JP2003525055A - 核酸増幅中の人工産物を減少させる方法 - Google Patents

核酸増幅中の人工産物を減少させる方法

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JP2003525055A
JP2003525055A JP2001563639A JP2001563639A JP2003525055A JP 2003525055 A JP2003525055 A JP 2003525055A JP 2001563639 A JP2001563639 A JP 2001563639A JP 2001563639 A JP2001563639 A JP 2001563639A JP 2003525055 A JP2003525055 A JP 2003525055A
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フランク・ビー・ディーン
エイ・ファワド・ファルキ
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Abstract

(57)【要約】 核酸増幅反応中の人工産物の形成を減少させるのに有用な組成物および方法を開示する。該方法は、本明細書においてテンプレート不全オリゴヌクレオチドと称する、その長さの一部において、核酸合成のためのテンプレートとして役立つことができない特殊なオリゴヌクレオチドを用いる。この方法は、人工産物の形成において、オリゴヌクレオチドが有効なテンプレートとして役立つのを妨げる。本発明方法は、核酸増幅反応において、オリゴヌクレオチド（好ましくはプライマー）の少なくとも１つとして、テンプレート不全オリゴヌクレオチドを用いることを必要とする（ここで、テンプレート不全オリゴヌクレオチドは、好ましくはテンプレート不全オリゴヌクレオチドの５'末端またはその近位において、１つまたはそれ以上のテンプレート不全ヌクレオチドを含む）。本発明方法は、オリゴヌクレオチドが関与するどのような核酸増幅反応においても人工産物を減少させるのに有用である。該方法の好ましい態様において、核酸増幅反応は、サーマルサイクリングを必要としない。本発明方法は、ノンサイクルオリゴヌクレオチドベース人工産物を減少させることにおいて有効である。核酸増幅反応中の人工産物を減少させるのに有用なキットも開示される。本発明キットは、１つまたはそれ以上のテンプレート不全ヌクレオチドを含むテンプレート不全オリゴヌクレオチドおよび核酸ポリメラーゼを含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の背景） 本発明は、核酸増幅反応の分野、さらに詳しくは、核酸増幅反応中の人工産物
を減少させるという領域に関する。 ストランド置換カスケード増幅 (SDCA)）（本明細書においては 指数ローリン
グサークル増幅（exponential rolling circle amplification (ERCA))およびロ
ーリングサークル増幅（rolling circle amplification (RCA)と称する）(米国
特許No. 5,854,033; PCT出願 No. WO 97/19193; Lizardiら, Nature Genetics 1
9 (3): 225-232 (1998)); マルチプル置換増幅(MDA)） (PCT出願WO 99/18241);
ストランド置換増幅（strand displacement amplification (SDA)）(Walkerら,
Nucleic Acids Research 20: 1691-1696 (1992), Walkerら, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 89: 392-396 (1992)); ポリメラーゼ鎖反応(PCR)およびサーマルサイ
クリング,自続式配列複製（self-sustained sequence replication）(3SR)）,
核酸配列に基づいた増幅 (NASBA)およびＱβレプリカーゼによる増幅 (Birkenme
yerおよびMushahwar, J. Virological Methods 35 : 117-126 (1991);Landegren
, Trends Genetics 9: 199-202 (1993))などの他の指数増幅技術;ならびにサイ
クルシーケンシングなどのサーマルサイクリングといったような種々の線形増幅
技術(Craxtonら, Methods Companion Methods in Enzymology 3: 20-26 (1991))
といったような非常に多くの核酸増幅技術が考案されている。
【０００２】 ほとんどすべての核酸増幅反応において、人工産物（すなわち、不必要な、予
期せぬ、あるいは非特異的な核酸分子）が観察されている。たとえば、Stumpら,
Nucleic Acids Research 27: 4642-4648 (1999)には、サイクルシーケンシング
中の異常なＰＣＲ工程から得られる核酸人工産物が記載されている。Stumpらの
文献から、完全には複製され得ないある種のプライマーを用いることによる、こ
のような人工産物を回避する手段が示唆される。Watson, Amplifications, 5-6
(1989),およびFerrieら, Am. J. Hum. Genet. 51: 251-262 (1992)には、ＰＣＲ
中のプライマー−ダイマー人工産物の形成が記載されている。Brownieら, Nucle
ic Acids Research 25: 3235-3241 (1997)から、ＰＣＲプライマーの５'末端に
テールを付加して、プライマー−ダイマー形成が始まるならば、複製不可能な構
造が形成されるようにすることによる、プライマーダイマー形成を回避する手段
が示唆される。他の態様の人工産物が、他のタイプの核酸増幅技術において起こ
り得る。
【０００３】 したがって、本発明の目的は、核酸増幅反応中の人工産物を減少、防止または
排除する方法を提供することである。 本発明の他の目的は、核酸増幅反応に用いた場合に、核酸増幅反応中の人工産
物を減少、防止または排除しうるオリゴヌクレオチドを提供することである。 本発明の別の目的は、核酸増幅反応中の人工産物を減少、防止または排除しう
る核酸増幅用キットを提供することである。
【０００４】 （発明の簡単な説明） 核酸増幅反応中の人工産物の形成を減少させるのに有用な組成物および方法を
開示する。該方法は、本明細書においてテンプレート不全（defficient）オリゴ
ヌクレオチドと称する、その長さの一部において、核酸合成のためのテンプレー
トとして役立つことができない特殊なオリゴヌクレオチドを用いる。この方法は
、人工産物の形成において、オリゴヌクレオチドが有効なテンプレートとして役
立つのを妨げる。本発明方法は、核酸増幅反応において、オリゴヌクレオチド（
好ましくはプライマー）の少なくとも１つとして、テンプレート不全オリゴヌク
レオチドを用いることを必要とする（ここで、テンプレート不全オリゴヌクレオ
チドは、好ましくはテンプレート不全オリゴヌクレオチドの５'末端またはその
近位において、１つまたはそれ以上のテンプレート不全ヌクレオチドを含む）。
本発明方法は、オリゴヌクレオチドが関与するどのような核酸増幅反応において
も人工産物を減少させるのに有用である。該方法の好ましい態様において、核酸
増幅反応は、サーマルサイクリングを必要としない。本発明方法は、ノンサイク
ルオリゴヌクレオチドベース人工産物を減少させることにおいて有効である。核
酸増幅反応中の人工産物を減少させるのに有用なキットも開示される。本発明キ
ットは、１つまたはそれ以上のテンプレート不全ヌクレオチドを含むテンプレー
ト不全オリゴヌクレオチドおよび核酸ポリメラーゼを含む。
【０００５】 （発明の詳細な記載） プライマーを用いる核酸増幅技術はしばしば、正当な増幅の産物ではない人工
産物の形成によって損なわれる。たとえば、増幅されるべき核酸配列の反対の鎖
に対して相補的な２つのプライマーを用いるイソサーマル増幅である鎖指数ロー
リングサークル増幅（ＥＲＣＡ）（ＰＣＴ出願ＷＯ９７／１９１９３におけるス
トランド置換カスケード増幅を参照）では、オリゴヌクレオチドベース人工産物
が形成されることがある。本明細書においてノンサイクルオリゴヌクレオチドベ
ース人工産物と称するこれらの人工産物は、サーマルサイクリングを含む増幅反
応中に起こり、相違するメカニズムから得られるプライマーダイマー人工産物と
は、構造において相違する
【０００６】 たとえば、ＥＲＣＡ中にＢｓｔポリメラーゼによって合成された人工産物的Ｄ
ＮＡ産物は、長い、何キロベースもの長さがあり、テンプレートがなくても生じ
るＤＮＡ分子、あるいはこのような大きさの産物を得るためのテンプレートとな
りうる同様の大きさのＤＮＡ分子からなる。人工産物ＤＮＡ合成は、ただ２つの
短いオリゴヌクレオチドプライマーおよびＢｓｔ単独の存在下で、効率よく起こ
りうる。ゲル電気泳動によって分析すると、人工産物的ＤＮＡは、広いシミのよ
うに見える大きさが非常に変化する産物の集合、もしくはバンド間の間隔が狭い
ハシゴとして出現する。
【０００７】 全長へ複製されえないことによって二本鎖平滑末端構造の合成を妨げるオリゴ
ヌクレオチドを用いることによって、ノンサイクルオリゴヌクレオチドベース人
工産物を減少させることができることが発見されている。本明細書では、このよ
うなオリゴヌクレオチドをテンプレート不全オリゴヌクレオチドと称する。この
ようなオリゴヌクレオチドは、末端への伸長が不充分にしかなされず、インター
ローピングオリゴヌクレオチドの挿入によって創製されるニックを横切ることが
不充分にしかできない（図２を参照せよ）。
【０００８】 本発明は、核酸増幅反応中のプライマー人工産物の形成を減少させるのに有用
な組成物および方法を開示する。該方法は、本明細書においてテンプレート不全
オリゴヌクレオチドと称する、その長さの一部において、核酸合成のためのテン
プレートとして役立つことのできない特殊なオリゴヌクレオチドを用いる。この
方法は、核酸増幅反応中の人工産物の形成において、オリゴヌクレオチドが有効
なテンプレートとして役立つのを妨げる。テンプレート不全オリゴヌクレオチド
がプライマーであり、核酸増幅反応に用いるすべてのプライマーがテンプレート
不全である、および／または核酸増幅反応に用いるすべてのオリゴヌクレオチド
がテンプレート不全であるのが好ましい。
【０００９】 １つの態様において、本発明方法は、テンプレート不全オリゴヌクレオチドを
用い；ここで、テンプレート不全オリゴヌクレオチドは、１つまたはそれ以上の
テンプレート不全ヌクレオチドを含む；ここで、テンプレート不全オリゴヌクレ
オチドの３'末端に最も近接したテンプレート不全ヌクレオチドのテンプレート
可能ヌクレオチド３'の数および組成は、３'末端に最も近接したテンプレート不
全ヌクレオチドのテンプレート可能ヌクレオチド３'に、単独で、核酸増幅反応
において有効に核酸合成を開始させるようにするのに十分である；ことを含む。
本明細書において、この形体のテンプレート不全オリゴヌクレオチドを３'オー
プンオリゴヌクレオチドと称する。本明細書において３'クローズオリゴヌクレ
オチドと称するテンプレート不全オリゴヌクレオチドは、テンプレート不全オリ
ゴヌクレオチドである；ここで、テンプレート不全オリゴヌクレオチドは、１つ
またはそれ以上のテンプレート不全ヌクレオチドを含む；ここで、テンプレート
不全オリゴヌクレオチドの３'末端に最も近接したテンプレート不全ヌクレオチ
ドのテンプレート可能ヌクレオチド３'の数および組成は、３'末端に最も近接し
たテンプレート不全ヌクレオチドのテンプレート可能ヌクレオチド３'に、単独
で、核酸増幅反応において有効に核酸合成を開始させるようにするのに不十分で
ある。言い方を変えると、テンプレート不全ヌクレオチドをオリゴヌクレオチド
の３'末端またはその近位に置くと、３'クローズオリゴヌクレオチドが得られる
。
【００１０】 別の態様では、本発明方法は、テンプレート不全オリゴヌクレオチドを用いる
ことを含む；ここで、テンプレート不全オリゴヌクレオチドは、１つまたはそれ
以上のテンプレート不全ヌクレオチドを含む。 テンプレート不全ヌクレオチドの多くの配置は、本発明テンプレート不全オリ
ゴヌクレオチドにおいて用いることができる。たとえば、テンプレート不全オリ
ゴヌクレオチドが１つまたはそれ以上のテンプレート不全ヌクレオチドを含む場
合、テンプレート不全ヌクレオチドはテンプレート不全オリゴヌクレオチドの５
'末端またはその近位に位置することができる。テンプレート不全オリゴヌクレ
オチドが２つまたはそれ以上のテンプレート不全ヌクレオチドを含む場合、少な
くとも２つのテンプレート不全ヌクレオチドは、隣接することができる。１つの
具体例において、隣接するテンプレート不全ヌクレオチドは、テンプレート不全
オリゴヌクレオチドの５'末端から３ヌクレオチド以内にあることができる。一
般に、テンプレート不全ヌクレオチドの特定の配置は必要ではない。
【００１１】 テンプレート不全ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、誘導体化ヌクレオチド
、リボヌクレオチドおよびヌクレオチド類縁体からなるグループから選ばれる。
好ましいテンプレート不全ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。好ましい
修飾ヌクレオチドは、脱塩基ヌクレオチドである。テンプレート不全ヌクレオチ
ドは、脱塩基ヌクレオチド、逆位塩基をもつヌクレオチド、フルオロ置換ヌクレ
オチド、アルキル置換ヌクレオチド、フェニル置換エーテルをもつヌクレオチド
、置換チオエーテルをもつヌクレオチド、リン酸エステルをもつヌクレオチド、
α−ヌクレオチド、２',３'−ジデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、ビ
オチン誘導体化ヌクレオチド、アミン誘導体化ヌクレオチド、Ｈｅｘ誘導体化ヌ
クレオチド、Ｔｅｔ誘導体化ヌクレオチド、Ｆａｍ誘導体化ヌクレオチド、フル
オレセイン誘導体化ヌクレオチド、ローダミン誘導体化ヌクレオチド、アルカリ
ホスファターゼ誘導体化ヌクレオチド、西洋ワサビペルオキシダーゼ誘導体化ヌ
クレオチド、スペーサー誘導体化ヌクレオチド、コレステリル誘導体化ヌクレオ
チド、ＤＮＰ−ＴＥＧ誘導体化ヌクレオチド、ソラレンクロスリンカー誘導体化
ヌクレオチド、インターカレーション剤誘導体化ヌクレオチドおよびＰＮＡ複合
体誘導体化ヌクレオチドを含む。
【００１２】 このようなヌクレオチドの例として、脱塩基ヌクレオシド(Biegelman ら, Bio
organic & Medicinal Chemistry Letters 4 (14): 1715-1720 (1994); Moran ら
, Nucleic Acids Res. 24 (11): 2044-2052 (1996); MatrayおよびKool, Nature
399: 704-708 (1999)), 5'-フルオロ置換ヌクレオシド (RobinsおよびWnuk, Te
trahedron Lett.29: 5729 (1988)), 5'-アルキル置換ヌクレオシド(RayおよびJa
xa-Chamiec, Heterocycles 31 (10): 1777-1780 (1990); Jun-DongおよびLi-He,
Synthesis 909-911 (1990); Tanakaら, Tetrahedron Lett. 30: 2567-2570 (19
89)), 5'-アルキルまたはフェニル置換エーテルをもつヌクレオシド(Jonesら, C
arbohydrates, Nucleosides, Nucleotides 4: 301 (1977)), 5'-置換チオエーテ
ル(ConnollyおよびRider, Nucleic Acids Res. 13: 4485 (1985);Connolly, Nuc
leic Acids Res. 15 : 3131-3139 (1987); SinhaおよびCook, Nucleic Acids Re
s. 16: 2659 (1988); Kumarら, Nucleic Acids Res. 19: 4561 (1991); Zuckerm
annら, Nucleic Acids Res. 15 : 5305 (1987); Guptaら., TetrahedronLett. 3
1: 2471-2474 (1990); Asslieら, Tetrahedron 48: 1233-1254 (1992)), 5'-ア
ミンおよび置換アミン(ConnollyおよびRider, Nucleic Acids Res. 13: 4485 (1
985); Sproatら, Nucleic Acids Res. 15: 4857 (1987); Zuckermanら, Nucleic
Acids Res. 15: 5305 (1987), Liら, Nucleic Acids Res. 15: 5275 (1987); D
reyerおよびDervan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 968 (1985)),5-ターミネ
ーターーとしてのリン酸エステル(Tanakaら, Tetrahedron Lett. 30: 2567-2570
(1989)),5-ターミネーターーとしての逆位塩基またはα-ヌクレオシド(Blochら
, Gene 72: 349 (1988); Sequin, Helv. Chim. Acta. 57: 68 (1974)),5-ターミ
ネーターーとしての2', 3'-ジデオキシヌクレオシド(HurynおよびOkabe, Chem.
Rev. 92: 1745-1768 (1992))が挙げられる。
【００１３】 ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを、たとえば、ビオチン、フルオレセ
インまたはローダミンなどの色素もしくはアルカリホスアターゼまたは西洋ワサ
ビペルオキシダーゼなどのタンパク質で誘導体化することもできる。本発明オリ
ゴヌクレオチドに有用な５'−修飾として、5'-スペーサー (Durardら, Nucleic
Acids Res. 18: 6353 (1990); Salunkheら, J. Amer. Chem. Soc. 114: 8768-87
72 (1992); Dolinnayaら, Nucleic Acids. Res. 21: 5403-5407 (1993); Takesh
itaら, J. Biol. Chem. 262: 10171-10179 (1987); Kalinら, Biochemistry 27
: 924-931 (1998)), 5'-ビオチン化スペーサー(Cocuzza, Tetrahedron Lett. 30
: 6287-6290 (1989); Nelsonら, Nucleic Acids Res. 20: 6253-6259 (1992)),
5'−コレステリル(Mackellarら, Nucleic Acids. Res. 20: 3411-3417 (1992);
Steinら, Biochemistry 30: 2439-2444 (1991)), 5'-DNP-TEG (Willら, Carbohy
drate Research 216: 315-322 (1991); Grzybowskiら, Nucleic Acids Res. 21:
1705-1712 (1993)), 5'−ソラレンクロスリンカー(PielesおよびEnglisch, Nuc
leic Acids Res. 17: 285 (1989); Taksugiら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88
: 5602-5606 (1991)), 5'-インターカレーション剤(ThoungおよびChassignol, T
etrahedron Lett. 29: 5905 (1988)), 5'-PNA複合体(Nielsenら, Science 254:
1497-1500 (1991); Egholmら, J. Am. Chem. Soc. 114: 1895-1897 (1992)), 5'
-酵素複合体(Jablonskiら, Nucleic Acids. Res. 14: 6115-6128 (1986)), 5'-d
ye-label (Molecular Probes, Eugene, Oreg.; Research Organics, Cleveland,
Ohio).が挙げられる。
【００１４】 テンプレート不全オリゴヌクレオチド中のすべてのテンプレート不全ヌクレオ
チドが同じタイプのヌクレオチドである必要はない。たとえば、テンプレート不
全オリゴヌクレオチドは、テンプレート不全ヌクレオチドとして脱塩基ヌクレオ
チドおよびリボヌクレオチドの両方を含むことができる。このようなテンプレー
ト不全ヌクレオチドは、異なる理由からテンプレート不全である（脱塩基ヌクレ
オチドはテンプレートとして役立つための塩基をもたず、リボヌクレオチドはポ
リメラーゼからテンプレートとして認識されない）。同じテンプレート不全オリ
ゴヌクレオチドにおいて用いることができる異なるテンプレート不全ヌクレオチ
ドの組み合わせに制限はない。同様に、核酸増幅反応に用いるすべてのテンプレ
ート不全オリゴヌクレオチドが、同じタイプまたはパターンのテンプレート不全
ヌクレオチドをもつ必要はない。たとえば、同じ増幅反応において、脱塩基ヌク
レオチドを含むプライマーを、逆位ヌクレオチドを含むプライマーとともに用い
ることができる。
【００１５】 本発明テンプレート不全オリゴヌクレオチドは、いずれの核酸増幅方法におい
ても用いることができる。本発明オリゴヌクレオチドを使用する核酸増幅の好ま
しい形体として、指数増幅（イソサーマルまたはサーマルサイクリングを含む）
を含む核酸増幅反応、指数増幅（イソサーマルまたはサーマルサイクリングを含
む）を必要とする核酸増幅反応、イソサーマル線形増幅を含む核酸増幅反応、イ
ソサーマル線形増幅を必要とする核酸増幅反応、ローリングサークル増幅を含む
核酸増幅反応、ポリメラーゼ鎖反応を含む核酸増幅反応およびサーマルサイクリ
ングを含まない核酸増幅方法が挙げられる。
【００１６】 核酸増幅反応の例は、指数ローリングサークル増幅（ＥＲＣＡ）（国際出願WO
97/19193ではストランド置換カスケード増幅と呼ばれ、Lizardiら, Nature Gene
tics 19 (3): 225-232 (1998)では、超分岐ローリングサークル増幅と呼ばれる
）およびローリングサークル増幅（ＲＣＡ）(米国特許 No. 5,854,033; 国際出
願 WO 97/19193; Lizardiら,Nature Genetics 19 (3): 225-232 (1998));マルチ
プル置換増幅（ＭＤＡ）（国際出願 WO99/18241）；ストランド置換増幅（ＳＤ
Ａ）(Walkerら, Nucleic Acids Research 20: 1691-1696 (1992), Walkerら,Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 89: 392-396 (1992)); 核酸配列ベース増幅（ＮＡＳ
ＢＡ）(Compton, Nature 350: 91-92 (1991));転写媒介増幅（ＴＭＡ）(Nelson,
Crit Rev Clin Lab Sci 35 : 369-414 (1998));ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）
ならびにサーマルサイクリングを含む他の指数増幅技術、自続式配列複製（３Ｓ
Ｒ）、およびＱβレプリカーゼによる増幅(BirkenmeyerおよびMushahwar, J. Vi
rological Methods 35 : 117-126 (1991) ; Landegren,Trends Genetics 9: 199
-202 (1993))；サイクルシーケンシングなどのサーマルサイクリングを含む種々
の線形増幅技術(Craxtonら, Methods Companion Methods in Enzymology 3: 20-
26 (1991))である。本発明のオリゴヌクレオチドおよび方法は、Lizardiら, Nat
ure Genetics 3: 225-232 (1998), Thomasら, Arch Pathol Lab Med 123 : 1170
-1176 (1999), Banerら, Nucleic Acids Research 26: 5073-5078 (1998)および
Zhangら, Gene 211 : 277-285 (1998)に記載の技術に有用である。
【００１７】 プライマーとして３'クローズオリゴヌクレオチドを用いる場合、核酸増幅反
応がサイクルシーケンシングを含まないか、核酸増幅反応がサーマルサイクリン
グを介する線形増幅を必要としないか、核酸増幅反応がサーマルサイクリングを
介する線形増幅を含まないか、あるいは核酸増幅反応がサーマルサイクリングを
介する指数増幅を含むのが好ましい。 本明細書は、核酸増幅反応中の人工産物を減少させるのに有用なキットも開示
する。本発明のキットは、これまでに記載したテンプレート不全オリゴヌクレオ
チドおよびポリメラーゼを含む。本明細書に記載のどのような形体のテンプレー
ト不全プライマーでも本発明キットに含めることができる。
【００１８】 どのような特定のメカニズムにも限定されることを望まないけれども、ノンサ
イクルオリゴヌクレオチドベース人工産物は以下の様式で生成されると考えられ
る。最初に、たとえば、１つのオリゴヌクレオチドが第２のオリゴヌクレオチド
に部分的にアニールし、該オリゴヌクレオチドの末端へ伸長するといったような
ミスプライミングが起こる（図１参照）。平滑末端産物は、伸長された時間の間
ポリメラーゼ活性部位に居座ることができる。一本鎖テンプレートＤＮＡ鎖に対
する酵素結合部位は、空いており、次いで、第２のオリゴヌクレオチドが活性部
位へ一時的に滑り込む。このような結合は、酵素一本鎖テンプレート結合部位に
あるアミノ酸との相互作用または５'テンプレート鎖塩基と３'末端インターロー
ピング鎖塩基との間のスタッキングエネルギーによって安定化することができる
。このような結合は、普通は、非常に安定あるいは永続的というわけではないが
、ヌクレオチドが新生鎖の３'末端に付着されるのに十分な程度には長い。これ
は、次いでその全長にすばやくコピーされうるインターローピングオリゴヌクレ
オチドをさらに安定化する。結果として、酵素がその活性部位に平滑末端二本鎖
とともに位置し、次いで、他方のオリゴヌクレオチドがテンプレート鎖結合部位
に適合することができ、サイクルそれ自体が繰り返される。このようなやり方で
、長いＤＮＡ産物が生成される。テンプレート鎖結合部位への連続的オリゴヌク
レオチドの結合による長い産物の人工産物合成のこのプロセスは、本明細書にお
いてテンプレーティングと称する（図１参照）。
【００１９】 定義 テンプレート不全オリゴヌクレオチドは、核酸合成のためのテンプレートとし
て役立つことができない領域を少なくとも１つもつオリゴヌクレオチドである。
機能的影響は、テンプレート不全オリゴヌクレオチドは完全には複製されえない
ということである。テンプレート不全オリゴヌクレオチドは、たとえば、該オリ
ゴヌクレオチドにテンプレート不全ヌクレオチドを含めることによって製造する
ことができる。幾つかのポリメラーゼに限って、あるタイプのヌクレオチドをテ
ンプレートとして用いることができるので、オリゴヌクレオチドがテンプレート
不全オリゴヌクレオチドであるかどうかは、用いられる核酸ポリメラーゼに依存
しうる。たとえば、多くのＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡテンプレートを必要とす
る。したがって、本明細書においては、オリゴヌクレオチドがテンプレート不全
であるかどうかは、核酸増幅反応に用いられる核酸ポリメラーゼに基づいて決定
される。本明細書においては、テンプレート不全オリゴヌクレオチドであるプラ
イマーをテンプレート不全プライマーと称する。
【００２０】 テンプレート不全ヌクレオチドとは、（核酸分子に含まれる場合に）テンプレ
ートとして役立ちえないヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体である。テンプ
レート不全ヌクレオチドの例は、脱塩基ヌクレオチドおよび誘導体化ヌクレオチ
ドである。機能的影響は、テンプレート不全ヌクレオチドの部位または部位の下
流にテンプレート不全ヌクレオチドを含む核酸鎖に対して相補的なテンプレート
不全ヌクレオチドは核酸鎖の合成を妨げることである。テンプレート可能ヌクレ
オチドは、テンプレート不全ではないヌクレオチドである。幾つかのポリメラー
ゼに限って、あるタイプのヌクレオチドをテンプレートとして用いることができ
るので、ヌクレオチドがテンプレート不全ヌクレオチドであるかどうかは、用い
られる核酸ポリメラーゼに依存しうる。たとえば、多くのＤＮＡポリメラーゼは
デオキシリボヌクレオチドテンプレートを必要とする。したがって、本明細書に
おいては、ヌクレオチドがテンプレート不全であるかどうかは、核酸増幅反応に
用いられる核酸ポリメラーゼに基づいて決定される。
【００２１】 オリゴヌクレオチドベース人工産物は、オリゴヌクレオチド以外の核酸の不在
下において、核酸増幅反応中に形成される核酸である。オリゴヌクレオチドベー
ス人工産物は、テンプレート核酸（最も多くは意図されたテンプレートではない
テンプレートである）の意図されたものでない、または非正統的なプライミング
から得られる人工産物とは区別されることになっている。オリゴヌクレオチドベ
ース人工産物は、オリゴヌクレオチド以外の核酸の存在下に生じるということに
留意すべきである。核酸の不在下におけるオリゴヌクレオチドベース人工産物の
形成は、本来、他のタイプの核酸増幅人工産物からオリゴヌクレオチドベース人
工産物を区別するために用いられる。ノンサイクルオリゴヌクレオチドベース人
工産物は、サーマルサイクリングを含まない核酸増幅反応中に形成されるオリゴ
ヌクレオチドベース人工産物である。サイクルオリゴヌクレオチドベース人工産
物は、人工産物の形成がサーマルサイクリングによって決まるサーマルサイクリ
ングを含む核酸増幅反応中に形成されるオリゴヌクレオチドベース人工産物であ
る。プライマーベース人工産物は、プライマーから、あるいはプライマーによっ
て形成されるオリゴヌクレオチドベース人工産物である
【００２２】 プライマー不全ヌクレオチドは、（核酸分子に含まれる場合）相補的ヌクレオ
チドに対してハイブリダイズできない（すなわち、水素結合できない）ヌクレオ
チドまたはヌクレオチド類縁体である。プライマー不全ヌクレオチドの例は、脱
塩基ヌクレオチドおよび誘導体化ヌクレオチドである。機能的影響は、プライマ
ー不全ヌクレオチドは、プライマー不全ヌクレオチドの部位にプライマー不全ヌ
クレオチドを含む核酸鎖へのハイブリッドの形成を妨げることである。プライマ
ー可能ヌクレオチドは、プライマー不全ではないヌクレオチドである。プライマ
ー可能ヌクレオチドの例は、通常のリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレ
オチドである。
【００２３】 ３'オープンオリゴヌクレオチドは、テンプレート不全オリゴヌクレオチドで
ある［ここで、テンプレート不全オリゴヌクレオチドは、１つまたはそれ以上の
テンプレート不全ヌクレオチドを含む］；ここで、テンプレート不全オリゴヌク
レオチドの３'末端に最も近接したテンプレート不全ヌクレオチドのテンプレー
ト可能ヌクレオチド３'の数および組成は、３'末端に最も近接したテンプレート
不全ヌクレオチドのテンプレート可能ヌクレオチド３'に、単独で、核酸増幅反
応において有効に核酸合成を開始させるようにするのに十分である。３'クロー
ズオリゴヌクレオチドは、テンプレート不全オリゴヌクレオチドである［ここで
、テンプレート不全オリゴヌクレオチドは、１つまたはそれ以上のテンプレート
不全ヌクレオチドを含む］；ここで、テンプレート不全オリゴヌクレオチドの３
'末端に最も近接したテンプレート不全ヌクレオチドのテンプレート可能ヌクレ
オチド３'の数および組成は、３'末端に最も近接したテンプレート不全ヌクレオ
チドのテンプレート可能ヌクレオチド３'に、単独で、核酸増幅反応において有
効に核酸合成を開始させるようにするのに不十分である。言い方を変えると、テ
ンプレート不全ヌクレオチドをオリゴヌクレオチドの３'末端またはその近位に
置くと、３'クローズオリゴヌクレオチドが得られるが、オリゴヌクレオチドの
領域をテンプレート不全ヌクレオチドの３'末端フリーまたはその近位に保持す
ると３'オープンオリゴヌクレオチドが得られる。
【００２４】 本明細書において、増幅反応が機能しない、あるいは所望の増幅が得られない
場合、核酸増幅反応が、特定化された成分または条件を“必要とする”と言う。
たとえば、ＰＣＲ増幅は、合成された鎖の分離および複製の他のラウンドのため
のテンプレートと合成された鎖の両方へのプライマーのアニーリングによって決
まるので、ＰＣＲはサーマルサイクリングを必要とする。本明細書において、増
幅反応が特定化された成分または条件を用いる場合、核酸増幅反応が、該成分ま
たは条件を“含む”と言う。所定の増幅反応が、特定の成分を含むかどうかは、
含まれる特異的反応によって決まる。たとえば、標識したプライマーを用いてＰ
ＣＲ反応を行うことができる。したがって、このような反応は、標識したプライ
マーを“含む”と言うことができる。しかし、ＰＣＲは、このようなプライマー
がなくても機能することができるので、ＰＣＲが、それらを“必要とする”とは
言わない。所定の成分または条件を“必要とする”すべての増幅反応は、その成
分または条件を“含む”とも言えるが、所定の成分または条件を“含む”増幅反
応がすべてその成分または条件を“必要とする”わけではない。
【００２５】 線形増幅は、反応物中の標的核酸の量に直接比例する標的核酸の増加を生じさ
せる、あるいは生じさせるように設計されている核酸増幅を意味する。たとえば
、サイクルシーケンシングは、存在する標的鎖毎に、一本鎖（または、より正確
には一鎖終結部分鎖（one chain-terminated partial strand））を生産する。
合成された鎖は、続いて起こるラウンドにおいてテンプレートとして用いられな
いので、増幅は線形である。指数増幅は、反応物中の標的核酸の量に幾何級数的
に比例する標的核酸の増加を生じさせる、あるいは生じさせるように設計されて
いる核酸増幅を意味する。たとえば、ＰＣＲは、すべてのオリジナル標的鎖およ
びすべての存在する合成された鎖に対して一本鎖を生成する。合成された鎖は続
いて起こるラウンドでテンプレートとして用いられるので、増幅は指数関数的で
ある。増幅反応がこのような増加を生じさせるように設計されているのであれば
、増幅反応は、実際に、指数関数的に、指数増幅とみなされる核酸の量の増加を
生じさせる必要はない。
【００２６】 サイクルシーケンシングは、サーマルサイクリングを必要とする核酸シーケン
シング反応を意味する。核酸増幅反応において、サイクリングは、反応のある条
件における周期的、繰り返し的変化を意味する。水浴の温度保持限界による温度
のわずかな変動といったような条件の小さな変化は、特に、このような変動が反
応に機能的影響をもたない場合は、サイクリングとみなされない。核酸増幅反応
において、サーマルサイクリングは、反応の反応温度における周期的、繰り返し
的変化を意味する。 核酸増幅反応は、一つまたはそれ以上の核酸分子のすべてまたは一部の１コピ
ー以上の合成が生じる反応である。本明細書において、核酸増幅反応は、核酸増
幅を必然的に含むアッセイ、反応、技術および手順を包含する。このようなアッ
セイ、反応、技術および手順が、核酸シーケンシングまたは核酸検出といったよ
うな核酸増幅以外の目標または核酸増幅に加えての目標をもつという事実は、そ
れが核酸増幅反応であるということを妨げない。
【００２７】 本明細書において、ヌクレオシドは、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウ
リジン、２'−デオキシアデノシン、２'−デオキシグアノシン、２'−デオキシ
シチジンまたはチミジンを意味する。ヌクレオシド類縁体は、ヌクレオシドの塩
基または糖部分のいずれかの位置に化学的修飾を含む化学的に修飾された形体の
ヌクレオシドである。本明細書において、語句ヌクレオシド類縁体は、たとえば
、イノシンおよびプソイドウリジンなどの天然の修飾ヌクレオシドに基づくヌク
レオシド類縁体ならびに糖の２位への修飾などの他の修飾を含むヌクレオシド類
縁体の両方を含む。本明細書において、ヌクレオチドは、上記ヌクレオシドのリ
ン酸誘導体を意味し、ヌクレオチド類縁体は、上記ヌクレオシド類縁体のリン酸
誘導体である。ペプチド核酸などのオリゴヌクレオチド類縁体のサブユニットも
またヌクレオチド類縁体とみなされる。
【００２８】 本明細書において、リボヌクレオチドは、２'水酸官能基をもつヌクレオチド
である。類似的に、２'−デオキシリボヌクレオチドは、２'水素のみをもつヌク
レオチドである。したがって、本明細書において、リボヌクレオチドおよびデオ
キシリボヌクレオチドは、いずれの化学的修飾も含むことなく、それぞれ、アデ
ノシン、グアノシン、シチジンおよびウリジン、または２'−デオキシアデノシ
ン、２'−デオキシグアノシン、２'−デオキシシチジンおよびチミジンというヌ
クレオシド成分を有する天然のヌクレオチドを意味する。それらがヌクレオチド
およびヌクレオチド類縁体に見られるリン酸基またはリン酸基の類縁体を欠いて
いる以外は、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド
類縁体およびデオキシリボヌクレオシド類縁体は同様に定義される。
【００２９】 本明細書において、オリゴヌクレオチド類縁体は、標準的ＲＮＡまたはＤＮＡ
ヌクレオチドとは離れた修飾を１つまたはそれ以上の位置に含む、配列従属性ハ
イブリダイゼーションといったような核酸様特性をもつ核酸様物質のポリマーで
ある。オリゴヌクレオチド類縁体の好ましい例は、ペプチド核酸である。 上記語句の意味は、本明細書の他の場所での語句の使用例によってさらに説明
される。本明細書で用いるが、上記では定義していない他の語句の意味は、当業
界における通常の使用例およびそれらの使用例の文脈によって一般的に理解する
ことができる。上記定義は、本明細書において使用され、定義される語句の排他
的なリストであることを意図するものではない。
【００３０】 オリゴヌクレオチド 種々のオリゴヌクレオチド構造を用いて、テンプレート不全オリゴヌクレオチ
ドを創造することができる。一般に、テンプレート不全オリゴヌクレオチドを作
成するのに有用なテンプレート不全ヌクレオチドには、修飾ヌクレオチド、誘導
体化ヌクレオチド、リボヌクレオチドおよびヌクレオチド類縁体が包含される。
たとえば、オリゴヌクレオチドは、１つまたはそれ以上の脱塩基ヌクレオチド、
１つまたはそれ以上の逆位塩基をもつヌクレオチド、１つまたはそれ以上のフル
オロ置換ヌクレオチド、１つまたはそれ以上のアルキル置換ヌクレオチド、１つ
またはそれ以上のアルキル基をもつヌクレオチド、１つまたはそれ以上のフェニ
ル置換エーテルをもつヌクレオチド、１つまたはそれ以上の置換チオエーテルを
もつヌクレオチド、１つまたはそれ以上のリン酸エステルをもつヌクレオチド、
１つまたはそれ以上のα−ヌクレオチド、１つまたはそれ以上の２',３'−ジデ
オキシヌクレオチド、もしくは１つまたはそれ以上のビオチン、アミン、Ｈｅｘ
、Ｔｅｔ、Ｆａｍ、フルオレセイン、ローダミン、アルカリホスファターゼ、西
洋ワサビペルオキシダーゼ、スペーサー、コレステリル、ＤＮＰ−ＴＥＧ、ソラ
レン、クロスリンカー、インターカレーション剤、ＰＮＡ複合体、他の酵素複合
体および他の色素標識などの化合物で誘導体化されたヌクレオチドである。
【００３１】 修飾または誘導体化されたヌクレオチドのひとつのクラスは、
【化１】 で示される構造をもつ。 各Ｂは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨＲ１、−ＣＯ
ＮＲ１Ｒ２、−ＮＨ２、−ＮＨＲ１、−ＮＲ１Ｒ２、−ＮＨＣＯＲ１、−ＳＨ、
ＳＲ１、−Ｆ、−ＯＮＨ２、−ＯＮＨＲ１、−ＯＮＲ１Ｒ２、−ＮＨＯＨ、−Ｎ
ＨＯＲ１、−ＮＲ２ＯＨ、−ＮＲ２ＯＲ１、置換または非置換Ｃ１−Ｃ１０直鎖
または分枝アルキル、置換または非置換Ｃ２−Ｃ１０直鎖または分枝アルケニル
、置換または非置換Ｃ２−Ｃ１０直鎖または分枝アルキニル、置換または非置換
Ｃ１−Ｃ１０直鎖または分枝アルコキシ、置換または非置換Ｃ２−Ｃ１０直鎖ま
たは分枝アルケニルオキシおよび置換または非置換Ｃ２−Ｃ１０直鎖または分枝
アルキニルオキシでありうる。Ｂ基のための置換基は、独立して、ハロゲン、シ
アノ、アミノ、カルボキシ、エステル、エーテル、カルボキシアミド、ヒドロキ
シまたはメルカプトである。Ｒ１およびＲ２は、置換または非置換アルキル、ア
ルケニルまたはアルキニル基［ここで置換基は、独立して、ハロゲン、シアノ、
アミノ、カルボキシ、エステル、エーテル、カルボキシアミド、ヒドロキシまた
はメルカプトである］でありうる。 各Ｖは、Ｏ、Ｓ、ＮＨまたはＣＨ２基でありうる。 各Ｗは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨＲ１、−ＣＯ
ＮＲ１Ｒ２、−ＮＨ２、−ＮＨＲ１、−ＮＲ１Ｒ２、−ＮＨＣＯＲ１、−ＳＨ、
ＳＲ１、−Ｆ、−ＯＮＨ２、−ＯＮＨＲ１、−ＯＮＲ１Ｒ２、−ＮＨＯＨ、−Ｎ
ＨＯＲ１、−ＮＲ２ＯＨ、−ＮＲ２ＯＲ１、置換または非置換Ｃ１−Ｃ１０直鎖
または分枝アルキル、置換または非置換Ｃ２−Ｃ１０直鎖または分枝アルケニル
、置換または非置換Ｃ２−Ｃ１０直鎖または分枝アルキニル、置換または非置換
Ｃ１−Ｃ１０直鎖または分枝アルコキシ、置換または非置換Ｃ２−Ｃ１０直鎖ま
たは分枝アルケニルオキシおよび置換または非置換Ｃ２−Ｃ１０直鎖または分枝
アルキニルオキシでありうる。Ｗ基のための置換基は、独立して、ハロゲン、シ
アノ、アミノ、カルボキシ、エステル、エーテル、カルボキシアミド、ヒドロキ
シまたはメルカプトである。Ｒ１およびＲ２は、置換または非置換アルキル、ア
ルケニルまたはアルキニル基［ここで置換基は、独立して、ハロゲン、シアノ、
アミノ、カルボキシ、エステル、エーテル、カルボキシアミド、ヒドロキシまた
はメルカプトである］でありうる。
【００３２】 ＤおよびＥは、一緒になって、隣接するヌクレオシドまたはヌクレオシド類縁
体との間にホスホジエステルまたはホスホロチオ酸ジエステル結合を形成するか
、または一緒になって、インターヌクレオシド結合をもつ類縁体を形成する残基
である。 すべての上記修飾は、ポリメラーゼがこのような修飾ヌクレオチドの反対にヌ
クレオチドを付加することを困難にするか、またはこのような修飾ヌクレオチド
を越えて合成を伸長することを困難にする。異なる修飾、誘導体化または置換を
もつヌクレオチドの組み合わせを、単一のテンプレート不全オリゴヌクレオチド
に用いることができる。同様に、異なるタイプの修飾、誘導体化または置換をも
つプライマーを同じ増幅反応に用いることができる（実施例２および図７を参照
）。
【００３３】 テンプレート不全オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、誘導体化オリゴ
ヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体を用いずに作成することもできる。たと
えば、使用したポリメラーゼに応じて、通常のリボヌクレオチドをテンプレート
不全ヌクレオチドとして用いることができる。ＤＮＡテンプレートを必要とする
ポリメラーゼは、プライマー内にリボヌクレオチドを用いることはできないであ
ろう。 テンプレート不全オリゴヌクレオチドが、少なくとも２つの連続または隣接し
たテンプレート不全ヌクレオチドをもつのが好ましい。このようなアレンジメン
トは、合成がオリゴヌクレオチド内のテンプレート不全領域を避けて通過できる
チャンスを減少させる。たとえば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼといったような
幾つかのポリメラーゼは、平滑末端二本鎖ＤＮＡ構造にオーバーハンギング３'
ヌクレオチドを付加する。このことは、テンプレーティングのシナリオにおいて
、５'脱塩基をオーバーハングし、なんとしてもテンプレーティングが起こり得
るようにする。２つの連続的脱塩基ヌクレオチドの使用は、ニックを横切る合成
を阻止すべきである（図３参照）。実施例は、それぞれ２つの５'脱塩基ヌクレ
オチドをもつ２つのプライマーオリゴヌクレオチド、Ｐ１およびＰ２を用いる場
合のＥＲＣＡ反応中の人工産物の減少を示す（図６参照）。
【００３４】 ＰＣＲなどのサーマルサイクリングを含む増幅反応における使用には、本発明
のオリゴヌクレオチドのサブセットが好ましい。Stumpらのプライマー（最も３'
テンプレート不全なヌクレオチドのテンプレート可能ヌクレオチド３'を、プラ
イマーが効果的に合成を開始できる鎖の合成を妨げるのに不十分にしかもたない
）とは異なり、サーマルサイクリング反応にとって好ましい本発明のプライマー
のサブセットは、最も３'テンプレート不全なヌクレオチドのテンプレート可能
ヌクレオチド３'を、合成鎖の効果的なプライミングを可能にするのに十分なだ
けもつ。 オリゴヌクレオチド内のどこにでもテンプレート不全ヌクレオチドを置くこと
ができる。オリゴヌクレオチドの５'末端にテンプレート不全ヌクレオチドがな
いようにするのが望ましい。たとえば、５'脱塩基残基または他の修飾をもつオ
リゴヌクレオチドは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびγ３２Ｐ−ＡＴＰを
用いるホスホリル化によって効果的に標識することができない。
【００３５】 方法 本発明方法は、興味の対象となる核酸増幅反応中の１つまたはそれ以上の本発
明テンプレート不全オリゴヌクレオチドの使用を含む。最も一般的には、本発明
オリゴヌクレオチドは、興味の対象となる増幅反応においてプライマーとして使
用される。反応において、１つ以上のオリゴヌクレオチドが必要であるか、また
は使用する場合、反応において、すべてのオリゴヌクレオチドがテンプレート不
全プライマーであるのが好ましい。本明細書において、核酸増幅反応は、核酸増
幅を必然的に含むアッセイ、反応、技術および手順を包含する。 人工産物に感受性のない核酸増幅反応の利点は、核酸合成産物がインプットま
たは標的テンプレートに対して特異的であることである。特に、核酸増幅反応を
必然的に含む検出アッセイにおける偽陽性（標的配列の存在に従属しない人工産
物的核酸合成によって生じた）は、減少するだろう。本発明に用いるための好ま
しい核酸増幅反応は、指数ローリングサークル増幅（ＥＲＣＡ）である。プライ
マー人工産物に感受性のないＥＲＣＡ反応の利点は、ＤＮＡ合成産物がインプッ
トテンプレートに対して特異的であり、ＤＮＡ合成産物の収量が、インプットテ
ンプレートの量に直接比例することである。
【００３６】 本発明方法は、Stumpら、Nucleic Acids Research、27:4642-4648（1999）に
記載された方法とは異なる。Stumpらでは、人工産物は、ＰＣＲ反応におけるサ
ーマルサイクリングから生じた。複製の１ラウンドの産物が、続いて起こるラウ
ンドのテンプレートなので、このＰＣＲ人工産物が生じた。このような人工産物
は、本明細書においてサイクルオリゴヌクレオチド人工産物と称する。Stumpら
は、合成された鎖が、プライマーに対して相補的な配列を、合成鎖上でプライマ
ーに合成を開始させるのに十分なだけ含まないように、完全には複製され得ない
プライマーを用いることによって、サイクルオリゴヌクレオチド人工産物を排除
した（これらのプライマーは、本明細書における３'クローズオリゴヌクレオチ
ドである）。対照的に、本明細書における３'オープンオリゴヌクレオチドは、
プライマーに対して相補的な配列を、合成鎖上でプライマーに合成を開始させる
のに十分に含む鎖を合成することができる。さらに、このようなプライマーは、
イソサーマル増幅反応中に生じるためにテンプレーティング人工産物にとって必
要であるような平滑二本鎖ＤＮＡ末端をもたらさない。
【００３７】 本発明方法は、核酸増幅反応をより特異的にする改良である。さらに詳しくは
、本発明方法は、インビトロ診断およびマルチウエル形式でのＳＮＰ分析などの
ＥＲＣＡを用いることができるすべてのアプリケーションにＥＲＣＡを用いる場
合の結果を改良する。本発明方法は、ＰＣＲおよびサーマルサイクリングを含む
他の増幅方法の改良をもたらし、いずれのＰＣＲまたは他のサーマルサイクリン
グ技術に用いることができる。ＰＣＲおよびサーマルサイクリングを含む他の増
幅技術における使用には、プライマーが、３'オープンオリゴヌクレオチド（す
なわち、使用した増幅条件下でプライマーによる有効なプライミングを行うのに
十分なプライマーの部分に対する相補鎖の合成をするのに十分な数のテンプレー
ト可能ヌクレオチドをプライマーの３'末端に含むオリゴヌクレオチド）である
のが好ましい。
【００３８】 （実施例） 実施例１：脱塩基ヌクレオチドを用いる指数ローリングサークル増幅における
プライマー人工産物の除去 この実施例は、テンプレートが存在しない場合に、ＥＲＣＡにおいて有意なプ
ライマー人工産物が生成すること、および２つの脱塩基ヌクレオチドを５'末端
にもつテンプレート不全プライマーがこれらのプライマー人工産物を除去するこ
とを説明する。特定の核酸を検出するのに用いられるほとんどの核酸増幅技術に
関し、検出される核酸の不在下における擬似核酸の人工的産生の結果として、誤
ったポジティブアッセイが得られる。検出される核酸が存在するアッセイにおい
ては、擬似核酸の人工的産生は、質的に、そして最も重要なことには量的に、ア
ッセイの正確さにおいて影響を及ぼす。
【００３９】 ５'末端に２つのテンプレート不全ヌクレオチドを含むプライマーを用いるこ
とによるプライマーベース人工産物の減少を説明するために、ＥＲＣＡに用いた
条件下で１０種の反応を行う。反応物(３０μl)は、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、
１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ (ＮＨ４)２ＳＯ４、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％
トリトンＸ−１００（ｐＨ８.８、２５℃）を含む。さらに、反応物は、４００
μＭのデオキシリボヌクレオチドトリホスフェート、α[３２Ｐ]ｄＣＴＰ、特異
的活性ｃｐｍ／ｐｍｏｌ総ｄＮＴＰおよび８ユニットのＢｓｔＤＮＡポリメラー
ゼを含む。以下に示すようにＥＲＣＡプライマーを加える。ここで、‘ａｂａ'
は、脱塩基ヌクレオチド残基の存在を示す。
【００４０】 P1 (5'末端テンプレート可能) 5'CTA AAG CTG AGA CAT GAC GAG TC 3' (SEQ ID NO : 1) P2 (5'末端テンプレート可能) 5'GTG ATT CCA CCT TCT CC 3' (SEQ ID NO : 2) P 1 aba (5'末端テンプレート
不全) 5' (aba) (aba) CTA AAG CTG AGA CAT GAC GAG TC 3' (配列番号：3) P2aba (5'末端テンプレート不全) 5' (aba) (aba) GTG ATT CCA CCT TCT CC 3' (配列番号：4)
【００４１】 反応は、Lizardiら., Nature Genetics 3: 225-232 (1998）の記載にしたがっ
て調製した‘Ｇ５４２Ｘギャップ・パドロック・サークル'と称する一本鎖環状
ＥＲＣＡテンプレートＤＮＡを含む。反応 添加物 1 P1 + P2 + Ｇ５４２Ｘギャップ・パドロック・サークル 2 P1+P2 3 P1 4 P2 5 P1aba + P2aba + Ｇ５４２Ｘギャップ・パドロック・サークル 6 P1aba + P2aba 7 P1aba 8 P2aba 9 P1 + P2aba 10 P1aba+P2
【００４２】 反応物を、氷上で組み立て、氷上で３０分間インキュベートする。反応物を６
５℃にすることによって反応を開始し、さらに３時間６５℃でインキュベートす
る。放射性デオキシリボヌクレオチドの取りこみによってＤＮＡ合成の量を計る
ために、０．５、１、１．５、２および３時間の時点でアリコート（４μl）を
取り、ＤＥ８１濾紙にスポットをつける。得られる結果を図６に示す。
【００４３】 図からわかるように、テンプレート可能プライマーを用いる場合、テンプレー
トの不在下では、有意な人工産物ＤＮＡ産生が起こる（Ｐ１＋Ｐ２−サークル曲
線を参照）。このような人工産物ＤＮＡは、テンプレート不全プライマーを用い
ると除去される（Ｐ１(aba)＋Ｐ２(aba)−サークル曲線を参照）。テンプレート
不全プライマーの使用は、正統の増幅を妨げない（Ｐ１(aba)＋Ｐ２(aba)−サー
クル曲線を参照）。１つのテンプレート不全プライマーと１つのテンプレート可
能プライマーの使用は、なお人工産物を生じるが、レベルは減少される（Ｐ１＋
Ｐ２(aba)−サークル曲線およびＰ１(aba)＋Ｐ２−サークル曲線を参照）。
【００４４】 実施例２：脱塩基ヌクレオチド、リボヌクレオチドを用いる指数ローリングサ
ークル増幅におけるプライマー人工産物の除去 この実験は、異なるタイプのテンプレート不全ヌクレオチドを有するテンプレ
ート不全プライマーが（単独または組み合わせで用いる）、ＥＲＣＡのプライマ
ー人工産物を減少させ得ることを説明する。 実施例１に記載の条件下で９種の実験を行う。配列中、小文字の使用によって
示されるように、Ｐ１ＣおよびＰ４Ｃは、５'末端に２'−Ｏ−メチルリボヌクレ
オチドをもつキメラＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。Ｐ１Ｃの５'末
端には２０個の２'−Ｏ−メチルリボヌクレオチドがあり、Ｐ４Ｃの５'末端には
１８個の２'−Ｏ−メチルリボヌクレオチドがある。配列中、大文字の使用によ
って示されるように、Ｐ１ＣおよびＰ４Ｃの３'末端にある６個のヌクレオチド
は、デオキシリボヌクレオチドである。
【００４５】 P1C (5'末端テンプレート不全) 5'aaactaaagctgagacatga CGAGTC 3' (配列番号：5) P4C (5'末端テンプレート不全) 5'agtttaatacgactcact ATAGGG 3' (配列番号：6)
【００４６】反応 添加物 1 P1 + P2 + Ｇ５４２Ｘギャップ・パドロック・サークル 2 P1 + P2 3 P1aba + P2aba + Ｇ５４２Ｘギャップ・パドロック・サークル 4 P1aba + P2aba 5 P1C + P4C 6 P1 + P4C 7 P1C + P2 8 P1aba + P4C 9 P1C + P2aba
【００４７】 反応物を、氷上で組み立て、氷上で３０分間インキュベートする。反応物を６
５℃にすることによって反応を開始し、さらに３時間６５℃でインキュベートす
る。放射性デオキシリボヌクレオチドの取りこみによってＤＮＡ合成の量を計る
ために、０．５、１、２および３時間の時点でアリコート（４μl）を取り、Ｄ
Ｅ８１濾紙にスポットをつける。これらのプライマーは、マッチペア（正常と正
常、脱塩基と脱塩基、キメラとキメラ）およびミスマッチペア（脱塩基とキメラ
、脱塩基と正常、キメラと正常）の両方において使用する。得られる結果を図７
に示す。
【００４８】 図からわかるように、テンプレート不全プライマーのすべての組み合わせが、
人工産物の形成を妨げる（Ｐ１aba＋Ｐ２aba、Ｐ１Ｃ＋Ｐ４Ｃ、Ｐ１aba＋Ｐ４
ＣおよびＰ１Ｃ＋Ｐ２aba曲線を参照）。これは、異なるタイプのテンプレート
不全ヌクレオチドをもつテンプレート不全プライマーの組み合わせを含む（Ｐ１
aba＋Ｐ４ＣおよびＰ１Ｃ＋Ｐ２aba曲線を参照）。１つのテンプレート不全プラ
イマーと１つのテンプレート可能プライマーの使用は、なお人工産物を生じるが
（Ｐ１Ｃ＋Ｐ２曲線を参照）、常にではない（Ｐ１＋Ｐ４Ｃ曲線を参照）。
【００４９】 結果を以下の表にまとめる。プライマーペア 非特異的ＤＮＡ合成 P1 + P2 有り P1aba + P2aba 無し P1C + P4C 無し P1 + P4C 無し P1C + P2 有り(減少) P1aba + P4C 無し P1C + P2aba 無し
【図面の簡単な説明】
【図１】 人工産物の形成に到る、提案された“テンプレーティング”工程
の図である。
【図２】 完全な相補鎖の合成のためのテンプレートとして役立ち得ないこ
とを示している５'末端に脱塩基ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドの図
である。
【図３】 完全な相補鎖の合成のためのテンプレートとして役立ち得ないこ
とを示している５'末端に２つの脱塩基ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチ
ドの図である。
【図４】 合成された鎖の３'末端におけるアデノシンの非テンプレート（
すなわち、オーバーハンギング）付加を介して、ＰＣＲ中にどのようにプライマ
ーダイマーが形成され得るかを示している図である。
【図５】 本発明のテンプレート不全オリゴヌクレオチドの例の種々の構造
の図である（オリゴヌクレオチド２〜１５）。テンプレート不全、テンプレート
可能、プライマー不全およびプライマー可能な各オリゴヌクレオチドの領域を示
す。比較として、オリゴヌクレオチド１は、正常なオリゴヌクレオチドである（
すなわち、完全にテンプレートおよびプライマー可能ヌクレオチドから構成され
る）。
【図６】 コントロールプライマー（Ｐ１およびＰ２）および脱塩基プライ
マー（Ｐ１(ａｂａ)およびＰ２(ａｂａ)）の種々の組み合わせを用いる指数ロー
リングサークル増幅反応中の取り込まれたヌクレオチドの量（ｐｍｏｌ／４μｌ
）対時間（分）のグラフである。脱塩基プライマーは５'末端に２つの脱塩基ヌ
クレオチドをもつものであった。用いたプライマー（およびテンプレートサーク
ルが存在したかどうか）をグラフの右側の各曲線の最終データ点の隣の注釈によ
って示す。底部の５つの注釈（Ｐ１(ａｂａ)＋Ｐ２(ａｂａ)−サークル、Ｐ１単
独、Ｐ２単独、Ｐ１(ａｂａ)単独およびＰ２(ａｂａ)単独）は、ヌクレオチド取
り込みの無いことを示す同一の曲線を有する反応を表す。実施例１に記載した各
曲線に相当する反応の番号を、注釈の隣の丸括弧内に示す。
【図７】 コントロールプライマー（Ｐ１およびＰ２）およびテンプレート
不全プライマー（Ｐ１ａｂａ、Ｐ２ａｂａ、Ｐ１ＣおよびＰ４Ｃ）の種々の組み
合わせを用いる指数ローリングサークル増幅反応中の取り込まれたヌクレオチド
の量（ｐｍｏｌ／４μｌ）対時間（時間）のグラフである。Ｐ１ａｂａおよびＰ
２ａｂａプライマーは５'末端に２つの脱塩基ヌクレオチドをもつものであった
。Ｐ１ＣおよびＰ４Ｃプライマーは、３'末端に６個のデオキシリボヌクレオチ
ドをもち、５'末端に１８個のリボヌクレオチドをもつキメラであった。用いた
プライマー（およびテンプレートサークルが存在したかどうか）をグラフの右側
の各曲線の最終データ点の隣の注釈によって示す。底部の５つの注釈（Ｐ１ａｂ
ａ＋Ｐ２ａｂａ、Ｐ１Ｃ＋Ｐ４Ｃ、Ｐ１＋Ｐ４Ｃ、Ｐ１ａｂａ＋Ｐ４ＣおよびＰ
１Ｃ＋Ｐ２ａｂａ）は、ヌクレオチド取り込みの無いことを示す同一の曲線を有
する反応を表す。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims (76)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 核酸増幅反応中の人工産物の形成を減少させる方法であって
    、 テンプレート不全オリゴヌクレオチドを用い； テンプレート不全オリゴヌクレオチドが、１つまたはそれ以上のテンプレート
    不全ヌクレオチドを含み； テンプレート不全オリゴヌクレオチドの３'末端に最も近接したテンプレート
    不全ヌクレオチドのテンプレート可能ヌクレオチド３'の数および組成が、３'末
    端に最も近接したテンプレート不全ヌクレオチドのテンプレート可能ヌクレオチ
    ド３'に、単独で、核酸増幅反応において有効に核酸合成を開始させるようにす
    るのに十分である： ことを含む方法。
  2. 【請求項２】 １つまたはそれ以上のテンプレート不全ヌクレオチドが、テ
    ンプレート不全オリゴヌクレオチドの５'末端またはその近位にある請求項１記
    載の方法。
  3. 【請求項３】 テンプレート不全オリゴヌクレオチドが、２つまたはそれ以
    上のテンプレート不全ヌクレオチドを含み、２つまたはそれ以上のテンプレート
    不全ヌクレオチドの少なくとも２つが隣接する請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 ２つまたはそれ以上の隣接するテンプレート不全ヌクレオチ
    ドが、テンプレート不全オリゴヌクレオチドの５'末端から３ヌクレオチド以内
    にある請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】 テンプレート不全ヌクレオチドが、修飾ヌクレオチド、誘導
    体化ヌクレオチド、リボヌクレオチドおよびヌクレオチド類縁体からなるグルー
    プから選ばれる請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】 テンプレート不全オリゴヌクレオチドが、２つまたはそれ以
    上のテンプレート不全ヌクレオチドを含み、２つまたはそれ以上のテンプレート
    不全ヌクレオチドの少なくとも２つが相異する請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】 テンプレート不全オリゴヌクレオチドが、２つまたはそれ以
    上のテンプレート不全ヌクレオチドを含み、２つまたはそれ以上のテンプレート
    不全ヌクレオチドの少なくとも２つが異なる理由でテンプレート不全である請求
    項１記載の方法。
  8. 【請求項８】 テンプレート不全ヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである
    請求項５記載の方法。
  9. 【請求項９】 テンプレート不全ヌクレオチドが、脱塩基ヌクレオチドであ
    る請求項５記載の方法。
  10. 【請求項１０】 テンプレート不全ヌクレオチドが、脱塩基ヌクレオチド、
    逆位塩基をもつヌクレオチド、フルオロ置換ヌクレオチド、アルキル置換ヌクレ
    オチド、フェニル置換エーテルをもつヌクレオチド、置換チオエーテルをもつヌ
    クレオチド、リン酸エステルをもつヌクレオチド、α−ヌクレオチド、２',３'
    −ジデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、ビオチン誘導体化ヌクレオチド
    、アミン誘導体化ヌクレオチド、Ｈｅｘ誘導体化ヌクレオチド、Ｔｅｔ誘導体化
    ヌクレオチド、Ｆａｍ誘導体化ヌクレオチド、フルオレセイン誘導体化ヌクレオ
    チド、ローダミン誘導体化ヌクレオチド、アルカリホスファターゼ誘導体化ヌク
    レオチド、西洋ワサビペルオキシダーゼ誘導体化ヌクレオチド、スペーサー誘導
    体化ヌクレオチド、コレステリル誘導体化ヌクレオチド、ＤＮＰ−ＴＥＧ誘導体
    化ヌクレオチド、ソラレンクロスリンカー誘導体化ヌクレオチド、インターカレ
    ーション剤誘導体化ヌクレオチドおよびＰＮＡ複合体誘導体化ヌクレオチドから
    なるグループから選ばれる請求項５記載の方法。
  11. 【請求項１１】 核酸増幅反応が、サイクルシーケンシングを含まない請求
    項１記載の方法。
  12. 【請求項１２】 核酸増幅反応が、サーマルサイクリングを介する線形増幅
    を必要としない請求項１１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 核酸増幅反応が、サーマルサイクリングを介する線形増幅
    を含まない請求項１２記載の方法。
  14. 【請求項１４】 核酸増幅反応が、サーマルサイクリングを介する指数増幅
    を含む請求項１記載の方法。
  15. 【請求項１５】 核酸増幅反応が、サーマルサイクリングを介する指数増幅
    を必要とする請求項１４記載の方法。
  16. 【請求項１６】 核酸増幅反応が、ポリメラーゼ鎖反応を含む請求項１４記
    載の方法。
  17. 【請求項１７】 核酸増幅反応が、サーマルサイクリングを含まない請求項
    １記載の方法。
  18. 【請求項１８】 核酸増幅反応が、ローリングサークル増幅である請求項１
    ７記載の方法。
  19. 【請求項１９】 核酸増幅反応が、指数ローリングサークル増幅(ＥＲＣＡ)
    およびローリングサークル増幅(ＲＣＡ)、 マルチプル置換増幅(ＭＤＡ)、 スト
    ランド置換増幅(ＳＤＡ)、核酸配列ベース増幅 (ＮＡＳＢＡ)、転写媒介増幅（
    ＴＭＡ）、ポリメラーゼ鎖反応(ＰＣＲ)、自続式配列複製(３ＳＲ)、Ｑβレプリ
    カーゼによる増幅およびサイクルシーケンシングからなるグループから選ばれる
    請求項１記載の方法。
  20. 【請求項２０】 テンプレート不全オリゴヌクレオチドが、プライマーであ
    る請求項１記載の方法。
  21. 【請求項２１】 核酸増幅反応に用いるすべてのプライマーが、テンプレー
    ト不全である請求項２０記載の方法。
  22. 【請求項２２】 核酸増幅反応に用いるすべてのオリゴヌクレオチドが、テ
    ンプレート不全である請求項１記載の方法。
  23. 【請求項２３】 核酸増幅反応中の人工産物の形成を減少させる方法であっ
    て、 核酸増幅反応における少なくとも１つのオリゴヌクレオチドとしてテンプレー
    ト不全オリゴヌクレオチドを用い； 核酸増幅反応が、サイクルシーケンシングを含まない； ことを含む方法。
  24. 【請求項２４】 核酸増幅反応が、サーマルサイクリングを介する線形増幅
    を必要としない請求項２３記載の方法。
  25. 【請求項２５】 核酸増幅反応が、サーマルサイクリングを介する線形増幅
    を含まない請求項２４記載の方法。
  26. 【請求項２６】 核酸増幅反応が、サーマルサイクリングを含まない請求項
    ２３記載の方法。
  27. 【請求項２７】 核酸増幅反応が、ローリングサークル増幅である請求項２
    ６記載の方法。
  28. 【請求項２８】 核酸増幅反応が、サーマルサイクリングを介する指数増幅
    を含む請求項２３記載の方法。
  29. 【請求項２９】 核酸増幅反応が、サーマルサイクリングを介する指数増幅
    を必要とする請求項２８記載の方法。
  30. 【請求項３０】 核酸増幅反応が、ポリメラーゼ鎖反応を含む請求項２８記
    載の方法。
  31. 【請求項３１】 核酸増幅反応が、指数ローリングサークル増幅(ＥＲＣＡ)
    およびローリングサークル増幅(ＲＣＡ)、 マルチプル置換増幅(ＭＤＡ)、 スト
    ランド置換増幅(ＳＤＡ)、核酸配列ベース増幅 (ＮＡＳＢＡ)、転写媒介増幅（
    ＴＭＡ）、ポリメラーゼ鎖反応(ＰＣＲ)、自続式配列複製(３ＳＲ)およびＱβレ
    プリカーゼによる増幅からなるグループから選ばれる請求項２３記載の方法。
  32. 【請求項３２】 テンプレート不全オリゴヌクレオチドが、１つまたはそれ
    以上のテンプレート不全ヌクレオチドを含む請求項２３記載の方法。
  33. 【請求項３３】 １つまたはそれ以上のテンプレート不全ヌクレオチドが、
    テンプレート不全オリゴヌクレオチドの５'末端またはその近位にある請求項３
    ２記載の方法。
  34. 【請求項３４】 テンプレート不全オリゴヌクレオチドが、２つまたはそれ
    以上のテンプレート不全ヌクレオチドを含み、２つまたはそれ以上のテンプレー
    ト不全ヌクレオチドの少なくとも２つが隣接する請求項３２記載の方法。
  35. 【請求項３５】 ２つまたはそれ以上の隣接するテンプレート不全ヌクレオ
    チドが、テンプレート不全オリゴヌクレオチドの５'末端から３ヌクレオチド以
    内にある請求項３４記載の方法。
  36. 【請求項３６】 テンプレート不全ヌクレオチドが、修飾ヌクレオチド、誘
    導体化ヌクレオチド、リボヌクレオチドおよびヌクレオチド類縁体からなるグル
    ープから選ばれる請求項３２記載の方法。
  37. 【請求項３７】 テンプレート不全オリゴヌクレオチドが、２つまたはそれ
    以上のテンプレート不全ヌクレオチドを含み、２つまたはそれ以上のテンプレー
    ト不全ヌクレオチドの少なくとも２つが相異する請求項３２記載の方法。
  38. 【請求項３８】 テンプレート不全オリゴヌクレオチドが、２つまたはそれ
    以上のテンプレート不全ヌクレオチドを含み、２つまたはそれ以上のテンプレー
    ト不全ヌクレオチドの少なくとも２つが異なる理由でテンプレート不全である請
    求項３２記載の方法。
  39. 【請求項３９】 テンプレート不全ヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドであ
    る請求項３６記載の方法。
  40. 【請求項４０】 テンプレート不全ヌクレオチドが、脱塩基ヌクレオチドで
    ある請求項３６記載の方法。
  41. 【請求項４１】 テンプレート不全ヌクレオチドが、脱塩基ヌクレオチド、
    逆位塩基をもつヌクレオチド、フルオロ置換ヌクレオチド、アルキル置換ヌクレ
    オチド、フェニル置換エーテルをもつヌクレオチド、置換チオエーテルをもつヌ
    クレオチド、リン酸エステルをもつヌクレオチド、α−ヌクレオチド、２',３'
    −ジデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、ビオチン誘導体化ヌクレオチド
    、アミン誘導体化ヌクレオチド、Ｈｅｘ誘導体化ヌクレオチド、Ｔｅｔ誘導体化
    ヌクレオチド、Ｆａｍ誘導体化ヌクレオチド、フルオレセイン誘導体化ヌクレオ
    チド、ローダミン誘導体化ヌクレオチド、アルカリホスファターゼ誘導体化ヌク
    レオチド、西洋ワサビペルオキシダーゼ誘導体化ヌクレオチド、スペーサー誘導
    体化ヌクレオチド、コレステリル誘導体化ヌクレオチド、ＤＮＰ−ＴＥＧ誘導体
    化ヌクレオチド、ソラレンクロスリンカー誘導体化ヌクレオチド、インターカレ
    ーション剤誘導体化ヌクレオチドおよびＰＮＡ複合体誘導体化ヌクレオチドから
    なるグループから選ばれる請求項３６記載の方法。
  42. 【請求項４２】 テンプレート不全オリゴヌクレオチドの３'末端に最も近
    接したテンプレート不全ヌクレオチドのテンプレート可能ヌクレオチド３'の数
    および組成が、３'末端に最も近接したテンプレート不全ヌクレオチドのテンプ
    レート可能ヌクレオチド３'に、単独で、核酸増幅反応において有効に核酸合成
    を開始させるようにするのに十分である請求項３２記載の方法。
  43. 【請求項４３】 テンプレート不全オリゴヌクレオチドが、プライマーであ
    る請求項２３記載の方法。
  44. 【請求項４４】 核酸増幅反応に用いるすべてのプライマーが、テンプレー
    ト不全である請求項４３記載の方法。
  45. 【請求項４５】 核酸増幅反応に用いるすべてのオリゴヌクレオチドが、テ
    ンプレート不全である請求項２３記載の方法。
  46. 【請求項４６】 核酸増幅反応中の人工産物の形成を減少させる方法であっ
    て、 核酸増幅反応における少なくとも１つのオリゴヌクレオチドとしてテンプレー
    ト不全オリゴヌクレオチドを用い； 核酸増幅反応が、サーマルサイクリングを介する指数増幅を含む； ことを含む方法。
  47. 【請求項４７】 核酸増幅反応が、サーマルサイクリングを介する指数増幅
    を必要とする請求項４６記載の方法。
  48. 【請求項４８】 核酸増幅反応が、ポリメラーゼ鎖反応を含む請求項４６記
    載の方法。
  49. 【請求項４９】 テンプレート不全オリゴヌクレオチドが、１つまたはそれ
    以上のテンプレート不全ヌクレオチドを含む請求項４６記載の方法。
  50. 【請求項５０】 テンプレート不全オリゴヌクレオチドの３'末端に最も近
    接したテンプレート不全ヌクレオチドのテンプレート可能ヌクレオチド３'の数
    および組成が、３'末端に最も近接したテンプレート不全ヌクレオチドのテンプ
    レート可能ヌクレオチド３'に、単独で、核酸増幅反応において有効に核酸合成
    を開始させるようにするのに十分である、１つまたはそれ以上のテンプレート不
    全ヌクレオチドを含むテンプレート不全オリゴヌクレオチド。
  51. 【請求項５１】 １つまたはそれ以上のテンプレート不全ヌクレオチドが、
    テンプレート不全オリゴヌクレオチドの５'末端またはその近位にある請求項５
    ０記載のテンプレート不全オリゴヌクレオチド。
  52. 【請求項５２】 テンプレート不全オリゴヌクレオチドが、２つまたはそれ
    以上のテンプレート不全ヌクレオチドを含み、２つまたはそれ以上のテンプレー
    ト不全ヌクレオチドの少なくとも２つが隣接する請求項５０記載のテンプレート
    不全オリゴヌクレオチド。
  53. 【請求項５３】 ２つまたはそれ以上の隣接するテンプレート不全ヌクレオ
    チドが、テンプレート不全オリゴヌクレオチドの５'末端から３ヌクレオチド以
    内にある請求項５２記載のテンプレート不全オリゴヌクレオチド。
  54. 【請求項５４】 テンプレート不全ヌクレオチドが、修飾ヌクレオチド、誘
    導体化ヌクレオチド、リボヌクレオチドおよびヌクレオチド類縁体からなるグル
    ープから選ばれる請求項５０記載のテンプレート不全オリゴヌクレオチド。
  55. 【請求項５５】 テンプレート不全オリゴヌクレオチドが、２つまたはそれ
    以上のテンプレート不全ヌクレオチドを含み、２つまたはそれ以上のテンプレー
    ト不全ヌクレオチドの少なくとも２つが相異する請求項５０記載のテンプレート
    不全オリゴヌクレオチド。
  56. 【請求項５６】 テンプレート不全オリゴヌクレオチドが、２つまたはそれ
    以上のテンプレート不全ヌクレオチドを含み、２つまたはそれ以上のテンプレー
    ト不全ヌクレオチドの少なくとも２つが異なる理由でテンプレート不全である請
    求項５０記載のテンプレート不全オリゴヌクレオチド。
  57. 【請求項５７】 テンプレート不全ヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドであ
    る請求項５４記載のテンプレート不全オリゴヌクレオチド。
  58. 【請求項５８】 テンプレート不全ヌクレオチドが、脱塩基ヌクレオチドで
    ある請求項５４記載のテンプレート不全オリゴヌクレオチド。
  59. 【請求項５９】 テンプレート不全ヌクレオチドが、脱塩基ヌクレオチド、
    逆位塩基をもつヌクレオチド、フルオロ置換ヌクレオチド、アルキル置換ヌクレ
    オチド、フェニル置換エーテルをもつヌクレオチド、置換チオエーテルをもつヌ
    クレオチド、リン酸エステルをもつヌクレオチド、α−ヌクレオチド、２',３'
    −ジデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、ビオチン誘導体化ヌクレオチド
    、アミン誘導体化ヌクレオチド、Ｈｅｘ誘導体化ヌクレオチド、Ｔｅｔ誘導体化
    ヌクレオチド、Ｆａｍ誘導体化ヌクレオチド、フルオレセイン誘導体化ヌクレオ
    チド、ローダミン誘導体化ヌクレオチド、アルカリホスファターゼ誘導体化ヌク
    レオチド、西洋ワサビペルオキシダーゼ誘導体化ヌクレオチド、スペーサー誘導
    体化ヌクレオチド、コレステリル誘導体化ヌクレオチド、ＤＮＰ−ＴＥＧ誘導体
    化ヌクレオチド、ソラレンクロスリンカー誘導体化ヌクレオチド、インターカレ
    ーション剤誘導体化ヌクレオチドおよびＰＮＡ複合体誘導体化ヌクレオチドから
    なるグループから選ばれる請求項５４記載のテンプレート不全オリゴヌクレオチ
    ド。
  60. 【請求項６０】 テンプレート不全プライマーを含む核酸増幅用キットであ
    って、 該テンプレート不全プライマーが、１つまたはそれ以上のテンプレート不全ヌ
    クレオチドを含み； テンプレート不全プライマーの３'末端に最も近接したテンプレート不全ヌク
    レオチドのテンプレート可能ヌクレオチド３'の数および組成が、３'末端に最も
    近接したテンプレート不全ヌクレオチドのテンプレート可能ヌクレオチド３'に
    、単独で、核酸増幅反応において有効に核酸合成を開始させるようにするのに十
    分である； ことを含むキット。
  61. 【請求項６１】 １つまたはそれ以上のテンプレート不全ヌクレオチドが、
    テンプレート不全プライマーの５'末端またはその近位にある請求項６０記載の
    キット。
  62. 【請求項６２】 テンプレート不全プライマーが、２つまたはそれ以上のテ
    ンプレート不全ヌクレオチドを含み、２つまたはそれ以上のテンプレート不全ヌ
    クレオチドの少なくとも２つが隣接する請求項６０記載のキット。
  63. 【請求項６３】 ２つまたはそれ以上の隣接するテンプレート不全ヌクレオ
    チドが、テンプレート不全プライマーの５'末端から３ヌクレオチド以内にある
    請求項６２記載のキット。
  64. 【請求項６４】 テンプレート不全ヌクレオチドが、修飾ヌクレオチド、誘
    導体化ヌクレオチド、リボヌクレオチドおよびヌクレオチド類縁体からなるグル
    ープから選ばれる請求項６０記載のキット。
  65. 【請求項６５】 テンプレート不全プライマーが、２つまたはそれ以上のテ
    ンプレート不全ヌクレオチドを含み、２つまたはそれ以上のテンプレート不全ヌ
    クレオチドの少なくとも２つが相異する請求項６０記載のキット。
  66. 【請求項６６】 テンプレート不全プライマーが、２つまたはそれ以上のテ
    ンプレート不全ヌクレオチドを含み、２つまたはそれ以上のテンプレート不全ヌ
    クレオチドの少なくとも２つが異なる理由でテンプレート不全である請求項６０
    記載のキット。
  67. 【請求項６７】 テンプレート不全ヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドであ
    る請求項６４記載のキット。
  68. 【請求項６８】 テンプレート不全ヌクレオチドが、脱塩基ヌクレオチドで
    ある請求項６４記載のキット。
  69. 【請求項６９】 テンプレート不全ヌクレオチドが、脱塩基ヌクレオチド、
    逆位塩基をもつヌクレオチド、フルオロ置換ヌクレオチド、アルキル置換ヌクレ
    オチド、フェニル置換エーテルをもつヌクレオチド、置換チオエーテルをもつヌ
    クレオチド、リン酸エステルをもつヌクレオチド、α−ヌクレオチド、２',３'
    −ジデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、ビオチン誘導体化ヌクレオチド
    、アミン誘導体化ヌクレオチド、Ｈｅｘ誘導体化ヌクレオチド、Ｔｅｔ誘導体化
    ヌクレオチド、Ｆａｍ誘導体化ヌクレオチド、フルオレセイン誘導体化ヌクレオ
    チド、ローダミン誘導体化ヌクレオチド、アルカリホスファターゼ誘導体化ヌク
    レオチド、西洋ワサビペルオキシダーゼ誘導体化ヌクレオチド、スペーサー誘導
    体化ヌクレオチド、コレステリル誘導体化ヌクレオチド、ＤＮＰ−ＴＥＧ誘導体
    化ヌクレオチド、ソラレンクロスリンカー誘導体化ヌクレオチド、インターカレ
    ーション剤誘導体化ヌクレオチドおよびＰＮＡ複合体誘導体化ヌクレオチドから
    なるグループから選ばれる請求項６４記載のキット。
  70. 【請求項７０】 核酸増幅反応が、サイクルシーケンシングを含まない請求
    項６０記載のキット。
  71. 【請求項７１】 核酸増幅反応が、サーマルサイクリングを介する線形増幅
    を必要としない請求項７０記載のキット。
  72. 【請求項７２】 核酸増幅反応が、サーマルサイクリングを介する線形増幅
    を含まない請求項７４記載のキット。
  73. 【請求項７３】 核酸増幅反応が、サーマルサイクリングを介する指数増幅
    を含む請求項６３記載のキット。
  74. 【請求項７４】 核酸増幅反応が、サーマルサイクリングを介する指数増幅
    を必要とする請求項７６記載のキット。
  75. 【請求項７５】 核酸増幅反応が、ポリメラーゼ鎖反応を含む請求項７６記
    載のキット。
  76. 【請求項７６】 核酸増幅反応が、指数ローリングサークル増幅(ＥＲＣＡ)
    およびローリングサークル増幅(ＲＣＡ)、 マルチプル置換増幅(ＭＤＡ)、 スト
    ランド置換増幅(ＳＤＡ)、核酸配列ベース増幅 (ＮＡＳＢＡ)、転写媒介増幅（
    ＴＭＡ）、ポリメラーゼ鎖反応(ＰＣＲ)、自続式配列複製(３ＳＲ)およびＱβレ
    プリカーゼによる増幅からなるグループから選ばれる請求項６３記載のキット。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1932924A1 (en) 2006-11-22 2008-06-18 FUJIFILM Corporation Nucleic acid amplification method using microchip and microchip, and nucleic acid amplification system using the same
JP2010539956A (ja) * 2007-10-04 2010-12-24 コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガニゼイション 核酸増幅

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6692918B2 (en) * 1999-09-13 2004-02-17 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for linear isothermal amplification of polynucleotide sequences
US7846733B2 (en) 2000-06-26 2010-12-07 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for transcription-based nucleic acid amplification
CA2430329A1 (en) 2000-12-13 2002-06-20 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for generation of multiple copies of nucleic acid sequences and methods of detection thereof
US8507662B2 (en) 2001-01-19 2013-08-13 General Electric Company Methods and kits for reducing non-specific nucleic acid amplification
BR0205268A (pt) 2001-03-09 2004-11-30 Nugen Technologies Inc Processos e composições para a mplificação de sequências de rna
US7297485B2 (en) * 2001-10-15 2007-11-20 Qiagen Gmbh Method for nucleic acid amplification that results in low amplification bias
US7629152B2 (en) 2002-03-01 2009-12-08 Integrated Dna Technologies, Inc. Methods for amplifying polymeric nucleic acids
US7176025B2 (en) 2002-03-11 2007-02-13 Nugen Technologies, Inc. Methods for generating double stranded DNA comprising a 3′ single stranded portion and uses of these complexes for recombination
US9487823B2 (en) 2002-12-20 2016-11-08 Qiagen Gmbh Nucleic acid amplification
WO2004092418A2 (en) 2003-04-14 2004-10-28 Nugen Technologies, Inc. Global amplification using a randomly primed composite primer
WO2005012499A2 (en) * 2003-08-01 2005-02-10 Integrated Dna Technologies, Inc. Methods for amplifying polymeric nucleic acids
JP2007524407A (ja) 2003-12-29 2007-08-30 ニューゲン テクノロジーズ， インコーポレイテッド 核酸のメチル化状態を分析するための方法、ならびに核酸の断片化、標識化および固定化のための方法
US7939258B2 (en) 2005-09-07 2011-05-10 Nugen Technologies, Inc. Nucleic acid amplification procedure using RNA and DNA composite primers
EP1762627A1 (de) 2005-09-09 2007-03-14 Qiagen GmbH Verfahren zur Aktivierung einer Nukleinsäure für eine Polymerase-Reaktion
US8460874B2 (en) 2007-07-03 2013-06-11 Genaphora Ltd. Use of RNA/DNA chimeric primers for improved nucleic acid amplification reactions
US8034568B2 (en) 2008-02-12 2011-10-11 Nugen Technologies, Inc. Isothermal nucleic acid amplification methods and compositions
WO2009117698A2 (en) 2008-03-21 2009-09-24 Nugen Technologies, Inc. Methods of rna amplification in the presence of dna
US9206418B2 (en) 2011-10-19 2015-12-08 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for directional nucleic acid amplification and sequencing
US9115394B2 (en) 2011-12-22 2015-08-25 Roche Molecular Systems, Inc. Methods and reagents for reducing non-specific amplification
CN104093890B (zh) 2012-01-26 2016-04-20 纽亘技术公司 用于靶向核酸序列富集和高效文库产生的组合物和方法
JP6181751B2 (ja) 2012-06-18 2017-08-16 ニューゲン テクノロジーズ， インコーポレイテッド 望まれない核酸配列のネガティブ選択のための組成物および方法
US20150011396A1 (en) 2012-07-09 2015-01-08 Benjamin G. Schroeder Methods for creating directional bisulfite-converted nucleic acid libraries for next generation sequencing
US9822408B2 (en) 2013-03-15 2017-11-21 Nugen Technologies, Inc. Sequential sequencing
EP3068883B1 (en) 2013-11-13 2020-04-29 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for identification of a duplicate sequencing read
US9745614B2 (en) 2014-02-28 2017-08-29 Nugen Technologies, Inc. Reduced representation bisulfite sequencing with diversity adaptors
US10227624B2 (en) 2014-07-18 2019-03-12 Fluidigm Corporation Reagents and kit compositions for single-cell whole genome amplification
JP6803327B2 (ja) 2014-08-06 2020-12-23 ニューゲン テクノロジーズ， インコーポレイテッド 標的化されたシークエンシングからのデジタル測定値
GB201621514D0 (en) 2016-12-16 2017-02-01 Q-Linea Ab Padlock probe detection method
US11099202B2 (en) 2017-10-20 2021-08-24 Tecan Genomics, Inc. Reagent delivery system
CN112439369B (zh) * 2021-02-01 2021-04-23 中国农业大学 Dna正四面体-滚环扩增产物双交联水凝胶的制备方法

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5573907A (en) 1990-01-26 1996-11-12 Abbott Laboratories Detecting and amplifying target nucleic acids using exonucleolytic activity
KR950013953B1 (ko) 1990-01-26 1995-11-18 애보트 래보라토리즈 리가제 연쇄 반응에 적용가능한 표적 핵산의 증폭 방법
WO1992006189A1 (en) * 1990-09-27 1992-04-16 Invitrogen Corporation Direct cloning of pcr amplified nucleic acids
AU4674393A (en) * 1992-07-20 1994-02-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pseudo-half-knot rna formation by hybridization of antisense oligonucleotides to target rna's secondary structure
EP0656068B1 (en) * 1992-07-24 1999-12-15 University Of South Australia Amplification and detection process
US6096880A (en) 1993-04-15 2000-08-01 University Of Rochester Circular DNA vectors for synthesis of RNA and DNA
US6027923A (en) * 1993-07-23 2000-02-22 Bio-Rad Laboratories, Inc. Linked linear amplification of nucleic acids
EP0710296A4 (en) * 1993-07-23 1999-05-26 Bio Rad Laboratories LINEAR AMPLIFICATION OF NUCLEIC ACIDS
US5925517A (en) 1993-11-12 1999-07-20 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits
US5876924A (en) 1994-06-22 1999-03-02 Mount Sinai School Of Medicine Nucleic acid amplification method hybridization signal amplification method (HSAM)
US5942391A (en) 1994-06-22 1999-08-24 Mount Sinai School Of Medicine Nucleic acid amplification method: ramification-extension amplification method (RAM)
US5629178A (en) * 1994-10-28 1997-05-13 Genetics & Ivf Institute Method for enhancing amplification in the polymerase chain reaction employing peptide nucleic acid (PNA)
JP2001518054A (ja) * 1995-06-07 2001-10-09 パーセプティブ バイオシステムズ，インコーポレーテッド Ｐｎａ−ｄｎａキメラと、このキメラ合成用のｐｎａシントン
AT402203B (de) 1995-06-13 1997-03-25 Himmler Gottfried Dipl Ing Dr Verfahren zur transkriptionsfreien amplifizierung von nucleinsäuren
DE69626032T2 (de) 1995-10-20 2004-01-22 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Modifizierung von oligonukleotid-primer-sequenzen zum manipilieren der zugabe von nicht-template-nukleotiden
DK0862656T3 (da) 1995-11-21 2001-04-09 Univ Yale Unimolekylær segmentamplifikation og -detektering
US5854033A (en) 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
US5866336A (en) 1996-07-16 1999-02-02 Oncor, Inc. Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon
US6117635A (en) 1996-07-16 2000-09-12 Intergen Company Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon
US6361940B1 (en) * 1996-09-24 2002-03-26 Qiagen Genomics, Inc. Compositions and methods for enhancing hybridization and priming specificity
US6124092A (en) 1996-10-04 2000-09-26 The Perkin-Elmer Corporation Multiplex polynucleotide capture methods and compositions
DK0866071T3 (da) 1997-03-20 2005-01-17 Hoffmann La Roche Modificerede primere
US6124120A (en) 1997-10-08 2000-09-26 Yale University Multiple displacement amplification
US6261783B1 (en) 1997-12-15 2001-07-17 Gilead Sciences, Inc. Homogeneous detection of a target through nucleic acid ligand-ligand beacon interaction
JP4318856B2 (ja) * 1998-03-05 2009-08-26 ジョンソン・アンド・ジョンソン・リサーチ・ピー・ティー・ワイ・リミテッド チモーゲン性核酸検出方法、および関連分子およびキット
JP2002525078A (ja) 1998-09-15 2002-08-13 イェール ユニバーシティ 人工的長末端反復配列
US6277607B1 (en) 1999-05-24 2001-08-21 Sanjay Tyagi High specificity primers, amplification methods and kits
US6316230B1 (en) * 1999-08-13 2001-11-13 Applera Corporation Polymerase extension at 3′ terminus of PNA-DNA chimera
US6221603B1 (en) 2000-02-04 2001-04-24 Molecular Dynamics, Inc. Rolling circle amplification assay for nucleic acid analysis
US6291187B1 (en) 2000-05-12 2001-09-18 Molecular Staging, Inc. Poly-primed amplification of nucleic acid sequences
US6323009B1 (en) 2000-06-28 2001-11-27 Molecular Staging, Inc. Multiply-primed amplification of nucleic acid sequences

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1932924A1 (en) 2006-11-22 2008-06-18 FUJIFILM Corporation Nucleic acid amplification method using microchip and microchip, and nucleic acid amplification system using the same
JP2010539956A (ja) * 2007-10-04 2010-12-24 コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガニゼイション 核酸増幅

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Publication number Publication date
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