KR100840736B1 - 감자걀쪽바이로이드 진단용 프라이머 - Google Patents

Abstract

본 발명은 감자걀쪽바이로이드(Potato spindle tuber viroid: PSTVd) 진단용 특이 프라이머에 관한 것이다.

본 발명의 프라이머는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 센스와 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 안티센스로 이루어지는 프라이머로서, 본 발명의 감자걀쪽바이로이드 진단용 특이 프라이머를 이용하면 조직배양 묘나 양액재배와 같은 작은 양의 시료에서도 감자걀쪽바이로이드 감염여부를 신속하게 진단할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머를 이용하면 감자의 다른 주요 바이러스와 비특이적 반응이 나타나지 않아 정확하게 감자걀쪽바이로이드를 진단할 수 있다.

감자걀쪽바이로이드, 프라이머, RT-PCR

Description

감자걀쪽바이로이드 진단용 프라이머{SPECIFIC PRIMERS FOR DETECTION OF POTATO SPINDLE TURBER VIROIL}

도 1은 본 발명의 감자걀쪽바이로이드 진단용 프라이머의 위치를 나타내는 도.

도 2는 설계된 조합 프라이머들에 의한 RT-PCR 결과를 나타내는 도.

도 3은 조합 프라이머들의 어닐링 온도에 따른 RT-PCR 결과를 나타내는 도.

도 4는 본 발명의 프라이머를 이용한 RT-PCR 결과를 나타내는 도.

본 발명은 감자걀쪽바이로이드(Potato spindle tuber viroid: PSTVd) 진단용 특이 프라이머에 관한 것이다.

감자걀쪽바이로이드는 육안으로 병징을 구별하기 어렵고 감자 괴경이 길쭉하게 길어지게 되는데, 이 감자걀쪽바이로이드에 감염되면 감자 생산량이 크게 감소되어 수확량이 65% 이상 감소되는 것으로 알려져 있다.

일반적으로 바이러스 진단을 위해서는 혈청학적 방법과 핵산진단 방법이 사용되고 있다.

감자걀쪽바이로이드는 RNA 핵산으로만 구성되어 있어 혈청학적 방법으로는 진단이 어렵다. 핵산진단 방법으로 보편화되어 있는 역전사 연쇄중합반응(Reverse Transcriptase Ploymerase Chain Reaction: RT-PCR) 방법을 이용하기 위해서는 프라이머를 제작하여야 한다.

따라서, 본 발명의 발명자들은 감자걀쪽바이로이드를 신속하고 정확하게 특이적으로 진단할 수 있는 진단용 프라이머를 개발하였다.

본 발명의 목적은 감자걀쪽바이로이드 진단을 위하여 특이 프라이머를 제공하는 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 감자걀쪽바이로이드와 관련하여 지금까지 보고된 모든 계통의 유전정보를 분석하였다.

본 발명에서는, 5' 말단에서 3개, 3' 말단에서 3개의 프라이머를 설계하고, 설계된 프라이머의 모든 조합들을 작성하여 최적의 프라이머를 선발하였다. 또한, 프라이머로서 조건을 충족하는 부분을 탐색하여 어닐링(annealing) 온도 차이가 5℃ 범위에 있도록 설계하였다.

본 발명에서 선발된 프라이머는, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 센스(PSTVdF)와 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 센스(PSTVdR)로 구성되는 감자걀쪽바이로이드 진단용 프라이머이다.

[서열번호 1] PSTVdF : 5'-GAACTAAACTCGTGGTTCCTGT-3'

[서열번호 2] PSTVdR : 5'-GTTCCAAGGGCTAAACACCCT-3'

본 발명의 프라이머를 이용하여 조직배양묘, 감자 괴경, 감자 잎을 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 하면 모두 강한 반응을 보이며 다른 감자의 주요 바이러스와 비특이반응도 나타나지 않는다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 프라이머 설계와 선발 및 RT-PCR 반응에 대하여 구체적으로 살펴본다.

< 실시예 1> 프라이머 설계 및 선발

1. 감자걀쪽바이로이드 진단에 사용할 수 있는 프라이머를 선발하기 위하여 도 1에 도시되어 있는 것과 같이 6개의 프라이머를 설계하였다. 설계한 프라이머의 염기서열 및 위치는 표 1과 같다.

[표 1]프라이머의 염기서열 및 위치

2. 각각의 프라이머를 표 2의 9개 조합으로 구성하여 RT-PCR을 실시하였다. RT-PCR시 어닐링 온도는 55℃로 하였다. 그 결과, 도 2에 도시되어 있는 바와 같이, PSTVdF + PSTVdR 조합의 프라이머(1)와 PSTVdF + PSTVdFuR 조합의 프라이머(2) 에서 다른 밴드가 나타나지 않았다. 다이머(dimer)의 형성이 PSTVdF+ PSTVdR 조합의 프라이머(1)에서 가장 약하게 나타났다.

[표 2]프라이머 조합 구성표

3. PSTVdF + PSTVdR 조합의 프라이머(1)와 PSTVdF + PSTVdFuR 조합의 프라이머(2)의 어닐링 온도에 의한 변화를 조사하기 위하여, 어닐링 온도를 50℃에서 61℃까지 각각 1℃씩 12 단계로 증가시켰다. 그 결과, 도 3에 도시되어 있는 바와 같이, 모두 강한 밴드를 형성하였다. 그러나 온도가 상승할수록 다이머 형성이 많이 나타남을 알 수 있었고, PSTVdF + PSTVdFuR 조합의 프라이머는 60℃ 이후로 밴드가 약하게 나타났다. 따라서, PSTVdF+ PSTVdR 조합의 프라이머(1)가 가장 적합한 것으로 판단되었고 어닐링 온도로는 50℃가 가장 좋았다.

< 실시예 2> RT - PCR

가. 핵산분리

1. 0.1g 식물체조직(감자괴경)을 냉장 보관된 2X STE buffer 600㎕, 10% SDS 100㎕, 메르캅토에탄올 20㎕을 넣고 막자(pestle)를 이용하여 E-튜브에서 마쇄하였다. STE(5.86g NaCl, 1.22g Tris, 0.38g EDTA, 전체 1,000㎖ H₂O)

2. 페놀(phenol), 클로로포름(chloroform), 이소아밀알코올(isoamylalcohol)을 25:24:1로 혼합한 혼합액 700㎕을 상기 E-튜브에 넣고 5분간 심하게 흔들었다.

3. 10,000g에서 20분간 원심분리 후 상층액 600㎕을 새로운 E-튜브로 옮긴 후 95% 냉동 에탄올 115㎕ 넣고 잘 흔들어 시료를 제조하였다.

4. CF-11 컬럼에 16.0중량% 에탄올이 첨감된 STE 완충용액으로 1회 세척한 후 앞서 제조된 시료를 컬럼에 넣었다.

5. 상기 컬럼을, 16.0중량% 에탄올이 첨감된 STE 완충용액으로 600㎕씩 7~9회 진공세척한 후 10,000g에서 2분간 원심분리하여 건조하였다.

6. 50㎕ 멸균된 증류수를 넣고 10,000g에서 1분간 원심분리하여 핵산을 추출하였다.

나. RT-PCR 및 결과 확인

CF-11 컬럼에서 분리한 핵산을 원스텝(one-step) RT-PCR 방법으로 검정하였다. One-step premix(intron) 효소 8㎕, 분리한 핵산 2㎕, 센스 프라이머(sense primer)(10 pM) 1㎕, 안티센스 프라이머(antisense prime)(10 pM) 1㎕, 증류수 8㎕을 넣어 전체가 20㎕가 되도록 조성하였다. RT-PCR 반응으로 먼저 45℃에서 30분간 역전사 반응을 하고 이어 94℃에서 4분간 역전사 효소를 제거한 후 94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 60초 반응을 35회 반복한 후 72℃ 5분간 처리한 후 다음 단계까지 4℃에서 유지되게 하였다. RT-PCR 반응이 완료된 후 1% 아가로오스 겔(agarose gel)에 100V에서 30분간 전기영동하여 그 결과를 U.V. 등에서 확인하였다.

<실시예 3> 비특이 반응 조사

본 발명의 프라이머가 감자의 주요 바이러스와 비특이 반응을 하는지 확인하기 위하여, 감자걀쪽바이로이드(1), 감자Y바이러스(PVY)(2), 감자잎말림바이러스(PLRV)(3), 감자X바이러스(PVX)(4), 감자S바이러스(PVS)(5)에 각각 감염된 감자를 실시예 1에서 선발된 PSTVdF + PSTVdR 조합의 프라이머를 이용하여 RT-PCR 반응을 실시하였다. 참고로 건전 감자(6)를 이용하여 RT-PCR 반응을 행하였다.

도 4에 도시된 바와 같이, 감자걀쪽바이로이드에서만이 밴드를 형성하였고 나머지 감자의 주요 바이러스에서는 반응을 나타내지 않아 감자걀쪽바이로이드 외에는 비특이 반응이 일어나지 않음을 확인할 수 있었다.

이상에서 본 발명의 구체예가 제시되어 있지만 본 발명이 상기에 한정되는 것은 아니며 본 발명의 기술 사상 범위 내에서 다양하게 변형 가능하고 이러한 변형은 하기한 본 발명의 청구범위에 속한다 할 것이다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 감자걀쪽바이로이드 진단용 특이 프라이머를 이용하면 조직배양 묘나 양액재배와 같은 작은 양의 시료에서도 감자걀쪽바이로이드 감염여부 진단이 가능하며 진단 소요 시간도 4시간 이내로 신속하게 진단할 수 있다.

또한, 본 발명의 프라이머를 이용하면 감자의 다른 주요 바이러스와 비특이적 반응이 나타나지 않아 정확하게 감자걀쪽바이로이드를 진단할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (1)

1. 서열번호 1의 PSTVdF와 서열번호 2의 PSTVdR로 구성되는 감자걀쪽바이로이드(PSTVd) 진단용 프라이머.

Images