JP2010539956A - 核酸増幅 - Google Patents
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- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Abstract
Description
(i)少なくとも1つの促進因子オリゴヌクレオチドであって、促進因子オリゴヌクレオチドからの3'伸長がブロックされるように、その3'末端にまたはその近くに少なくとも1つの修飾を含む促進因子オリゴヌクレオチド、および
(ii)2つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーであって、これらのうちの少なくとも1つが、修飾の存在により相補鎖合成が早期に終結するように修飾された開始因子プライマーであるオリゴヌクレオチドプライマーと接触させるステップであって、
促進因子オリゴヌクレオチドおよび開始因子プライマーが、鋳型核酸分子の実質的に同じまたは隣接する領域に結合し、促進因子オリゴヌクレオチドが、開始因子プライマーの結合位置に対して3'側に、標的配列に相補的な配列をさらに含むステップと、
特異的な標的配列が選択的に増幅されるように、熱サイクルの酵素的増幅を実行するステップと
を含む方法が提供される。
(a)鋳型核酸分子を変性させるステップと、
(b)変性した鋳型核酸分子を少なくとも1つの開始因子プライマーと接触させ、それから第2の鎖合成を開始し、それによって、新しく合成された鎖に開始因子プライマーからの修飾を導入するステップと、
(c)そのように生成された二本鎖分子を変性させて、開始因子プライマーが結合する標的ヌクレオチド配列の反対の端に位置するプライマーからの逆方向の鎖合成を開始し、それによって、逆方向の鎖合成が、ステップ(b)において導入された修飾により、早期に終結するステップと、
(d)新しく合成された二本鎖分子を変性させて、ステップ(c)において生成された不完全な逆方向の鎖に促進因子オリゴヌクレオチドを結合し、それから鎖伸長を開始して、それによって逆方向の鎖を完成させるステップと、
(e)1回または複数回のさらなるサイクルでステップ(a)〜(d)を任意選択で反復するステップと
を含んでいてもよい。
核酸分子(「鋳型」分子)を、
(i)少なくとも1つの促進因子オリゴヌクレオチドであって、促進因子オリゴヌクレオチドからの3'伸長がブロックされるように、その3'末端にまたはその近くに少なくとも1つの修飾を含む促進因子オリゴヌクレオチド、および
(ii)2つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーであって、これらのうちの少なくとも1つが、修飾の存在により相補鎖合成が早期に終結するように修飾された開始因子プライマーであるオリゴヌクレオチドプライマーと接触させるステップであって、
促進因子オリゴヌクレオチドおよび開始因子プライマーが、鋳型核酸分子の実質的に同じまたは隣接する領域に結合し、促進因子オリゴヌクレオチドが、開始因子プライマーの結合位置に対して3'側に、標的配列に相補的な3'配列をさらに含み、前記3'配列は、対応する非変異配列へではなく、変異配列を含む標的ヌクレオチド配列への促進因子オリゴヌクレオチドの優先的な結合を可能にするステップと、
特異的な標的配列が選択的に増幅されるように、熱サイクルの酵素的増幅を実行するステップと、
増幅された産物のヌクレオチド配列を非変異標的配列に対応する配列と比較して、変異ヌクレオチド配列を検出するステップと
を含む方法を提供する。
核酸分子(「鋳型」分子)を、
(i)少なくとも1つの促進因子オリゴヌクレオチドであって、促進因子オリゴヌクレオチドからの3'伸長がブロックされるように、その3'末端にまたはその近くに少なくとも1つの修飾を含む促進因子オリゴヌクレオチド、および
(ii)少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマーであって、これらのうちの少なくとも1つが、修飾の存在により相補鎖合成が早期に終結するように修飾された開始因子プライマーであるオリゴヌクレオチドプライマーと接触させるステップであって、
促進因子オリゴヌクレオチドおよび開始因子プライマーが、鋳型核酸分子の実質的に同じまたは隣接する領域に結合し、促進因子オリゴヌクレオチドが、開始因子プライマーの結合位置に対して3'側に、標的配列に相補的な配列をさらに含むステップと、
特異的な標的配列が選択的に増幅されるように、熱サイクルの酵素的増幅を実行するステップと
を含む方法を提供する。
方法および材料
修飾オリゴヌクレオチドプライマー
プライマー伸長を終結させるプライマー修飾の例は、以下のとおりとする:2'-Oメチルヌクレオチド-小文字(たとえば、2'Oメチルウリジンについてはu)、イノシン-I、脱塩基部位-△、および/または+ddG-ターミナルトランスフェラーゼを使用してオリゴヌクレオチドの端に付加されたジデオキシグアノシン。脱塩基部位は、オリゴヌクレオチド合成の間のd-スペーサーの組み込みまたはデオキシウリジンのいずれかによって含めた。後者の場合において、ウラシルは、37℃で2時間、200μLのTEX緩衝液(10mM Tris HCl、0.1mM EDTA、0.01%Triton-X 100)において、4ユニットのウラシルDNAグリコシラーゼ(New England Biolabs)を用いて、5μM(つまり1nmole)でオリゴヌクレオチドを処理することによって、脱塩基部位に変換した。
ヌクレオチド標的配列鋳型は、標的領域に対応する合成単鎖核酸分子から調製した。標準的なPCR増幅は、二本鎖標的配列鋳型を増幅し、生成するために使用した。増幅産物は、その後、10,000分の1に希釈し、標的領域鋳型としてHDCR増幅に使用した。
HDCRの標準的な条件(25μl中)は、以下のとおりに行った:それぞれの実施例において明示されるオリゴヌクレオチド濃度およびサイクリング条件と共に1×Platinum Taq緩衝液[20mM Tris-HCl(pH8.4)および50mM KCl]、4mM MgCl2、0.2mMのそれぞれのdNTP、1/25,000希釈のSYBR Green、およびInvitrogenからの0.5U Platinum Taq DNAポリメラーゼ(ホットスタート)。
増幅の成功のための開始因子プライマーおよび促進因子オリゴヌクレオチドに対する依存性
本実施例は、本発明の実施形態に従うHDCR増幅技術が、開始因子プライマーおよび促進因子オリゴヌクレオチドの両方の存在に依存することを実証する。
HDCR方法論を用いる選択的増幅
本実施例は、単一の塩基対が異なる核酸鋳型から選択的増幅を達成することが可能であることを実証する。図4において示される配列の中央領域は、v-rafマウス肉腫ウイルス癌遺伝子相同体B1(BRAF)遺伝子の配列の一部に相当する。下線を引いた塩基は、正常配列(NORB)と比較した、共通の発癌性のTからAへの突然変異V600E(MUTB配列)の場所を示す。外側配列は、使用されるオリゴヌクレオチドプライマーとマッチする。図5において示されるように、順方向開始因子プライマーBRF2は、その3'端から7塩基目に脱塩基部位を含有する。促進因子オリゴヌクレオチドBFol3の3'端は、標的DNAに対して6つのミスマッチを含有し、その伸長を阻止するためにジデオキシGTPによって終結させている。促進因子オリゴヌクレオチドは、突然変異配列と正確にマッチする、BRF2プライマーに隣接する19個の塩基領域を含有するが、正常BRAF配列に対して単一の塩基ミスマッチを含有する(ギャップに下線を引いている)。促進因子オリゴヌクレオチドはまた、促進因子オリゴヌクレオチド/伸長した逆方向鎖二重鎖の安定性を低下させるために、開始因子プライマーと等価な領域において、いくつかのグアニンの代わりにイノシンをも含有する(図5を参照されたい)。
HDCR方法論を使用する選択的増幅および増幅効率の改善
本実施例は、重亜硫酸処理の後に差次的にメチル化されたDNAの選択的増幅にHDCR増幅を使用するための可能性および逆方向鎖の2ステップの合成の効率を改善するための、温度サイクリングにおける中間の加熱ステップの利点の両方を実証する。図7は、重亜硫酸処理の後の、hMLH1遺伝子の領域の重亜硫酸処理から産生した配列を模倣する中央領域(下線を引く)を用いて調製した異なる核酸配列鋳型を示す。両方の配列には、オリゴヌクレオチドプライマー結合のための同じ配列が隣接する。鋳型Mは、CpGジヌクレオチドのシトシンが重亜硫酸処理の後にCとして残存するメチル化DNAを模倣する。鋳型Uは、シトシンがすべて、ウラシル(続いて増幅の後にT)に変換される非メチル化DNAを模倣する。核酸鋳型は、PCRによって調製し、HDCR反応増幅への添加のために1:100に希釈した。開始因子プライマー、促進因子オリゴヌクレオチド、および逆方向プライマーCommR2Gの配列は、図8に示す。
共通の外側プライミング部位の組み込みのためのHDCR
本実施例は、有効な多重化システムを組み立てるために、どのようにHDCRを使用することができるのかを実証する。選択的な増幅は、別個の管において実行したが、同じ「外側」プライマーは両方の反応に使用した。本研究のために選んだ2つのCpGアイランドは、それらが、結腸直腸癌などの多くの癌において過剰メチル化されるようになるので、癌研究において興味深いが、血液を含む正常組織からのDNAにおいて非メチル化のままである。図10は、TMEFF2およびhMLH1のCpGアイランド内の標的配列領域(それぞれ、hg18 chr2:192,767,556〜192,767,775(鎖)およびhg18 chr3:37,010,130〜37,010,262)ならびに重亜硫酸処理メチル化DNAに由来する配列と比べた、プライマーおよび促進因子オリゴヌクレオチドの配置を示す。
250nM TMEFInL1 TTTTTAGAGTTTTTTTTTTATGGTAGTΔGTTTTT
250nM TMEFInR1 CCRAACAACRAACTACTAAΔCATCCC
40nM TMEFLdS170
TGGCCCGTCGCCGTCCCTCTGTTTTGCTGTΔTTTCGCGTTTTCGGCAA ddG
40nM TMEFRdS133
CACACGTCGCTCGGGCCTGTGTTCTTGTCAΔCCCGCGAACGACGGA ddG
500nM MCD6 TGG555GT5G55GT555T5TGΔTTTGCT
500nM MCD4 CA5A5GT5G5T5GGG55TGTGΔTCTTGT
100nM TPEFMC HEX-AAATTTTCGAGATTATGCGCGGGT TAMRA
とした。
250nM MLHInit2 AATGTTATTAAAGAGATGATTGAGAΔTTGGTA
250nM MLHInit1 CTATACATACCTCTACCCRAACAΔAAAAAC
40nM 131hMLHFoldS2
CACACGTCGCTCGGGCCTGTGTTCTTGTAAAAΔCGTATCCGCGCCAGG-ddG
40nM RMLH170
TGGCCCGTCGCCGTCCCTCTGTTTTGCTTTGΔTACGGAGGGAGTCGCC-ddG
500nM MCD6 TGG555GT5G55GT555T5TGΔTTTGCT
500nM MCD4 CA5A5GT5G5T5GGG55TGTGΔTCTTGT
100nM hMLH HEX-ACGCGACCCGTTAAATCGTAACCCT BHQ1
とし、
ここで、△=d-スペーサー、5=メチルシトシン、ddG=ターミナルトランスフェラーゼを使用して導入したジデオキシグアノシン、R=AおよびGの混合物、HEX=ヘキサクロロ-6-カルボキシフルオレスセイン、TAMRA=6-カルボキシテトラメチルローダミン、BHQ1=Black Hole Quencher1とする。下線を引いた塩基=付加したddGと共に伸長を低下させ、または排除するミスマッチ。
HDCRのオリゴヌクレオチド依存性
hMLH1標的を使用する本実施例は、3つすべてのオリゴヌクレオチド(標的の一方の端のみを考慮する)がHDCRに必要とされることを示す。緩衝液およびサイクリング条件は、前の実施例においてhMLH1に使用したものと同じとしたが、この場合において、反応はすべて、1ナノグラムの重亜硫酸変換Ssslメチル化DNA(M)を含有した。複製反応のうちのいくつかは、HDCRの成功のためのそのオリゴヌクレオチドの必要性を確立するために特定のオリゴヌクレオチドを欠いた。HEX(加水分解プローブ)およびSYBR Greenの両方は、50サイクル分を含有する段階の間に60℃のステップで読み取った。結果を図12に示す。加水分解プローブおよびSYBR Greenを使用して得た曲線の間で差異はほとんどなく、hMLH1標的が特異的に増幅されたことを示唆した。試験したオリゴヌクレオチドの3つすべてが存在した場合、増幅は、サイクル20の直後に最初に検出された。開始因子のうちの1つであるMLHInit2を反応から抜いた場合、増幅は、反応のうちの1つについて、サイクル35の後に検出することができたにすぎなかった。他の複製反応において、増幅は検出されなかった。促進因子オリゴヌクレオチドRMLH170または外側依存的プライマーMCD6のいずれかを抜くと、非常に遅い増幅がもたらされた。これは、HDCRの成功が、3つすべてのオリゴヌクレオチドの包含に依存することを示す。標的の他端を対象とする、対応するオリゴヌクレオチドは、反応のすべてにおいて存在した。
Claims (30)
- 核酸分子内に位置する標的ヌクレオチド配列の選択的増幅のための方法であって、核酸分子(「鋳型」分子)を、
(i)少なくとも1つの促進因子オリゴヌクレオチドであって、促進因子オリゴヌクレオチドからの3'伸長がブロックされるように、その3'末端にまたはその近くに少なくとも1つの修飾を含む促進因子オリゴヌクレオチド、および
(ii)2つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーであって、これらのうちの少なくとも1つが、修飾の存在により相補鎖合成が早期に終結するように修飾された開始因子プライマーであるオリゴヌクレオチドプライマーと接触させるステップであって、
促進因子オリゴヌクレオチドおよび開始因子プライマーが、鋳型核酸分子の実質的に同じまたは隣接する領域に結合し、促進因子オリゴヌクレオチドが、開始因子プライマーの結合位置に対して3'側に、標的配列に相補的な配列をさらに含むステップと、
特異的な標的配列が選択的に増幅されるように、熱サイクルの酵素的増幅を実行するステップと
を含む方法。 - (a)鋳型核酸分子を変性させるステップと、
(b)変性した鋳型核酸分子を少なくとも1つの開始因子プライマーと接触させ、それから第2の鎖合成を開始し、それによって、新しく合成された鎖に開始因子プライマーからの修飾を導入するステップと、
(c)そのように生成された二本鎖分子を変性させて、開始因子プライマーが結合する標的ヌクレオチド配列の反対の端に位置するプライマーからの逆方向の鎖合成を開始し、それによって、逆方向の鎖合成が、ステップ(b)において導入された修飾により、早期に終結するステップと、
(d)新しく合成された二本鎖分子を変性させて、ステップ(c)において生成された不完全な逆方向の鎖に促進因子オリゴヌクレオチドを結合し、それから鎖伸長を開始して、それによって逆方向の鎖を完成させるステップと、
(e)1回または複数回のさらなるサイクルでステップ(a)〜(d)を任意選択で反復するステップと
を含む、請求項1に記載の方法。 - 開始因子プライマー結合部位が、促進因子オリゴヌクレオチドから開始される鎖伸長に続いて再生成され、それによって、開始因子プライマーが鎖合成のさらなるラウンドを開始することを可能にするように、促進因子オリゴヌクレオチドの5'領域が開始因子プライマーと十分な配列同一性を有する、請求項1または2に記載の方法。
- 開始因子プライマー結合部位が、促進因子オリゴヌクレオチドから開始される鎖合成に続いて再生成されないように、促進因子オリゴヌクレオチドの5'領域が開始因子プライマーと不十分な配列同一性を有する、請求項1または2に記載の方法。
- 修飾の存在により相補鎖合成が早期に終結するように修飾された促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーをさらに使用し、前記プライマーが、促進因子オリゴヌクレオチドから開始される鎖合成から促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマー結合部位が生成され、それによって、促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーが鎖合成のさらなるラウンドを開始することを可能にするように、促進因子オリゴヌクレオチドの5'領域と十分な配列同一性を有する、請求項4に記載の方法。
- 所望の標的配列の増幅の特異性を改善し、同時に、所望されない非標的配列の増幅を実質的に低下させ、または排除するために使用される、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 鋳型核酸分子が、組織、細胞、および/またはその抽出物から選択される生物学的試料中に存在する、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 促進因子オリゴヌクレオチドの3'伸長をブロックする少なくとも1つの修飾が、3'末端のまたはその近くの1つまたは複数の非伸長性部分またはヌクレオチド類似体の組み込みを含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つの修飾が、単一の3'末端非伸長性塩基もしくは塩基類似体、3'末端非伸長性塩基およびオリゴヌクレオチドの3'末端の近くの1つもしくは複数のヌクレオチドミスマッチの組合せおよび/またはオリゴヌクレオチドの3'末端の近くの脱塩基部位の組み込みを含む、請求項8に記載の方法。
- 非伸長性塩基が、2',3'ジデオキシヌクレオチド、3'C3、C18もしくは他の長さのスペーサー、3'リン酸化ヌクレオチド、「ペプチド核酸」塩基、「ロックド核酸」(LNA)塩基、ヌクレオチドアミン誘導体、ウラシルDNAグリコシラーゼを用いて処理されたウラシル、RNAもしくは2'O-メチルヌクレオチド、またはこれらの組合せから選択される、請求項9に記載の方法。
- 開始因子プライマーおよび/または促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーが、1つまたは複数のスペーサー、脱塩基部位、または2'-O-メチルヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドの包含によって修飾される、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 開始因子プライマーおよび/または促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーにおける修飾が、プライマーが3'伸長を開始する能力を保持する一方で、そのプライマー配列内に修飾を含有する伸長産物が複製される場合に、相補鎖が早期に切断され、後の増幅サイクルにおけるプライマー結合を阻止するように、プライマーの3'末端の十分近くに位置する、請求項11に記載の方法。
- 促進因子オリゴヌクレオチドの5'末端が、開始因子プライマーの5'末端と一致する、または開始因子プライマーに含まれる、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- 促進因子オリゴヌクレオチドの5'末端が、促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーの5'末端と一致する、または促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーに含まれる、請求項5から12のいずれか一項に記載の方法。
- 促進因子オリゴヌクレオチドが、開始因子プライマーの5'端に存在する配列に付加的な配列を含む、伸長された5'尾部を含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- 促進因子オリゴヌクレオチドが、促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーの5'端に存在する配列に付加的な配列を含む、伸長された5'尾部を含む、請求項5から12のいずれか一項に記載の方法。
- 促進因子オリゴヌクレオチドの5'尾部が、検出可能なタグまたは標識の付加を促進する、請求項15または16に記載の方法。
- 標的配列に隣接する両方のオリゴヌクレオチドプライマーが開始因子プライマーであり、2つの促進因子オリゴヌクレオチドを使用し、これらのうちの一方が、順方向開始因子プライマーと実質的に同じまたはそれに隣接する、鋳型核酸分子の領域に結合し、他方が、逆方向開始因子プライマーと実質的に同じまたはそれに隣接する、鋳型核酸分子の領域に結合する、請求項1に記載の方法。
- 開始因子プライマー結合部位が、少なくとも1つの促進因子オリゴヌクレオチドから開始される鎖伸長に続いて再生成され、それによって、対応する開始因子プライマーが、鎖合成のさらなるラウンドを開始することを可能にするように、少なくとも1つの促進因子オリゴヌクレオチドの5'領域が、対応する開始因子プライマーと十分な配列同一性を有する、請求項18に記載の方法。
- 開始因子プライマー結合部位が、少なくとも1つの促進因子オリゴヌクレオチドから開始される鎖合成に続いて再生成されないように、少なくとも1つの促進因子オリゴヌクレオチドの5'領域が、対応する開始因子プライマーと不十分な配列同一性を有する、請求項18に記載の方法。
- 修飾の存在により相補鎖合成が早期に終結するように修飾された少なくとも1つの促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーをさらに使用し、前記プライマーが、促進因子オリゴヌクレオチドから開始される鎖合成から促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマー結合部位が生成され、それによって、促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーが鎖合成のさらなるラウンドを開始することを可能にするように、対応する促進因子オリゴヌクレオチドの5'領域と十分な配列同一性を有する、請求項20に記載の方法。
- 2つの促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーを使用し、これらのうちの一方が、一方の促進因子オリゴヌクレオチドと実質的に同じまたはそれに隣接する、鋳型核酸分子の領域に結合し、他方が、他方の促進因子オリゴヌクレオチドと実質的に同じまたはそれに隣接する、鋳型核酸分子の領域に結合する、請求項21に記載の方法。
- 熱サイクルの酵素的増幅反応の特異性を改善するための方法であって、反応が、核酸分子内に位置する、対象とする標的ヌクレオチド配列に隣接する少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマーを利用し、前記プライマーの少なくとも1つが、修飾の存在により相補鎖合成が早期に終結するように修飾されており、反応が、少なくとも1つの非プライミング促進因子オリゴヌクレオチドをさらに利用し、促進因子オリゴヌクレオチドが、促進因子オリゴヌクレオチドからの3'伸長がブロックされるように、その3'末端にまたはその近くに少なくとも1つの修飾を含み、促進因子オリゴヌクレオチドおよび修飾プライマーが、鋳型核酸分子の実質的に同じまたは隣接する領域に結合し、促進因子オリゴヌクレオチドが、修飾プライマーの結合位置に対して3'側に、標的配列に相補的な配列をさらに含む方法。
- 熱サイクルの酵素的増幅反応の特異性が、対象とする標的ヌクレオチド配列を含まない増幅産物の消失またはその量の低下によって決定される、請求項23に記載の方法。
- 核酸分子内に位置し、変異配列を含む標的ヌクレオチド配列を選択的に増幅するステップを含む、変異ヌクレオチド配列を検出するための方法であって、
核酸分子(「鋳型」分子)を、
(i)少なくとも1つの促進因子オリゴヌクレオチドであって、促進因子オリゴヌクレオチドからの3'伸長がブロックされるように、その3'末端にまたはその近くに少なくとも1つの修飾を含む促進因子オリゴヌクレオチド、および
(ii)2つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーであって、これらのうちの少なくとも1つが、修飾の存在により相補鎖合成が早期に終結するように修飾された開始因子プライマーであるオリゴヌクレオチドプライマーと接触させるステップであって、
促進因子オリゴヌクレオチドおよび開始因子プライマーが、鋳型核酸分子の実質的に同じまたは隣接する領域に結合し、促進因子オリゴヌクレオチドが、開始因子プライマーの結合位置に対して3'側に、標的配列に相補的な3'配列をさらに含み、前記3'配列は、対応する非変異配列へではなく、変異配列を含む標的ヌクレオチド配列への促進因子オリゴヌクレオチドの優先的な結合を可能にするステップと、
特異的な標的配列が選択的に増幅されるように、熱サイクルの酵素的増幅を実行するステップと、
増幅された産物のヌクレオチド配列を非変異標的配列に対応する配列と比較して、変異ヌクレオチド配列を検出するステップと
を含む方法。 - 開始因子プライマー結合部位が、促進因子オリゴヌクレオチドから開始される鎖伸長に続いて再生成され、それによって、開始因子プライマーが、鎖合成のさらなるラウンドを開始することを可能にするように、促進因子オリゴヌクレオチドの5'領域が開始因子プライマーと十分な配列同一性を有する、請求項25に記載の方法。
- 開始因子プライマー結合部位が、促進因子オリゴヌクレオチドから開始される鎖合成に続いて再生成されないように、促進因子オリゴヌクレオチドの5'領域が開始因子プライマーの対応する領域と不十分な配列同一性を有する、請求項25に記載の方法。
- 促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーをさらに使用し、前記プライマーが、促進因子オリゴヌクレオチドから開始される鎖合成から促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマー結合部位が生成され、それによって、促進因子オリゴヌクレオチド依存的プライマーが鎖合成のさらなるラウンドを開始することを可能にするように、促進因子オリゴヌクレオチドの5'領域と十分な配列同一性を有する、請求項27に記載の方法。
- 変異配列が、1つもしくは複数のヌクレオチドの付加、欠失、もしくは置換または標的配列内の1つもしくは複数のヌクレオチドに対するメチル化状態の変化などの修飾を含む、請求項25から28のいずれか一項に記載の方法。
- DNAメチル化分析において、かつ/または被験者における疾患もしくは状態の診断もしくはそれに対する感受性の予測において利用され、疾患または状態が、遺伝子配列における変化によって特徴づけられ、またはそれと関連する、請求項1から29のいずれか一項に記載の方法。
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