FI101159B - Menetelmä ja pakkaus mustaherukan suonenkatotaudin diagnosoimiseksi - Google Patents

Description

P

ΙΟΊ 159

MENETELMÄ JA PAKKAUS MUSTAHERUKAN SUONENKATOTAUDIN DIAGNOSOIMISEKSI

Keksintö koskee menetelmää mustaherukan suonenkatotaudin 5 diagnosoimiseksi kasveissa, erityisesti mustaherukoissa (Ribes). Keksinnön mukaisesti mustaherukan suonenkatovi-ruksen, BRV:n (blackcurrant reversion virus), toteamiseen käytetään käänteistranskriptaasi-PCR:ää valinnaisesti yhdessä immunokaappausmenetelmän kanssa. Keksintö koskee 10 myös menetelmässä käytettävää testipakkausta. Keksintöön johtavassa työssä karakterisoitiin osittain BRV:n RNA.

Näin määritetystä viruksen nukleotidisekvenssistä oli mahdollista konstruoida alukkeet keksinnön mukaisessa menetelmässä ja pakkauksessa käytettäväksi. Keksintöön 15 johtavan työn kuluessa kutsuimme virusta mustaherukan suo-nenkatotautiin liittyväksi virukseksi, BRAV (Blackcurrant Reversion Associated Virus).

RiJbes-kasveissa tunnistetusta noin 14:stä eri virustaudis- 20 ta tai virustaudin kaltaisesta taudista mustaherukan suo- nenkatotauti on ilman muuta kaikkein tärkein mustaherukan satoa maailmanlaajuisesti ajatellen (1,2); se vaivaa myös punaherukkaa (3). Tautia esiintyy Ribes-lajeissa maailman- ··. laajuisesti Amerikoita lukuun ottamatta. Kuten taudin nimi 25 viittaa, se muuttaa kasvin kasvutapaa, erityisesti lehden ulkonäköä, mistä johtuen (englanninkielinen nimi) 'rever- ".!*! sion' viittaa 'palautumiseen· primitiiviseen alkukantai- • · · * * seen kasvityyppiin (3). Diagnoosia varten luotettavimmat • · · *···* suonenkatotaudin oireet ilmenevät kuitenkin kukkasilmuissa • · · • · « *.* * 30 niiden auetessa aikaisin keväällä. Suonenkatotaudin ylei nen eurooppalainen muoto (E; 1, 2) aiheuttaa kukkasilmujen • · • *·· karvatiheydessä merkittävää vähenemistä ja itse silmujen värin voimistumista (3) . Taudin vakavampi muoto (R; l, 2), ; jota tavataan Suomessa (4) , Itä-Euroopassa ja entisen Neu- • « t ! 35 vostoliiton alueen maissa, aiheuttaa lisäksi jakautumisen, jonka seurauksena verholehtiä muodostuu viiden sijasta kymmenen, ja voimistaa edelleen niiden väritystä (3) .

”·: Suonenkatotaudin kaikki muodot aiheuttavat kukille taval- 101159 2 lisesti steriiliyden, ja infektoidut kasvit tulevatkin nopeasti lisääntymiskyvyttömiksi. Punaherukassa lehti- ja kukkaoireet ovat paljon heikommin havaittavissa kuin mustaherukassa; karviaismarjan on selostettu olevan immuuni 5 infektiolle (3). Luonnossa taudinaiheuttaja leviää kasvien välillä mustaherukan äkämäpunkin (Cecidophyopsis ribis Westw.), mutta ei siementen välityksellä. Kokeellisesti se leviää Ribes-kasvien välillä varrentamalla (3).

10 Suonenkatotaudin aiheuttajaa ei ole karakterisoitu siitä huolimatta, että tutkimusta on tehty yli 50 vuotta, ja ainoa testi taudin toteamiseksi on varrentaminen sensitiivisiin mustaherukkalajikkeisiin ja oireiden kehittymisen odottaminen aina 2 vuoteen asti (3, 5). Tällainen totea-15 mismenetelmä on luonnollisesti työläs ja epätaloudellinen. Siksi onkin tarvetta nopeammalle ja luotettavammalle menetelmälle mustaherukan suonenkatotaudin diagnosoimiseksi.

Tässä keksinnössä kuvataan sellaisen viruksen eristäminen 20 mustaherukasta, jolla on samanlaisia ominaisuuksia kuin eräillä nepoviruksilla. Virus siirrettiin suonenkato-taudista kärsivästä mustaherukasta mekaanisella ymppäyk-sellä ruohovartisiin koekasveihin. Virukselle muodostettiin antiseerumia ja sen kahdesta genomisesta RNA:sta 25 määritettiin toisen 3'-pään nukleotidisekvenssi. Tämän : 1 i vuoksi oli mahdollista konstruoida alukkeet käytettäväksi ; j*. nopeassa ja spesifisessä PCR-järjestelmässä mustaherukan • · · suonenkatotaudin toteamiseksi ja diagnosoimiseksi kasveissa.

.. 30 • · • · ·

Keksinnön eräs näkökohta koskee menetelmää mustaherukan • · · ‘•j * suonenkatotaudin diagnosoimiseksi kasvissa toteamalla ·*· · siinä oleva mustaherukan suonenkatovirus (BRV), jossa menetelmässä: 35 - tutkittavasta kasvista otetaan näyte, 101159 3 - näytteellä tehdään käänteinen transkriptioreaktio yksijuosteisen cDNA:n valmistamiseksi näytteessä olevasta viruksen RNA:sta käyttäen viruksen RNA-sekvens-sistä johdettua oligonukleotidialuketta, joka on 5 komplementaarinen viruksen RNA:n nukleotidisekvens- sille, - cDNA monistetaan polymeraasiketjureaktiolla käyttäen paria oligonukleotidialukkeita, joista toinen on viruksen RNA-sekvenssistä johdettu oligonukleotidi- 10 aluke, joka on komplementaarinen viruksen RNA:n en simmäiselle nukleotidisekvenssifragmentille, ja toinen on mainitun viruksen RNA:sta johdettu oligonuk-leotidialuke, joka vastaa viruksen RNA:n toista nuk-leotidisekvenssifragmenttia, joka on eri kuin mainit-15 tu ensimmäinen nukleotidisekvenssifragmentti, ja mai nitut ensimmäinen ja toinen nukleotidisekvenssifragmentti reunustavat monistettavaa nukleotidisekvens-siä, ja - todetaan monistettu tuote.

20

Vielä eräässä keksinnön näkökohdassa mainittu menetelmä yhdistetään immunokaappausmenetelmään, jossa näyte saatetaan yhteyteen BRV:n vasta-aineen kanssa, jolla substraatti on päällystetty BRV:tä sisältävien partikkeleiden 25 erottamiseksi ja konsentroimiseksi näytteestä, sitten . . partikkelit hajotetaan, esim. kuumentamalla, viruksen • · . .*. RNA:n vapauttamiseksi.

• · · • · ·

Lisäksi keksintö koskee diagnostista testipakkausta musta- .. 30 herukan suonenkatotaudin diagnosoimiseksi kasvissa käyttä- • · ‘ mällä käänteistranskriptaasi-polymeraasiketjureaktiota '·* (RT-PCR) mustaherukan suonenkatoviruksen, BRV:n, totea- ·*♦ : miseksi kasvista, joka pakkaus sisältää - BRV:n vasta-aineen tai BRV:n vasta-aineella päällystetyn 35 substraatin ja 101159 4 - RT-PCR:ää varten parin BRV:n RNA:sta johdettuja oligo-nukleotidialukkeita sellaisen cDNA-fragmentin monistamiseksi, joka on komplementaarinen BRV:n RNA:lie.

5 Edullisen suoritustavan mukaan keksintö koskee oligonuk-leotidialukeparin käyttöä keksinnön mukaisessa menetelmässä ja pakkauksessa, joten alukkeet reunustavat ja kykenevät monistamaan käänteisessä transkriptioreaktiossa viruksen RNA:sta muodostetun cDNA:n 3'-Proksimaalisen 210 bp:n 10 f ragment in.

PIIRROSTEN LYHYT KUVAUS

Kuvassa 1 esitetään BRV:n RNA:n sellaisen 210 bp:n cDNA-15 fragmentin RT-PCR-monistus, joka on saatu seuraavista lähteistä peräisin olevista nukleiinihappouutteista (kaistojen numerot suluissa): a. BRV-infektoidun Chenopodium quinoan paikallisesti ja 20 systeemisesti infektoidut lehdet (vastaavasti 1 ja 2); BRV-infektoidun Nicotiana occidentaliksen, 37-B, systeemisesti infektoidut lehdet (3); terveet C. quinoan lehdet (4); ja osittain puhdistetut BRV-partikkelit (5). Kaista 'M' sisältää Pstl-pilkottua λ-DNA:ta molekyylipainon mark-25 kereina.

• · . b. osittain puhdistetut valmisteet suonenkatotaudin R- • · · muodon vaivaamien mustaherukoiden lehdistä, saatu Maatalouden tutkimuskeskuksen maatalouslaitoksesta (ARC-IH) 30 Piikkiöstä (2) ja Parikkalasta (3), terveet kasvit (4) ja • · \ puhdistetut BRV-partikkelit (5). Kaista 1 sisältää pus- • · · *·’ ‘ kurikontrollin ja kaista 'M1 1 kb:n "tikkaan" (ladder) ·*· : molekyylipainomarkkerina (Gibco BRL) .

35 Kuvassa 2 esitetään BRV:n RNA:n, joka on saatu kasvien tai punkkien nukleiinihappouutteista, 210 bp:n cDNA-fragmentin IC-RT-PCR-monistus. Jokaisessa geelissä kaista 'M' sisäl- 101159 5 tää 100 bp:n DNA-tikkaan (Gibco BRL) ja kaista ' C· terveen mustaherukan IC-RT-PCR:stä saatua materiaalia. Uutteet olivat peräisin seuraavista lähteistä (kaistojen numerot suluissa): 5 a. yksittäiset suonenkatotaudin R-muodon vaivaamat musta-herukkapensaat, jotka oli saatu alunperin HRSrltä Piikkiöstä (1-5) ja Parikkalasta (6-10); ja 50 äkämäpunkin ryhmät sairastuneiden mustaherukkapensaiden äkämistä Maa- 10 talouden tutkimuskeskuksen maatalousosastolta Piikkiöstä (11) ja Parikkalasta (12). Vyöhykkeet kaistoissa 6, 9 ja 12 olivat hyvin heikkoja, eivätkä ne toistu hyvin kuvassa.

b. kaksi mustaherukkapensasta, joista kummallakin oli suo-15 nenkatotaudin R-muoto, molemmat olivat lajiketta Lepaan musta (1, 2), Karila (3, 4), Nikkala (5, 6), Bija (7, 8) ja Suont-musta (9, 10). Vyöhykkeet kaistoissa 4 ja 9 olivat hyvin heikkoja, eivätkä ne toistu hyvin kuvassa. Kaistassa 10 ei todettu vyöhykettä.

20 c. yksittäiset Kaarinassa kasvaneet mustaherukkapensaat, jotka olivat joko oireettomia (1) tai niillä oli suonenkatotaudin E-muodon oireita (2-7). Kaistassa 7 oleva vyöhyke oli hyvin heikko, eikä se toistu hyvin kuvassa.

25 . . Kuvassa 3 esitetään Skotlannista saaduista kasvinäytteiden : .*. uutteista peräisin olevan BRV:n RNA:n 210 bp:n cDNA-frag- « · m mentin IC-RT-PCR-monistus. Jokaisessa geelissä kaistat 'C' ja 'M' edustavat terveen mustaherukan analyysiä ja vastaa-30 vasti 100 bp:n DNA-tikkaan (Gibco BRL). Näytteet ovat pe-räisin uutteista, jotka on saatu seuraavista lähteistä • « · *·] ‘ (kaistojen numerot suluissa) : • · • · · a. terveitä kasveja mustaherukkalajikkeista Ben Alder (1, 35 7), Ben Lomond (2, 11), Ben Nevis (8), Ben Tirran (9) ja

Ben Sarek (10) sekä nimettömät lajikkeet, joilla on suonenkatotaudin R-muoto (3, 4) ja E-muoto (5, 6).

101159 6 b. Chenopodium quinoa -kasvit (1-5) ja i?ibes-lajikkeet (6-15). C. quinoa infektoitiin mansikan latentilla rengas-laikkuviruksella (1), Arabiksen mosaiikkiviruksella (ArMVj - mustaherukkaisolaatti (2) ja - syreeni-isolaatti (5), 5 vadelman rengaslaikkuviruksella - skotlantilainen isolaat-ti (3) ja infektoimaton terve kasvi (4). Mustaherukan la-jikenäytteet ovat kasveja, jotka on aikaisemmin varrennet-tu jRibes-kasveilla, joilla on: 10 keltalehtisyys (yellows disease) - lajikkeet Ben Alder (6) ja öjebyn (8); infektiivinen muunnos - lajike Öjebyn (10); karviaismarjan lehtisuonia yhdistävä tauti (veinbanding disease, GVBD) - lajike Ben Nevis GVBD-oireilla (11) ja ilman niitä (9); ArMV - lajike Ben Lomond, jossa on lehden 15 keltaisuusoireita (14), ja oireettomat (15); suonenkato-taudin R-muoto - lajikkeet Ben More (7) ja Amosin Musta -mustaherukka (13) ; terve Amosin Musta -mustaherukkalajike (12) .

20 Kuvassa 4 esitetään Uudesta Seelannista saadun Silvergier-ters Schwarze -lajikkeen uutteista saadun BRV:n RNA:n 210 bp:n cDNA-fragmentin IC-RT-PCR-monistus. Kaista 1, terve kasvi; kaistat 2 ja 3, kasvit, joilla on lieviä ja vastaavasti vakavia suonenkatotaudin oireita; kaistat 4 ja 5, 25 kontrollinäytteet terveestä ja vastaavasti suonenkatotau-. . tia sairastavasta mustaherukasta Suomesta; kaista M, 50- ; 1000 bp:n DNA-markkeri (FMC) .

• · « • · · • · ·

Keksintöön johtavassa työssä olemme onnistuneet eristämään .. 30 todennäköisesti uutena kuvatun viruksen, mustaherukan suo- nenkatoviruksen, BRV:n, ja kuvaamaan sen ominaisuudet.

• · · • · · ·’·· Taudin R-muotoa sairastavan mustaherukan juurrutuspistok- kaissa varhain ilmestyneisiin lehtiin kehittyi selviä 35 kloroottisia kuvioita ja rengaslaikkuja. Virus siirrettiin näistä oireellisista lehdistä työläästi mekaanisesti lajiin Chenopodium quinoa Willd. ja tästä isännästä muihin 101159 7 ruohovartisiin testikasveihin. Virus puhdistettiin, karakterisoitiin osittain ja sitä vastaan muodostettiin anti-seerumia. Viruspartikkelit olivat vakiomittaisia, noin 27 nm läpimitaltaan, ja ne sedimentoituivat kahtena nukleo-5 proteiinikomponenttina. Ne sisälsivät molekyylipainoltaan Mr 55 kD:n proteiinityyppiä, joka hajosi helposti 54 kD:n proteiiniksi, ja kahta pääasiallista RNA-komponenttia, joiden koot olivat noin 6700 ja 7700 nukleotidia, molemmilla oli poly-A-hännät. Nepoviruksilla on useimmat näistä 10 ominaisuuksista, mutta virus ei ollut serologisesti sukua 14 tutkitulle nepovirukselle tai mahdolliselle nepoviruk-selle.

Spesifisesti virus eristettiin Skotlannin kasvinviljely-15 tutkimuslaitoksen (SCRI, Scottish Crop Research Institute) mustaherukan jalostuslinjasta. Puhdistettua virusta käytettiin antiseerumin muodostamiseen immunisoimalla kani. Saatua antiseerumia käytettiin BRV-partikkelien puhdistamiseen ja konsentroimiseen diagnosoitavissa näytteissä.

20

Viruksen vaippaproteiini ja nukleiinihappo analysoitiin.

RNA eristettiin ja analysoitiin agaroosigeelillä, minkä jälkeen tehtiin Northern blot -analyysi. Sekvenssianalyysiä varten cDNA syntetisoitiin viruksen RNAtsta yhdistel-25 mäkloonien muodostamiseksi. DNA eristettiin valikoiduista . yhdistelmäklooneista alustavaa restriktioanalyysiä ja sek- • · . .·. venssianalyysiä varten. Siten oli mahdollista analysoida • · · .•j*. sekvenssi, joka sisälsi 1260 3 '-terminaalista nukleotidia ja BRV:n yhden RNA-komponentin poly-A-hännän. Mainittu .. 30 sekvenssi esitetään SEKV. ID NO:l:ssä.

• l 10 «·· • · · *·* * Sekvenssianalyysi mahdollisti alukkeiden suunnittelun *· : keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettäväksi. Spesifi sesti se mahdollisti alukkeiden suunnittelun sellaisen 3'-35 Proksimaalisen alueen monistamiseksi, joka sisälsi BRV:n RNA:lie komplementaarisen 210 bp:n DNA:n välittömästi po-ly-A-hännästä ylävirtaan.

101159 8

Keksinnön edullisessa suoritustavassa käytetään mustaherukan suonenkatotaudin diagnosoimiseksi kasvissa immunokaap-paus-käänteistranskriptio-PCR:ää (IC-RT-PCR). Tällaisessa menetelmässä voidaan käyttää näytettä, kuten esimerkiksi 5 kasviuutetta, joka saadaan soveltuvista oireellisista kasvin osista, esimerkiksi lehdistä. Näissä uutteissa olevat BRV-partikkelit konsentroidaan ja puhdistetaan im-munokaappausmenetelmällä, kuten on kuvattu kirjallisuusviitteessä (6). Tähän tarkoitukseen voidaan käyttää alus-10 taa, kuten esimerkiksi PCR-putkea, mikrofugiputkea tai mikrotitterilevyä, joka on päällystetty antiseerumilla. Inkuboinnin jälkeen viruspartikkelit, jotka on "pyydystetty" antiseerumilla päällystettyyn alustaan, hajotetaan, esimerkiksi kuumentamalla, RNA:n vapauttamiseksi.

15 Näin saatua RNA:ta käytetään cDNA:n ensimmäisen juosteen synteesiin käänteistranskriptaasireaktiossa, jossa käytetään käänteistranskriptioseosta, esimerkiksi kaupallisesti saatavaa seosta, yhdessä sellaisen oligonukleotidialukkeen 20 (aluke 1) kanssa, joka on komplementaarinen viruksen välittömästi poly-A-hännästä ylävirtaan sijaitsevan nukleo-tidisekvenssin kanssa, sekä käänteistranskriptaasientsyy-miä. Sopivan inkubointiajan jälkeen käänteistranskriptaa-sientsyymi inaktivoidaan.

25 Tämän jälkeen näin saatu cDNA monistetaan PCR-reaktiossa.

. .·. Edullisen suoritustavan mukaan monistamisessa käytetään • · · !!I 'hot start'-menetelmää (7). Hot start -menetelmässä DNA- * polymeraasi aktivoidaan vasta sen jälkeen, kun reaktio on 30 saavuttanut korkean lämpötilan, näin minimoiden väärän • · • '* kohteen monistus ja ei-toivottujen sivutuotteiden muodos- « · · V * tuminen. Hot start voidaan suorittaa lisäämällä reaktio- : putkeen olennainen komponentti vasta kun se on saavuttanut korkean lämpötilan.

35 PCR:n alukkeina käytetään edellä mainittua aluketta 1 yh- dessä toisen alukkeen, aluke 2:n, kanssa, joka vastaa vi- 101159 9 ruksen toista nukleotidisekvenssiä, jotka alukkeet 1 ja 2 reunustavat monistettavaa kohdenukleotidisekvenssiä, cDNA:ta.

5 Keksinnön erään edullisen suoritustavan mukaan aluke 1 on komplementaarinen viruksen nukleotidisekvenssin kanssa kohdassa 1-15 poly-A-hännästä ylävirtaan, ja sillä on sekvenssi 5' GAAAGGACATTTCAG 3' (SEKV. ID NO:3). Aluke 2 vastaa nukleotidisekvenssiä kohdassa 199-210 poly-A-hän-10 nästä ylävirtaan, ja sillä on sekvenssi 5' CGCTGGTGTCTC 3' (SEKV. ID NO:4). Alukkeet voidaan syntetisoida tunnettujen periaatteiden mukaisesti, esimerkiksi käyttämällä kiin-teäfaasista fosforamidiittimenetelmää.

15 PCR-monistusreaktio voidaan suorittaa automaattisena prosessina lämpösyklilaitteessa, ajamalla esimerkiksi 30 sykliä, jossa templaatin denaturointi tapahtuu 95 °C:ssa l minuutti, alukkeen emäspariutus 37 °C:ssa 1 minuutti ja elongaatio 72 °C:ssa 1 minuutti. Elongaatiovaihetta piden-20 netään 30 syklin jälkeen. Toteamista varten PCR-tuotteille tehdään elektroforeesi agaroosigeelillä, värjätään etidi-umbromidilla ja tarkastellaan UV-valossa. Vaihtoehtoisesti PCR-reaktiotuotteet voidaan leimata fluoresoivasti aloittamalla niiden synteesi fluoresoivasti leimatulla aluk-25 keella, jolloin tuotteet todetaan automaattisella optisel- ; . ; la detektiolla, käyttämällä esimerkiksi ALF Manager Syste- • « . .·. miä.

• · · • · · • « · • · · • tl

Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä.

30 • ·

; “ Esimerkki 1: BRV-VIRUKSEN ERISTYS JA ANALYYSI

• « · • · ♦ • · · ·’· : Kasvimateriaali, siirrostusmenetelmät ja virusviljelmä.

Mustaherukkamateriaali, josta virus eristettiin, oli Skot-35 lännin kasvinviljelytutkimuslaitoksen (SCRI) jalostuslin-jaa P9/5/1, joka kasvaa Maatalouden tutkimuskeskuksen Puu-tarhalaitoksen (ARC-IH) koetilalla Piikkiössä Suomessa. Se 101159 10 istutettiin viruksettomana materiaalina, mutta se infektoitui nopeasti suonenkatotaudin R-muodon aiheuttajalla, joka oli todennäköisesti peräisin lähistöllä kasvavista tartunnan saaneista suomalaisista mustaherukkapensaista.

5 Tästä kasvista otettiin pehmeästä puusta pistokkaat (soft wood cuttings), jotka juurrutettiin turve-hiekkaseokseen kasvihuoneessa Maatalouden tutkimuskeskuksen Kasvinsuoje-lulaitoksella, Jokioisissa. Juurtumisen aikana näiden pistokkaiden uusiin lehtiin kehittyi selviä klorootti-10 sia/keltaisia kuvioita ja rengaslaikkuja. Tällaiset lehdet hienonnettiin 2%:isessa nikotiiniliuoksessa, pH 9,5, mah-lauutetta hierottiin ruohovartisten koekasvien karborundu-milla pölytettyihin lehtiin, ja kasveja pidettiin kasvihuoneessa noin 21 °C:ssa. Yhden tällaisen siirrostuksen 15 jälkeen Chenopodium quinoan lehdissä havaittiin oireita. BRV-virus, jota tämän kasvin havaittiin sisältävän, ylläpidettiin sen jälkeen sarjasiirrostuksilla (serial passages) C. quinoassa ja muissa ruohovartisissa isännissä. Virusta säilytettiin myös infektoituina C. quinoan lehtinä 20 -20 °C:ssa ja -80 °C:ssa.

Viruksen puhdistus. BRV puhdistettiin käyttämällä hieman muutettua menetelmää, jonka ovat kuvanneet Frison ja Sta-ce-Smith (8) Arabiksen mosaiikkinepovirukselle. Siirros-25 tetut ja/tai systeemisesti infektoidut C. quinoan lehdet . . . otettiin talteen 15-28 päivää siirrostuksen jälkeen ja

. jauhettiin 3 ml/g:n puskurilla (0,05 M Na2HP04 , 0,02 M

• · · III askorbiinihappoa, 0,02 M 2-merkaptoetanolia, pH 8,0).

• · φ * Homogenaatti suodatettiin juustoliinan läpi ja kirkastet-30 tiin sentrifugoimalla kiihtyvyydellä 15 000 g 20 minuutin • · ' ** ajan. Supernatanttinesteen pH säädettiin arvoon 5,0 lai- • · · *.* * mealla Helillä, pidettiin yli yön 4 °C:ssa, ja sentrifu- ·*· ; goitiin sen jälkeen 15 000 g:llä 20 minuutin ajan. Super- natanttinesteeseen lisättiin 1 % NaCl:ää ja 8 % polyety-35 leeniglykolia (PEG 6000) ja seosta sekoitettiin 4 °C:ssa 1 tunnin ajan, minkä jälkeen sitä sentrifugoitiin 15 000 g:llä 20 minuutin ajan. Pelletti resuspendoitiin yhteen 101159 11 kymmenesosaan alkuperäisestä tilavuudesta 0,05 M Na-sit-raattipuskuria, pH 7, joka sisälsi 1 % NaCl:ää, ja seosta sekoitettiin 1 tunnin ajan ennen kuin sitä sentrifugoitiin jälleen 15 000 g:llä 20 minuutin ajan. Supernatanttineste 5 otettiin talteen ja säilytettiin, ja pelletti liuotettiin uudelleen alkuperäisestä tilavuudesta puoleen tilavuuteen 0,05 M Na-sitraattipuskuria ennen kuin sentrifugoitiin jälleen 15 000 g:llä 20 minuutin ajan. Supernatanttineste otettiin jälleen talteen ja yhdistettiin aikaisemmin saa-10 tuun supernatanttinäytteeseen, minkä jälkeen sentrifugoitiin 105 000 g:llä 90 minuutin ajan. Viruksia sisältävät pelletit resuspendoitiin 0,05 M sitraattipuskuriin. Muissa kokeissa BRV puhdistettiin Nicotiana benthalmianasta Do-min. kirkastamalla kasviuutteet 50%:isella (v/v) kloro-15 formilla. Vesifaasi kirkastettiin vielä ja konsentroitiin yhdellä kierroksella korkean ja matalan nopeuden sentrifu-gointia. Virusvalmisteet puhdistettiin edelleen panemalla 100-500 μΐ lopullista virussuspensiota 10-40%:isille sakkaroosin tiheysgradienteille 0,05 M sitraattipuskurissa, 20 jotka valmistettiin Beckmann SW41 tai SW50.1 -putkissa.

Sakkaroosin tiheysgradienttiputkia sentrifugoitiin 38 000 rpmrllä 90 minuutin ajan (SW41) tai 45 000 rpm:llä 50 minuutin ajan (SW50.1), ja gradientit fraktioitiin pystysuuntaisella siirtymällä (upward displacement) käyttä-25 mällä ISCO-tiheysgradienttifraktioijaa, absorptiota seurattiin 254 nm:ssä. Virusta sisältävät fraktiot yhdistet- • · . .1 2 3. tiin, laimennettiin yhtä suurella tilavuudella sitraatti- puskuria ja sentrifugoitiin 180 000 g:llä 2 tunnin ajan.

Lopulliset pelletit resuspendoitiin pieneen määrään sit- .. 30 raattipuskuria.

• · » « l 2 • · « 3 1 Virussaannot olivat suhteellisen pieniä, vaikka valmisteet ·'· : tehtiin BRV-infektoiduista ruohovartisista kasveista oi reiden ilmenemisen suhteen optimaalisena vuodenaikana.

35 Enimmäissaannot olivat noin 4-5 mg/kg lehteä. Puhdistetut virusvalmisteet muodostivat sakkaroosin tiheysgradient-tisentrifugoinnin jälkeen tavallisesti kaksi läheisesti 101159 12 sedimentoituvaa valon hajaantumisvyöhykettä, jotka tunnistettiin gradientin keskivaiheilla olevista kahdesta pääab-sorbanssipiikistä. Näiden piikkien fraktiot liittyivät suurimpaan infektiivisyyteen.

5

Elektronimikroskopia. Puhdistetut virusvalmisteet pantiin hiilellä päällystettyihin kupariverkkoihin (grids) ja värjättiin negatiivisesti sekä tutkittiin JEOL JEM-100SX tai JEOL 100S -elektronimikroskoopilla.

10

Elektronimikroskoopissa virusvalmisteiden havaittiin sisältävän monia vakiomittaisia partikkeleja, joista jotkut olivat ääriviivoiltaan kulmikkaita (ikosahedrejä) ja niiden läpimitaksi mitattiin noin 27 nm. Kaikki käytetyt 15 neljä negatiivista väriainetta läpäisivät useita partikkeleita, mutta värin läpäisemien partikkelien osuus näytti olevan suurempi ammoniummolybdaatissa, pH 7,0, kuin PTA:-ssa (fosfovolframaattihappo), pH 7,0, metioniinivolframaa-tissa, pH 7,0, tai uranyyliasetaatissa, pH 3,5. Partikke-20 leissa, jotka väri uranyyliasetaatissa läpäisi osittain, näytti olevan joko keskusydin tai paksumpi proteiinikuori, jota partikkeleissa ei ilmennyt muissa väriaineissa. Vaikka nämä erot partikkelien ulkonäössä voivat olla uranyyli-asetaattivärin aikaansaamia keinotekoisia tuotteita, niitä 25 ei aikaisemmin ole havaittu varmojen nepoviruspartikkelien kohdalla tässä väriaineessa.

· t • · 4 0 4 • · ·

Viruksen vaippaproteiinin ja nukleiinihapon analysointi.

* Viruksen vaippaproteiinin koko määritettiin elektroforee- .. 30 silla 10%:isillä SDS-PAGE-geeleillä, kuten Laemmli on • · kuvannut (9) . Nukleiinihappo eristettiin puhdistetuista • · * *.* * virusvalmisteista joko käyttämällä kaupallista Micro-Fast- ·*· : Track-pakkausta (Invitrogen) poly-A-hännällä varustetun RNA:n eristämiseen, tai uuttamalla fenolilla, fenoli-klo-35 roformilla ja seostamalla etanolilla. Uutettu nukleiinihappo denaturoitiin glyoksaalilla ja dimetyylisulfoksidil- 101'159 13 la, analysoitiin 1%:isillä agaroosigeeleillä ja värjättiin etidiumbromidilla, kuten Sambrook ym. ovat kuvanneet (10).

Northern blot -analyysiä varten RNA:t siirrettiin aga-5 roosigeeleiltä Hybond-N-kalvolle (Amersham) ja kalvo fiksoitiin UV:llä ja glyoksaali poistettiin kuumentamalla 80 °C:ssa 2 tunnin ajan. Täplät tutkittiin viruksen cDNAtlla, joka oli leimattu digoksigeniini-dUTP:llä (Boehringer Mannheim). Hybridisaatioreaktiot todettiin käyttämällä 10 pakkausta DIG Luminescent Detection Kit (Boehringer Mannheim) .

SDS-PAGE-geeleillä analysoitaessa puhdistettujen virusval-misteiden proteiiniuutteet siirtyivät tavallisesti kahtena 15 selvästi erottuvana vyöhykkeenä, joiden koot olivat noin 54 kD ja 55 kD. Kuitenkin joissain valmisteissa todettiin vain 54 kD:n virusproteiinin vyöhyke. Kun sitten tällaista virusvalmistetta, josta saatiin vain tätä proteiinia, siirrostettiin C. quinoaan, se tuotti BRV:n alkuinfektion 20 kanssa samanlaisia oireita, ja näistä infektoiduista kasveista puhdistettu viruspartikkelivalmiste sisälsi sekä 54 kD:n että 55 kD:n proteiineja. Tämä viittaa siihen, että molemmat proteiinit ovat peräisin viruksesta, ja että pienempi ilmaantuu luultavasti suuremman proteiinin hajoami-25 sen tuloksena. Nämä kaksi proteiinivyöhykettä havaittiin . . vastaavasti puhdistettujen BRV-valmisteiden western blot • · . -analyyseissä, kun niitä analysoitiin BRV:n polyklonaali- .···, sella antiseerumilla.

• · c .. 30 Kun denaturoituvia agaroosigeelejä analysoitiin, viruksen • · nukleiinihappovalmisteet tuottivat kaksi päävyöhykettä.

• ( i *·[ ’ Näytteistä saadut nukleiinihappoprofiilit olivat identti- r’· : siä, olipa ne saatu joko absorptiolla kaupalliseen oligo- dT-selluloosamatriksiin (Invitrogen) tai fenoliuutolla ja 35 etanolisaostuksella. Kun valmisteisiin lisättiin 10 Mg/ml RNaasi A:ta, nukleiinihappoja ei todettu enää lainkaan, mikä viittaa siihen, että viruksen nukleiinihappo oli 101159 14 RNA:ta. RNA:n absorptio oligo-dT:lle osoittaa sen, että kaksi RNA-lajia on polyadenyloitu. Käyttämällä MCID kuva-analyysi järjestelmää (versio 1.2) ja 0,24-9,5 kb:n RNA-tikasta (Gibco BRL) molekyylikoon markkerina, kahden RNA-5 molekyylin kooksi arvioitiin noin 6700 ja vastaavasti 7700 nukleotidia.

cDNA:n kloonaus ja sekvenssianalyysi. Ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin viruksen RNArsta oligo-dT-alukkeilla 10 käyttämällä pakkausta 'First Strand cDNA Synthesis Kit' (Pharmacia). Reaktioseos käytettiin heti toisen juosteen synteesiin Sambrookin ym. (10) mukaisesti. cDNA:hän lisättiin Notl-linkkerit, minkä jälkeen cDNA liitettiin Notl-pilkottuun, defosforyloituun Bluescript SK+ -vektoriin ja 15 transformoitiin elektroporaatiolla JM109-soluihin. DNA

eristettiin valikoiduista yhdistelmäklooneista alkalisella lyysauksella (10) joko pienoisvalmistusmittakaavalla alustavaa restriktioanalyysiä varten tai suuressa mittakaavassa sekvenssianalyysiä varten. Sekvenssianalyysi tehtiin 20 automaattisella sekvensoinnilla käyttämällä ALF Manager -järjestelmää, versiota 2.5. Sekvenssiaineisto analysoitiin eri ohjelmilla Genetics Computer Group (GCG) sekvens-sianalyysiohjelmapakkauksella, versio 8,0.

25 Antiseerumi valmistettiin immunoimalla kani ihonalaisesti . . noin 50-100 /xg:lla puhdistettua virusta Freundin epätäy- • · • dellisessä adjuvantissa. Lihakseen annettiin kaksi tehos-··« teruisketta 14 päivän välein. Seerumi otettiin eläimestä • « · 14 päivän kuluttua viimeistä ruiskeesta ja säilytettiin .. 30 -20 °C:ssa.

• · • · · ··»

"·* * Esimerkki 2 MUSTAHERUKAN SUONENKATOTAUDIN DIAGNOSOINTI

·*· : KASVEISSA

35 Oligonukleotidialukkeiden suunnittelu. Edellä määritellyn BRV:n RNA:n 3'-pään sekvenssin perusteella syntetisoitiin seuraavat oligonukleotidit: 5' GAAAGGACATTTCAG 3' (aluke 101159 15 1), joka on komplementaarinen viruksen nukleotidisekvens-sille kohdassa 1-15 poly-A-hännästä ylävirtaan, ja 5' CGCTGGTGTCTC 3' (aluke 2), joka vastaa viruksen nukleoti-disekvenssiä kohdassa 199-210 poly-A-hännästä ylävirtaan.

5 Viruksen nukleotidisekvenssin 230 bp;n fraktio DNA:ksi muutettuna, poly-A-häntä mukaan lukien, esitetään liitteenä olevassa SEKV. ID NO:2:ssa. Alukkeet syntetisoitiin kiinteäfaasisella fosforamidiittimenetelmällä 0,01 mikro-molaarisessa mittakaavassa ja suolat poistettiin ennen 10 käyttöä.

Viruksen RNA:n uuttaminen puhdistetuista viruspartikke-leista, infektoiduista kasveista ja punkeista. Edellä kuvatulla tavalla puhdistettuun BRV-partikkelien suspen-15 sioon lisättiin yhtä suuri tilavuus RNA:n uuttopuskuria (0,1 M glysiiniä, 0,1 M Tris'iä, pH 8,6, 0,1 M NaCl:ää, 0,01 M EDTA:ta, 0,2 % SDS:ää (natriumdodekyylisulfaatti), 0,2 % natriumdodekyylisarkosiinia). RNA uutettiin tästä suspensiosta lisäämällä yhtä suuri tilavuus fenoli/kloro-20 formia, ja RNA saostettiin vesifaasista 1/10-tilavuudella 3 M NaOActtä, pH 5,2, ja 2,5 tilavuusosalla etanolia.

RNA:ta sisältävä pelletti resuspendoitiin 8 /il:aan vettä ja käytettiin suoraan cDNA:n ensimmäisen juosteen synteesiin.

25 . . . Nukleiinihapon uuttamiseksi BRV-infektoiduista ruohovarti- • · * l' sista kasveista, oireelliset lehdet jauhettiin nestety- • · · pessä ja hienonnettiin survimella ja huhmareella RNA:n • · · '** uuttopuskurissa (2 ml/g lehteä) . Homogenaatti uutettiin 30 yhtä suurella tilavuusmäärällä fenolia ja fenoli/klorofor- • · : ’·· mia ja nukleiinihappo etanolisaostettiin, kuten edellä on • · · : kuvattu. Nukleiinihapon uuttamiseksi Ribeksen lehdistä • · noin 300 μg nuoria lehtiä jauhettiin nestetypessä Eppen- dorf-putkessa lasisauvalla. Uutteeseen lisättiin koko ajan 35 sekoittaen 500 μΐ TE-puskuria (10 mM Tris'iä, 1 mM EDTA:-ta), pH 7,4. Homogenaattia jäädytettiin 20 minuutin ajan -20 °C:ssa, sulatettiin huoneenlämpötilassa ja uutettiin 101159 16 0,25 tilavuusosalla kloroformia 5 minuutin ajan. Emulsiota sentrifugoitiin 2000 rpmrllä 5 minuutin ajan, vesifaasi otettiin pois ja sentrifugoitiin 12 000 rpmillä 10 minuutin ajan. Pelletti resuspendoitiin 500 /xl:aan RNA:n uutto-5 puskuria, uutettiin kahdesti fenoli/klorofonnilla ja nukleiinihappo saostettiin etanolilla -70 °C:ssa.

Nukleiinihapon uuttamiseksi äkämäpunkeista äkämäiset mustaherukan silmut suonenkatotaudin R-muodon vaivaamista 10 pensaista, jotka kasvoivat Jokioisissa Kasvinsuojelulai- toksen pellolla, leikattiin puoliksi ja alkeislehtiä (leaf primordia) ravisteltiin varovasti pienessä vesimäärässä, jotta punkit saatiin irrotettua kudoksista. Tästä punk-kisuspensiosta poimittiin talteen noin 50 punkin ryhmät 15 ohuella karvalla Eppendorf-putkiin ja sentrifugoitiin nopeasti punkkien pelletoimiseksi. Punkkeja sisältävä pelletti pestiin kerran vedessä ja punkit pelletoitiin uudelleen nopealla sentrifugoinnilla. Punkkeja sisältävät pelletit jauhettiin lisäämällä nestetyppeä ja hienonnettiin 20 sitten lasisauvalla 500 μΙιββΆ RNA:n uuttopuskuria ennen fenoli/kloroformiuuttoa ja nukleiinihapon etanolisaostus-ta, kuten edellä on kuvattu.

Kasvinäytteet analyysiä varten. Kasvinäytteet kerättiin 25 PCR-analyysiä varten loppukeväällä/alkukesällä. Suomessa !!'! näytteet olivat peräisin Jokioisista Kasvinsuojelulaitok- ‘ * sen (IPP) peltokasveista, joissa oli suonenkatotaudin • · · *·”* oireita kukissa ja/tai lehdissä, Maatalouden tutkimuskes- • · « *·* * kuksen Puutarhalaitoksen, Piikkiö, ituplasmakokoelmista 30 sekä monilta yksityisiltä puutarhoilta Etelä-Suomesta.

• · • *·· Terveet kasvit (varmennetut viruksettomat kasvit) olivat »·· ::: alun perin Maatalouden tutkimuskeskuksen Laukaan tutkimus- ,·’ ♦ ja eliittikasviyksiköstä ja niitä ylläpidettiin sen jäl keen suojatuissa kasvihuoneissa IPP:llä, Jokioisissa.

35 Skotlannissa näytteet olivat peräisin varmennetuista viruksettomista emokasveista, joita säilytettiin suojatussa tilassa (screen house), SCRIillä, Dundee, ja ne tarkistet- 17 1G1159 tiin säännöllisesti sen varmistamiseksi, että ne olivat koko ajan vapaita kaikista Ribeksen tunnetuista virustaudeista, sekä näistä ja muista sellaisista kasveista, jotka oli aikaisemmin infektoitu varrentamalla tunnetuilla 5 viruksilla tai viruksen kaltaisilla tekijöillä, tai tartutettu Eriophyidae-äkämäpunkeilla, jotka olivat peräisin mustaherukan suonenkatotautia sairastavista mustaherukka-pensaista. Näytteet Uudesta-Seelannista olivat peräisin sekä terveistä että suonenkatotaudin vaivaamista mustahe-10 rukoista, lajikkeesta Silvergierters Schwarze. Suonenkato-tautinäytteissä oli joko lieviä tai vaikeita taudin E-muo-don aiheuttamia oireita. Nepovirusnäytteet C. quinoassa olivat peräisin viljelmistä, joita ylläpidettiin SCRI:ssä.

15 Ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi. cDNA:n ensimmäisen juosteen synteesiä varten RNA joko saatiin suoraan puhdistetuista BRV-partikkeleista tai uutettiin BRV-partikke-leista, jotka oli saatu talteen kasvi- tai punkkiuutteista immunokaappauksella. Sellaisesta RNA:sta alkaneessa syn-20 teesissä, joka oli eristetty suoraan puhdistetuista partikkeleista, reaktioseos sisälsi 8 μΐ RNArta vedessä, 1 μΐ aluketta 1, 1 μΐ 200 mM DTT:tä ja 5 μΐ käänteistranskriptio- (RT)-seosta. RT-seos oli joko 'First Strand Synthesis Kit' -pakkaus (Pharmacia Biotech) tai seos, joka sisälsi 25 135 mM Tris-HCl:ää, pH 8, 200 mM KCl:ää, 30 mM MgCl2:ia, 30 mM DTT:tä (ditiotreitoli), 5,5 mM jokaista dNTP:tä, 240 • · * * mg/ml RNaasi/DNaasi-vapaata BSA:ta (Pharmacia Biotech), • ♦ · **"* 2,7 U/μΙ RNAguard-valmistetta (Pharmacia Biotech) ja 3 • · r U/μΙ hiiren käänteistranskriptaasia (Pharmacia Biotech).

30 Reaktioita inkuboitiin 37 °C:ssa 1 tunnin ajan ja sen • · • ’·· jälkeen 90 °C:ssa 5 minuutin ajan käänteistranskriptaasin • · « : :: inaktivoimiseksi.

• ·

Immunokaappaus-menetelmä. BRV-partikkelien immunokaappaus 35 lehti- ja punkkiuutteista noudatteli pääosin Nolascon ym. menetelmää (6) vähäisin muutoksin. Lehdet (0,3 g) jauhettiin nestetypessä ja uutettiin petkeltä ja huhmaretta 101159 18 käyttäen 2,1 ml:ssa kylmää TE-puskuria, pH 8,0. Noin 0,5 ml uutetta siirrettiin Eppendorf-putkeen, jäädytettiin -20 °C:ssa 20 minuutin ajan, sulatettiin ja sentrifugoitiin jälleen 5 minuutin ajan 3000 rpmrllä 4 °C:ssa. Kirkkaasta 5 supernatantista pantiin sitten erä (50 μΐ) PCR-putkiin, joita oli aikaisemmin inkuboitu 50 μ1:η kanssa viruksen antiseerumin l:150-laimennosta 50 mM natriumkarbonaatissa, pH 9,6, 37 °C:ssa 2 tunnin ajan, minkä jälkeen se pestiin kahdesti 100 pl:lla PBS:ää (fosfaattipuskuroitu suola-10 liuos), joka sisälsi 0,05 % Tween 20:tä (PBS-Tween). Sen jälkeen, kun kirkasta kasviuutetta oli lisätty pällystet-tyihin PCR-putkiin, niitä inkuboitiin 37 °C:ssa 4 tunnin ajan tai 7 °C:ssa yli yön. Inkuboinnin jälkeen PCR-putket tyhjennettiin, pestiin kahdesti 100 pl:lla PBS-Tweeniä, ja 15 lisättiin 8 μΐ vettä ja putkia kuumennettiin 65 °C:ssa 10 minuutin ajan "pyydystettyjen" viruspartikkelien hajottamiseksi. Putket siirrettiin jäähän ja käytettiin suoraan ensimmäisen juosteen synteesiin, kuten edellä on kuvattu.

20 PCR. Käytettiin "hot start"-menetelmää (7). PCR-reaktio-komponentit pipetoitiin PCR-putkiin, minkä jälkeen lisättiin cDNA-näytteet. Reaktioseos (50 μΐ) sisälsi 20-40 pmol kumpaakin aluketta ja 400 μΜ dNTPija 1 x DyNAzyme™ -DNA-polymeraasipuskurissa. Reaktioseos peitettiin sulalla 25 DyNAWaxT“illa (Finnzymes), joka jähmettyy nopeasti joutuessaan yhteyteen reaktioseoksen kanssa. Tämän vahakerroksen • · \ päälle lisättiin 50 μΐ liuosta, joka sisälsi 2 U DyNAzy- me™-DNA-polymeraasia (Finnzymes) ja 5 μΐ ensimmäisen juos- • · o *·* ' teen cDNA-reaktiota 1 x DyNAzyme™ -polymeraasipuskurissa.

30 RT-PCR-monistus tehtiin Hybaid-lämpösyklilaitteessa (Omni- • '·· gene), jossa ajettiin 30 sykliä: templaatin denaturointi • · · ’·/· ‘ 95 °C:ssa 1 minuutti, alukkeen emäspariutus 37 °C:ssa 1 ·’ · minuutti ja pidennys 72 °C:ssa 1 minuuttia. 30 syklin

jälkeen tuotteita pidennettiin 72 °C:ssa 10 minuutin ajan 35 ja jäähdytettiin 4 °C:seen. PCR-reaktioiden erille (30 μΐ) tehtiin elektroforeesi 1,5%:isissä tai 2%:isissä agaroosi-geeleissä TBE-puskurissa (0,045 M Tris-boraattia, 1 mM

101159 19 EDTA:ta) ja geelit värjättiin etidiumbromidilla ja tarkasteltiin UV-valossa.

PCR-reaktioiden tulokset esitetään kuvissa 1-4. Voidaan 5 havaita, että kyseisiä alukkeita käyttämällä kloonatusta cDNArsta aikaansaadaan tuotteen luotettava monistus "hot start"-menetelmällä. Sen vuoksi "hot start"-menetelmää käytettiin kaikissa näissä tutkimuksissa ja sillä saatiin onnistuneesti monistettua odotetun kokoinen tuote, kun si-10 tä käytettiin RNA:11a, joka oli saatu puhdistetuista BRV-partikkeleista (kuvat la ja Ib, kaista 5), BRV-infektoi-dusta c. quinoasta (kaistat 1 ja 2) ja N. occidentalikses-ta (kaista 3) (kuva la). Kun infektoiduista Ribeksen lehdistä saadut BRV-partikkelit ensin konsentroitiin ja osit-15 tain puhdistettiin, kuten on kuvattu, 210 bp:n tuote saatiin suonenkatotautia sairastavan mustaherukkaisolaatin näytteistä Piikkiöstä (kaista 2, kuva IB) ja Parikkalasta (kaista 3, kuva Ib). Kuvissa la ja Ib ajetaan puskurikont-rollit kaistalla 1 ja terveet kasvinäytteet kaistalla 4.

20

Luotettavammin ja tehokkaammin 210 bp:n PCR-tuote todettiin Ribeksen lehdistä koko kauden aikana, kun käytettiin IC-RT-PCR:ää. Spesifinen tuote todettiin 10 sellaisen pellolla kasvatetun mustaherukan lehdistä, joita vaivasi suo-25 nenkatotaudin R-muoto, ja ne saatiin alun perin Maatalou-. . . den tutkimuskeskuksen Puutarhalaitokselta Piikkiöstä ja [ Parikkalasta (kuva 2a, kaistat 1-10) sekä myös 50 punkin • · « (Cecidophyopsis ribis) ryhmistä, jotka poimittiin näiden • · « • · · * mustaherukoiden äkämien vaivaamista silmuista (kuva 2a, 30 kaistat 11-12). Kuitenkin joissakin näissä määrityksissä : ** havaittiin vain hyvin vähän 210 bp:n PCR-tuotetta (kuva • · « * 2a, kaistat 5, 6, 9 ja 12) .

• ·

Infektion kytkeminen BRVzhen ja mustaherukan suonenkato-35 tautiin. Yrityksissä määrittää suonenkatotaudin liittyminen tämän 210 bp:n PCR-tuotteen toteamiseen käytettiin IC-' : RT-PCR:ää lehdillä, jotka olivat peräisin erilaisista sekä 101159 20 suonenkatotaudin vaivaamista että ilmeisen terveistä mustaherukoista. Suomalaista materiaalia tutkittaessa PCR-tuote todettiin lehtinäytteistä, jotka olivat peräisin: jokaisesta kahdesta pensaasta mustaherukkapensaslajiketta 5 Bija, Karila, Lepaan musta, Nikkala ja toisesta kahdesta lajikkeen Suont-musta pensaasta, jotka kasvavat HRS:n pellolla Piikkiössä ja joilla oli suonenkatotaudin R-muodon lehti- ja kukkaoireita (kuva 2b, kaistat 1-10), sekä kuudesta mustaherukkapensaasta, jotka kasvoivat yksityisissä 10 puutarhoissa Kaarinan lähellä Suomessa ja joilla oli suonenkatotaudin E-muodolle tyypillisiä lehti- ja kukkaoireita (kuva 2c, kaistat 2-7). Värjätyn PCR-tuotteen voimakkuus kuitenkin vaihteli kunkin kasvin näytteiden välillä sekä saman kasvin oksista otettujen näytteiden välillä, 15 mikä viittaa siihen, että viruskonsentraatio ja/tai sen jakautuminen kasveissa saattaa olla epätasaista (kuva 2b, c). Yhtään 210 bp:n vyöhykettä ei todettu kasvimäärityk-sissä, jotka tehtiin niistä puutarhoista olevista kasveista, joissa ei ollut suonenkatotaudin oireita (kuva 2c, 20 kaista 1).

Lisätutkimuksissa IC-RT-PCR-analyysi tehtiin kasveilla, jotka kasvoivat SCRI:n mustaherukan koepellolla Kasvin- suojelulaitoksella (IPP) Jokioisissa, joka oli perustettu 25 suonenkatotaudin aiheuttajan ja sen äkämäpunkkivektorin . . . leviämisen määrittämiseksi. Tutkitut kasvit istutettiin • « ] m'm punkittomina ja viruksettomina pistokkaina infektorimus- • · · taherukkapensaitten välille, joita äkämäpunkit vaivasivat *·* ja joilla oli suonenkatotaudin R-muodon lehti- ja kukkaoi- 30 reita.

• · • · • * · • · · : Kaikki tutkitut kasvit tartutettiin äkämäpunkeilla ja ne ♦ · osoittivat eri laajuisia suonenkatotaudin R-muodolle tyy pillisiä lehti- ja kukkaoireita. Jokaisesta Neosyp ja Ben 35 Tirran -lajikkeen 5 kasvista otetuissa satunnaisissa leh-tinäytteissä todettiin 210 bp:n tuote kaikissa muissa paitsi 2:ssa 10:stä näytteestä, joilla oli taudin R-muodon 101159 21 oireita, vaikkakin tuotteen voimakkuus vaihteli kunkin lajikkeen kasvien välillä (taulukko 1). Muut määritykset tehtiin satunnaisilla lehtinäytteillä, jotka olivat mustaherukoista (rekisteröimättömistä lajikkeista) 28 yksityi-5 sestä puutarhasta eri alueilta Etelä-Suomesta, joissa taudin E-muoto on vallitseva. 210 bp:n vyöhyke todettiin ll:ssä 15:stä näytteestä, joilla oli suonenkatotaudin E-muodon selviä oireita, mutta ei 13:ssa I4:stä sellaisesta kasvista, joilla ei ollut ilmeisiä suonenkatotaudin oirei-10 ta (taulukko 1). Hyvin pieni määrä tuotetta todettiin yhdessä kasvissa, joka oli ilmeisen vapaa suonenkatotaudin oireista (taulukko 1), mutta on mahdollista, että tämä aiheutui taudinaiheuttajan äskettäisestä tartunnasta, jolloin oireita ei vielä ollut kehittynyt.

15 TAULUKKO 1 IC-RT-PCR:n tulokset BRV:n toteamiseksi eri mustaherukka-materiaalilla, jossa osalla oli suonenkatotaudin oireita ja osalla ei. Mustaherukat kasvoivat pelloilla eri alueil-20 la Suomessa.

Näyte-nro. Sijainti Oireet PCR-tulokset I ΊΡΡ S + 25 2 *IPP S ++

:·. . 3 ΊΡΡ S

• · * 4 ΊΡΡ S ++ • · · « · · ::: 5 *ipp s ++ • # · 6 *IPP M +

30 7 ΊΡΡ M

• · : 8 *IPP M ++ « · · V ; 9 *IPP M + • · 10 ΊΡΡ s + II Forssa S +

35 12 Forssa O

13 Forssa 0 14 Forssa 0 101159 22 15 Forssa O -

16 Forssa O

17 Forssa O - 18 Forssa S ++

5 19 Forssa M

20 Forssa O

21 Forssa O -

22 Forssa M

23 Forssa O

10 24 Forssa M

25 Forssa O

26 Sorro O (+) 27 Sorro S ++ 2 8 Kustavi S ++ 15 29 Kustavi M (+) 30 Turku S ++ 31 Turku S ++

3 2 Turku S

3 3 Turku O

20 34 Turku S ++ 3 5 Turku S ++ 36 Turku S ++ 37 Turku S ++ 38 Nokia O - 25 _ • · t • Ψ [ l Näytteet 1-5 olivat Neosyp-lajiketta ja 6-10 Ben Tirran • · « ’** -lajiketta, jotka kasvoivat Kasvinsuojelulaitoksen (IPP) • · · ’·* * koekentällä Jokioisissa. Kasveissa oli suonenkatotaudin R- 30 muoto. Näytteet 11-38 olivat rekisteröimättömiä lajikkeita • · ! '·· alueilta, joissa suonenkatotaudin E-muoto oli vallitseva.

»«» • · · • · · • · O = Ei oireita; S = vakavia oireita; M = lieviä oireita.

- = PCR-tuotetta ei todettu; (+) = heikko PCR-tuote todet-35 tiin; + = PCR-tuote todettiin; ++ = todettiin voimakas PCR-tuote.

101159 23

Skotlannista saadut näytteet IC-RT-PCR:ään olivat sellaisten Ribes-kasvien laboratorioviljelmistä, jotka olivat joko infektoituja tai ei-infektoituja suonenkatotaudin aiheuttajalla, tai Ribeksestä tai Chenopodium quinoasta, joil-5 la oli tunnettuja Ribeksen virus- tai virustaudin kaltaisia tauteja. Näissä tutkimuksissa spesifinen 210 bp:n PCR-tuote oli läsnä vain niiden kasvien määrityksissä, joiden tiedettiin olevan suonenkatotaudin aiheuttajan (R- ja E-muodot) infektoimia (kuva 3a, kaistat 3, 4, 5 ja 6 sekä 10 kuva 3b, kaistat 7 ja 13). Tuotetta ei ollut virustesta-tuissa terveissä kasveissa kuudesta mustaherukkalajikkees-ta (kuva 3a, kaistat 1, 2, 7, 8, 9, 10 ja 11 sekä kuva 3b, kaista 12) eikä mustaherukoissa, jotka olivat infektoituneet luontaisesti tai varrentamalla Arabiksen mosaiikkine-15 poviruksella (ArMV; kuva 3b, kaistat 14 ja 15), tai mustaherukan keltalehtisyystaudin (yellows) aiheuttajilla (kaistat 6 ja 8), infektiivisellä muunnoksella (kaista 10) tai karviaismarjan lehtisuonia yhdistävällä taudilla (veinbanding) (kaistat 9 ja 11). 210 bp:n tuotetta ei 20 myöskään tavattu sellaisten nukleiinihappouutteiden IC-RT-PCR:n jälkeen, jotka olivat peräisin C. guinoa -kasveista, jotka oli infektoitu joko ArMV:llä (2 isolaattia, kaistat 2 ja 5), vadelman rengaslaikku- (skotlantilainen kanta, kaista 3) tai mansikan latentilla rengaslaikku- (skotlan-25 tilainen kanta) -nepoviruksilla (kaista 1) (kuva 3b). 210 ... bp:n tuote todettiin myös tutkimuksissa, jotka tehtiin • · . .·. kolmella Ben Nevis -mustaherukkakasvilla ja kahdella kas- • · « ϊ·\ villa molempia lajikkeita Ben Lomond ja Ben More, jotka • · < oli tartutettu 4 vuotta aikaisemmin äkämäpunkeilla, jotka 30 olivat peräisin mustaherukkapensaasta, jolla oli suonenka- • · • '* totaudin E-muodon oireita, ja jota kasvatettiin lämmite- • · · *.* * tyssä kasvihuoneessa. Kuitenkin vain kolmella Ben Nevis ·*- r -kasvilla oli selviä suonenkatotaudin oireita, mutta nämä .... ilmenivät vasta neljäntenä vuonna punkkitartunnan jälkeen.

35 Epäilemättä sen vuoksi punkki levitti BRV:n kaikkiin 7 kasviin. Punkit levittivät myös suonenkatotaudin aiheutta- * jaa ainakin Ben Nevis -kasveihin. Suonenkatotaudin oirei- 101159 24 den puuttuminen kahdesta muusta lajikkeesta saattaa mahdollisesti johtua tunnetusta viiveestä suonenkatotaudin ilmenemisessä ymppäämisen jälkeen (3), ja tätä viivettä vahvisti käytetyn ympin vähäinen määrä (punkit verrattuna 5 varrentamisymppäykseen) sekä lämpimät olosuhteet, joissa kasveja sittemmin pidettiin.

IC-RT-PCR:llä todettiin 210 bp:n tuote myös kaikissa Uu-desta-Seelannista saaduista suonenkatotaudin vaivaamista 10 mustaherukkanäytteistä, olipa niillä sitten lieviä tai vakavia oireita (kuva 4, kaistat 2 ja 3), mutta terveiltä kasveilta tuotetta ei todettu (kuva 4, kaistat 1 ja 4).

Kuvan 4 kaistalla 5 esitetään positiivinen kontrollinäyte, joka on suonenkatotaudin infektoimasta mustaherukasta 15 Suomesta.

• · • · · • · · • · · • · · • · » • · « • 1 • · • · ·

• M

• · · • · · · • · · • · · « « 101159 25

KIRJALLISUUSVIITTEET

1. Jones, A. T. 1993. Defining the problem: Reversion disease and eriophyid mite vectors in Europe. Proceedings 5 of the Risk Assessment Workshop, 17-18 August 1992> Corvallis, Oregon, USA, pp. 1-4.

2. Jones, A. T. 1995. Recent developments affecting the control of two important diseases of small fruit crops in 10 the UK. Acta Hortic. 385: 64-69.

3. Adams, A. N., ja Thresh, J. M. 1987. Reversion of blackcurrant. Pages 133-136 in: Virus Diseases of Small Fruit-s. R. H. Converse, ed. USDA Agriculture Handbook No. 631.

15 4. Bremer, K., ja Heikinheimo, O. 1980. Problems of the reversion disease of Ribes in Finland. Acta Hortic. 95: 87-91.

20 5. Jones, A. T. 1992. Appendix I. Recommended indexing procedures for detecting viruses, viroids, mycoplasma- and rickettsia-like organisms and virus-like diseases in small fruit crops: Currants and Gooseberries (Ribes). Acta Hortic. 308: 51-154.

25 . . 6. Nolasco, G.. de Bias, C., Torres, V., ja Ponz, F. 1993.

·.·,! A method combining immunocapture and PCR amplification in :T: a microtitre plate for detection of plant viruses and subviral pathogens. J. Virol. Methods 45: 201-218.

:·. 30 • · · 7. Erlich, H. A., Gelfand, D., ja Sninsky, J. J. 1991.

• t · *· Recent advances in the polymerase chain reaction. Science : 252: 1643 - 1651.

35 8. Frison, E. A., ja Stace-Smith, R. 1992. Cross-reacting and heterospecific monoclonal antibodies produced against arabis mosaic virus. J. Gen. Virol. 73: 2525-2530.

101159 26 9. Laeitimli, U. K. 1970. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4. Nature (London) 227: 680-685.

5 10. Sambrook, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T. (1989).

Molecular Cloning. A laboratory Manual, 2nd edn. New York: Cold Spring Harbor Laboratory.

10 • · • · · * · · • · · • · · * » » • 1 · • · • t • · .

• « · • · · • · · · • · · • · · 101159 27

SEKVENSSILISTAUS

(1) YLEISET TIEDOT: (i) HAKIJA: (A) NIMI: Oy AboaTech Ab

(B) KATU: Tykistökatu 4 A

(C) KAUPUNKI: Turku (E) MAA: Suomi (F) POSTINUMERO (ZIP): 20520 (ii) KEKSINNÖN NIMITYS: Menetelmä ja pakkaus mustaherukan suonenkatotaudin diagnosoimiseksi (iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 4 (iv) KONEKOODIMUOTO: (A) VÄLINETYYPPI: Levyke (B) TIETOKONE: IBM PC-yhteensopiva

(C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PC-DOS/MS-DOS

(D) OHJELMISTO: Patentin julkaisulupa #1.0, versio #1.25 (EPO) (2) SEKVENSSIN ID NO: 1 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 1280 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: genominen RNA muunnettu DNA:ksi (vi) ALKUPERÄ: (A) ORGANISMI: BRV (Blackcurrant reversion virus) • · : (ix) ominaispiirre: II! (A) NIMI/selitys: muu piirre : (B) SIJAINTI: 168..170 (D) MUU INFORMATION: /huomautus= "5'-päässä oletetun ORF:n TAC-lopetuskodoni" • « • ·< « « · V ; (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO: 1: • · • · · TTGGCTATGG CCACGATGTG AATCATGGAG TAACGCACCA TGAGTCCCCC GATAATTCGG 60 TCCCAAGAGA CTACACTTGG GTTGAAAATG ATGGTAAACC ATCCGTATGG GTCTATGCTC 120 ATATGTTAAG AGTTGTCTTA CTGTATATGG CTTCTACATA AGGTCGGTAC CCCTGAAATA 180 GGGATCCTGT TCGCTTGCGT GGTTGTAGGA GTGCTAAGTA TAGTTGCAAC ATAAATATGA 240 28 101159 CTTGGGAGAC AAAGTCTCAT CCACCTTGGA ACCGCACAGG GATATAACTC AAAGCGGAAT 300 GGTAGTAAAC TACTTGCCCT ATCAGTAGGG ATGGGAACGC TCATTATTAG CAAACCCTTA 360 CCCTGAACAT TAGGTGCTTC AGCAATATGA GGCGAAAGAC TAGGGAGAAA GTTCCTATGG 420 ACGTGTAATT CGTCCACTCG AGATGGGAGT CATGCCATCG TGTTATCTTA TTTTCTTGTA 480 TTGTATTTCA ATTTCAAAGA AAGTTGCTGG ATCTAAACCA GACCCAGGTG AGTGGACCTT 540 CTGCGTCCAC TCGGTTTGGT ATTTTACGAT TAAATACCCA GGTCTACTGC TTCCGAGCCT 600 GATAAAATCT TAAAGCGCCA TCGTTCAGTA CTTGCTGGCA TGGTGACCTG AGTGATGATG 660 CTTTATGAAT CATCCAATAG TTTCTTTGTT TCTATTTCTG GGAAATCCTT TTGGAGAGTG 720 CCCATGAGAA TAATGAAGCG TTTAGTACAC GATATAGTAC TATCTCTGTT CCAGGAGATT 780 GTGCCGGAAA TATAGTCGAT CATTTTATGA TCAAGGTATT TCTGGATGGG CTCGTTGCGA 840 AGAGTTTTCG CTCAAGGTTC ACATGACTGT AAATTGTAAG TGTACTCAAG ATGTTTCTAG 900 TCTAGGCAAC TAGATGCATT GGATGAGGTC CCGATTGATA CGGGGGGATA ATTAATCCCA 960 GCTTACGGTG TGTGCCGACT TATATGGAAG TGTCCATATC GCATTTTGCT TGTTTTTAGA 1020 CATAAATAAG CACTCTTTAC GCGTGTAATA CGCTGGTGTC TCATTATATA CTAGCGTTGC 1080 AGCGCTAGGA CTACCTAAGA CAACCGTATT ATACGTTTGC TTTATTTATT TTTGTTACTC 1140 CTGTTTAGCA GGTCGTGCCT TCAGTAAGCA CACAAAAATA TTTTCCATTT TTAGGTTTTG 1200 GTTAAGAGTC ATTTTATTGA GCACTTTTCT TTTAGAGAAT AGAGTCTGAA ATGTCCTTTC 1260 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1280 (2) SEKVENSSIN ID NO: 2 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 230 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen .. (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · • · · (ii) MOLEKYYLITYYPPI: genominen RNA muunnettu DNA:ksi • · · .·* . (vi) ALKUPERÄ: : (A) ORGANISMI: BRV (Blackcurrant reversion virus) ‘ (Xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO: 2: 101159 29 CGCTGGTGTC TCATTATATA CTAGCGTTGC AGCGCTAGGA CTACCTAAGA CAACCGTATT 60 ATACGTTTGC TTTATTTATT TTTGTTACTC CTGTTTAGCA GGTCGTGCCT TCAGTAAGCA 120 CACAAAAATA TTTTCCATTT TTAGGTTTTG GTTAAGAGTC ATTTTATTGA GCACTTTTCT 180 TTTAGAGAAT AGAGTCTGAA ATGTCCTTTC AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 230 (2) SEKVENSSIN ID NO: 3 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 15 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (synteettinen) (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: muu piirre (B) SIJAINTI: 1..15 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "aluke 1» (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO: 3: GAAAGGACAT TTCAG 15 (2) SEKVENSSIN ID NO: 4 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: * : (A) PITUUS: 12 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksi juosteinen *·1 1 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (synteettinen) • · • «o » · • · · ' ·) 1 (ix) OMINAISPIIRRE: .·[ : (A) NIMI/SELITYS: muu piirre ’ “ (B) SIJAINTI: 1..12 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "aluke 2" (Xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO: 4: CGCTGGTGTC TC 12

Claims (14)

101159

1. Menetelmä mustaherukan suonenkatotaudin diagnosoimiseksi kasvissa toteamalla siinä mustaherukan suonenkato- 5 virus (BRV, Blackcurrant Reversion Virus), joka menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: - tutkittavasta kasvista otetaan näyte, - näytteellä tehdään käänteinen transkriptioreaktio yksijuosteisen cDNA:n valmistamiseksi näytteessä ole- 10 vasta viruksen RNA:sta käyttäen viruksen RNA-sekvens- sistä johdettua oligonukleotidialuketta, joka on komplementaarinen viruksen RNA:n nukleotidisekvens-sille, - cDNA monistetaan polymeraasiketjureaktiolla käyttä- 15 en paria oligonukleotidialukkeita, joista toinen on viruksen RNA-sekvenssistä johdettu oligonukleotidi-aluke, joka on komplementaarinen viruksen RNA:n ensimmäiselle nukleotidisekvenssifragmentille, ja toinen on mainitun viruksen RNA:sta johdettu oligonuk-20 leotidialuke, joka vastaa viruksen RNA:n toista nuk- leotidisekvenssifragmenttia, joka on eri kuin mainittu ensimmäinen nukleotidisekvenssifragmentti, ja mainitut ensimmäinen ja toinen nukleotidisekvenssifragmentti reunustavat monistettavaa nukleotidisekvens-25 siä, ja . - todetaan monistettu tuote. • « · ♦ ♦ · • « · • · · • · t

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu .. siitä, että näyte on kasvista saatu uute. • t

• »· • · « '·' 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että näyte sisältää BRV-partikkeleita.

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnet-’ ‘ 35 tu siitä, että ennen käänteistä transkriptioreaktiota suo ritetaan immunokaappaus, jossa näyte saatetaan kosketuk- 101159 seen kantajalle immobilisoidun BRV:n vasta-aineen kanssa, minkä jälkeen kiinni jääneet viruspartikkelit hajotetaan.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu sii-5 tä, että monistetun tuotteen toteamiseen käytetään elektroforeesia.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polymeraasiketjureaktio suoritetaan Mhot-start"- 10 menetelmällä.

7. Diagnostinen testipakkaus mustaherukan suonenkatotaudin diagnosoimiseksi kasvissa käyttäen käänteistranskriptaasi-polymeraasiketjureaktiota (RT-PCR) mustaherukan suonenka- 15 toviruksen (BRV, Blackcurrant Reversion Virus) toteamiseksi kasvissa, joka pakkaus sisältää - BRV:n vasta-aineen tai BRV:n vasta-aineella päällystetyn substraatin ja - RT-PCR:ää varten parin BRV:n RNA:sta johdettuja oligo-20 nukleotidialukkeita sellaisen cDNA-fragmentin monistamiseksi, joka on komplementaarinen BRV:n RNA:lle.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen pakkaus, tunnettu siitä, että oligonukleotidialukkeet suunnitellaan sellaisen DNA- 25 fragmentin monistamiseksi, joka on komplementaarinen vi- . . ruksen RNA:n 3'-proksimaaliselle 210 bp:n fragmentille. • · · • · · • · «

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen pakkaus, tunnettu siitä, että 3'-proksimaalisella 210 bp:n fragmentilla on nukleo- 30 tidisekvenssi 1-210, joka kuvataan SEKV. ID. N0:2:ssa. * · * « • « · • · « • · ·

10. Oligonukleotidialuke sellaisen cDNA-fragmentin monis- • · ·.*·: tamiseen, joka on komplementaarinen BRV:n (Blackcurrant Reversion Virus) RNA-fragmentille. 35 i<<>;

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen oligonukleotidialuke sellaisen cDNA-fragmentin monistamiseen, joka on komple- 101159 mentaarinen viruksen RNA:n 3'-proksimaaliselle 210 bp:n fragmentille.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen oligonukleotidialuke, 5 jolla on DNA-sekvenssi 5' GAAAGGACATTTCAG 3',

13. Patenttivaatimuksen 11 mukainen oligonukleotidialuke, jolla on DNA-sekvenssi 5· CGCTGGTGTCTC 3'.

14. Mustaherukan suonenkatovirukselle BRV (Blackcurrant Reversion Virus) tuotettu vasta-aine. 15