chain reaction)(PCR)[Erlich,
H.A.他, EP 258,017; Cohen,S.N.U.S.特許4,293,652; M
ullis,K.B., EP 201,184; Mullis, 他, EP 200,362;Sai
ki,R.K.他, Science 239: 487−491(1988); Mullis,K.
B.,Meth. Enzymol. 155: 335−350 (1987); Scharf,R.
K. 他, Science 233: 1076 −1079(1986)参照］であ
る。
【００１３】核酸の分子ハイブリダイゼーションはウイ
ルス性及びサブウイルス性病原体の検出と同定にしばし
ば使用されている。しかしながら、放射能標識した(rad
io-actively marked)プローブを使用するため、この方
法は高価であり、特殊な装置を必要としそして多数の試
料を検査する場合には長時間を要する。ビオチン又はジ
ゴシゲニン(digosigenine)についての非放射能標識によ
りこれらの問題は若干解消されるが感度が制限される。
ルス性及びサブウイルス性病原体の検出と同定にしばし
ば使用されている。しかしながら、放射能標識した(rad
io-actively marked)プローブを使用するため、この方
法は高価であり、特殊な装置を必要としそして多数の試
料を検査する場合には長時間を要する。ビオチン又はジ
ゴシゲニン(digosigenine)についての非放射能標識によ
りこれらの問題は若干解消されるが感度が制限される。
【００１４】ポリメラーゼ鎖反応(PCR) は非常に効率的
でかつ特異的な方法であり、理論的には、DNA モデル(D
NA model) の単一配列(single sequence) を100 万コピ
ー以上合成し得る。この方法は DNAゲノムを使用してウ
イルス性病原体を検出するのに使用されている［Rybick
y,E.P.及び Hughes,F.L. (1990),J.Gen.Virol. 71:2519
−2526; Pasamontes他(1991), J. of Virol. Meth. 35:
137−141;Soler,C.他,(1991),J. of Virol. Meth. 35:
143−147 参照］。ウイルス RNAを使用する相補的 DNA
(cDNA)の合成(synthesis) と、これに続いて行われるポ
リメラーゼ鎖反応によるその増幅(amplification) とを
組合せた方法(RT-PCR)は RNAゲノムを使用する種々のウ
イルスの検出と特徴化(characterisation)において使用
されている；この場合に使用される RNAゲノムは動物の
RNAゲノム［Lin.,S.T. 他, (1991) J. of Virol. Met
h. 35: 227 −236 ; Meyer,R.F.他 (1991),J. of Viro
l. Meth. 34: 161−172 ] 及び植物 RNAゲノム［Vunsh,
R.他, (1990), Ann. Appl. Biol. 117 : 561−569 ; K
orschineek他 (1991).J. of Virol. Meth. 31: 139−14
6 ; Borja,M.J.及び Ponz,F.(1992),J. of Virol. Met
h. 36: 73−86参照］の両者である。RT-PCR法の感度は
ELISA法のそれより非常に大きい［Borja,M.J.及び Pon
z,F.(1992), J. of Virol.Meth. 36: 73 −86参照］。
しかしながら、RT-PCR法を日常的検査で使用した場合の
欠点は、核酸抽出の初期の段階とゲル中での電気泳動に
よる増幅生成物の検出において毒性の高い物質であるフ
ェノールを使用するということである。
でかつ特異的な方法であり、理論的には、DNA モデル(D
NA model) の単一配列(single sequence) を100 万コピ
ー以上合成し得る。この方法は DNAゲノムを使用してウ
イルス性病原体を検出するのに使用されている［Rybick
y,E.P.及び Hughes,F.L. (1990),J.Gen.Virol. 71:2519
−2526; Pasamontes他(1991), J. of Virol. Meth. 35:
137−141;Soler,C.他,(1991),J. of Virol. Meth. 35:
143−147 参照］。ウイルス RNAを使用する相補的 DNA
(cDNA)の合成(synthesis) と、これに続いて行われるポ
リメラーゼ鎖反応によるその増幅(amplification) とを
組合せた方法(RT-PCR)は RNAゲノムを使用する種々のウ
イルスの検出と特徴化(characterisation)において使用
されている；この場合に使用される RNAゲノムは動物の
RNAゲノム［Lin.,S.T. 他, (1991) J. of Virol. Met
h. 35: 227 −236 ; Meyer,R.F.他 (1991),J. of Viro
l. Meth. 34: 161−172 ] 及び植物 RNAゲノム［Vunsh,
R.他, (1990), Ann. Appl. Biol. 117 : 561−569 ; K
orschineek他 (1991).J. of Virol. Meth. 31: 139−14
6 ; Borja,M.J.及び Ponz,F.(1992),J. of Virol. Met
h. 36: 73−86参照］の両者である。RT-PCR法の感度は
ELISA法のそれより非常に大きい［Borja,M.J.及び Pon
z,F.(1992), J. of Virol.Meth. 36: 73 −86参照］。
しかしながら、RT-PCR法を日常的検査で使用した場合の
欠点は、核酸抽出の初期の段階とゲル中での電気泳動に
よる増幅生成物の検出において毒性の高い物質であるフ
ェノールを使用するということである。
【００１５】Wetzel,T等 (1991), J. of Virol. Meth.
33: 355 −365 及びBorja,M.J.及びPonz,F.(1992),J. o
f Virol. Meth. 36: 73−86には、RT-PCR法によりかつ
予備的なフェノール化(phenolisation) を行うことなし
に、組織ホモジネート(tissue homogenate) 中のシャル
カウイルス(sharka virus)及びサクラ葉巻き病ウイルス
(cherry leaf-roll virus)のウオールナット菌株(walnu
t strain)(WCLRV) を検出することが記載されている；
しかしながら、この方法は一般的に他の植物ウイルスを
検出することには成功しなかった。Jansen,R.W. 他 (19
90),Proc.Nat.Acad.Sci.USA,87,2867 −2871には、RT-P
CR法により A型肝炎ウイルス(hepatitis A virus) を検
出することが記載されている；この場合には、エッペン
ドルフチューブ(Eppendorftube) の壁面上で固定した(i
mmbilised)抗体によりウイルスを精製しついでビリオン
(virion)の熱粉砕(heat fracture) を行いついでRT及び
酵素増幅を行う工程が導入されている。この方法は植物
ウイルスの検出と同定には一般的には適用されない。Li
ange,T 及び Wands,J.R.(1988) の米国特許第 262,347
号には B型肝炎ウイルスを検出する方法であって、CNBr
−活性化セファローサ( CNBr−activated Sepharosa)に
結合させた抗体を使用する病原体の捕捉(capture) と、
ウイルス DNAの酵素増幅と増幅生成物の電気泳動法によ
る同定とを組合せた方法が記載されている。この方法を
日常的検査で使用した場合には時間を要する。
33: 355 −365 及びBorja,M.J.及びPonz,F.(1992),J. o
f Virol. Meth. 36: 73−86には、RT-PCR法によりかつ
予備的なフェノール化(phenolisation) を行うことなし
に、組織ホモジネート(tissue homogenate) 中のシャル
カウイルス(sharka virus)及びサクラ葉巻き病ウイルス
(cherry leaf-roll virus)のウオールナット菌株(walnu
t strain)(WCLRV) を検出することが記載されている；
しかしながら、この方法は一般的に他の植物ウイルスを
検出することには成功しなかった。Jansen,R.W. 他 (19
90),Proc.Nat.Acad.Sci.USA,87,2867 −2871には、RT-P
CR法により A型肝炎ウイルス(hepatitis A virus) を検
出することが記載されている；この場合には、エッペン
ドルフチューブ(Eppendorftube) の壁面上で固定した(i
mmbilised)抗体によりウイルスを精製しついでビリオン
(virion)の熱粉砕(heat fracture) を行いついでRT及び
酵素増幅を行う工程が導入されている。この方法は植物
ウイルスの検出と同定には一般的には適用されない。Li
ange,T 及び Wands,J.R.(1988) の米国特許第 262,347
号には B型肝炎ウイルスを検出する方法であって、CNBr
−活性化セファローサ( CNBr−activated Sepharosa)に
結合させた抗体を使用する病原体の捕捉(capture) と、
ウイルス DNAの酵素増幅と増幅生成物の電気泳動法によ
る同定とを組合せた方法が記載されている。この方法を
日常的検査で使用した場合には時間を要する。
【００１６】
【発明の構成】本発明によれば、生物的試料中の、ゲノ
ムがRNAによって構成されているウイルス性及びサブウ
イルス性病原体を検出しかつ同定する方法であって、 （ａ）上記病原体を、該病原体の構造成分に対する特異
性又は二本鎖RNAに対する特異性を有する抗体を予め固
定した固体支持体、例えば、マイクロタイトレーション
プレートカップの上に固定し、 （ｂ）、固定された上記病原体を溶解させかつその核酸
を放出させるための特殊な処理を行うことなしに、固定
された病原体の核酸の断片に対する相補的DNA鎖(cDNA)
を同一の支持体中で合成し、 （ｃ）工程(b)で予め合成されたcDNAの断片を、同一の
支持体中で酵素増幅させ、ついで （ｄ）工程(c)の酵素増幅から得られる生成物を、同一
の支持体上で分光光度分析法を使用して定量することを
特徴とする、ウイルス性及びサブウイルス性病原体の検
出及び同定方法が提供される。
ムがRNAによって構成されているウイルス性及びサブウ
イルス性病原体を検出しかつ同定する方法であって、 （ａ）上記病原体を、該病原体の構造成分に対する特異
性又は二本鎖RNAに対する特異性を有する抗体を予め固
定した固体支持体、例えば、マイクロタイトレーション
プレートカップの上に固定し、 （ｂ）、固定された上記病原体を溶解させかつその核酸
を放出させるための特殊な処理を行うことなしに、固定
された病原体の核酸の断片に対する相補的DNA鎖(cDNA)
を同一の支持体中で合成し、 （ｃ）工程(b)で予め合成されたcDNAの断片を、同一の
支持体中で酵素増幅させ、ついで （ｄ）工程(c)の酵素増幅から得られる生成物を、同一
の支持体上で分光光度分析法を使用して定量することを
特徴とする、ウイルス性及びサブウイルス性病原体の検
出及び同定方法が提供される。
【００１７】上記本発明の方法においては、更に、所望
に応じて、酵素増幅から得られる生成物を電気泳動法に
より同定する工程が行われる。
に応じて、酵素増幅から得られる生成物を電気泳動法に
より同定する工程が行われる。
【００１８】ウイルス性及びサブウイルス性病原体を検
出し、同定するための日常的方法とし使用るために必要
な条件に従うことの他に、本発明の方法は、特に、次の
ごとき利点を有する： −本発明の方法は一般的な方法である；その理由は本発
明の方法を使用することにより、非常に多数の起源から
の生物的試料中の、かつ、次の群のウイルス：即ち、ト
バモウイルス(tobamovirus) 、ポチウイルス(potyviru
s) 、クロステロウイルス(closterovirus) 、ルテロウ
イルス(luterovirus) 、ネポウイルス(nepovirus) 、ク
クモウイルス(cucumovirus) 及びトスポウイルス(tospo
virus)によって示されるごとき異なる生物学的及び構造
的(architectural) 特徴を有するウイルスの検出と同定
が可能であることにある。
出し、同定するための日常的方法とし使用るために必要
な条件に従うことの他に、本発明の方法は、特に、次の
ごとき利点を有する： −本発明の方法は一般的な方法である；その理由は本発
明の方法を使用することにより、非常に多数の起源から
の生物的試料中の、かつ、次の群のウイルス：即ち、ト
バモウイルス(tobamovirus) 、ポチウイルス(potyviru
s) 、クロステロウイルス(closterovirus) 、ルテロウ
イルス(luterovirus) 、ネポウイルス(nepovirus) 、ク
クモウイルス(cucumovirus) 及びトスポウイルス(tospo
virus)によって示されるごとき異なる生物学的及び構造
的(architectural) 特徴を有するウイルスの検出と同定
が可能であることにある。
【００１９】−本発明の方法によりサブウイルス性病原
体を検出し、同定することが可能である。 −本発明の方法はキャプシド蛋白質に対して抗体を利用
できないウイルス性病原体を検出し、同定するのに適用
し得る；その理由は病原体を固定する際に RNAの二本鎖
に対して抗体を使用し得ることにある。 −本発明の方法は感度が高いため、感染能力(capacity
of infection) の低いウイルス性病原体を検出し、同定
し得る。
体を検出し、同定することが可能である。 −本発明の方法はキャプシド蛋白質に対して抗体を利用
できないウイルス性病原体を検出し、同定するのに適用
し得る；その理由は病原体を固定する際に RNAの二本鎖
に対して抗体を使用し得ることにある。 −本発明の方法は感度が高いため、感染能力(capacity
of infection) の低いウイルス性病原体を検出し、同定
し得る。
【００２０】−本発明の方法によりウイルス性及びサブ
ウイルス性病原体による宿主の感染を早期に検出し、同
定することが可能である。 −本発明の方法は過剰な又は複雑な操作を必要としな
い。 −固定、増幅及び分光光度法による定量は同一のマイク
ロタイトレーションプレート上で実施し得る。
ウイルス性病原体による宿主の感染を早期に検出し、同
定することが可能である。 −本発明の方法は過剰な又は複雑な操作を必要としな
い。 −固定、増幅及び分光光度法による定量は同一のマイク
ロタイトレーションプレート上で実施し得る。
【００２１】本発明のウイルス性及びサブウイルス性病
原体の検出と同定を行うためには、対応する抗体をマイ
クロタイトレーションプレートのカップの内部表面に結
合させ、上記のカップに塩基性のpHを有する緩衝液中の
抗体の溶液を充満させついで全体を50℃を越えない温度
で少なくとも15分間インキュベートしついでカップを洗
浄剤を含有する食塩溶液及び殆ど中性のpHを有する緩衝
液で数回洗浄する。
原体の検出と同定を行うためには、対応する抗体をマイ
クロタイトレーションプレートのカップの内部表面に結
合させ、上記のカップに塩基性のpHを有する緩衝液中の
抗体の溶液を充満させついで全体を50℃を越えない温度
で少なくとも15分間インキュベートしついでカップを洗
浄剤を含有する食塩溶液及び殆ど中性のpHを有する緩衝
液で数回洗浄する。
【００２２】ついで、分析すべき試料をカップ中に分布
させ、全体を20℃を越えない温度で少なくとも15分間イ
ンキュベートしついでカップを前記した食塩溶液で数回
洗浄する。
させ、全体を20℃を越えない温度で少なくとも15分間イ
ンキュベートしついでカップを前記した食塩溶液で数回
洗浄する。
【００２３】DNAゲノムを有するウイルス性病原体の場
合には、酵素反応を行うのに必要な薬剤をカップに添加
しついで全体を変性(denaturalisation)、リンギング(r
inging) 及び合成(synthesis) からなる一連のサイクル
にかけることにより増幅(amplification) を行う。各サ
イクルの温度と時間は増幅させるべき断片のヌクレオチ
ド配列に応じて変動する。
合には、酵素反応を行うのに必要な薬剤をカップに添加
しついで全体を変性(denaturalisation)、リンギング(r
inging) 及び合成(synthesis) からなる一連のサイクル
にかけることにより増幅(amplification) を行う。各サ
イクルの温度と時間は増幅させるべき断片のヌクレオチ
ド配列に応じて変動する。
【００２４】RNAゲノムを有するウイルス性病原体又は
サブウイルス性病原体の場合には、増幅を行う前に、増
幅させるべきゲノムの断片を使用して相補的 DNA(c DN
A) を合成する；この目的のためには、cDNAの合成に必
要な薬剤をカップに添加しついで全体を少なくとも15℃
の温度でインキュベートして、前記した方法で増幅工程
を継続する。
サブウイルス性病原体の場合には、増幅を行う前に、増
幅させるべきゲノムの断片を使用して相補的 DNA(c DN
A) を合成する；この目的のためには、cDNAの合成に必
要な薬剤をカップに添加しついで全体を少なくとも15℃
の温度でインキュベートして、前記した方法で増幅工程
を継続する。
【００２５】増幅を行った後、ビスベンジミド(bisbenz
ymide)とDNA を用いて形成させた錯体(complex) の溶液
を分光光度法的に(spectrophotometrically)に定量す
る。増幅生成物の同定は電気泳動法により行われる。
ymide)とDNA を用いて形成させた錯体(complex) の溶液
を分光光度法的に(spectrophotometrically)に定量す
る。増幅生成物の同定は電気泳動法により行われる。
【００２６】本発明のウイルス性病原体及びサブウイル
ス性病原体の検出及び同定方法の実施例を以下に示す。
ス性病原体の検出及び同定方法の実施例を以下に示す。
【００２７】
【実施例】実施例 １ ポチウイルス(potyvirus) の検出と同定 ポチウイルスはウイルス性病原体である。その粒子は細
長く(elongated) 、屈曲性であり、直径は約12nmであ
り、長さは 680〜900nm である。そのゲノムは約10キロ
ベース(kilobase)のモノカテナリー RNA(monocatenary
RNA)の線状分子である［Francki,R.I.B., 他, Atras of
Plant Viruses,Vol.II,284(1985),CRSPress 参照］。
この群のウイルスの代表的なものは豆黄色モザイクウイ
ルス(bean yellow mosaic virus)(BYMV)である。本実施
例においてはソラマメ植物( Vicia faba L )中のこの
ウイルスの検出と同定を例示する。
長く(elongated) 、屈曲性であり、直径は約12nmであ
り、長さは 680〜900nm である。そのゲノムは約10キロ
ベース(kilobase)のモノカテナリー RNA(monocatenary
RNA)の線状分子である［Francki,R.I.B., 他, Atras of
Plant Viruses,Vol.II,284(1985),CRSPress 参照］。
この群のウイルスの代表的なものは豆黄色モザイクウイ
ルス(bean yellow mosaic virus)(BYMV)である。本実施
例においてはソラマメ植物( Vicia faba L )中のこの
ウイルスの検出と同定を例示する。
【００２８】BYMVに感染した植物からの葉の試料の各々
を、2%のポリビニルピロリドン、1%のポリエチレングリ
コール 6000 、0.8%のNacl、0.005%のツイーン(Tween)2
0 及び0.02% のナトリウム酸(sodium acid) を含有する
Tris-HCl 緩衝液 0.5M pH8.0 を1/10（重量/ 容量）の
比率で使用してホモジナイズした。ホモジネートの50マ
イクロリッターのアリコートを Clark,M.F. 及びBar-Jo
seph,MによりMethod in Virology 7,51 −85 (1984) に
記載されている方法に従って、予めBYMV抗血清を被覆し
たマイクロタイトレーションプレートのカップ中に分配
した。 20マイクロリッターの Tris-HCl 緩衝液 0.5M
,pH 8.3 、0.075 M KCl 、0.003 M MgCl2 、各々， 0.
001 Mの dNTP 、200 単位の M-MLV逆転写酵素(inverse
transcriptase) 及び 5'--3' の方向の合成におけるオ
リゴヌクレオチドプライマーの 1マイクロモルを各々の
カップに添加することにより、前記と同一のプレート上
で逆転写(inverse transcription) を行った。37℃で 1
時間インキュベートした後、80マイクロリッターの複合
増幅混合物(compositionamplification mixture)を各カ
ップに添加した；最終濃度は次の通りである：Tris-HCl
緩衝液 60mM,pH 9, 0.015 mM KCl, 2.1 mM MgCl2 ,
各dNTP中に20 mM ( NH4 ) 2 SO4 , 0.005%ウシ血清アル
ブミン(BSA) 及び各オリゴヌクレオチドプライマー 0.2
mM。使用したオリゴヌクレオチドプライマー（表１）は
ウイルスゲノム配列上に現存する情報(exisiting infor
mation) に基づいて設計した（Hammond,J 及びHammond,
R.W.(1989), J.Gen.Virol. 70: 1961-74参照）。プレー
トを 94 ℃で 2分間加熱した後、72℃に冷却し、1.6 単
位の T DNAポリメラーゼを添加しついで加熱と冷却のサ
イクルを30回反復する間に cDNA を増幅させた。各サイ
クルは次の工程からなる： 52 ℃で 1分間のリンギング
(ringing) 、52℃で 1分間の伸長(elongation)及び 93
℃で30秒間の変性(denaturalisation)。最終サイクルに
おいては伸長時間を 5分間に延長した。加熱勾配は0.3
℃/ 秒とした。
を、2%のポリビニルピロリドン、1%のポリエチレングリ
コール 6000 、0.8%のNacl、0.005%のツイーン(Tween)2
0 及び0.02% のナトリウム酸(sodium acid) を含有する
Tris-HCl 緩衝液 0.5M pH8.0 を1/10（重量/ 容量）の
比率で使用してホモジナイズした。ホモジネートの50マ
イクロリッターのアリコートを Clark,M.F. 及びBar-Jo
seph,MによりMethod in Virology 7,51 −85 (1984) に
記載されている方法に従って、予めBYMV抗血清を被覆し
たマイクロタイトレーションプレートのカップ中に分配
した。 20マイクロリッターの Tris-HCl 緩衝液 0.5M
,pH 8.3 、0.075 M KCl 、0.003 M MgCl2 、各々， 0.
001 Mの dNTP 、200 単位の M-MLV逆転写酵素(inverse
transcriptase) 及び 5'--3' の方向の合成におけるオ
リゴヌクレオチドプライマーの 1マイクロモルを各々の
カップに添加することにより、前記と同一のプレート上
で逆転写(inverse transcription) を行った。37℃で 1
時間インキュベートした後、80マイクロリッターの複合
増幅混合物(compositionamplification mixture)を各カ
ップに添加した；最終濃度は次の通りである：Tris-HCl
緩衝液 60mM,pH 9, 0.015 mM KCl, 2.1 mM MgCl2 ,
各dNTP中に20 mM ( NH4 ) 2 SO4 , 0.005%ウシ血清アル
ブミン(BSA) 及び各オリゴヌクレオチドプライマー 0.2
mM。使用したオリゴヌクレオチドプライマー（表１）は
ウイルスゲノム配列上に現存する情報(exisiting infor
mation) に基づいて設計した（Hammond,J 及びHammond,
R.W.(1989), J.Gen.Virol. 70: 1961-74参照）。プレー
トを 94 ℃で 2分間加熱した後、72℃に冷却し、1.6 単
位の T DNAポリメラーゼを添加しついで加熱と冷却のサ
イクルを30回反復する間に cDNA を増幅させた。各サイ
クルは次の工程からなる： 52 ℃で 1分間のリンギング
(ringing) 、52℃で 1分間の伸長(elongation)及び 93
℃で30秒間の変性(denaturalisation)。最終サイクルに
おいては伸長時間を 5分間に延長した。加熱勾配は0.3
℃/ 秒とした。
【００２９】増幅生成物の分光光度法による定量を行う
めには、ビスベンジミドの溶液 50マイクロリッターを
0.1 mg/mlの濃度でカップに添加し、マイクロタイトレ
ーションプレートのリーダー(reader)を備えた分光蛍光
計を使用して、353nm で活性化しそして最大蛍光放射(f
luorescent emission)の波長を検出することによりその
結果を読取った。
めには、ビスベンジミドの溶液 50マイクロリッターを
0.1 mg/mlの濃度でカップに添加し、マイクロタイトレ
ーションプレートのリーダー(reader)を備えた分光蛍光
計を使用して、353nm で活性化しそして最大蛍光放射(f
luorescent emission)の波長を検出することによりその
結果を読取った。
【００３０】増幅生成物の同定を行うためには核酸電気
泳動における標準的な方法を使用した［Maniatis,T.
他、Molecular Cloning(A Laboratory Manual). Cold S
pringHarbor Laboratory(1982) 参照］。
泳動における標準的な方法を使用した［Maniatis,T.
他、Molecular Cloning(A Laboratory Manual). Cold S
pringHarbor Laboratory(1982) 参照］。
【００３１】得られた結果は図１に示されている。増幅
された断片の電気泳動移動度は449塩基対の断片につい
て期待されるもの相当した。
された断片の電気泳動移動度は449塩基対の断片につい
て期待されるもの相当した。
【００３２】分光光度法による定量から次のごとき結果
が得られた： 緩衝液(buffer): 8 単位の蛍光(fluores
cence) 正常な豆 (heathy bean): 9 単位の蛍光 感染した豆(infected bean): 56 単位の蛍光
が得られた： 緩衝液(buffer): 8 単位の蛍光(fluores
cence) 正常な豆 (heathy bean): 9 単位の蛍光 感染した豆(infected bean): 56 単位の蛍光
【００３３】実施例 ２ トスポウイルス(tospovirus)の検出と同定 トスポウイルスは動物ブニアウイルス(bunyavirus)のあ
る種の特徴、例えば、脂質コート(lipid coating) を有
すること、ゲノムが 3分子のモノカテナリーRNA からな
ること、配列の相同性(sequential homology) 及びその
粒子の細胞質の成熟(cytoplasmic matuation) を提供す
るウイルスである（Elliot,R.M.(1990),J. of Gen. Vir
ol. 71: 501-552参照）。この群のウイルスの代表的な
ものはトマト斑点立枯病(tomato spotted-wilt virus)
(TSWV) である。
る種の特徴、例えば、脂質コート(lipid coating) を有
すること、ゲノムが 3分子のモノカテナリーRNA からな
ること、配列の相同性(sequential homology) 及びその
粒子の細胞質の成熟(cytoplasmic matuation) を提供す
るウイルスである（Elliot,R.M.(1990),J. of Gen. Vir
ol. 71: 501-552参照）。この群のウイルスの代表的な
ものはトマト斑点立枯病(tomato spotted-wilt virus)
(TSWV) である。
【００３４】トマト植物( Lycopersicum esculentum
L）中のTSWVの検出と同定を行うために、実施例１で述
べた方法を行った。使用したオリゴヌクレオチドプライ
マー（表１）はウイルスゲノム配列及び465 塩基対上に
現存する情報に基づいて設計した。
L）中のTSWVの検出と同定を行うために、実施例１で述
べた方法を行った。使用したオリゴヌクレオチドプライ
マー（表１）はウイルスゲノム配列及び465 塩基対上に
現存する情報に基づいて設計した。
【００３５】得られた結果は図１に示されている。増幅
された断片の電気泳動移動度は465塩基対の断片につい
て期待されるもの相当した。
された断片の電気泳動移動度は465塩基対の断片につい
て期待されるもの相当した。
【００３６】分光光度法による定量から次のごとき結果
が得られた： 緩衝液: 8単位の蛍光 正常なトマト: 13単位の蛍光 感染したトマト: 380単位の蛍光
が得られた： 緩衝液: 8単位の蛍光 正常なトマト: 13単位の蛍光 感染したトマト: 380単位の蛍光
【００３７】
【００３８】実施例 ３ クロステロウイルス(closterovirus) の検出と同定 クロステロウイルスはウイルス性病原体である。その粒
子は細長く、非常に屈曲性であり、らせん状の対称性(h
elicoidal symmetry) を有しており、長さは1250nm〜20
00nmである。そのゲノムはモノカテナリー RNAの分子で
ある（Lister, R.M.及び Bar-Joseph,M., Handbook of
Plant Virus Infections andComparative Diagonosis,
809 −844, E.Kurstak(Ed.) Elsevier North-HollandBi
omedical Press(1981)参照）。この群のウイルスの代表
的なものはシトルストリステザ ウイルス(citrus tris
teza virus)(CTV)である。
子は細長く、非常に屈曲性であり、らせん状の対称性(h
elicoidal symmetry) を有しており、長さは1250nm〜20
00nmである。そのゲノムはモノカテナリー RNAの分子で
ある（Lister, R.M.及び Bar-Joseph,M., Handbook of
Plant Virus Infections andComparative Diagonosis,
809 −844, E.Kurstak(Ed.) Elsevier North-HollandBi
omedical Press(1981)参照）。この群のウイルスの代表
的なものはシトルストリステザ ウイルス(citrus tris
teza virus)(CTV)である。
【００３９】オレンジ ( Citrus sinesia ）の木の C
TVの検出と同定を行うために、実施例１で述べた方法を
行った。使用したオリゴヌクレオチドプライマー（表
１）はウイルスゲノム配列上に現存する情報に基づいて
設計し（Sekiya,M.E. 他、(1991), J. of Gen. Virol.
72: 1013-1020 参照）、キャプシド蛋白質遺伝子の最初
の540 ヌクレオチドの増幅を可能にした。
TVの検出と同定を行うために、実施例１で述べた方法を
行った。使用したオリゴヌクレオチドプライマー（表
１）はウイルスゲノム配列上に現存する情報に基づいて
設計し（Sekiya,M.E. 他、(1991), J. of Gen. Virol.
72: 1013-1020 参照）、キャプシド蛋白質遺伝子の最初
の540 ヌクレオチドの増幅を可能にした。
【００４０】得られた結果は図１に示されている。増幅
された断片の電気泳動移動度は465塩基対の断片につい
て期待されるもの相当した。
された断片の電気泳動移動度は465塩基対の断片につい
て期待されるもの相当した。
【００４１】分光光度法による定量から次のごとき結果
が得られた： 緩衝液: 8単位の蛍光 正常なオレンジの木: 14単位の蛍光 感染したオレンジの木: 240単位の蛍光
が得られた： 緩衝液: 8単位の蛍光 正常なオレンジの木: 14単位の蛍光 感染したオレンジの木: 240単位の蛍光
【００４２】実施例 ４ トバモウイルス(tobamovirus) の検出と同定 トバモウイルスはウイルス性病原体である。その粒子は
細長く、剛性であり(rigid) 、平均の長さ(300nm) であ
り、そのゲノムはモノカテナリー RNAの線状分子である
（Van Regenmortel,M.H.V.(1981), Handbook of Plant
VirusInfections and Comparative Diagonosis, E.Kurs
tak(Ed.) Elsevier North-Holland Biomedical Press(1
981) 参照）。この群のウイルスの代表的なものはコシ
ョウマイルドモットリングウイルス(pepper mild mottl
ing virus)(PMMV)である。
細長く、剛性であり(rigid) 、平均の長さ(300nm) であ
り、そのゲノムはモノカテナリー RNAの線状分子である
（Van Regenmortel,M.H.V.(1981), Handbook of Plant
VirusInfections and Comparative Diagonosis, E.Kurs
tak(Ed.) Elsevier North-Holland Biomedical Press(1
981) 参照）。この群のウイルスの代表的なものはコシ
ョウマイルドモットリングウイルス(pepper mild mottl
ing virus)(PMMV)である。
【００４３】コショウ植物( Capsicum annum) のPMMV
の検出と同定を行うために、実施例１で述べた方法を行
った。使用したオリゴヌクレオチドプライマー（表１）
はウイルスゲノム配列（Alonso 他(1991), J. of Gen.
Virol. 72: 2875-2884参照）及びヌクレオチド735 と12
31の間の496 塩基対の断片上に現存する情報に基づいて
設計した。
の検出と同定を行うために、実施例１で述べた方法を行
った。使用したオリゴヌクレオチドプライマー（表１）
はウイルスゲノム配列（Alonso 他(1991), J. of Gen.
Virol. 72: 2875-2884参照）及びヌクレオチド735 と12
31の間の496 塩基対の断片上に現存する情報に基づいて
設計した。
【００４４】得られた結果は図１に示されている。 2個
の断片が得られた；その一つは期待した移動度を有する
ものであり、他の一つはヌクレオチド1062と1082との間
のゲノム断片を有する5'--3'の方向の合成プライマーに
よって表わされる相同性(68%）のために350 塩基対の大
きさに相当する。
の断片が得られた；その一つは期待した移動度を有する
ものであり、他の一つはヌクレオチド1062と1082との間
のゲノム断片を有する5'--3'の方向の合成プライマーに
よって表わされる相同性(68%）のために350 塩基対の大
きさに相当する。
【００４５】分光光度法による定量から次のごとき結果
が得られた： 緩衝液: 8単位の蛍光 正常なコショウ植物: 18単位の蛍光 感染したコショウ植物: 410単位の蛍光
が得られた： 緩衝液: 8単位の蛍光 正常なコショウ植物: 18単位の蛍光 感染したコショウ植物: 410単位の蛍光
【００４６】実施例 ５ ルテロウイルス(luterovirus) の検出と同定 ルテロウイルスはウイルス性病原体である。その粒子は
25nmの平均直径を有する二十面体型(icosahedral) であ
り、そのゲノムはモノカテナリー RNAの線状分子である
(Rachow,W.F.及び Duffus,J.E. (1981),Handbook of Pl
ant VirusInfections and Comparative Diagonosis, E.
Kurstak(Ed.), Elsevier North-Holland Biocmedical P
ress(1981) 参照）。この群のウイルスの代表的なもの
は馬鈴薯葉巻き病ウイルス(potato leaf-roll virus)(P
LRV)である。
25nmの平均直径を有する二十面体型(icosahedral) であ
り、そのゲノムはモノカテナリー RNAの線状分子である
(Rachow,W.F.及び Duffus,J.E. (1981),Handbook of Pl
ant VirusInfections and Comparative Diagonosis, E.
Kurstak(Ed.), Elsevier North-Holland Biocmedical P
ress(1981) 参照）。この群のウイルスの代表的なもの
は馬鈴薯葉巻き病ウイルス(potato leaf-roll virus)(P
LRV)である。
【００４７】馬鈴薯植物 (Solanum tuberosum ) のPL
RV検出と同定を行うために、増幅サイクルの数を35に増
加しかつリンギング工程中の温度を41℃に低下させたこ
と以外、実施例１で述べた方法を行った。使用したオリ
ゴヌクレオチドプライマー（表１）はウイルス配列（Ro
bertson,N.L.他(1991), J. of Gen.Virol. 72: 1473
-1477 参照）及びヌクレオチド3687と3701の間の534 塩
基対の断片上に現存する情報に基づいて設計した。
RV検出と同定を行うために、増幅サイクルの数を35に増
加しかつリンギング工程中の温度を41℃に低下させたこ
と以外、実施例１で述べた方法を行った。使用したオリ
ゴヌクレオチドプライマー（表１）はウイルス配列（Ro
bertson,N.L.他(1991), J. of Gen.Virol. 72: 1473
-1477 参照）及びヌクレオチド3687と3701の間の534 塩
基対の断片上に現存する情報に基づいて設計した。
【００４８】得られた結果は図１に示されている。増幅
された断片の電気泳動移動度は534塩基対の断片につい
て期待されるもの相当した。
された断片の電気泳動移動度は534塩基対の断片につい
て期待されるもの相当した。
【００４９】分光光度法による定量から次のごとき結果
が得られた： 緩衝液: 8単位の蛍光 正常な馬鈴薯植物: 11単位の蛍光 感染した馬鈴薯植物: 72単位の蛍光
が得られた： 緩衝液: 8単位の蛍光 正常な馬鈴薯植物: 11単位の蛍光 感染した馬鈴薯植物: 72単位の蛍光
【００５０】実施例 ６ ネポウイルス(nepovirus) の検出と同定 ネポウイルスはウイルス性病原体である。そのゲノムは
各々が28nmの平均直径を有する二十面体型粒子中に包封
された(encapsulated)、正の(positive)モノカテナリー
RNAの 2個の線状分子である（Murant,A.F.,Handbook o
f Plant VirusInfections and Comparative Diagonosi
s, 198 , E.Kurstak(Ed.) Elsevier North-Holland Bio
cmedical Press 参照）。この群のウイルスの２種の代
表的なものはサクラ葉巻き病ウイルス(CLRV)及びブドウ
(grapevine) ファンリーフウイルス(fanleaf virus)(GF
LV) である。
各々が28nmの平均直径を有する二十面体型粒子中に包封
された(encapsulated)、正の(positive)モノカテナリー
RNAの 2個の線状分子である（Murant,A.F.,Handbook o
f Plant VirusInfections and Comparative Diagonosi
s, 198 , E.Kurstak(Ed.) Elsevier North-Holland Bio
cmedical Press 参照）。この群のウイルスの２種の代
表的なものはサクラ葉巻き病ウイルス(CLRV)及びブドウ
(grapevine) ファンリーフウイルス(fanleaf virus)(GF
LV) である。
【００５１】クルミ (Juglans regia ) のCLRVとブド
ウ (Vitis vinifera) のGFLVの検出と同定を行うため
実施例１と同様の方法を行った。使用したオリゴヌクレ
オチドプライマーはCLRVの配列（Borja,M.J.及び Ponz,
F.(1992), J.of Virol.Meth.36:78-83参照）及びGFLVの
配列(Sanchez,F. 他 (1991), Nucleic Acid Res. 19:54
40参照）上に現存する情報に基づいて設計した。GFLVの
場合にはキャプシド蛋白質のシストロン(cistron) の最
初の568 ヌクレオチドに相当する断片を増幅し、CLRVの
場合には 3'-UTR のヌクレオチド1194と1642の間の448
塩基対の断片を増幅した。
ウ (Vitis vinifera) のGFLVの検出と同定を行うため
実施例１と同様の方法を行った。使用したオリゴヌクレ
オチドプライマーはCLRVの配列（Borja,M.J.及び Ponz,
F.(1992), J.of Virol.Meth.36:78-83参照）及びGFLVの
配列(Sanchez,F. 他 (1991), Nucleic Acid Res. 19:54
40参照）上に現存する情報に基づいて設計した。GFLVの
場合にはキャプシド蛋白質のシストロン(cistron) の最
初の568 ヌクレオチドに相当する断片を増幅し、CLRVの
場合には 3'-UTR のヌクレオチド1194と1642の間の448
塩基対の断片を増幅した。
【００５２】得られた結果は図１に示されている。電気
泳動移動度は568 及び448 塩基対の断片について期待さ
れるもの相当した。
泳動移動度は568 及び448 塩基対の断片について期待さ
れるもの相当した。
【００５３】分光光度法による定量から次のごとき結果
が得られた： 緩衝液: 8単位の蛍光 正常なクルミ植物: 14単位の蛍光 感染したクルミ植物: 560単位の蛍光 正常なブドウ 11単位の蛍光 感染したブドウ 65単位の蛍光
が得られた： 緩衝液: 8単位の蛍光 正常なクルミ植物: 14単位の蛍光 感染したクルミ植物: 560単位の蛍光 正常なブドウ 11単位の蛍光 感染したブドウ 65単位の蛍光
【００５４】実施例 ７ ククモウイルス(cucumovirus) の検出と同定 ククモウイルスはウイルス性病原体である。その粒子は
等長(isometric）であり、直径が約30nmであり、そのゲ
ノムは正のモノカテナリー RNAの３つの分子である（Ka
per,J.M.及び Waterworth (1991), Handbook of Plant
Virus Infections and Comparative Diagonosis, 257,
E.Kurstak(Ed.) ElsevierNorth-Holland Biocmedical
Press 参照）。この群のウイルスの代表的なものはキュ
ウリモザイクウイルス(CMV) である。
等長(isometric）であり、直径が約30nmであり、そのゲ
ノムは正のモノカテナリー RNAの３つの分子である（Ka
per,J.M.及び Waterworth (1991), Handbook of Plant
Virus Infections and Comparative Diagonosis, 257,
E.Kurstak(Ed.) ElsevierNorth-Holland Biocmedical
Press 参照）。この群のウイルスの代表的なものはキュ
ウリモザイクウイルス(CMV) である。
【００５５】タバコ植物（Nicotiana tabacum ) のCM
V の検出と同定を行うために実施例１と同様の方法を行
った。使用したオリゴヌクレオチドプライマー（表１）
はウイルスゲノム配列（Quemada H 他(1989), J. of Ge
n.Virol. 70: 1065-1073参照）及びRNA3のヌクレオチド
112 と653 の間の541 塩基対の断片上に現存する情報に
基づいて設計した。
V の検出と同定を行うために実施例１と同様の方法を行
った。使用したオリゴヌクレオチドプライマー（表１）
はウイルスゲノム配列（Quemada H 他(1989), J. of Ge
n.Virol. 70: 1065-1073参照）及びRNA3のヌクレオチド
112 と653 の間の541 塩基対の断片上に現存する情報に
基づいて設計した。
【００５６】得られた結果は図１に示されている。増幅
された断片の電気泳動移動度は541塩基対の断片につい
て期待されるもの相当した。
された断片の電気泳動移動度は541塩基対の断片につい
て期待されるもの相当した。
【００５７】分光光度法的定量から次のごとき結果が得
られた： 緩衝液: 8単位の蛍光 正常なタバコ: 14単位の蛍光 感染したタバコ: 620単位の蛍光
られた： 緩衝液: 8単位の蛍光 正常なタバコ: 14単位の蛍光 感染したタバコ: 620単位の蛍光
【００５８】実施例 ８ サテライト RNAの検出と同定 サテライト RNAは植物に固有の(exclusive) サブウイル
ス性病原体である。そのゲノムは構造蛋白質をコード(c
odify)しない正のモノカテナリー RNAの線状分子であ
る。サテライト RNAはその粒子を形成するために植物ウ
イルスのキャプシド蛋白質を使用する（Matthews, R.E.
F.(1991), Viroids, Satellite Virusesand satellite
RNAs, Plant Virology, 306, Academic Press 参照）。
ス性病原体である。そのゲノムは構造蛋白質をコード(c
odify)しない正のモノカテナリー RNAの線状分子であ
る。サテライト RNAはその粒子を形成するために植物ウ
イルスのキャプシド蛋白質を使用する（Matthews, R.E.
F.(1991), Viroids, Satellite Virusesand satellite
RNAs, Plant Virology, 306, Academic Press 参照）。
【００５９】本実施例においては、CARNA-5 、即ち、コ
ショウ植物（Capsicum annum ) のキュウリモザイクウ
イルス(CMV) のサテライト RNAの検出と同定を行った。
マイクロタイトレーションプレートのカップのリンギン
グにおいて二本鎖 RNAに対する抗体を使用したこと以
外，実施例１と同様の方法を行った。使用したオリゴヌ
クレオチドプライマーはサテライト RNA配列(Kaper,J.
M. 他(1988),Virology,163:284-292 参照）及びヌクレ
オチド10と312 の間の303 塩基対の断片上についての情
報に基づいて設計した。
ショウ植物（Capsicum annum ) のキュウリモザイクウ
イルス(CMV) のサテライト RNAの検出と同定を行った。
マイクロタイトレーションプレートのカップのリンギン
グにおいて二本鎖 RNAに対する抗体を使用したこと以
外，実施例１と同様の方法を行った。使用したオリゴヌ
クレオチドプライマーはサテライト RNA配列(Kaper,J.
M. 他(1988),Virology,163:284-292 参照）及びヌクレ
オチド10と312 の間の303 塩基対の断片上についての情
報に基づいて設計した。
【００６０】得られた結果は図１に示されている。増幅
された断片の電気泳動移動度は303塩基対の断片につい
て期待されるもの相当した。
された断片の電気泳動移動度は303塩基対の断片につい
て期待されるもの相当した。
【００６１】分光光度法による定量から次のごとき結果
が得られた： 緩衝液: 8単位の蛍光 正常なコショウ植物: 16単位の蛍光 感染したコショウ植物: 420単位の蛍光
が得られた： 緩衝液: 8単位の蛍光 正常なコショウ植物: 16単位の蛍光 感染したコショウ植物: 420単位の蛍光
【００６２】実施例 ９ ウイロイドの検出と同定 ウイロイドは植物に固有のサブウイルス性病原体であ
る。そのゲノムは構造蛋白質をコード(codify)しないモ
ノカテナリー RNAの環状分子である(Matthews,R.E.F.の
文献参照）。
る。そのゲノムは構造蛋白質をコード(codify)しないモ
ノカテナリー RNAの環状分子である(Matthews,R.E.F.の
文献参照）。
【００６３】本実施例においては馬鈴薯スピンドルチュ
ウバーウイロイド(spindle tuberviroid) の検出と同定
を行った。マイクロタイトレーションプレートのカップ
のリンギングにおいて二本鎖 RNAに対する抗体を使用し
たこと以外，実施例１と同様の方法を行った。使用した
オリゴヌクレオチドプライマーはウイロイドゲノム配列
(Gross 他 (1978), Nature(London),273:203-208 参
照）及びヌクレオチド(349-1) の間の258 塩基対の断片
上についての情報に基づいて設計した。
ウバーウイロイド(spindle tuberviroid) の検出と同定
を行った。マイクロタイトレーションプレートのカップ
のリンギングにおいて二本鎖 RNAに対する抗体を使用し
たこと以外，実施例１と同様の方法を行った。使用した
オリゴヌクレオチドプライマーはウイロイドゲノム配列
(Gross 他 (1978), Nature(London),273:203-208 参
照）及びヌクレオチド(349-1) の間の258 塩基対の断片
上についての情報に基づいて設計した。
【００６４】得られた結果は図３に示されている。増幅
された断片の電気泳動移動度は258塩基対の断片につい
て期待されるもの相当した。
された断片の電気泳動移動度は258塩基対の断片につい
て期待されるもの相当した。
【００６５】分光光度法による定量から次のごとき結果
が得られた： 緩衝液: 8単位の蛍光 正常な馬鈴薯: 15単位の蛍光 感染した馬鈴薯: 380単位の蛍光
が得られた： 緩衝液: 8単位の蛍光 正常な馬鈴薯: 15単位の蛍光 感染した馬鈴薯: 380単位の蛍光
【００６６】実施例 １０ 二本鎖 RNAに対する抗体を使用するウイルス性病原体の
検出と同定 下記のウイルス性病原体の検出と同定に二本鎖 RNAに対
する抗体を使用した場合に得られる結果は図２に示され
ている： a)ソラマメ(broad-bean)の豆黄色モザイクウイルス； b)タバコ植物のキュウリモザイクウイルス； c)ブドウ(grapewine) のブドウファンリーフウイルス； d)クルミ植物のサクラ葉巻き病ウイルス。 本実施例では前記の実施例と同様の方法を行った。
検出と同定 下記のウイルス性病原体の検出と同定に二本鎖 RNAに対
する抗体を使用した場合に得られる結果は図２に示され
ている： a)ソラマメ(broad-bean)の豆黄色モザイクウイルス； b)タバコ植物のキュウリモザイクウイルス； c)ブドウ(grapewine) のブドウファンリーフウイルス； d)クルミ植物のサクラ葉巻き病ウイルス。 本実施例では前記の実施例と同様の方法を行った。
【図１】実施例１〜８における酵素増幅生成物の電気泳
動移動度を示す写真である。
動移動度を示す写真である。
【図２】実施例１０における酵素増幅生成物の電気泳動
移動度を示す写真である。
移動度を示す写真である。
【図３】実施例９における酵素増幅生成物の電気泳動移
動度を示す写真である。
動度を示す写真である。
フロントページの続き (72)発明者 カルメン・デ・ブラス・ベオルレギ スペイン国．28016・マドリード．セカ ンド・フロアー．ヌメロ・50．コロンビ ア・ストリート（番地その他表示なし) (72)発明者 マ・ホセ・ボルハ・トメ スペイン国．28023・マドリード．ポス エロ・デ・アラルコン．ヌメロ・48．ア ルキテクツアラ・ストリート（番地その 他表示なし) (72)発明者 フエルナンド・ポンツ・アスカソ スペイン国．28230・マドリード．ラ ス・ロサス・デ・マドリード．ウルバニ サシオン“エル・ソト・デ・ラス・ロサ ス”．ヌメロ．２．ハベア・ストリート （番地その他表示なし) (72)発明者 ビセンテ・トレス・パスカル スペイン国．28029・マドリード．フオ ース・フロアー．ヌメロ．６．ビリヤ・ デ・マリン・ストリート（番地その他表 示なし) (56)参考文献 特開 平２−257899（ＪＰ，Ａ) Ｐｒｏｃ．Ｎｏｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，1990年，87，2867−2871 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/70 C12N 15/33 - 15/51
Claims (13)
- 【請求項１】 生物的試料中の、ゲノムがRNAによって
構成されているウイルス性及びサブウイルス性病原体を
検出しかつ同定する方法であって、 （ａ）上記病原体を、該病原体の構造成分に対する特異
性又は二本鎖RNAに対する特異性を有する抗体を予め固
定した固体支持体上に固定し、 （ｂ）、固定された上記病原体を溶解させかつその核酸
を放出させるための特殊な処理を行うことなしに、固定
された病原体の核酸の断片に対する相補的DNA鎖(cDNA)
を同一の支持体中で合成し、 （ｃ）工程(b)で予め合成されたcDNAの断片を、同一の
支持体中で酵素増幅させ、ついで （ｄ）工程(c)の酵素増幅から得られる生成物を、同一
の支持体上で分光光度分析法を使用して定量することを
特徴とする、ウイルス性及びサブウイルス性病原体の検
出及び同定方法。 - 【請求項２】 （e）工程(c)の酵素増幅から得られる生
成物を、電気泳動法を使用して同定する、請求項１に記
載の方法。 - 【請求項３】 固体支持体はマイクロタイトレーション
プレートである、請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 固体支持体上に固定される抗体は、コー
テイングタンパク質に対する特異性を有する抗体からな
る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 cDNAの合成は、逆転写により行う、請求
項１に記載の方法。 - 【請求項６】 合成されたcDNAの増幅は、ポリメラーゼ
鎖反応(PCR)により行う、請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】 ウイルス性病原体は、動物ウイルス、植
物ウイルス、バクテリアウイルス及びカビウイルスから
なる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項８】 生物的試料中の、ゲノムがDNAによって
構成されているウイルス性及びサブウイルス性病原体を
検出しかつ同定する方法であって、 （ａ）上記病原体を、該病原体の構造成分に対する特異
性又は二本鎖DNAに対する特異性を有する抗体を予め固
定した固体支持体上に固定し、 （ｂ）固定された上記病原体を溶解させかつその核酸を
放出させるための特殊な処理を行うことなしに、固定さ
れた病原体のゲノムDNAを同一の支持体上で酵素増幅さ
せ、ついで （ｃ）工程(ｂ)の酵素増幅から得られる生成物を、同一
の支持体上で分光光度分析法を使用して定量することを
特徴とする、ウイルス性及びサブウイルス性病原体の検
出及び同定方法。 - 【請求項９】 （e）工程(c)の酵素増幅から得られる生
成物を電気泳動法を使用して同定する、請求項8に記載
の方法。 - 【請求項１０】 固体支持体はマイクロタイトレーショ
ンプレートである、請求項8に記載の方法。 - 【請求項１１】 固体支持体上に固定される抗体は、コ
ーテイングタンパク質に対する特異性を有する抗体から
なる群から選ばれる、請求項8に記載の方法。 - 【請求項１２】 ゲノムDNAの酵素増幅は、ポリメラー
ゼ鎖反応(PCR)により行う、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１３】 ウイルス性病原体は動物ウイルス、植
物ウイルス、バクテリアウイルス及びカビウイルスから
なる群から選ばれたウイルス性病原体である、請求項８
に記載の方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES9201232 | 1992-06-12 | ||
| ES09201232A ES2044784B1 (es) | 1992-06-12 | 1992-06-12 | Procedimiento para la deteccion e identificacion de patogenos virales y subvirales. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0662900A JPH0662900A (ja) | 1994-03-08 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| ES2078185B1 (es) * | 1994-05-06 | 1996-08-16 | Inia | Procedimiento para la tipificacion molecular de patogenos virales con genoma rna y de patogenos subvirales mediante sintesis aleatoria de cdna. |
| AR005140A1 (es) | 1995-12-21 | 1999-04-14 | Cornell Res Foundation Inc | Una molecula de adn aislada que codifica una proteina o polipeptido de un virus del enrollamiento de la hoja de la vid, un sistema de expresion, unacelula huesped, un transplante de vastago o de rizoma transgenico que incluye dicha molecula de adn, metodo para producir dicho transplante, un metodo para |
| FI101159B (fi) * | 1996-09-05 | 1998-04-30 | Aboatech Ab Oy | Menetelmä ja pakkaus mustaherukan suonenkatotaudin diagnosoimiseksi |
| ES2121698B1 (es) * | 1996-12-02 | 1999-07-01 | Inia | Procedimiento para la obtencionn de fragmentos amplificados de acido nucleico de particulas virales y subvirales que contienen rna. |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2537725B1 (fr) * | 1982-12-09 | 1985-07-12 | Pasteur Institut | Procede de detection immunobacteriologique de germes pathogenes dans des milieux biologiques contamines |
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| CA1253777A (en) * | 1984-06-01 | 1989-05-09 | Robert J. Carrico | Nucleic acid hybridization assay employing immobilized rna probes |
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| US5077192A (en) * | 1988-10-25 | 1991-12-31 | The General Hospital Corporation | Method of detecting antigenic, nucleic acid-containing macromolecular entities |
| IE64040B1 (en) * | 1989-06-15 | 1995-06-28 | Akzo Nv | Method for determining nucleic acid |
| WO1991011534A1 (en) * | 1990-01-24 | 1991-08-08 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, U.S. Department Of Commerce | A rapid and sensitive test for detecting hepatitis a virus |
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