JP7001678B2

JP7001678B2 - Ｎｇｓライブラリー濃度の正規化

Info

Publication number: JP7001678B2
Application number: JP2019512800A
Authority: JP
Inventors: ブラディミルマカロフ，; サージーチュプリータ，
Original assignee: スウィフトバイオサイエンシーズ，インコーポレイテッド
Priority date: 2016-09-06
Filing date: 2017-09-06
Publication date: 2022-02-04
Anticipated expiration: 2037-09-06
Also published as: AU2017324946B2; WO2018048957A3; US20210277447A1; WO2018048957A2; JP7439041B2; US20190211374A1; CN110012671A; CA3035698A1; US20240068011A1; US11697836B2; JP2019526267A; AU2017324946A1; JP2022044605A; EP3510155A2; AU2017324946C1; US10961562B2; EP3510155A4

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年９月６日に出願された米国仮出願番号第６２／３８４，１１８号に基づく優先権を主張しており、この仮出願の全体は、参考として本明細書中に援用される。
［０００１．１］
本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。上記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１７年９月２２日に作成され、１６－２１０２９－ＷＯＳＬ．ｔｘｔの名称であり、サイズが３１，２２１バイトである。

背景
高品質の次世代配列決定（ＮＧＳ）データを最大化するためには、正確な分量のライブラリーＤＮＡを配列決定機器にローディングすることが必要不可欠である。不十分な分量のライブラリーＤＮＡがローディングされると、低クラスター密度（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）／低鋳型陽性ＩＳＰ（low template-positive ISP）（ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ）および配列決定出力低減がもたらされ、その一方、ライブラリーＤＮＡが過剰に存在すると、キメラクラスター（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）／ポリクローナルＩＳＰ（ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ）がもたらされ、品質が低い、低減されたデータが得られることになる。ライブラリーが多重配列決定のためにプールされる場合、不正確な定量化は、不均衡な配列データに結び付き、過少に定量化されたライブラリーは過剰に配列決定され、過剰に定量化されたライブラリーは過少に配列決定される。これらの理由で、配列決定可能なライブラリー分子の数の正確な定量化は、ＮＧＳワークフローの重要なステップである。ハイブリダイゼーション捕捉のための多重プールを生成するためにライブラリーをプールする場合も、正確なライブラリー定量化が必要である。ライブラリー定量化のための現行方法としては、チップ電気泳動法（例えば、ＡｇｉｌｅｎｔＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ）、ｄｓＤＮＡの蛍光定量法（例えば、Ｑｕｂｉｔ）、およびｑＰＣＲ（種々の市販キット）が挙げられる。チップ電気泳動法および蛍光定量法は両方とも、完全に適合するライブラリー分子が濃縮されたＰＣＲ増幅ライブラリーを正確に定量化することができるに過ぎない。それは、これらの方法では、ＰＣＲフリーライブラリー調製物中に存在する、機能的分子（両ＮＧＳアダプターを含有する断片）と、非機能的分子（１つのみのＮＧＳアダプターを含有するかまたはＮＧＳアダプターを含有しない断片）とを区別することができないためである。ｑＰＣＲは、機能的ライブラリー分子の正確な定量化を可能にするため、ＮＧＳワークフローで広く使用されているが、このプロトコールは、複数のピペットステップを含み、相当量の時間がかかる。各ライブラリーを系列希釈し、標準曲線に沿ってｑＰＣＲアッセイを三重反復で実行し、その後、ｑＰＣＲデータ分析をしなければならない。ｑＰＣＲ定量化手順には、ほぼ２時間かかり、手動取扱い時間は少なくとも４５分間である。最後に、これらの方法のすべては、試料をプールする際に、各ＮＧＳライブラリーの手作業濃度調整を必要とする。加えて、すべての現行のライブラリー定量化法は、ライブラリーインサートサイズに依存して、質量をモル濃度に変換しており、ライブラリーが幅広いサイズ分布または不画定のサイズを有する場合、モル定量化は正確には決定されない。

要旨

本開示は、ライブラリーインサートサイズに依存しないＮＧＳライブラリー濃度のモル正規化のための新規手順を提供する。本方法は、ライブラリー濃度の手作業調整が後に行われるライブラリー定量化（図１Ａ）に対する単純な代替法を提供する。開示されているライブラリー正規化は、単一ステップまたはいくつかのステップのいずれかで生じ、等モルのＮＧＳライブラリー分量を有する複数の試料を産生する。

単一ステップを必要とする方法は、ＰＣＲに基づく正規化（Ｎ－ＰＣＲ）であり、各ＮＧＳライブラリーの増幅が、加速アニーリング動力学を示す限定された濃度の正規化プライマー（Ｎ－ＰＣＲプライマー）、およびＰＣＲ反応中にプライマーが完全に利用され、したがって各ＮＧＳライブラリーの指定モル分量が提供される増幅条件を使用して実施される。

いくつかのステップを必要とする方法は、酵素に基づく正規化であり、以下を要する：
ａ．ＰＣＲ中またはＰＣＲ後の酵素消化中のいずれかにおいて、一方または両方の末端に５’または３’突出をもたらすプレ正規化プライマー（プレＮプライマー）を使用する、過剰分量の各ＮＧＳライブラリーのＰＣＲ増幅、およびその後の精製ステップ、
ｂ．各増幅されたライブラリーを、限定的な指定モル分量の正規化プローブ（Ｎ－プローブ）および一部の実施形態ではＤＮＡリガーゼとのインキュベーションであって、５’または３’突出とのプローブアニーリングおよびライゲーションにより、Ｎ－プローブと等モルのライブラリー画分が選択される、インキュベーション、ならびに
ｃ．一部の実施形態では、プローブ選択画分の単離を、非選択ライブラリー画分の酵素消化により、または固相固定化からのプローブ選択画分の酵素媒介性放出により実施する。

酵素に基づく正規化法の例示的なワークフローは、図１Ｂに示されている。見ての通り、本プロセスは、図１Ａに示されているｑＰＣＲ定量化および手作業調整よりも短い手動取扱い時間および短い合計時間を伴い得る。

したがって、正規化ＰＣＲプライマー濃度を限定すること、またはＮ－プローブ濃度を限定することのいずれかにより、ライブラリー正規化が達成される（例えば、ライブラリー正規化のシミュレーションについては図２を参照。点線は、正規化プローブの分量を表す）。図２に示されているように、本開示の方法を使用すると、過剰分量のライブラリーが排除され、等モルのライブラリー濃度がもたらされ得るように、ライブラリーを正規化することができる。開示されているＮＧＳライブラリー正規化は迅速であり、系列希釈または手作業濃度調整を必要としないため、ｑＰＣＲ定量化と比較して、手動取扱い時間が最大１時間および合計調製時間が最大２時間削減される。本方法は、配列決定機器にローディングする前にＮＧＳライブラリーのモル濃度を調整するために、またはハイブリダイゼーション捕捉前にプールを行うために使用することができる（それぞれ、図３Ａおよび３Ｂ）。これは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ、またはＰＣＲ増幅ＤＮＡライブラリーを配列決定する他のプラットフォームを使用するあらゆるＮＧＳライブラリー（ＤＮＡまたはＲＮＡ）と適合性である。開示されている選択肢では、非常に過剰なライブラリー入力を必要とせず、モル濃度の出力範囲の変動に結び付く回収率の不良な一貫性をもたらす限定されたストレプトアビジンビーズ結合ステップは利用されない。また、開示されている方法の単純なインキュベーションは、ピペットステップをほとんど有しておらず、容易に自動化することができる。

開示されている方法は、ＰＣＲによるライブラリー増幅を必要とし、ＰＣＲフリーライブラリープロトコールでは直接使用することができないが、ＰＣＲフリーＮＧＳライブラリーで機能するように調整することができる。また、酵素に基づく正規化の場合、指定モル閾値未満のＰＣＲ後収量を有するライブラリーは、正規化手順後に低減されたモル分量を維持することになり、それにより、配列またはハイブリダイゼーション捕捉ワークフローでのデータ出力低減を示す過少評価（ｕｎｄｅｒ－ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ）ライブラリーがもたらされる（図２、試料３）。そのため、過少評価試料を回避するために、より少ないモル分量のＮ－プローブに対して過剰モル分量の各ライブラリーを産生することが推奨される。

開示されている正規化法の一部は、正規化された増幅ライブラリーをもたらすか（Ｎ－ＰＣＲの場合）、または一方もしくは両方のアダプター末端に５’もしくは３’突出をもたらすか（酵素に基づく正規化の場合）のいずれかであるＰＣＲ増幅ステップを必要とする。一部の場合では、突出は、必ずしも必要ではない。突出は、ＰＣＲ中またはＰＣＲ後の酵素消化中のいずれかにおいて生成され、Ｎ－プローブとｄｓＤＮＡ基質とのアニーリングを可能にする。酵素正規化法は、一部の場合では、二本鎖ＮＧＳライブラリーの５’または３’突出により、当量のモル分量のＮＧＳライブラリー分子とアニーリングする限定的な指定モル分量のＮ－プローブを有する。一部の場合では、突出は必要ではなく、プローブは、例として、限定ではないが、平滑末端ライゲーション、ＴＡライゲーション、および付着末端ライゲーションなどの方法により、増幅されたライブラリーのライブラリー分子とライゲートさせてもよい。したがって、正確なＮ－プローブ分量により、酵素に基づく正規化プロセス中に回収されることになるライブラリー分子の数が選択される。ＰＣＲに基づく正規化法は、当量のモル分量のＮＧＳライブラリーを増幅する限定的な指定モル分量のＮ－ＰＣＲプライマーを有する。したがって、正確なＮ－ＰＣＲプライマー分量により、Ｎ－ＰＣＲプロセス中に生成されることになるライブラリー分子の数が選択される。

ＰＣＲに基づく正規化

プライマー濃度を限定することによりＰＣＲ産物の量を制御しようとするために従来の試薬を使用する場合、いくつかの要因により、そのような方法の有用性が低減される。第１に、従来のＰＣＲプライマー濃度は、２００ｎＭから１ｕＭよりも高い範囲であり、そのような高濃度のプライマーの完全な利用は１０～５０ｐｍｏｌのＰＣＲ産物をもたらすことになり、そのため高いＤＮＡポリメラーゼ濃度が必要とされ、試料の著しい過剰増幅がもたらされることになる。複製エラーおよび塩基組成バイアスが導入される場合があり、ＮＧＳライブラリーを増幅する場合は特に重要なことだがこのような試料の著しい過剰増幅は望ましくない。代わりに、低減された２０～４０ｎＭのプライマー濃度でＰＣＲを実施して、１～２ｐｍｏｌの増幅された産物を得ることはできるが、その場合、ＮＧＳライブラリーなどの高複雑性鋳型の効率的なプライマーアニーリング、伸長、および非バイアス増幅を保証するためには、それに応じてプライマーアニーリング時間を１０倍増加させる必要があるだろう。その場合、過度の熱サイクルインキュベーション時間は、ＤＮＡ損傷を誘発し、ＮＧＳライブラリー品質を低減し得るため、これも望ましくないだろう。本開示のある特定の実施形態では、これらの問題に対処する新規の正規化ＰＣＲプライマー組成物（Ｎ－ＰＣＲプライマー）が導入される。正規化ＰＣＲプライマー組成物は、プライマーアニーリングハイブリダイゼーション速度を増加させ、アニーリング時間を低減し、従来のアニーリング時間による増幅サイクルを使用して、ＰＣＲプライマーの効率的で完全な利用を可能にし、したがって、ＰＣＲプライマー濃度を限定することにより、指定モル分量のＮＧＳライブラリーの複製可能な生成を提供する。

プライマーハイブリダイゼーション速度を増加させるために、低複雑性配列を含む５’尾部を、対の各Ｎ－ＰＣＲプライマーに導入し、各プライマーの３’部分を、ライブラリー鋳型に既に存在するＮＧＳアダプター配列にアニーリングさせる。一部の実施形態では、フォワードおよびリバースＮ－ＰＣＲプライマーは、異なる５’尾部配列を有する。他の実施形態では、フォワードおよびリバースＮ－ＰＣＲプライマーは、同じ５’尾部配列を有する。低複雑性５’尾部は、（Ａ）ｎ、（Ｔ）ｎ、（Ｇ）ｎ、もしくは（Ｃ）ｎなどのホモポリマー反復配列、（ＡＧ）ｎ、（ＡＣ）ｎ、（ＧＴ）ｎ、（ＣＴ）ｎ、（ＡＴ）ｎ、もしくは（ＧＣ）ｎなどのジヌクレオチド反復配列、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、またはさらに大きな反復配列エレメントで構成されていてもよい。Ｎ－ＰＣＲプライマーの５’尾部は、追加の修飾を有するまたは有していないデオキシヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそれらの混合物で構成されている８～５０塩基またはそれよりも大きい長さであり得る。一部の実施形態では、Ｎ－ＰＣＲプライマーの３’部分は、各末端に固有のアダプター配列を含むＮＧＳライブラリーの増幅中に、フォワードおよびリバースプライマーで異なるアダプター配列にアニーリングするが、他の実施形態では、フォワードおよびリバースＮ－ＰＣＲプライマーは、両ライブラリー末端に同じアダプターを有するＮＧＳライブラリーの増幅中に、同じアダプター配列にアニーリングする。

最初の２回のサイクル中に、限定された濃度のＮ－ＰＣＲプライマーを使用する場合、鋳型とのプライマーアニーリングは、ＮＧＳアダプターに相補的なＮ－ＰＣＲプライマーの３’部分でのみ生じる。そのため、低プライマー濃度の場合、最初のサイクルのアニーリング時間は、すべてのライブラリー分子のプライミングおよび伸長を保証するように長さを延長させるべきである。低複雑性／反復性尾部配列のリバース相補体がアンプリコンに組み込まれたら、Ｎ－ＰＣＲプライマーの５’および３’部分は両方とも、鋳型とのアニーリングに参加することができ、低複雑性組成のため、アニーリングが著しく加速され、その結果として、従来のアニーリング時間をその後のサイクルに使用することができ、したがって、ライブラリーの効率的なＰＣＲ増幅が可能になる。加速されたプライマーハイブリダイゼーションは、低複雑性／反復性の５’尾部配列の迅速なアニーリング、その後の高複雑性３’アダプター配列のアニーリングにより生じる。Ｎ－ＰＣＲプライマーの利用が完了した時点で、指定モル分量のＮＧＳライブラリーが生成されている。得られた増幅ライブラリーは、限定的なプライマー濃度のため、主に一本鎖であり得るが、アダプター配列の再アニーリングが生じて、部分的に二本鎖のヘテロ二重鎖分子が産生される場合がある。任意選択で、低複雑性尾部配列は、所望の場合、配列決定前にライブラリーから切断することができる。代わりに、各Ｎ－ＰＣＲプライマーの５’尾部に相補的な低複雑性配列を、ＮＧＳアダプターの末端に配列を組み込むことにより、アダプターライゲーションステップ中に、ライブラリー調製物に導入してもよい。この実施形態では、低複雑性配列が、完成したＮＧＳライブラリー基質にＰＣＲ前に既に存在するため、Ｎ－ＰＣＲ増幅のすべてのサイクル中に、従来のアニーリング時間を実施することができる。

酵素に基づく正規化

この方法では、プレ正規化プライマー（プレＮプライマー）を使用したＰＣＲ増幅を、ライブラリーの画分を選択するために利用されることになる正規化プローブ（Ｎ－プローブ）の量に対して過剰なモル分量を産生するために使用する。Ｎ－プローブは、複数の方法で利用することができる（図４は例示的な方法を示す）。一実施形態では、プレＮＰＣＲプライマーは、ビオチン基および少なくとも１つのＲＮＡ塩基を有し、ビオチン標識ＮＧＳライブラリーは、その全体がストレプトアビジンビーズを使用して捕捉され、Ｎ－プローブがアニーリングされた選択モル画分のみが、ＲＮＡ塩基とオーバーラップし、ＲＮａｓｅＨ酵素切断の基質を生成するため、ビーズ固定化から放出される（方法１；制御された放出）。他の実施形態では、選択されたライブラリー画分とのＮ－プローブのアニーリングおよびライゲーションは、このライブラリー画分の酵素消化に対するヌクレアーゼ耐性を付与する（方法２；制御された保護）。これらの選択肢では、Ｎ－プローブは、酵素消化に対する耐性を付与する塩基、基、または立体構造を含有する。他の実施形態では、選択されたライブラリー画分とのＮ－プローブのアニーリングおよびライゲーションは、酵素消化および特定の機能的ライブラリー配列の除去後に生じ、Ｎ－プローブライゲーションは、選択されたライブラリー画分のライブラリー機能性の回復をもたらす（方法３；制御された修復）。さらに別の実施形態では、Ｎ－プローブライゲーションは、ライブラリー合成を完了させ、指定のプローブライゲートされたモル画分のみが、機能的ライブラリー分子を産生する（方法４；制御された合成）。方法１は、３つの正規化ステップを必要とし、方法２は、２つのステップを必要とし、方法３および４は、単一のステップを有する。これらはすべて、ＰＣＲ後である。限定ではないが、これらの異なる方法の態様を、それらの任意の組合せで使用して、ＮＧＳライブラリーのモル正規化を達成することができることが理解される。

ｄｓＤＮＡライブラリー基質とのＮ－プローブアニーリングを可能にするために、正規化ステップのための５’突出を生成することができる少なくとも３つの方法が存在する。一部の実施形態では、一方または両方のライブラリー末端の５’突出は、Ｎ－プローブアニーリングのための５’尾部を有するプレ正規化プライマー（プレＮプライマー）および尾部とアダプター配列との間に位置する複製不能なスペーサーを使用してＰＣＲ中に生成され、複製不能な基としては、これらに限定されないが、ｄＵ塩基（古細菌（archael）ＤＮＡポリメラーゼの場合）、ｄＳｐａｃｅｒ、ｒＳｐａｃｅｒ、スペーサーＣ３、Ｃ６、またはＣ１２、ヘキサンジオール、トリエチレングリコールスペーサー９、およびヘキサエチレングリコールスペーサー１８などの安定脱塩基部位が挙げられる。他の実施形態では、一方または両方のライブラリー末端の５’突出は、３’エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、およびＮ－プローブアニーリングのための５’尾部を有するプレＮプライマー、ならびに３つまたはそれよりも多くのリボＵまたはリボＡ塩基の連続伸張を含み、尾部およびアダプター配列の間に位置する新規の複製不能なスペーサーを使用してＰＣＲ中に生成され、高フィデリティーＤＮＡポリメラーゼは、（リボＵ）_ｎまたは（リボＡ）_ｎ鋳型を越えて伸長することができず、式中、ｎ＝３またはそれよりも大きい。本明細書で開示される（リボＵ）_ｎ／（リボＡ）_ｎ複製ブロックは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼなどの非プルーフリーディングポリメラーゼにより複製することができ、また、ライゲート不能接合部位を生成する他の複製ブロッキング基とは異なり、５’尾部およびポリ（ｒＵ）またはポリ（ｒＡ）伸張に相補的なプローブオリゴヌクレオチドのライゲーションを可能にするという点で独特である。さらなる他の実施形態では、一方または両方のライブラリー末端の５’突出は、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを使用して、ＰＣＲ後に生成される。この場合、プレＮＰＣＲプライマーには、５’尾部および３’隣接緩衝領域が組み込まれている。尾部領域は、１０～２０塩基であり、ホモポリマー、ジ－またはトリ－ヌクレオチド組成を含み、その後に５’尾部領域から除外されるヌクレオチド組成を含有する５～１０塩基緩衝領域が後続する。そのような配列を含むＮＧＳライブラリーを、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、および緩衝領域に相補的であるが、尾部領域には相補的でない塩基のみに制限されたヌクレオチドミックスと共にインキュベートすると、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの３’エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性は、緩衝領域に到達するまで３’相補的尾部領域を不可逆的にトリミングすることになり、緩衝領域では、ヌクレオチドを可逆的に除去および置換し、したがって緩衝領域により画定される５’突出を生成することができる。

代わりに、Ｎ－プローブアニーリングのための３’突出を生成することができる少なくとも２つの異なる方法が存在する。一部の実施形態では、一方または両方のライブラリー末端の３’突出は、ＲＮａｓｅＨ、ＵＤＧおよび脱塩基部位エンドヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼＶのミックスなどの酵素と共にインキュベートし、そのような切断可能な塩基を含む修飾されたプレＮＰＣＲプライマーにより組み込まれたＲＮＡ、デオキシウラシル、またはデオキシイノシン塩基を切断することにより、ＰＣＲ後に生成される。他の実施形態では、一方または両方のライブラリー末端の３’突出は、Ｔ７エキソヌクレアーゼまたはラムダエキソヌクレアーゼなどの５’エキソヌクレアーゼと共にインキュベートすることにより、ＰＣＲ後に生成される。これらの実施形態における３’突出の長さは、プレＮＰＣＲプライマーおよびプライマー全体の長さ以内の切断可能／ヌクレアーゼ耐性の塩基または連結の位置により制御される。

一部の実施形態では、Ｎ－プローブは、ＮＧＳライブラリーの３’または５’末端にライゲーションされ、この場合、ＤＮＡリガーゼは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ＤＮＡリガーゼ、またはＥ．ｃｏｌｉＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ、９°ＮＤＮＡリガーゼ、もしくはＰｆｕＤＮＡリガーゼなどの熱安定性ＤＮＡリガーゼである。他の実施形態では、Ｎ－プローブライゲーションは実施されない。さらに他の実施形態では、プローブライゲーションは、ＲＮａｓｅＨによる切断後に残された残存５’ＲＮＡ塩基、またはＵＤＧおよび脱塩基部位エンドヌクレアーゼもしくはエンドヌクレアーゼＶのミックスによる不完全な消化に由来する残存デオキシウラシルもしくはデオキシイノシン修飾塩基、またはＴ７エキソヌクレアーゼもしくはラムダエキソヌクレアーゼ消化後に残されたヌクレアーゼ耐性塩基を置換および切断することを含んでいてもよい。この場合、ライゲーション反応は、限定されたニックトランスレーション反応を可能にするために、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼＩおよび必要に応じて制限ヌクレオチドミックスで補完することができる。

一部の実施形態は、Ｎ－プローブライゲーション後にプローブ選択ライブラリー単離の追加ステップを必要とする。方法１の場合、プローブ選択ライブラリー切断（固定化からの放出）に使用される酵素としては、Ｅ．ｃｏｌｉＲＮａｓｅＨＩおよびＲＮａｓｅＨ２、または熱安定性ＲＮａｓｅＨを含むＲＮａｓｅＨ酵素が挙げられる。他の実施形態（方法２）では、非プローブ選択ライブラリー消化に使用される酵素としては、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼＩなどの３’エキソヌクレアーゼ、ならびにエキソヌクレアーゼＴ７またはラムダエキソヌクレアーゼなどの５’エキソヌクレアーゼが挙げられる。限定ではないが、５’および３’突出生成、Ｎ－プローブライゲーション、およびライブラリー画分の濃縮または枯渇のための異なる方法の態様を、それらの任意の組合せで使用して、ＮＧＳライブラリーのモル正規化を達成することができることが理解される。

上記の概要、ならびに実例的な実施形態の以下の詳細な記載は、添付の図面と併せて読むとより良好に理解される。本開示を説明する目的で、本開示の例示的な構築物作製が図面に示されている。しかしながら、本開示は、本明細書で開示されている特定の方法および手段に限定されない。

以下の図では、Ｐ５およびＰ７は、それぞれＰ５ＮＧＳアダプターおよびＰ７ＮＧＳアダプターを指すために使用される。

図１Ａおよび１Ｂは、ｑＰＣＲライブラリー定量化（図１Ａ）を、本開示の酵素処理による正規化反応（図１Ｂ）と比較する。

図２は、個々の試料容積の手作業調整を行わずに等モル濃度の各試料を産生する本開示の正規化法の結果を示す。

図３Ａは、本開示の正規化法の例示的なワークフローを示し、このワークフローでは、ライブラリー調製後、ライブラリーをＰＣＲにかけ、その後ＳＰＲＩにより精製し、正規化して、ＮＧＳの正規化された試料を得る。

図３Ｂは、正規化プロセスを組み込む例示的な多重ワークフローを示す。

図４は、正規化のための本開示の４つの例示的な方法を示し、第１のステップは、ＮＧＳライブラリーのＰＣＲ、ならびに増幅されたＮＧＳライブラリーのＳＰＲＩによる精製、その後の正規化プローブアニーリングおよび任意選択のライゲーション、その後プローブ選択画分の濃縮を含む。

図５は、方法１（制御された放出）による酵素に基づく正規化の例示的な方法を示す。「Ｂ」はビオチンを表す。

図６は、方法１（制御された放出）による酵素に基づく正規化の例示的な方法を示す。「Ｂ」はビオチンを表す。赤色バーは、ＲＮＡ塩基の一部分を示す。黒色バーは、複製不能なＤＮＡスペーサーの位置を示す。第１のインキュベーションにおいて、正規化プローブおよびストレプトアビジンビーズが添加される。ステップ１：指定分量の正規化切断プローブを、等モル分量の５’突出にアニーリングする。ステップ２：すべてのＮＧＳライブラリー分子をストレプトアビジン磁気ビーズに結合させる。ステップ３：ＲＮａｓｅＨ洗浄ビーズを添加し、ＲＮａｓｅＨ切断によって、プローブ指定ＮＧＳライブラリー画分を放出する。

図７Ａは、方法２（ａ）（制御された保護）および方法２（ｂ）（制御された保護）による、酵素に基づく正規化の例示的な方法を示す。

図７Ｂは、方法２（ｃ）（制御された保護）による、酵素に基づく正規化の例示的な方法を示す。

図８Ａは、１つのプレＮＰＣＲプライマーを使用して１つのライブラリー鎖を標的とする方法２（ａ）による、酵素に基づく正規化の例示的な方法を示す。ステップ１：単一の正規化プライマーを、従来のプライマーと共に使用する場合に、一方の末端に５’突出を有するインデックス化全長ＮＧＳライブラリーを産出するためのＰＣＲ。ステップ２：エキソヌクレアーゼＩ（任意選択の未使用のプライマー消化）。ステップ３：ＳＰＲＩ。ステップ４：指定分量のヌクレアーゼ耐性正規化プローブに共有結合で付着されたＴ４ＤＮＡリガーゼ。ステップ５：エキソヌクレアーゼＩＩＩが、ヌクレアーゼ耐性プローブを欠如する３’末端を消化する。図面は、配列番号６７として「（ｄＴ） _１２（ｒＵ） _４」を、配列番号６８として「（ｄＡ） _１２（ｄＡ） _４」を、配列番号５６として「（ｄＴ） _１２」を開示する。

図８Ｂは、１つのライブラリー鎖を標的として一本鎖ＤＮＡライブラリーをもたらす方法２（ａ）による、酵素に基づく正規化の例示的な方法を示す。図面は、配列番号６７として「（ｄＴ） _１２（ｒＵ） _４」を、配列番号６８として「（ｄＡ） _１２（ｄＡ） _４」を開示する。

図８Ｃは、２つのプレＮＰＣＲプライマーを使用して両ライブラリー鎖を標的とする方法２（ａ）による、酵素に基づく正規化の例示的な方法を示す。ステップ１：２つの正規化プライマーが使用される場合に、２つの同一の５’突出を有するインデックス化全長ＮＧＳライブラリーを産出するためのＰＣＲ。ステップ２：エキソヌクレアーゼＩ（任意選択の未使用のプライマー消化）。ステップ３：ＳＰＲＩ。ステップ４：Ｔ４ＤＮＡリガーゼ。ステップ５：エキソヌクレアーゼＩＩＩ。図面は、配列番号６７として「（ｄＴ） _１２（ｒＵ） _４」を、配列番号６８として「（ｄＡ） _１２（ｄＡ） _４」を開示する。

図８Ｄは、ライブラリー内に一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡを両方とももたらす、１つのプレＮＰＣＲプライマーを使用して両ライブラリー鎖を標的とする方法２（ａ）による、酵素に基づく正規化の例示的な方法を示す。図面は、配列番号６７として「（ｄＴ） _１２（ｒＵ） _４」を、配列番号６８として「（ｄＡ） _１２（ｄＡ） _４」を開示する。

図９Ａは、プレＮＰＣＲプライマーおよび従来のプライマーを使用して１つのライブラリー鎖を標的とする方法２（ａ）のためのＰＣＲ増幅の例示的な方法を示す。図面は、配列番号６７として「（ｄＴ） _１２（ｒＵ） _４」を開示する。

図９Ｂは、インデックス化プライマーを使用して短縮アダプターを有するＮＧＳライブラリーを完成させる前ＰＣＲステップによる、プレＮＰＣＲプライマーおよび従来のプライマーを使用して１つのライブラリー鎖を標的とする方法２（ａ）のためのＰＣＲ増幅の例示的な方法を示す。図面は、配列番号６７として「（ｄＴ） _１２（ｒＵ） _４」を開示する。

図１０Ａは、２つのプレＮＰＣＲプライマーを使用して両ライブラリー鎖を標的とする方法２（ａ）のためのＰＣＲ増幅の例示的な方法を示す。図面は、配列番号６７として「（ｄＴ） _１２（ｒＵ） _４」を開示する。

図１０Ｂは、インデックス付与プライマーを使用して短縮アダプターを有するＮＧＳライブラリーを完成させる前ＰＣＲステップによる、２つのプレＮＰＣＲプライマーを使用して両ライブラリー鎖を標的とする方法２（ａ）のためのＰＣＲ増幅の例示的な方法を示す。図面は、配列番号６７として「（ｄＴ） _１２（ｒＵ） _４」を開示する。

図１１は、方法２（ｂ）（制御された保護）によりＴ４ＤＮＡポリメラーゼを使用して５’突出を生成し、その後ＮＧＳライブラリーを正規化するための消化を行う例示的な方法を示す。プレ正規化プライマーおよびプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ。第１のインキュベーションにおいて、正規化プローブ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝領域に相補的なヌクレオチドミックスおよびＴ４ＤＮＡリガーゼが添加される。ステップ１：Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼとのインキュベーションは、Ｐ５アダプターに５’突出を生成する；これは、尾部領域から３’塩基を除去するが、緩衝領域においては停止する。反対側末端は、３’末端における緩衝領域のため、平滑のままである。ステップ２：指定分量の正規化プローブの、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによって生成された５’突出へのアニーリング。ステップ３：Ｔ４ＤＮＡリガーゼによる、正規化プローブの、ＮＧＳライブラリーの３’末端へのライゲーション。ステップ４：エキソヌクレアーゼＩＩＩまたはアピラーゼを添加する；エキソヌクレアーゼＩＩＩによる、またはアピラーゼによるヌクレオチド分解後のＴ４ＤＮＡＰｏｌによる、非保護ＮＧＳライブラリー画分の分解。

図１２は、方法２（ｃ）（制御された保護）のために、３’突出を生成し、５’エキソヌクレアーゼを使用するための例示的な方法を示す。プレ正規化プライマーおよびプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ。プレ正規化プライマーは、ＲＮａｓｅＨを使用してＰＣＲ産物から切断することができるＲＮＡ塩基を含む。第１のインキュベーションにおいて、正規化プローブ、プライマー消化酵素（ＲＮａｓｅＨ）およびＤＮＡリガーゼが添加される。ステップ１：ＲＮａｓｅＨとのインキュベーションは、一方または両方のアダプター末端に３’突出を生成する。ステップ２：指定分量の正規化プローブの、ＲＮａｓｅＨ処理により生成された３’突出へのアニーリング。ステップ３：Ｔ４ＤＮＡリガーゼによる、正規化プローブの、ＮＧＳライブラリーの５’末端へのライゲーション。ステップ４：Ｔ７エキソヌクレアーゼまたはラムダエキソヌクレアーゼを添加する；Ｔ７またはラムダエキソヌクレアーゼによる非保護ＮＧＳライブラリー末端の分解。

図１３は、方法３（ａ）、３（ｂ）、および３（ｃ）による制御されたＮＧＳアダプター修復による、酵素に基づく正規化の例示的な方法を示す。

図１４は、方法３ａ（制御された修復）による、ＲＮａｓｅＨ、リガーゼ、およびエキソヌクレアーゼＩを使用する正規化の例示的な方法を示す。プレ正規化プライマーおよびプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ。矢印はＲＮａｓｅＨを使用してＰＣＲ産物から切断することができるＲＮＡ塩基の位置を示す。第１のインキュベーションにおいて、正規化プローブ、ＲＮａｓｅＨおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは任意選択である）が添加される。ステップ１：ＲＮａｓｅＨとのインキュベーションは、ライブラリーの５０％を不活性化し、一方のアダプター末端に３’突出を生成する。ステップ２：指定分量の正規化プローブの３’突出へのアニーリングおよびライゲーションは、ｄｓＤＮＡ末端をエキソヌクレアーゼＩによる消化から保護し、プローブを欠如するライブラリー画分は、エキソヌクレアーゼＩに感受性である。ステップ３：エキソヌクレアーゼＩを添加する；エキソヌクレアーゼＩによる非プローブ保護一本鎖ＮＧＳライブラリー末端の分解。

図１５は、方法３ｂ（制御された修復）による、ＲＮａｓｅＨおよびリガーゼを使用する正規化の例示的な方法を示す。プレ正規化プライマーおよびプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ。矢印はＲＮａｓｅＨを使用してＰＣＲ産物から切断することができるＲＮＡ塩基の位置を示す。単一のインキュベーションにおいて、正規化プローブ、ＲＮａｓｅＨおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは任意選択である）が添加される。ステップ１：ＲＮａｓｅＨとのインキュベーションは、ライブラリーを不活性化し、両方のアダプター末端に３’突出を生成する。ステップ２：指定分量の正規化プローブのＰ５３’突出のみへのアニーリング。ステップ３：正規化プローブのＰ５アダプター５’末端へのライゲーションによる、指定分量のＮＧＳライブラリーの回収（必要であれば、ＴａｑＤＮＡｐｏｌの５’－ｆｌａｐエンドヌクレアーゼ活性による残存ＲＮＡ塩基の置換および切断を伴う）。

図１６は、方法３ｃ（制御された修復）による、５’エキソヌクレアーゼおよびリガーゼを使用する正規化の例示的な方法を示す。プレ正規化プライマーおよびプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ。矢印はヌクレアーゼ耐性塩基または連結（６つ以上）の位置を示す。単一のインキュベーションにおいて、正規化プローブ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ（５’）およびＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＴａｑＤＮＡＰｏｌは任意選択である）が添加される。ステップ１：Ｔ７エキソヌクレアーゼとのインキュベーションは、ライブラリーを不活性化し、両方のアダプター末端に３’突出を生成する。ＰＣＲ増幅中に導入されるヌクレアーゼ耐性塩基において、消化が停止する。ステップ２：指定分量の正規化プローブの、５’エキソヌクレアーゼ消化により生成される３’突出へのアニーリング。ステップ３：正規化プローブのライゲーションによる、指定分量のＮＧＳライブラリーの回収。

図１７は、方法５（ａ）および５（ｂ）（制御された合成）による、制御されたＰＣＲ後ライブラリー合成による正規化の例示的な方法を示す。

図１８は、方法４（制御された合成）を使用して１つのＮＧＳライブラリー鎖を標的とする合成による正規化の例示的な方法を示す。図面は、配列番号６７として「（ｄＴ） _１２（ｒＵ） _４」を、配列番号６８として「（ｄＡ） _１２（ｄＡ） _４」を開示する。

図１９は、方法４（制御された合成）を使用して両ＮＧＳライブラリー鎖を標的とする合成による正規化の例示的な方法を示す。図面は、配列番号６９として「（Ｔ） _１２（Ｓ） _６」を、配列番号７０として「（Ｓ） _６（Ａ） _１２」を、配列番号７１として「（Ｓ） _６（Ｔ） _１２（Ｓ） _６」を、配列番号７２として「（Ｓ） _６（Ａ） _１２（Ｓ） _６」を開示する。

図２０Ａは、Ｐ５末端正規化、単一インデックス付与（インデックス化プローブによる二重インデックス付与）を使用して、１つのライブラリー鎖を標的とする方法４による正規化のためのＰＣＲ増幅の例示的な方法を示す。図面は、配列番号６７として「（ｄＴ） _１２（ｒＵ） _４」を開示する。図２０Ｂは、Ｐ７末端正規化、二重インデックス付与を使用して、１つのライブラリー鎖を標的とする方法４による正規化のためのＰＣＲ増幅の例示的な方法を示す。

図２１Ａは、両ライブラリー鎖を標的とする方法４（制御された合成）による正規化のためのＰＣＲ増幅の例示的な方法を示す。図面は、出現順に、それぞれ配列番号７３、７３および７４を開示する。

図２１Ｂは、方法４（制御された合成）の正規化プローブを使用して、単一インデックス付与または二重インデックス付与するための例示的な方法を示す。図面は、出現順に、それぞれ配列番号７３、７４、７５、７３、７５、７６および７７を開示する。

図２２は、制御された増幅による正規化のために、加速されたアニーリング速度を示すＮ－ＰＣＲプライマーを使用するための例示的な方法を示す。

図２３Ａは、Ｎ－ＰＣＲプライマーのジヌクレオチド反復５’尾部領域を使用する制御された増幅によるＰＣＲに基づく正規化の例示的な方法を示す。図面は、出現順に、それぞれ配列番号７８、７９、７８、８０、８１および７９を開示する。

図２３Ｂは、Ｎ－ＰＣＲプライマーのホモポリマー反復５’尾部領域を使用する制御された増幅によるＰＣＲに基づく正規化の例示的な方法を示す。図面は、出現順に、それぞれ配列番号８２、８３、８２、８２、８３および８３を開示する。

図２４Ａは、Ｎ－ＰＣＲ中のＮ－ＰＣＲプライマーおよびライブラリー濃度のグラフを示す。

図２４Ｂは、Ｎ－ＰＣＲ中のＮ－ＰＣＲプライマーおよびライブラリー濃度のグラフを示す。図２４Ｃは、Ｎ－ＰＣＲ中のＮ－ＰＣＲプライマーおよびライブラリー濃度のグラフを示す。

図２４Ｄは、Ｎ－ＰＣＲ中のＮ－ＰＣＲプライマーおよびライブラリー濃度のグラフを示す。

図２５は、ホモポリマー尾部、ジヌクレオチド尾部、またはトリヌクレオチド尾部のいずれかを有する例示的なＮ－ＰＣＲプライマーを示す。図面は、出現順に、それぞれ配列番号８４～９５を開示する。

図２６は、Ｎ－ＰＣＲプライマーのアニーリング加速の提唱機序を示す。ステップ１：Ｎ－ＰＣＲプライマーが、標的鋳型の反復５’部分によって標的鋳型に係留される。ステップ２：Ｎ－ＰＣＲプライマーが、その３’部分によってアニーリングする。ステップ３：Ｎ－ＰＣＲプライマーが、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。図面は、出現順に、それぞれ配列番号８８、９１、８８、９１、９６、９１、９６および９１を開示する。

図２７は、Ｎ－ＰＣＲプライマーを使用する、ＮＧＳライブラリーの増幅および正規化のための例示的な方法を示す。ステップ１：第１の長期間アニーリング／伸長サイクルは、ＮＧＳライブラリーの片側に反復尾部を付加する。ステップ２：第２の長期間アニーリング／伸長サイクルは、ＮＧＳライブラリーの両側に反復尾部を付加する。ステップ３：その後の迅速なアニーリング－伸長サイクルは、すべてのＮ－ＰＣＲプライマーを利用して、Ｎ－ＰＣＲプライマーのモル量に等しいモル量のＰＣＲ増幅ＮＧＳライブラリーを生成する。図面は、配列番号７９として「ＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴ」を、配列番号８０として「ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣ」を、配列番号９７として「ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡ」を、配列番号９８として「ＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣ」を開示する。

図２８は、ＰＣＲ産物の予測収量のためにＮ－ＰＣＲプライマーを使用するＰＣＲの例示的な方法を示す。ステップ１：第１の長期間アニーリング／伸長サイクルは、片側のＤＮＡアンプリコンを生成する。ステップ２：第２の長期間アニーリング／伸長サイクルは、両側のＤＮＡアンプリコンを生成する。ステップ３：その後の迅速なアニーリング－伸長サイクルは、すべてのＮ－ＰＣＲプライマーを利用して、Ｎ－ＰＣＲプライマーのモル量に等しいモル量のＰＣＲ増幅標的ＤＮＡを生成する。図面は、配列番号７９として「ＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴ」を、配列番号８０として「ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣ」を、配列番号９７として「ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡ」を、配列番号９８として「ＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣ」を開示する。

図２９Ａは、両Ｎ－ＰＣＲプライマーが同じ尾部配列を共有する場合の、二次構造形成の提唱機序を示す。図面は、配列番号９９として「ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ」を、配列番号８５として「ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ」を開示する。

図２９Ｂは、Ｎ－ＰＣＲプライマーが相補的尾部配列を有する場合の、Ｎ－ＰＣＲプライマー間の干渉の提唱機序を示す。図面は、配列番号９９として「ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ」を、配列番号８５として「ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ」を開示する。

図２９Ｃは、非ワトソン－クリック二次構造の形成により非相補的ホモポリマー尾部を有するＮ－ＰＣＲプライマーを使用する場合の、複製失敗の提唱機序を示す。図面は、配列番号９９として「ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ」を、配列番号１００として「ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ」を、配列番号８５として「ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ」を、配列番号１０１として「ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ」開示する。

図２９Ｄは、ジヌクレオチド反復尾部を有する例示的なＮ－ＰＣＲプライマーを示す。図面は、出現順に、それぞれ配列番号８８～９１を開示する。

図３０は、ＰＣＲ後のＮＧＳライブラリーモル濃度定量化のための例示的な方法を示す。ステップ１：フルオロフォア含むプライマーによるＰＣＲ→蛍光読み取りＦ１。ステップ２：クエンチャーオリゴヌクレオチドを（プライマー濃度に対して過剰に）添加する→蛍光読み取りＦ２。ステップ３：式［ＮＧＳライブラリー］＝Ｆ２／Ｆ１ｘ［Ｐ _０］（式中、［Ｐ _０］は、ＰＣＲ反応の開始における、フルオロフォアを含むプライマーの濃度である）を使用して、ＮＧＳライブラリーのモル濃度を決定する。

図３１Ａは、リボヌクレオチド複製ブロッカーを含有するＤＮＡ鋳型でのプライマー伸長反応の概略図を示す。

図３１Ｂは、図３１Ａのプライマー伸長反応の予想ゲル電気泳動結果を示す。

図３２は、実施例２における伸長反応の産物を、ＳＹＢＲＧｏｌｄで染色した１５％ＴＢＥ－尿素ゲルで示す。「^＊」は鋳型を示し、「^＊＊」は、完全に伸長されたプライマーを示し、「^＊＊＊」は、部分的に伸長されたプライマーを示す。

図３３Ａは、ＴａｑおよびＱ５ｄＵ迂回を用いた実施例３における伸長反応の産物を、ＳＹＢＲＧｏｌｄで染色した１５％ＴＢＥ－尿素ゲルで示す。「^＊」は鋳型を示し、「^＊＊」は、完全に伸長されたプライマーを示し、「^＊＊＊」は、部分的に伸長されたプライマーを示す。

図３３Ｂは、ＫａｐｐａＨｉＦｉまたはＰＲＩＭＥＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬを用いた実施例３における伸長反応の産物を、ＳＹＢＲＧｏｌｄで染色した１５％ＴＢＥ－尿素ゲルで示す。「^＊」は鋳型を示し、「^＊＊」は、完全に伸長されたプライマーを示し、「^＊＊＊」は、部分的に伸長されたプライマーを示す。

図３３Ｃは、Ｑ５ポリメラーゼを用いた実施例３における伸長反応の産物を、ＳＹＢＲＧｏｌｄで染色した１５％ＴＢＥ－尿素ゲルで示す。「^＊」は鋳型を示し、「^＊＊」は、完全に伸長されたプライマーを示し、「^＊＊＊」は、部分的に伸長されたプライマーを示す。

図３４Ａは、通常の増幅プライマー、ならびに複製ブロッカーおよび５’末端非相補的尾部を含有するプライマーを用いた増幅実験の概略図を示す。

図３４Ｂは、ＴａｑおよびＰＲＩＭＥＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬを用いた実施例５における伸長反応の産物を、ＳＹＢＲＧｏｌｄで染色した１５％ＴＢＥ－尿素ゲルで示す。「^＊＊」は全長増幅産物を示し、「^＊＊＊」は、短縮増幅産物を示す。

図３５Ａは、蛍光標識プローブとクエンチャーオリゴヌクレオチドとの結合の概略図を示す。図３５Ｂは、クエンチャーを有する過剰量の相補的基質オリゴヌクレオチド（点線）に対する２５ｎＭの蛍光性複雑配列プローブの結合、およびクエンチャーを有するその相補的基質（実線）に対する２５ｎＭ蛍光ホモポリマー性配列プローブの結合の、時間に対する蛍光強度を示す。

図３６Ａは、実施例７におけるライブラリー＃１～７の正規化前の濃度を示す。

図３６Ｂは、実施例７におけるライブラリー＃１～７の正規化後の終濃度を示す。

図３７Ａは、クエンチャーを有する過剰の２つの異なる基質オリゴヌクレオチドに対する蛍光プローブの結合の、時間に対する蛍光強度を示す。

図３７Ｂは、クエンチャーを有する従来の鋳型との蛍光プローブ結合の概略図を示す。図面は、配列番号９１として「ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡ」を、配列番号８８として「ＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧ」を開示する。図３７Ｃは、クエンチャーを有するＧＲ尾部付き鋳型との蛍光プローブ結合の概略図を示す。

図３８Ａは、従来のプライマーで使用するための、実施例９におけるライブラリー＃１～７のライブラリー入力濃度を示す。

図３８Ｂは、実施例９における、従来のプライマーを使用したＰＣＲ後のライブラリー＃１～７の収量を示す。

図３８Ｃは、Ｎ－ＰＣＲプライマーで使用するための、実施例９におけるライブラリー＃１～７のライブラリー入力濃度を示す。

図３８Ｄは、Ｎ－ＰＣＲプライマーを使用したＮ－ＰＣＲ後のライブラリー＃１～７の収量を示す。

図３９Ａは、実施例１０におけるライブラリー＃１～８のライブラリー入力濃度を示す。

図３９Ｂは、Ｎ－ＰＣＲプライマーを使用したＮ－ＰＣＲ後のライブラリー＃１～８の収量を示す。

図３９Ｃは、Ｎ－ＰＣＲ正規化ライブラリーを使用した次世代配列決定からのライブラリー＃１～８についてのフローセルで形成されたクラスターの％を示す。

図４０Ａは、実施例１１におけるライブラリー＃１～１６のライブラリー入力濃度を示す。

図４０Ｂは、実施例１１におけるライブラリー＃１～１６の正規化ライブラリー濃度を示す。

図４０Ｃは、実施例１１においてクエンチャーを添加する前の相対的ライブラリー濃度を示す。

図４０Ｄは、実施例１１においてクエンチャーを添加した後の相対的ライブラリー濃度を示す。

図４１Ａは、本開示の例示的な正規化法の概略図を示す。

図４１Ｂは、本開示の例示的な正規化法の概略図を示す。

図４１Ｃは、本開示の例示的な正規化法の概略図を示す。

図４１Ｄは、本開示の例示的な正規化法の概略図を示す。

図４１Ｅは、本開示の例示的な正規化法の概略図を示す。

図４２Ａは、本開示の例示的な正規化法の概略図を示す。

図４２Ｂは、本開示の例示的な正規化法の概略図を示す。

図４２Ｃは、本開示の例示的な正規化法の概略図を示す。

図４２Ｄは、本開示の例示的な正規化法の概略図を示す。

図４２Ｅは、本開示の例示的な正規化法の概略図を示す。

図４２Ｆは、本開示の例示的な正規化法の概略図を示す。

図４２Ｇは、本開示の例示的な正規化法の概略図を示す。

図４２Ｈは、本開示の例示的な正規化法の概略図を示す。

図４２Ｉは、本開示の例示的な正規化法の概略図を示す。

図４３Ａは、実施例１２を示す。

図４３Ｂは、実施例１２を示す。図面は、出現順に、それぞれ配列番号３２、４３、１０２、３２、１０３、３３、３４、１０４および１０２を開示する。

図４３Ｃは、実施例１２を示す。図面は、出現順に、それぞれ配列番号１０５、４３、１０２、１０５、１０３、３６、１０５、１０６および１０７を開示する。

図４３Ｄは、実施例１２を示す。

図４４は、実施例１３を示す。ステップ１：ｒＵ複製ブロックを両方に含むプライマーによるＰＣＲ増幅。ステップ２：アダプター末端を完成させるための、凹んだ過剰量の保護キャップへの指定分量のＮ－プローブのライゲーション。ステップ３：非保護ＤＮＡ鎖を消化するための、エキソヌクレアーゼＩＩＩとのインキュベーション。

図４５Ａは、実施例１４を示す。ステップ１：第１のＰＣＲ（多重）。ステップ２：高フィデリティーＤＮＡポリメラーゼ、および非複製ポリ（ｒＵ）リンカーを含むユニバーサルプライマーによる第２のＰＣＲは、両端に５’突出を有するＤＮＡ分子を生成する（一方の末端のみが示される）。ステップ３：ＳＰＲＩは、非組み込みプライマーを除去する。ステップ４：ステム－ループアダプターはアニーリングし、ＤＮＡの５’末端にライゲーションされる。ステップ５：両端にインデックス化配列ＩＤおよびポリＡ尾部を含むリンカー分子は、両方のＤＮＡ鎖上のギャップ領域にアニーリングし、ライゲーションされる。図面は、出現順に、それぞれ配列番号６１、６１、１０８、６１、１０８、１０９、１０９、６１、１１０および１０９を開示する。

図４５Ｂは、実施例１４を示す。ステップ１：第１のＰＣＲ（多重）。ステップ２：高フィデリティーＤＮＡポリメラーゼ、および非複製ポリ（ｒＵ）リンカーを含むユニバーサルステム－ループプライマーによる第２のＰＣＲは、一本鎖ギャップ領域を有するダンベルＤＮＡ構造を生成する。ステップ３：ＳＰＲＩは、非組み込みプライマーを除去する。ステップ４：両端にインデックス化配列ＩＤおよびポリＡ尾部を含むリンカー分子は、両方のＤＮＡ鎖上のギャップ領域にアニーリングする。ステップ５：Ｔ４ＤＮＡリガーゼが、ニックをシールする。ステップ６：エンドヌクレアーゼが、ループを切断する（任意選択で、ＱｘｆｏｒｄＮａｎｏｐｏｒｅ配列決定プラットフォーム上で使用するため）。

図４５Ｃは、実施例１４を示す。

図４６Ａは、実施例１４を示す。ステップ１：高フィデリティーＤＮＡポリメラーゼ、および非複製ポリ（ｒＵ）リンカーを介して標的特異的部分に連結したポリＴ５’尾部を含むプライマーを用いたＰＣＲ。ステップ２：ＳＰＲＩは、非組み込みプライマーを除去する。ステップ３：ステム－ループアダプターは、ＤＮＡの５’末端にアニーリングする。ステップ４：Ｔ４ＤＮＡリガーゼが、ニックをシールする。

図４６Ｂは、実施例１４を示す。ステップ１：：高フィデリティーＤＮＡポリメラーゼ、および非複製ポリ（ｒＵ）リンカーを含むステム－ループプライマーを用いたＰＣＲは、２つのニックを有するダンベルＤＮＡ構造を生成する。ステップ２：ＳＰＲＩは、非組み込みプライマーを除去する。ステップ３：Ｔ４ＤＮＡリガーゼが、ニックをシールする。

図４７Ａは、実施例１４を示す。ステップ１：ＰＣＲなし、または標的特異的尾部付きプライマーを用いた第１のＰＣＲ；標的特異的プライマーを用いた第１のＰＣＲ、または３つもしくはそれよりも多くのｒＵ塩基を含む非複製リンカーを介して、標的特異的もしくはユニバーサル部分に連結される５’尾部Ｘを含むユニバーサルプライマーを用いた第２のＰＣＲ。ステップ２：ＳＰＲＩは、非組み込みプライマーを除去する。ステップ３：５’末端に、プライマーの尾部Ｘに相補的な尾部Ｘ’を有するステム－ループアダプターのアニーリング。ステップ４：Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるライゲーション。

図４７Ｂは、実施例１４を示す。ステップ１：尾部に存在しない塩基を含む隣接する緩衝領域Ｂを有する、低複雑性尾部配列Ｘを含むプライマーを用いたＰＣＲ。ステップ２：ＳＰＲＩ精製は、非組み込みプライマー、ヌクレオチドおよびポリメラーゼを除去する。ステップ３：３’アンプリコン尾部配列には存在しないが、隣接する緩衝配列には存在するアダプター、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、反応緩衝液およびヌクレオチドトリリン酸を添加する。緩衝領域に存在するが、尾部領域に存在しないヌクレオチドの存在下で、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲアンプリコンの末端に５’突出Ｘを生成する。ステップ４：ステム領域内に同様の緩衝領域Ｂが存在することにより、アダプターの完全性は、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼに影響を受けないままである。アダプターは、一本鎖５’末端（配列Ｘ’）によって、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによってＰＣＲアンプリコンの末端に生じる相補的な突出（配列Ｘ）にアニーリングする。ステップ５：Ｔ４ＤＮＡリガーゼが、ニックをシールする。

図４８Ａは、実施例１５を示す。ステップ１Ａ：（ｒＵ） _ｎおよび／または（ｒＡ） _ｎ複製ブロック（示さず）を有する尾部配列ＡおよびＢを含むプライマーによるＰＣＲ。ステップ１Ｂ：低複雑性、ならびに尾部に存在しない塩基（示さず）を含む隣接する緩衝領域を有する相補的尾部配列ＡおよびＡ’を含むプライマーによるＰＣＲ。ステップ２：緩衝領域に存在するが、尾部領域には存在しないヌクレオチドの存在下での、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼとのインキュベーション。ステップ３：ライゲーション反応。

図４８Ｂは、実施例１５を示す。ステップ１Ａ：（ｒＵ） _ｎ複製ブロック（示さず）を有する尾部配列ＡおよびＢを含むプライマーによるＰＣＲ。ステップ１Ｂ：尾部に存在しない塩基（示さず）を含む隣接する緩衝領域を有する低複雑性尾部配列ＡおよびＢを含むプライマーによるＰＣＲ。ステップ２：緩衝領域に存在するが、尾部領域には存在しないヌクレオチドの存在下でのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ。リンカーも両端に緩衝領域を有し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによる分解を防止する（示さず）。ステップ３：ライゲーション反応は、等モル濃度のアンプリコンおよびリンカーにおいて生じる。

図４８Ｃは、実施例１５を示す。ステップ１：隣接する（リボＵ） _ｎおよびポリ（リボＡ） _ｎ複製ブロックを有する尾部配列（Ｔ） _ｍおよび（Ａ） _ｍを含むプライマーによるＰＣＲ。ステップ２：ＳＰＲＩ精製は、非組み込みプライマーを除去する。ステップ３：高アンプリコン濃度において、アンプリコン末端は互いにアニーリングし、ＤＮＡリガーゼによって共有結合での連結となるオリゴマーを形成する。

図４８Ｄは、実施例１５を示す。ステップ１：少なくとも６つのＧおよびＣ塩基（ＡおよびＴではない）を含む隣接する緩衝領域を有する尾部配列（Ｔ） _ｍおよび（Ａ） _ｍを含むプライマーによるＰＣＲ。ステップ２：ＳＰＲＩ精製は、非組み込みプライマーを除去する。ステップ３：ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰヌクレオチドの存在下のＴ４ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲアンプリコンの一方に突出（Ｔ） _ｍを、別の末端に突出（Ｔ） _ｍを生成する。ステップ４：高アンプリコン濃度において、アンプリコン末端は互いにアニーリングし、ＤＮＡリガーゼによって共有結合での連結となるオリゴマーを形成する。

図４８Ｅは、実施例１５を示す。ステップ３：分子間オリゴマー化のためにＤＮＡを濃縮し、分子間環状化のためにＤＮＡを希釈する。図面は、出現の順に、それぞれ配列番号６１、１１１、６１、１１１、１０９、１０９、６１、１１１、１１０、１１０、１０９、１１２、１１３および１０９を開示する。

図４９Ａは、実施例１６を示す。ステップ１：標的特異的プライマーによるＰＣＲ。ステップ２：希釈後の、５’末端にビオチンおよび（ｒＵ） _４（ｄＴ） _１２配列をそれぞれ含むユニバーサルプライマーＡおよびプライマーＢによる第２のＰＣＲ。ステップ３：ＡＭＰｕｒｅＸＰビーズ精製。ステップ４：ＰＣＲ産物の３’末端へのヌクレアーゼ耐性ポリＡ配列Ｃのアニーリングおよびライゲーション。ステップ５：エキソヌクレアーゼＩＩＩとのインキュベーションおよび５’末端におけるビオチンとの一本鎖プローブの生成。図面は、配列番号１１４として「（ｒＵ） _４（ｄＴ） _１２」を開示する。

図４９Ｂは、実施例１６を示す。ステップ１：：標的特異的プライマーによるＰＣＲ。ステップ２：希釈後の、５’末端に（ｒＵ） _４（ｄＴ） _１２配列およびビオチンをそれぞれ含むユニバーサルプライマーＡおよびプライマーＢによる第２のＰＣＲ。ステップ３：ＡＭＰｕｒｅＸＰビーズ精製。ステップ４：ＰＣＲ産物の３’末端へのヌクレアーゼ耐性ポリＡ配列Ｃのアニーリングおよびライゲーション。ステップ５：エキソヌクレアーゼＩＩＩとのインキュベーションおよび５’末端におけるビオチンとの一本鎖プローブの生成。図面は、配列番号１１４として「（ｒＵ） _４（ｄＴ） _１２」を開示する。

図４９Ｃは、実施例１６を示す。ステップ１：Ｎプローブを含むプールを生成する。ステップ２：ユニバーサルプライマーＡおよびＢを使用したＰＣＲによって、プールを増幅する。ステップ３：５’末端の付近に５’リン酸およびホスホロチオエート連結を含むヌクレアーゼ耐性オリゴＣをアニーリングし、ライゲーションし、ＡＭＰｕｒｅＸＰビーズにより精製する。ステップ４：非ビオチン鎖をエキソヌクレアーゼＩＩＩにより分解し、９５℃で加熱することによってｅｘｏＩＩＩを阻害する、または精製する。

図５０Ａは、実施例１７を示す。図面は、出現の順に、それぞれ配列番号４８、４８、４９、１１５、５０、５０、５１、１１６、５２、５２、５３、１１７、５４、５４および５５を開示する。

図５０Ｂは、実施例１７を示す。

説明
本開示は、特定の実施形態を、ある特定の図面を参照して記載しているが、本主題は、それらに限定されない。記載されている図面は、概略に過ぎず、非限定的である。図面では、要素の一部の大きさは、誇張されるかまたは歪められている場合があり、説明のために縮尺通りに描かれていない場合がある。本開示の要素は、別様に具体的に述べられていない限り、初出時には「ａ」または「ａｎ」で指定され、２回目または以降の出現時には「ｔｈｅ」または「ｓａｉｄ」で指定される。

本開示は、添付の図面に対する説明を提供することになるが、図面には、本開示の主題のすべての実施形態ではなく一部の実施形態が示されている。実際、本主題は、多数の異なる形態で具現化することができ、本明細書で示される実施形態に限定されると解釈されるべきでない。むしろ、これらの実施形態は、本開示がすべての法的要件を満たすように提供されている。

ある用語法は、以下の記載では便宜的に使用されているに過ぎず、限定ではない。本明細書で使用されるある単語は、参照されている図面での方向を指定する。本明細書で具体的に示されていない限り、用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、１つの要素に限定されず、その代り、「少なくとも１つ」を意味すると解釈されるべきである。本明細書で使用される場合、「別の」は、少なくとも第２のまたはそれよりも多くのを意味する。用語法は、上記で示された単語、それらの派生語、および同様の意味の単語を含む。

特許請求の範囲における用語「または」の使用は、代替物のみを指すと明示的に指示されていない限り、または代替物が互いに排他的でない限り、「および／または」を意味するために使用される。

用語「約」の使用は、数値と共に使用される場合、＋／－１０％を含むことが意図される。例えば、アミノ酸の数が、約２００個と特定されている場合、これは、１８０～２２０個（プラスまたはマイナス１０％）を含むことになる。

別様に定義されていない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。

酵素に基づくライブラリー正規化法
方法１：固定化からの制御された放出による酵素に基づくライブラリー正規化
この方法は、指定モル分量のライブラリーを磁気ビーズ固定化から酵素的に放出することを利用する。この方法は、少なくとも３つのステップ：プレＮＰＣＲステップとその後の精製、次いで捕捉ステップ、および制御された溶出ステップを有する。限定ではないが、この方法の態様および代替的実施形態を、それらの任意の組合せで使用して、ＮＧＳライブラリーのモル正規化を達成することができることが理解される。図５は、以下のステップを含む、方法の例示的な４ステップ型を示す：（１）複製不能なスペーサーを有するプライマーを使用してＰＣＲ増幅を行って、５’末端にビオチンを有する５’突出、およびＮＧＳアダプター末端の一方にＲＮＡ切断部位を導入し、ＳＰＲＩ精製を行うステップ；（２）５’突出に指定分量の正規化プローブをアニーリングさせることにより、指定数のライブラリー分子を選択するステップ；（３）ライブラリー全体をビーズ捕捉するステップ（ステップ２および３は同じ反応で実施してもよく、または２の後に３もしくは３の後に２のいずれの順序で実施してもよい）；ならびに（４）ＲＮａｓｅＨ（ＲＮＡ塩基において切断する）と共にインキュベートすることにより、正規化プローブを含有する指定モル画分のライブラリーをビーズ放出するステップ。

この方法は、使用されることになるＮ－プローブの分量に対してモル過剰なＮＧＳライブラリーのＰＣＲ増幅を必要とする。ＰＣＲでは、プレＮプライマーは、増幅されたＮＧＳライブラリーの一方の末端に５’または３’突出を導入し、一部の実施形態では、３’エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが使用される。５’または３’突出は、開示されている方法のいずれかを使用して生成することができる（複製ブロックは、図６で使用されるプライマーに示されている）。この方法の場合、プレＮプライマーは、好ましくは、得られる５’または３’突出の中間に配置されるビオチン基および少なくとも１つのＲＮＡ塩基も必要とする。増幅後、精製ステップを実施し、次いで、増幅されたライブラリー全体のストレプトアビジン磁気ビーズ捕捉を実施し、同じ捕捉反応には、５’または３’突出に相補的であり、好ましくはホモポリマー配列を含み、当量のモル分量の固定化ライブラリーにアニーリングする限定的指定モル分量のＮ－プローブが含まれており、ホモポリマー配列は、複雑な配列組成を有するプローブに比べ、著しくモル過剰なプローブまたは基質のいずれかの非存在下でのアニーリングを促進する。最終ステップでは、指定モル分量のｄｓＤＮＡライブラリーの溶出を、ＲＮａｓｅＨを使用する酵素的切断により実施し、この場合、プローブは、ＲＮＡ塩基を含む突出にハイブリダイズするため、選択されたＮ－プローブ結合画分のみが、ＲＮａｓｅＨ切断の基質であり、固相固定化から放出される。

方法２：エキソヌクレアーゼ消化からの制御された保護による、酵素に基づくライブラリー正規化
図７Ａ～７Ｂには、方法２を実施するための３つの例示的な選択肢が概説されており、プレＮＰＣＲ増幅後、方法２ａは、ライゲーションステップおよび消化ステップを有し、方法２ｂおよびｃは、切断／ライゲーションステップおよび消化ステップを有する。方法２ａおよびｂでは、５’突出が生成されるが、方法２ｃでは、３’突出が生成され、突出は、開示されている方法のいずれかを使用して生成される。３つの正規化選択肢はすべて、使用されることになるＮ－プローブのモル量と比較してモル過剰なＮＧＳライブラリーのＰＣＲ増幅を必要とする。プレＮプライマーは、１つのプレＮプライマーを従来のプライマーと共に使用する場合は、ｄｓＤＮＡライブラリーの一方の末端に、または２つのプレＮプライマーを使用する場合は、ｄｓＤＮＡライブラリーの両末端に、５’または３’突出を導入する。方法２ａでは、５’突出は、複製をブロックする３つまたはそれよりも多くのリボＵまたはリボＡ塩基の連続伸張を含むプレＮプライマーを使用して、３’エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼにより、ＰＣＲ中に生成される。方法２ｂでは、５’突出は、正規化反応におけるプレＮプライマーの特定のヌクレオチド組成およびｄＮＴＰ組成に基づき、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ３’エキソヌクレアーゼ活性により、ＰＣＲ後に生成される。方法２ｃでは、組み込まれたプライマー配列の酵素的切断によりＰＣＲ後に生成され、ここで、３’突出は、プレＮプライマーが切断可能な塩基をＰＣＲ産物に導入する。３つの方法すべての場合で、ＰＣＲ増幅後に、精製ステップが実施され、第１の酵素に基づく正規化ステップでは、限定的な指定モル分量のＮ－プローブが、リガーゼと共に添加され、方法２ｂおよびｃでは、この反応に切断酵素も添加される。Ｎ－プローブは、ヌクレアーゼ耐性修飾を含み、好ましくはホモポリマーなどの低複雑性配列を含む５’または３’突出に相補的であり、当量のモル分量の増幅されたライブラリーにアニーリングおよびライゲートする。ホモポリマー配列は、複雑な配列組成を有するプローブに比べ、著しくモル過剰なプローブまたは基質のいずれかの非存在下でのアニーリングを促進する。第２の酵素に基づく正規化ステップでは、プローブライゲーションを欠如する過剰なライブラリー画分の酵素消化が実施され、この場合、Ｎ－プローブにより指定されるモル分量のライブラリーは、ヌクレアーゼ耐性のままであり、消化から保護される。方法２ａおよびｂの場合、３’エキソヌクレアーゼが使用されるが、方法２ｃの場合は、５’エキソヌクレアーゼが使用される。

５’または３’突出の形成は、Ｎ－プローブライゲーションの必要条件ではないが、突出は、低濃度のプローブおよびライブラリーのライゲーションを著しく促進する。一実施形態では、単一のＴ塩基３’突出を有する二本鎖正規化プローブのライゲーションには、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ中に生成される単一Ａ塩基３’突出を有するライブラリーが必要である。別の実施形態では、二本鎖正規化プローブは平滑末端を有し、高フィデリティーＤＮＡポリメラーゼを使用して増幅された平滑末端ライブラリーにライゲートされる。ライブラリーの短縮アダプター末端との、限定された量の平滑末端または単一Ｔ塩基３’突出正規化プローブのライゲーションは、ＰＣＲ中に生成される高ライブラリー濃度により促進することができる。ＮＧＳライブラリーの反対側末端でのアダプターとのプローブライゲーションの防止は、アダプター末端の５’ホスフェート基の欠如、または適合性の平滑末端もしくは単一Ａ塩基突出の欠如、または５’ホスフェートおよびプローブライゲーションに適合性の末端の両方の欠如により制御することができる。

具体的には、図７Ａでは、方法２（ａ）および２（ｂ）は、４つのステップを含む：（１）ＰＣＲ中に５’突出を生成する複製不能な塩基もしくは塩基の組合せ（方法２ａ）またはＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより５’突出を可能にする特殊な塩基組成（方法２ｂ）のいずれかを含有するＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行って、一方または両方のアダプター末端にプローブ結合配列を導入し、その後、ＳＰＲＩ精製を行うステップ；（２）Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ媒介性３’－５’エキソヌクレアーゼ消化により５’突出を生成するステップ（方法２ｂのみ）；（３）５’突出に指定分量の正規化プローブをアニーリングおよびライゲーションさせることにより、指定数のライブラリー分子を保護するステップ；ならびに（４）非プローブ保護ライブラリー画分を３’エキソヌクレアーゼ消化するステップ。

具体的には、図７Ｂでは、方法２（ｃ）は、４つのステップを含む：（１）酵素的切断による３’突出生成を可能にする切断可能な塩基を含有するＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行って、一方または両方のアダプター末端にプローブ結合配列を導入し、その後ＳＰＲＩ精製を行うステップ；（２）切断可能な塩基を含有する組み込まれたＰＣＲプライマー部分の酵素的切断により３’突出を生成するステップ；（３）３’突出に指定分量の正規化プローブをアニーリングおよびライゲーションさせることにより、指定数のライブラリー分子を保護するステップ；および（４）非プローブ保護ライブラリー画分を５’エキソヌクレアーゼ消化するステップ。

方法２ａ
方法２ａのさらなる詳細は、図８Ａ～８Ｄ、９Ａ～９Ｂ、および１０Ａ～１０Ｂに見出される。図８Ａは、単一５’突出を使用した反応を示しており、相補的プローブ配列は、複雑な配列Ｓ（任意の２つ、３つ、または４つの塩基組成を含む。図示せず）、または低複雑性ホモポリマー配列、例として、限定ではないが、図８Ａに示されているような（ｄＴ）_１２（配列番号５６）のいずれかである。この例では、１つのプレＮプライマーのみが、従来のリバースプライマーと共に使用されており、２つのＮＧＳライブラリー鎖の一方のみに対する正規化反応が標的とされる。ＤＮＡリガーゼに加えて限定的指定モル分量のＮ－プローブが添加される第１の正規化ステップには、過剰分量のＮＧＳライブラリーが含まれる。アニーリングは、低複雑性ホモポリマー配列の場合、高複雑性配列Ｓと比較してより迅速に生じるだろう。リボＵ塩基の連続伸張を複製ブロックとして使用するため、５’突出は、好ましくはポリ（Ｔ）ホモポリマーであり、Ｎ－プローブは、好ましくは、ＴおよびリボＵ塩基の両方に相補的なポリ（Ａ）ホモポリマーである。複製ブロックがリボＡ塩基で構成される他の実施形態では、５’突出は、好ましいポリ（Ａ）であり、Ｎ－プローブは、好ましいポリ（Ｔ）ホモポリマーである。Ｎ－プローブは、ライブラリー末端とのプローブアニーリングおよびライゲーション後に、エキソヌクレアーゼＩＩＩ消化に対する耐性を提供するために、Ｃ３炭素スペーサーなどの任意選択の３’末端ブロックに加えて、その３’末端のプローブ配列内に、内部的に、またはその５’末端付近に連続して配置することができるホスホロチオエート連結などの１つまたは複数のヌクレアーゼ耐性修飾をさらに含む。任意選択で、Ｎ－プローブは、二本鎖ＤＮＡ特異的活性を有するエキソヌクレアーゼＩＩＩ消化に対するさらなる耐性を付与するために、ＮＧＳライブラリーとのライゲーション後に一本鎖３’突出を生成するように５’突出よりも長さが長い。

限定的な指定モル分量のＮ－プローブのアニーリングおよびライゲーション後、過剰な非プローブ保護ライブラリー画分を消化するためにエキソヌクレアーゼＩＩＩが添加される第２の正規化ステップが実施される。そのｄｓＤＮＡ特異的な３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性のため、完全に非保護のライブラリー分子は、反対側の鎖の消化と遭遇するまで３’末端から消化され、非機能的であり、増幅または配列決定することができない２つの一本鎖部分的ライブラリー断片がもたらされる。ＮＧＳライブラリーの一本鎖保護画分の場合、非保護鎖は、完全に消化され、プローブ保護鎖は、ヌクレアーゼ耐性である。その結果、２倍のモル分量のｓｓＤＮＡＮ－プローブが、対応する指定モル分量のｄｓＤＮＡライブラリーを保護するのに必要であり、得られるライブラリーは、一本鎖であり、アダプター配列に対して方向性である（図８Ｂ）。図８Ｂでは、例として、８ｎＭの正規化プローブは、４ｎＭの二本鎖ＤＮＡＮＧＳライブラリーに相当する８ｎＭの一本鎖ＤＮＡＮＧＳライブラリーを産出するだろう。

代わりに、両ＮＧＳライブラリー末端に５’突出を生成する２つのプレＮプライマーを使用して方法２ａを実施し、正規化後に両鎖の回収をもたらしてもよい（図８Ｃおよび８Ｄ）。この例では、Ｎ－プローブモル濃度に対して過剰分量のライブラリーから、所望分量のｄｓＤＮＡライブラリーを回収するには、２倍のモル濃度のｓｓＤＮＡＮ－プローブの使用も必要とされる。また、対応するｄｓＤＮＡライブラリー分量が回収されるが、正規化されたライブラリーは、Ｎ－プローブが入力ＮＧＳライブラリーに比べて限定的であるため、各二重鎖の一方の鎖が保護されていたかまたは両方の鎖が保護されていたかに応じて、ｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡライブラリー分子を両方とも含む。例えば、図８Ｃでは、４ｎＭのｄｓＤＮＡＮＧＳライブラリー分量を産生するには、８ｎＭの一本鎖プローブおよび４ｎＭよりも多くのＰＣＲ増幅ｄｓＤＮＡライブラリーが必要とされるだろう。

方法２ａの場合、プレＮプライマーを使用するＰＣＲ増幅は、２つまたは４つのプライマーを使用して実施してもよい（それぞれ、図９Ａおよび１０Ａ、ならびに９Ｂおよび１０Ｂ）。１つのみのＮＧＳライブラリー鎖を標的として、ｄｓＤＮＡライブラリー１分子当たり単一の５’突出を生成する場合、この２本プライマーＰＣＲでは、単一のプレＮプライマーが、５’尾部配列を有していない従来のリバースプライマーと共に使用される。図９Ａ～９Ｂは、プライマー対を示しており、このプライマー対では、両プライマーは、インデックス付与配列が組み込まれている長鎖５’尾部を含み、短縮ＮＧＳアダプターがライゲートされたライブラリーを鋳型として使用すると（およびプレＮプライマーが、Ｎ－プローブアニーリング尾部領域を組み込んでいる追加の５’尾部領域を導入する場合）アダプターを完成させるが、この２つのプライマーは、完成された全長インデックス化ライブラリーを増幅するように設計することもでき、その場合、プライマーは、ライブラリー増幅に使用される末端アダプター配列のみにアニーリングし、プレＮプライマーのみが、Ｎ－プローブアニーリング尾部領域を含む５’尾部配列を含むが、従来のプライマーは、５’尾部を有しない（図示せず）。

４本プライマーＰＣＲ増幅（図９Ｂ）は、鋳型としては、短縮ＮＧＳアダプターがライゲートされたライブラリーに限定され、長鎖５’尾部をプレＮプライマーおよび従来のプライマーに組み込んで、ＮＧＳアダプター配列を完成させ、同時にＮ－プローブアニーリングのための尾部領域を導入する代わりに、配列組み込みを順次実施し、第１のインデックス付与プライマー対を使用してＮＧＳアダプターを完成させる場合、両プライマーは、ＮＧＳアダプターを完成させる５’尾部を含み、次いで第２のプレＮプライマー対が、第１のプライマー対の増幅産物にＮ－プローブアニーリングのための尾部領域を導入し、この場合、プレＮプライマーを、従来のプライマーと共に使用して、ＮＧＳライブラリーの一方の鎖が標的とされる。４本プライマー反応では、インデックス付与プライマー対は、それらの消費に結び付くより低い濃度で使用してもよく、プレＮプライマー対は、完成ライブラリー産物と第１のプライマー対とがプライミングする可能性（それにより、Ｎ－プローブアニーリングの尾部領域が除去されるだろう）を低減するために、より高い濃度でライブラリー増幅に使用される。

図９Ａ～９Ｂは、第１のＮＧＳアダプターの配向性のみを使用して、一本鎖を標的とするための５’突出が生成することを示しているが、代わりに、反対側の第２のＮＧＳアダプターを使用して、５’突出を生成してもよく、その場合は、次いで従来のプライマーを、第１のＮＧＳアダプター（図示せず）に対して使用する。

図１０Ａ～１０Ｂに示されているように、方法２ａが、ＮＧＳライブラリーの両ＤＮＡ鎖を標的とするように設計されている場合、２つのプライマーが使用されるかまたは４つのプライマーが使用されるかに関わらず、いずれの場合でも、プレＮプライマー対および従来のプライマー対が使用されるのではなく、２つのプレＮプライマーが存在し、それらは両方とも、２つのプライマーの各々が、第１または第２のＮＧＳアダプター配列のいずれかに特異的にアニーリングし、任意選択で、アダプター配列の末端部分を組み込み、両ライブラリー末端に対称性の５’突出を生成すること以外、同一組成を有する５’末端尾部領域を導入する。

図９Ｂおよび１０Ｂでは、ＰＣＲ反応は、インデックス付与プライマーを用いて開始し、インデックス付与プライマーが消費されたら正規化プライマーを用いて継続する（例えば、図９Ｂおよび１０Ｂに示されているように、１０ｎＭ濃度のＮＧＳライブラリーで）。

方法２ｂ
５’突出がＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより生成される方法２ｂのさらなる詳細は、図１１に見出される。この図は、５’緩衝領域を有する従来のリバースプライマーと共に単一のプレＮプライマーを使用した、一方のライブラリー鎖のエキソヌクレアーゼ保護を示しているが、２つのプレＮプライマーを使用すれば、両ライブラリー鎖のエキソヌクレアーゼ保護が可能である（図示せず）。図１１では、５’末端尾部領域および３’隣接緩衝領域を含有する１つのプレＮプライマーのみが、第１の緩衝領域と塩基組成が同一である５’末端緩衝領域を含有するリバースプライマーと共に、ＰＣＲ増幅ステップで使用される。緩衝領域の塩基組成は、尾部領域から除外されるヌクレオチドに制限される。使用されるＮ－プローブの分量に対して過剰モル分量のライブラリーを生成した後の精製ステップ後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝領域に相補的であるが、尾部領域には相補的でないヌクレオチドミックス、およびＤＮＡリガーゼに加えて、尾部領域に相補的な限定的モル分量のＮ－プローブを添加することにより、第１の正規化ステップを実施する。相補的突出との低複雑性プローブアニーリングは、高複雑性配列と比較して、より迅速に生じるため、ホモポリマー、ジ－またはトリ－ヌクレオチド配列などの、低複雑性Ｎ－プローブ配列の使用が好ましい。Ｎ－プローブは、ライブラリー末端とのＮ－プローブアニーリングおよびライゲーション後にエキソヌクレアーゼＩＩＩ消化に対する耐性を提供するために、その３’末端のプローブ配列内に、内部的に、またはその５’末端付近に連続して配置することができるホスホロチオエート連結などの１つまたは複数のヌクレアーゼ耐性修飾をさらに含む。また、Ｎ－プローブは、３’ホスフェートなどの保護基、または３’自己相補的ヘアピンおよび複製ブロックの組合せなどの二次構造、またはＴ４ＤＮＡポリメラーゼ３’エキソヌクレアーゼ活性に対するＮ－プローブの耐性を付与する任意の他の修飾を含む。

この第１の酵素に基づく正規化反応内では、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼは、以前のｄｓＤＮＡ尾部領域に５’突出を生成して、増幅されたライブラリーとのＮ－プローブアニーリングを可能にし、適切な反応条件下では、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼは、そのｄＮＴＰが反応に存在しない３’塩基を相補的尾部領域から不可逆的に除去するが、緩衝領域に相補的なｄＮＴＰが存在するため、３’隣接緩衝領域の塩基を可逆的に除去および置換する。増幅されたライブラリーの反対側の末端は、第１の緩衝領域と同じヌクレオチド組成を有する第２の緩衝領域が存在するため二本鎖のままであり、塩基は、適切なヌクレオチドミックスが存在するため、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより可逆的に除去および置換される。それにより、第１の末端にある緩衝領域の５’突出の境界が画定され、反対側の末端では、第２の緩衝領域は、突出の形成を防止する。

限定的Ｎ－プローブ分量のアニーリングおよびライゲーションの後、エキソヌクレアーゼＩＩＩを添加して、過剰な非プローブ保護ライブラリー画分を消化することにより、第２の酵素に基づく正規化ステップを実施する。そのｄｓＤＮＡ特異的な３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性のため、完全に非保護のライブラリー分子は、反対側の鎖の消化と遭遇するまで３’末端から消化され、非機能的であり、増幅または配列決定することができない２つの一本鎖部分的ライブラリー断片がもたらされる。ＮＧＳライブラリーの一本鎖保護画分の場合、非保護鎖は、完全に消化され、プローブ保護鎖は、ヌクレアーゼ耐性である。その結果、２倍のモル濃度のｓｓＤＮＡＮ－プローブ分量が、対応するｄｓＤＮＡライブラリー分量を保護するのに必要であり、得られるライブラリーは、一本鎖であり、アダプター配列に対して方向性である（図１１）。この方法の代替的な実施形態では、エキソヌクレアーゼＩＩＩを添加して非プローブ選択画分を消化する代わりに、アピラーゼジホスファターゼ酵素を添加して、反応中に存在するｄＮＴＰ混合物に由来するホスフェートを加水分解する。これは、次いで、切除された塩基を置換するための任意の機能的ｄＮＴＰの非存在下におけるＴ４ＤＮＡポリメラーゼの制御されない３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性に結び付くことになり、したがって、非プローブ選択ライブラリー画分は消化されて、配列決定不能になり、Ｎ－プローブ選択画分は、依然としてヌクレアーゼ耐性であり、配列決定可能である。

他の態様では、両方とも尾部および緩衝領域を含有する２つのプレＮプライマーを使用して、方法２ｂを実施し、両ＮＧＳライブラリー末端に５’突出を生成して、Ｎ－プローブライゲーションおよびライブラリー消化後に両ＮＧＳライブラリー鎖の回収をもたらすことができる。一実施形態では、ホモポリマー尾部領域を、ジヌクレオチド緩衝領域と共に使用するが、緩衝領域の塩基組成が尾部領域から除外される限り、任意の低複雑性配列を、尾部領域に使用することができる。その３’末端に、内部的に、もしくはその５’末端付近にヌクレアーゼ耐性修飾を含む線形Ｎ－プローブを使用してもよく、または３’自己相補的ヘアピンおよび複製不能なスペーサーを有する任意選択のＮ－プローブを使用して、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ３’エキソヌクレアーゼ活性およびエキソヌクレアーゼＩＩＩに対するさらなる耐性を付与してもよい。いずれの場合でも、プローブは、３’エキソヌクレアーゼ消化に対する耐性を付与する。これら２つの酵素に基づく正規化ステップ後、Ｎ－プローブに対して過剰モル濃度のライブラリー入力から、所望のモル分量のｄｓＤＮＡライブラリーが回収されるが、２倍のモル濃度の一本鎖ＤＮＡＮ－プローブが使用される。また、ｄｓＤＮＡモルライブラリー分量が回収されるが、正規化ライブラリーは、Ｎ－プローブが限定的であるため、各二重鎖の一方の鎖が保護されているかまたは両方の鎖が保護されているかに応じて、ｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡライブラリー分子を両方とも含む。

方法２ｃ
代わりにＮ－プローブライゲーションのための３’突出が、切断酵素によりＰＣＲ後に生成されるこの方法は、図１２に見出すことができる。この図は、１つのみの切断可能なプレＮプライマーを使用して、一方のＮＧＳライブラリー鎖に単一の３’突出を生成することが示されているが、ＰＣＲプライマーが両方とも切断可能な塩基を含有する場合、３’突出は、両ライブラリー末端に生成され、ヌクレアーゼ耐性Ｎ－プローブのアニーリングおよびライゲーション後、両ＮＧＳライブラリー鎖が、５’エキソヌクレアーゼ消化から保護される。プレＮプライマーに組み込まれる切断可能な塩基は、ＲＮＡ、デオキシウラシル、またはデオキシイノシンであってもよく、組み込まれたプライマー配列は、それぞれ、ＲＮＡｓｅＨ、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、および脱プリン部位エンドヌクレアーゼ、またはエンドヌクレアーゼＶでの切断により、得られたアンプリコンから切断することができる。

使用されるＮ－プローブモル分量に対して過剰モル分量のＮＧＳライブラリーを生成した後の精製ステップ後、切断酵素およびＤＮＡリガーゼに加えて指定モル分量のＮ－プローブを添加することにより、第１の正規化反応を実施する。低複雑性プローブアニーリングは、高複雑性配列と比較してより迅速に生じることになるため、３’突出に相補的な、ホモポリマー、ジ－またはトリ－ヌクレオチド配列などの低複雑性プローブ配列の使用が好ましい。Ｎ－プローブは、ライブラリー末端とのプローブアニーリングおよびライゲーション後に５’エキソヌクレアーゼ消化に対する耐性を提供するために、その５’末端のプローブ配列内に、内部的に、またはその３’末端付近に連続して配置することができるホスホロチオエート連結などの１つまたは複数のヌクレアーゼ耐性修飾をさらに含む。この反応内では、プレＮプライマーの長さおよび位置の両方ならびに切断可能な塩基の数が、酵素的切断により生成される３’突出の長さを画定する。したがって、切断酵素は、３’突出を生成して、限定的指定プローブ分量から過剰分量の３’突出のプローブアニーリングおよびライゲーションを可能にし、それにより、選択されたライブラリー画分に５’エキソヌクレアーゼ耐性が付与される。第２の正規化ステップでは、次いでラムダまたはＴ７エキソヌクレアーゼを添加して、非プローブ保護ライブラリー画分を消化する。それらのｄｓＤＮＡ特異的な５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性のため、完全に非保護のライブラリー分子は、反対側の鎖の消化と遭遇するまで５’末端から消化され、非機能的であり、増幅または配列決定することができない２つの一本鎖部分的ライブラリー断片がもたらされる。ＮＧＳライブラリーの一本鎖保護画分の場合、非保護鎖は、完全に消化され、プローブ保護鎖は、ヌクレアーゼ耐性である。その結果、２倍のｓｓＤＮＡプローブモル分量が、対応する所望のｄｓＤＮＡライブラリーモル分量を保護するのに必要であり、得られるライブラリーは、一本鎖であり、アダプター配列に対して方向性である。

また、図４１Ａ～４１Ｅは、エキソヌクレアーゼ消化からの制御された保護の異なる例示的な実施形態を示している。一部の場合では、突出は必要ではない（例えば、図４１Ａを参照）。一部の場合では、ライゲーションは、例として、限定ではないが、平滑末端（図４１Ａ）、ＴＡライゲーション（図４１Ｂ）、または付着末端ライゲーションであってもよい。図４１Ａ～４１Ｅに示されている方法のすべてでは、限定および指定された量のヌクレアーゼ耐性塩基保持Ｎ－プローブを、３’もしくは５’のいずれかまたは両ＤＮＡ末端とライゲーションすることができ、したがって、エキソヌクレアーゼ分解から指定のライブラリー画分が保護される。ライブラリー分子は、本開示に記載されており、当業者に公知の方法により産生することができる。突出がＰＣＲにより生成される場合、本開示の方法を使用して、そのような突出を生成することができる。

図４１Ａでは、ＮＧＳライブラリーを、高フィデリティーＤＮＡポリメラーゼおよび従来のプライマーを用いて増幅して平滑末端断片を産出し、次いで、平滑末端断片を、エキソヌクレアーゼによる消化に対する耐性を提供する修飾を有する指定量の二本鎖（または一本鎖、図示せず）プローブと平滑末端ライゲートさせ、次いでエキソヌクレアーゼに曝露させて、正規化されたＮＧＳライブラリーを産出することができる。プローブアニーリングおよびライゲーションを加速させる低複雑性配列が存在しないため、非常に高いライブラリー濃度およびＤＮＡリガーゼ濃度で反応を進行させて、効率化を図ってもよい。

図４１Ｂでは、ライブラリーを、Ｔａｑまたは３’プルーフリーディング活性を欠如する任意の他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよび従来のプライマーを用いて増幅して、末端にＡ尾部を有する断片を得、次いでそれを、ＴＡライゲーションにより、Ｔ尾部を有する正規化プローブとライゲートさせることができる。図４１に示されているように、プローブアニーリングおよびライゲーションを加速させる低複雑性配列が存在しないため、非常に高いライブラリー濃度およびＤＮＡリガーゼ濃度で反応を進行させて、効率化を図ってもよい。

図４１Ｃでは、プレＮＰＣＲプライマーを使用してライブラリーを増幅し、５’尾部領域および３’隣接緩衝領域を組み込む。尾部領域は、６～２０塩基であり、ホモポリマー、ジ－またはトリ－ヌクレオチド組成を含み、その後に５’尾部領域から除外されるヌクレオチド組成を含有する５～１０塩基緩衝領域が後続する。そのような配列を含むＮＧＳライブラリーを、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、および緩衝領域に相補的であるが、尾部領域には相補的でない塩基のみに制限されたヌクレオチドミックスと共にインキュベートすると、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの３’エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性は、緩衝領域に到達するまで３’相補的尾部領域を不可逆的にトリミングすることになり、緩衝領域では、ヌクレオチドを可逆的に除去および置換し、したがって緩衝領域により画定される５’突出を生成することができる。５’突出の生成、および相補的５’突出配列を有するＮ－プローブのライゲーションは、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを除去もしくは熱不活化した後で逐次的に実施してもよく、またはＮ－プローブが、５’尾部に３’隣接する同じ塩基組成を有する緩衝領域を含有する場合、単一のインキュベーション反応内に組み合わせてもよい。プレＮＰＣＲプライマーおよびＮ－プローブ相補的尾部配列は、プローブアニーリングおよびライゲーションを加速させて、低プローブ濃度での効率的なライゲーションを可能にする、ポリＡおよびポリＴなどのホモポリマー反復配列である。

図４１Ｄでは、ライブラリーは、５’尾部を有するプレＮＰＣＲプライマーを使用して増幅され、尾部とアダプター配列との間には、ｄＵ塩基（古細菌ＤＮＡポリメラーゼの場合）を含む複製不能な基、または３つもしくはそれよりも多くのリボＵもしくはリボＡ塩基の連続伸張を含む複製不能なスペーサーが位置し、高フィデリティーＤＮＡポリメラーゼは、（リボＵ）_ｎまたは（リボＡ）_ｎ鋳型を越えて伸長することができない。式中、ｎ＝３またはそれよりも大きい。リボＵおよびリボＡ塩基が、それぞれポリ（ｄＴ）およびポリ（ｄＡ）６～２０塩基尾部配列（それぞれ配列番号５７および５８）によりフランキングされている場合、ＰＣＲは、ホモポリマーＮ－プローブライゲーションのための、対応するホモポリマー５’突出を有するライブラリー分子をもたらす。ポリＡおよびポリＴなどの反復配列は、プローブアニーリングおよびライゲーションを加速させて、低プローブ濃度での効率的なライゲーションを可能にする。

図４１Ｅでは、ライブラリーは、切断可能な塩基またはヌクレアーゼ耐性の塩基のいずれかを含む修飾塩基を有するプレＮＰＣＲプライマーを使用して増幅される。切断可能な塩基は、５’尾部内、またはアダプター配列の５’部分内に均等に位置していてもよく、ｄＵ塩基、ＲＮＡ、およびデオキシイノシンを含むがが、それらに限定されない。ホスホロチオエート塩基などのヌクレアーゼ耐性塩基は、５’尾部の３’部分内、または尾部が存在しない場合（図示せず）は、アダプター配列内に位置していてもよい。ＵＤＧ／脱塩基部位エンドヌクレアーゼミックス、ＲＮａｓｅＨまたはエンドヌクレアーゼＶ（切断可能な塩基の場合）、およびＴ７エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、またはエキソヌクレアーゼＶなどの５’エキソヌクレアーゼ（ヌクレアーゼ耐性塩基の場合）と共にインキュベートすることにより、プレＮＰＣＲプライマー内の切断可能な／ヌクレアーゼ耐性の塩基または連結の位置によりその長さが制御される３’突出がもたらされるだろう。尾部配列は、複雑な配列またはホモポリマー低複雑性配列のいずれであってもよい。

方法３：制御された修復による酵素に基づくライブラリー正規化
３つの制御された修復方法が、図１３～１６に概説されており、プレＮプライマーＰＣＲ増幅後に、方法３ａは、２つの正規化ステップ：切断／ライゲーションステップ、その後のエキソヌクレアーゼステップを有し、方法３ｂおよびｃは、単一の切断／ライゲーションステップのみを有する。方法２ｃと同様に、方法３ａおよびｂでは、切断可能な塩基を含むプレＮＰＣＲプライマーを利用して、ＰＣＲ後に、過剰モル分量のＮＧＳライブラリーに３’突出を生成するが、方法３ｃでは、ヌクレアーゼ耐性修飾を含むプレＮプライマーを有する５’エキソヌクレアーゼを使用して３’突出を生成する。方法３ａでは、単一のプレＮプライマーを従来のプライマーと共に使用して、生成される単一の３’突出は、ＮＧＳアダプターの機能的部分を含み、その結果、組み込まれたプライマー配列の切断は、ライブラリー分子の５０％の部分的なライブラリー不活化をもたらし、アダプターの５’部分が無いため、切断されたライブラリー鎖は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定プラットフォームでのクラスター形成、またはＩｏｎｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓでのサポートエマルジョンＰＣＲ（supporting emulsion PCR）が不可能にされているが、第２のＮＧＳ鎖は、依然として完全性および機能性を保つ。１つではなく２つのプレＮプライマーが使用される場合（方法３ｂ）、両ライブラリー鎖またはライブラリー分子の１００％が、切断反応により不活化される。いずれの方法でも、ＲＮＡ、デオキシウラシル（dexoyuracil）、またはデオキシイノシン切断可能な塩基が、ＲＮａｓｅＨ、ＵＤＧおよび脱プリン部位エンドヌクレアーゼ、またはエンドヌクレアーゼＶ切断と組み合わせて、正規化プライマーに含まれている。３’突出の長さは、プライマー内の切断可能な塩基の位置ならびにプライマー全体の長さにより制御される。他の実施形態（方法３ｃ）では、一方または両方のライブラリー末端の３’突出は、ＰＣＲ後に、Ｔ７またはラムダエキソヌクレアーゼなどの５’エキソヌクレアーゼと共にインキュベートすることにより生成され、５’エキソヌクレアーゼは、ホスホロチオエート結合または他の修飾などのヌクレアーゼ耐性連結と内部的に遭遇するまで、増幅されたライブラリー分子の５’末端を消化することになる。３’突出の長さは、プレＮＰＣＲプライマー内のヌクレアーゼ耐性塩基または連結に対する消化可能な塩基の位置ならびにプライマー全体の長さにより制御される。

また、酵素に基づく正規化ステップでは、限定的モル分量のＮ－プローブおよびリガーゼが存在する。任意選択で、置換または切断されなければＮ－プローブの完全なアニーリングおよびライゲーションを妨げることになる、不完全なプライマー消化反応に由来するあらゆる残存する切断可能な塩基を置換または切断するために、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼまたはｆｌａｐエンドヌクレアーゼなどの酵素も含まれる。このステップ内では、一方の（方法３ａ）または両方の（方法３ｂ、ｃ）５’末端のいずれかを酵素的に除去して、一方または両方のライブラリー鎖を不活化した後、過剰モル分量のライブラリーの選択された画分を、切断により除去されたＮＧＳアダプター配列に対応する限定的モル分量のＮ－プローブとライゲートさせ、したがって、機能的ＮＧＳアダプターおよび配列決定されるその能力を回復させる。回復された機能性を有する選択されたライブラリー画分は、限定的モル分量のＮ－プローブに対応するモル分量であるため、これにより、方法４ｂおよびｃの酵素に基づく正規化プロセスが完了する。方法３ａは、追加の正規化ステップを必要とし、追加の正規化ステップでは、エキソヌクレアーゼＩなどの一本鎖特異的３’－５’エキソヌクレアーゼを使用して、完全なままで残されていたが、その相補鎖がＮ－プローブにライゲートしなかったライブラリー鎖の３’突出を消化し、したがって、Ｎ－プローブとライゲートしたライブラリー鎖を除くすべてのライブラリー鎖を不活化し、それによりＮＧＳライブラリーのモル濃度を、Ｎ－プローブモル分量に相当するように正規化する。

具体的には、図１３では、上記３つの方法を説明する４つのステップが存在する：（１）ＰＣＲ増幅を行って、切断可能な塩基（方法３ａまたは３ｂ）またはヌクレアーゼ耐性の塩基（方法３ｃ）を、一方（方法３ａ）または両方の（方法３ｂまたは３ｃ）アダプター末端に有するＮＧＳライブラリーを生成し、その後ＳＰＲＩ精製を行うステップ；（２）一方のＮＧＳアダプターの５’部分の消化による部分的ライブラリー不活化（方法３ａ）、または両ＮＧＳアダプターの５’部分の酵素的消化（方法３ｂ）もしくは５’エキソヌクレアーゼ消化（方法３ｃ）による完全ライブラリー不活化を行って、３’突出を生成するステップ；（３）３’突出に指定分量の正規化プローブをアニーリングおよびライゲーションさせることにより、指定数のライブラリー分子を回復させるステップ；ならびに（４）エキソヌクレアーゼＩなどの一本鎖特異的エキソヌクレアーゼを使用して３’突出を消化することにより、非修復ライブラリー画分の完全な不活化を行うステップ（方法３ａのみ）。

方法４：制御された合成による酵素に基づくライブラリー正規化
酵素に基づくライブラリー正規化のための２つの制御された合成方法が、図１７に概説されており、方法は、短縮されたまたは不完全な非機能的アダプター配列を一方または両方の末端に有するＮＧＳライブラリーを構築および増幅し、その後、ライブラリーの選択されたモル画分の機能的ライブラリー構築を完成させる限定されたＮ－プローブ分量をライゲーションさせるステップを含む。方法４ａでは、５’突出が、プレＮプライマーの複製不能な部分を使用してＰＣＲ中に生成され、または方法４ｂでは、５’突出が、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより、以前に記載されているようにＰＣＲ後に生成される（プレＮＰＣＲプライマーの緩衝領域から除外される、尾部の限定された塩基組成、その後の、相補的尾部領域から除外されているが、相補的緩衝領域に含まれている、ＰＣＲ後の３’－５’エキソヌクレアーゼ反応での限定されたｄＮＴＰ組成）。他の態様では、５’突出は、本明細書の他の開示されている方法により生成することができる。代わりに、方法２ｃで開示されているＮ－プローブアニーリングおよびライゲーションのための開示されている方法のいずれかにより３’突出の生成を行った後、制御された合成正規化を実施してもよい（図示せず）。５’または３’突出を形成した後、一実施形態（方法４ａ）では、一本鎖Ｎ－プローブを使用して、それがライゲートする鎖のみにライブラリー機能性を付与する。別の実施形態（方法４ｂ）では、部分的に二本鎖のＮ－プローブを使用して、それがライゲートする両鎖にライブラリー機能性を付与する。

５’または３’突出の形成は、Ｎ－プローブライゲーションの必要条件ではないが、突出は、低濃度でのプローブおよびライブラリーライゲーションを著しく促進する。一実施形態では、単一のＴ塩基３’突出を有する二本鎖正規化プローブのライゲーションは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによりＰＣＲ中に生成される単一のＡ塩基３’突出を有するライブラリーを必要とする（図４２Ｂ）。別の実施形態では、二本鎖正規化プローブは平滑末端を有し、高フィデリティーＤＮＡポリメラーゼを使用して増幅されたライブラリーにライゲートされる（図４２Ａ）。短縮アダプター末端との、限定された量の平滑末端または単一Ｔ塩基３’突出正規化プローブのライゲーションは、ＰＣＲ中に生成される高ライブラリー濃度により促進することができる。ＮＧＳライブラリーの反対側の末端にあるアダプターとのプローブライゲーションの防止は、５’ホスフェート基の欠如、または適合性の平滑末端もしくは単一Ａ塩基３’突出の欠如、または５’ホスフェートおよび適合性の末端の両方の欠如により制御することができる。

具体的には、図１７では、示されている２つのステップは、（１）複製不能な塩基もしくは塩基の組合せを含有するか（方法４）、またはＴ４ＤＮＡポリメラーゼによる５’突出生成を可能にする特殊な塩基組成を両末端に有する（方法４）ＰＣＲプライマーを使用してＰＣＲ増幅を行って、短縮アダプター末端に５’突出を有する非機能的ライブラリー分子を生成し、その後ＳＰＲＩ精製を行うステップならびに（２）指定量の正規化合成プローブを５’突出とアニーリングおよびライゲーションすることにより（方法４）、または第１に、限定されたヌクレオチド組成の存在下でＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより短縮アダプター末端に５’突出を産生し、第２に、指定分量の二本鎖正規化合成プローブを５’突出とアニーリングおよびライゲーションすることにより（方法４）、指定数の機能的ライブラリー分子を合成するステップを含む。

図１８～４２Ｉは、制御された合成に基づく正規化のために、１つまたは２つのライブラリー鎖が標的とされる場合の詳細を示している。図１８、２０、および４２Ｄは、短縮された第１のＮＧＳアダプターを維持するが、平滑末端を産生する従来のリバースプライマーと組み合わせると、５’突出として低複雑性（ホモポリマーを含むが、それに限定されない）プローブアニーリング部位を導入し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定に必要とされるような試料インデックス付与を導入することができる、単一のプレＮプライマーを用いて、１つのライブラリー鎖を標的とする場合の選択肢を示している。ＰＣＲ後、Ｎ－プローブおよびＤＮＡリガーゼと共にＰＣＲ産物をインキュベートする前に、精製ステップを実施する。この場合、Ｎ－プローブは、低複雑性配列に相補的な配列を含み、ライゲーションすると、短縮ＮＧＳアダプターの欠失部分を導入し、機能的ＮＧＳライブラリーを付与する。得られたライブラリーは、内部低複雑性挿入を有する完全に機能的なアダプターを含む。代替的な実施形態（図４２Ｅ～４２Ｈ）では、低複雑性配列を導入して迅速なアニーリングを促進する代わりに、５’突出プローブアニーリング領域が、機能的アダプター配列に対応する。この場合、５’突出の生成は、アダプター配列内のいくつかのヌクレオチドをリボヌクレオチドに置換することによりもたらすことができる。１つのそのような実施形態では、プレＮ－プライマー内の３つの連続チミン塩基を、３つの連続リボウリジン塩基に置換する（図４２Ｅおよび図４３Ｂ～４３）。この場合、Ｎ－プローブライゲーション後、低複雑性配列が組み込まれていない機能的ＮＧＳライブラリーが生成される。さらに別の実施形態では、アダプター配列を含む一本鎖Ｎ－プローブのライゲーションは、相互に相補的な低複雑性配列、例えばポリＡおよびポリＴを、それぞれ、プレＮ－プライマーおよびＮ－プローブの５’および３’末端に付加することにより、加速させることができる（図４２Ｇおよび４３Ｃ）。この場合、Ｎ－プローブライゲーション後、低複雑性配列がアダプター内に組み込まれる代わりに、アダプターの末端に組み込まれている機能的ＮＧＳライブラリーが生成される。得られた５’突出を、限定的モル分量の一本鎖または二本鎖のＮ－プローブとライゲーションさせた後、Ｎ－プローブのモル濃度に相当する一本鎖機能的ライブラリーが生成される。指定モル濃度のｄｓＤＮＡライブラリー当量の分量を生成するには、２倍高いｓｓＤＮＡプローブ濃度が必要であることが理解される。

図１９および図２１Ａは、２つのプレＮ－プライマーを用いて両ライブラリー鎖を標的とする場合の選択肢を示している。この場合、１つのプレＮ－プライマーは、短縮された第１のＮＧＳアダプターを維持するが、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ媒介性５’突出生成を促進する追加の配列を導入し、第２のプレＮ－プライマーは、第２のＮＧＳアダプターの末端にインデックス配列および緩衝領域を導入し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ３’エキソヌクレアーゼ活性に対する耐性を付与して平滑末端を維持する。プレＮ－プライマーを用いてＰＣＲ増幅し、その後、未使用のプライマーを除去し緩衝液交換を実施する精製ステップを行った後、精製したＰＣＲ産物を、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、および緩衝配列に相補的であるが、尾部配列には相補的でない限定されたデオキシヌクレオチド組成物と共にインキュベートし、それにより、短縮された第１のアダプター末端に５’突出、および完全な第２のアダプター末端に平滑末端を有する産物を生成する。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの熱不活化後、低複雑性尾部配列に相補的な配列および機能性の付与に必要なＮＧＳアダプターの欠失部分を含む限定的モル分量のＮ－プローブを、５’突出にライゲートさせる。代替的な実施形態では、Ｎ－プローブは、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを使用した５’突出生成およびライゲーションを同時に可能にするために、その３’末端に３’エキソヌクレアーゼ耐性のための緩衝領域をさらに含む。

図２０Ａ～２０Ｂは、単一のプレＮプライマーを使用する場合（方法４ａ）、いずれかのアダプター末端を使用して、Ｎ－プローブアニーリングおよびライゲーションのための５’突出を導入することができ、加えて、第１のアダプター末端に対する正規化を標的とするかまたは第２のアダプター末端に対する正規化を標的とするかに関わらず、単一または二重インデックス付与のいずれかを、いずれかの実施形態に組み込むことができることを示している。図２１Ａでは、ＰＣＲ増幅ＮＧＳライブラリーは、インデックス化全長Ｐ７アダプターおよび短縮Ｐ５アダプターを含み、Ｐ５は、末端プローブアニーリングおよび緩衝配列を有し、Ｐ７は、緩衝配列を有する（緩衝配列は、適切なｄＮＴＰ組成物を用いて、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼエキソヌクレアーゼ消化をブロックする）。図２１Ｂでは、完全に合成されたＮＧＳライブラリーは、Ｐ７インデックスおよび任意選択のＰ５二重インデックスを有し、Ｐ５アダプターは、内部正規化プローブ配列を含む。

代替的な実施形態では、制御された合成による正規化には、短縮アダプターライブラリーの産生は必要ではない。これは、リボヌクレオチドが配列決定ワークフローと非適合性であるため、リボヌクレオチド塩基をアダプター配列に挿入することにより、ライブラリーを非機能的にすることができるからである。したがって、全長アダプターは、内部リボヌクレオチドを含む場合、非機能的であり得る。図４２Ｈにより示されているように、リボ塩基を有するプレＮ－プライマーは、完全なサイズのアダプター配列を有し得るが、ＰＣＲの産物は、少なくともＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定プラットフォームに関しては依然として非機能的であり得る。これは、ＰＣＲ産物の一方の鎖（下方）は、短縮され、非機能的であり、他方（上方）の鎖は、Ｉｌｌｕｍｉｎａフローセルでのクラスター形成に使用される高フィデリティーＤＮＡポリメラーゼにより完全には複製可能でなく、したがってこの鎖も非機能的であるためである。Ｎ－プローブとＰＣＲ産物のボトム鎖とのその後のライゲーションは、機能的ライブラリーを産生し、このライブラリーの量は、正規化プローブの量により制御される。

一態様では、ＰＣＲに基づくＮＧＳライブラリー正規化または酵素に基づくＮＧＳライブラリー正規化のためのキットは、本明細書で開示される方法または方法の組合せおよびそれらの実施形態を実施するのに必要な成分を含む。別の態様では、酵素に基づくＮＧＳライブラリー正規化のためのキットは、プレＮプライマー、ポリメラーゼ、Ｎ－プローブ、リガーゼ、およびヌクレアーゼを含む、方法２ａに必要な成分を含む。代替的な実施形態では、ＰＣＲに基づくライブラリー正規化のためのキットは、Ｎ－ＰＣＲプライマー対およびポリメラーゼを含む。

制御された合成のための代替的な方法は、一方の末端に短縮アダプターを有する短縮ＮＧＳライブラリーが、様々な方法のいずれかにより産生され、プローブが、アダプターの欠失部分を提供して、ＮＧＳのためのＮＧＳライブラリーの機能性を回復させる実施形態を含む図４２Ａ～４２Ｈに示されている。

図４２Ａでは、ライブラリーを、高フィデリティーＤＮＡポリメラーゼおよび従来のプライマーで増幅して、平滑末端断片を産生し、次いで、平滑末端Ｎ－プローブとライゲートさせる。効率化を図るために、そのような反応は、非常に高いライブラリーおよびＤＮＡリガーゼ濃度で進行させて、低複雑性配列の非存在下における低プローブ濃度でのライゲーションを可能にするべきである。非欠損末端は、対応するＰＣＲプライマーの５’末端にかさ高いスペーサーを配置することにより、そのようなライゲーションを回避することができる。増幅されたライブラリーは、欠損アダプター末端を有するため最初は短縮されており、これは、アダプターの欠失部分を含むプローブとライゲートされると、機能的な正規化されたＮＧＳライブラリーが産出される。

図４２Ｂでは、ライブラリーを、Ｔａｑまたは３’プルーフリーディング活性を欠如する任意の他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよび従来のプライマーを用いて増幅して、末端にＡ尾部を有する断片を産生させ、次いで、Ｔ尾部を有するＮ－プローブとライゲートさせる。Ａの場合と同様に、そのような反応は、非常に高いライブラリーおよびＤＮＡリガーゼ濃度で進行させて、低複雑性配列の非存在下における低プローブ濃度でのライゲーションを可能にするべきである。非欠損末端は、対応するＰＣＲプライマーの５’末端にかさ高いスペーサーを配置することにより、そのようなライゲーションを回避することができる。増幅されたライブラリーは、欠損アダプター末端を有するため、最初は短縮されており、これは、アダプターの欠失部分を含むプローブとライゲートされると、機能的な正規化されたＮＧＳライブラリーが産出される。

図４２Ｃでは、プレＮＰＣＲプライマーを使用してライブラリーを増幅し、ＮＧＳライブラリーの短縮アダプター末端に５’尾部および３’隣接緩衝領域を組み込む。尾部領域は、６～２０塩基であり、ホモポリマーまたはジ－ヌクレオチド組成を含み、その後に５’尾部領域から除外されるヌクレオチド組成を含有する５～１０塩基緩衝領域が後続する。そのような配列を含むＮＧＳライブラリーを、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、および緩衝領域に相補的であるが、尾部領域には相補的でない塩基のみに制限されたヌクレオチドミックスと共にインキュベートすると、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの３’エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性は、緩衝領域に到達するまで３’相補的尾部領域を不可逆的にトリミングすることになり、緩衝領域では、ヌクレオチドを可逆的に除去および置換し、したがって緩衝領域により画定される５’突出を生成することができる。５’突出の生成、および相補的５’突出配列を有するＮ－プローブのライゲーションは、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを除去もしくは熱不活化した後で逐次的に実施してもよく、またはＮ－プローブが、その５’尾部に３’隣接する、同じ塩基組成を有する緩衝領域を含有する場合、単一のインキュベーション反応内に組み合わせてもよい。最良のシナリオでは、プレＮＰＣＲプライマーおよびＮ－プローブ相補的尾部配列は、低プローブ濃度でのプローブアニーリングおよびライゲーションを加速させる、ポリＡおよびポリＴなどのホモ－ヌクレオチド反復配列である。増幅されたライブラリーは、欠損アダプター末端を有するため、最初は短縮されており、これは、アダプターの欠失部分を含むプローブとライゲートされると、機能的な正規化されたＮＧＳライブラリーが産出される。

図４２Ｄでは、ライブラリーは、５’尾部を有するプレＮＰＣＲプライマーを使用して増幅され、尾部と、アダプター配列、つまりｄＵ塩基（古細菌ＤＮＡポリメラーゼの場合）を含む複製不能な基、または３つもしくはそれよりも多くのリボＵもしくはリボＡ塩基の連続伸張を含む複製不能なスペーサーとの間に位置し、高フィデリティーＤＮＡポリメラーゼは、（リボＵ）_ｎまたは（リボＡ）_ｎ鋳型を越えて伸長することができない。式中、ｎ＝３またはそれよりも大きい。リボＵおよびリボＡ塩基が、それぞれポリ（ｄＴ）およびポリ（ｄＡ）６～２０塩基尾部配列（それぞれ配列番号５７および５８）によりフランキングされている場合、ＰＣＲは、Ｎプローブとホモポリマー５’尾部とのライゲーションのための、対応するホモポリマー５’突出を有するライブラリー分子をもたらす。ポリＡおよびポリＴなどの反復配列は、プローブアニーリングおよびライゲーションを加速させて、低プローブ濃度での効率的なライゲーションを可能にする。増幅されたライブラリーは、欠損アダプター末端を有するため、最初は短縮されており、これは、アダプターの欠失部分を含むプローブとライゲートされると、機能的な正規化されたＮＧＳライブラリーが産出される。

図４２Ｅでは、ライブラリーは、元のＮＧＳアダプター配列内のデオキシリボヌクレオチドを置換する３つまたはそれよりも多くのリボ塩基の連続伸張を有するプレＮＰＣＲプライマーを使用して増幅される。Ｎ－プローブは二本鎖である。増幅されたライブラリーは、欠損アダプター末端を有するため、最初は短縮されており、これは、アダプターの欠失部分を含むプローブとライゲートされると、機能的な正規化されたＮＧＳライブラリーが産出される。この方法は、３’プルーフリーディング活性のないポリメラーゼを、短縮アダプター配列に追加の配列を付加せずに使用する場合、５’突出を有する短縮ライブラリーの生成を可能にする。

図４２Ｆでは、ライブラリーは、元のＮＧＳアダプター配列内のデオキシリボヌクレオチドを置換する３つまたはそれよりも多くのリボ塩基の連続伸張を有するプレＮＰＣＲプライマーを使用して増幅される。Ｎ－プローブは、一本鎖である。増幅されたライブラリーは、欠損アダプター末端を有するため、最初は短縮されており、これは、アダプターの欠失部分を含むプローブとライゲートされると、機能的な正規化されたＮＧＳライブラリーが産出される。

図４２Ｇでは、ライブラリーは、元のＮＧＳアダプター配列内のデオキシリボヌクレオチドを置換する３つまたはそれよりも多くのリボ塩基の連続伸張、および５’末端にホモ－、ジ－、トリ－ヌクレオチド反復配列を有するプレＮＰＣＲプライマーを使用して増幅される。Ｎ－プローブは、低プローブ濃度でのプローブアニーリングおよびライゲーションを加速させる相補的反復配列を５’末端に有する一本鎖である。増幅されたライブラリーは、欠損アダプター末端を有するため、最初は短縮されており、これは、アダプターの欠失部分を含むプローブとライゲートされると、機能的な正規化されたＮＧＳライブラリーが産出される。Ｎ－プローブは、その３’末端に１０～２０個のポリＡまたはポリＴ塩基（それぞれ配列番号５９および６０）を有していてもよい。したがって、一部の実施形態では、短縮ＮＧＳライブラリーは、突出、しばしば５’突出を含んでいてもよく、ライブラリー増幅のためのアニーリングの加速を促進することができる一方で、プローブが短縮ＮＧＳライブラリーにライゲートされた場合にループ中に存在する欠失アダプター部分のプローブによる再組み込みを可能する、本開示に記載されている低複雑性配列も含む。これは、プローブにライゲートされたライブラリー分子の短縮ＮＧＳライブラリーの機能性を回復することができるが、低複雑性配列とプローブの相補的配列との結合のため、より速くより効率的な速度で実施することができる。

図４２Ｈでは、ライブラリーは、切断可能な塩基またはヌクレアーゼ耐性塩基のいずれかを含む修飾塩基を有するプレＮＰＣＲプライマーを使用して増幅される。切断可能な塩基は、アダプター配列の５’部分内に均等に位置し、ｄＵ塩基、ＲＮＡ、およびデオキシイノシンを含むが、それらに限定されない。ホスホロチオエート塩基などのヌクレアーゼ耐性塩基は、５’尾部の３’部分内、または尾部が存在しない場合は、アダプター配列内に位置していてもよい。ＵＤＧ／脱塩基部位エンドヌクレアーゼミックス、ＲＮａｓｅＨ、またはエンドヌクレアーゼＶ（切断可能な塩基の場合）、およびＴ７エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、またはエキソヌクレアーゼＶなどの５’エキソヌクレアーゼ（ヌクレアーゼ耐性塩基の場合）と共にインキュベートすると、プレＮＰＣＲプライマー内の切断可能な／ヌクレアーゼ耐性の塩基または連結の位置によりその長さが制御される３’突出がもたらされるだろう。５’突出の生成、および相補的５’突出配列を有するＮ－プローブのライゲーションは、切断酵素を除去もしくは熱不活化した後で逐次的に実施してもよく、または単一のインキュベーション反応内に組み合わせてもよい。エキソヌクレアーゼ消化の場合、Ｎ－プローブは、３’突出の遠位にある末端部分内にヌクレアーゼ耐性塩基を有する保護領域を含有する。増幅されたライブラリーは、欠損アダプター末端を有するため、最初は短縮されており、これは、アダプターの欠失部分を含むプローブとライゲートされると、機能的な正規化されたＮＧＳライブラリーが産出される。

Ｎ－ＰＣＲ：ＰＣＲに基づくＮＧＳライブラリー正規化法
ＰＣＲによるＮＧＳライブラリー濃度の正規化（Ｎ－ＰＣＲ）は、増幅中にすべてのＰＣＲプライマーを利用して、ＮＧＳライブラリーへと変換することができ、したがって、Ｎ－ＰＣＲプライマーのモル分量と等しいモル分量のＮＧＳライブラリーを産生することができるという仮定に依存する。ＮＧＳライブラリーの効率的な増幅を保証し、その複雑性を保存するため、従来のＰＣＲ反応中のプライマー濃度は、通常は、２００ｎＭから＞１，０００ｎＭまで様々である。このプライマー濃度では、５０ｕｌの反応容積で実施されるＰＣＲ増幅反応は、ＰＣＲプライマーの完全な利用を仮定すると、３０～５０ｐｍｏｌのＮＧＳライブラリーをもたらすはずである。この分量のライブラリーの産生には、実用的でない追加量のＤＮＡポリメラーゼが必要とされることになるが、この場合でさえ、反応は、後期ＰＣＲサイクルでは依然として、大分量のＤＮＡによる阻害を被ることになるだろう。また、それは、すべてのプライマーをライブラリーへと変換するために、より多くのＰＣＲサイクルを必要とし、ＰＣＲ複製物の大幅な増加、ならびにＤＮＡを損傷するおよび熱誘発性突然変異を誘導するリスクを伴う熱へのＤＮＡの追加の曝露をもたらすだろう。

問題は、プライマー濃度を低下させることにより対処することができる可能性があるが、標準的アニーリングおよび伸長時間を使用する場合、低減されたプライマー濃度では、プライミング効率およびライブラリー複雑性が低下する場合があり、代わりに、アニーリングおよび伸長時間を増加させて、プライマー濃度の低減を補償するとすれば、ＰＣＲ反応は、数時間に及ぶだろう。

ＰＣＲに基づくライブラリー正規化は、低プライマー濃度での効率的なプライマーアニーリングに結び付く本明細書で開示される新規なプライマー設計を使用して、従来のアニーリング時間の使用を可能にすることにより達成することができる。これらの修飾Ｎ－ＰＣＲプライマーは、プライミング効率またはＮＧＳライブラリー複雑性を低減させずに、低減された濃度および従来のアニーリング時間で性能を発揮することができる。加速されたアニーリングプロセスの概略図は、図２２に示されている。

アニーリング時間の加速を示す修飾Ｎ－ＰＣＲプライマーは、２つのドメイン：ライブラリー増幅のためのＮＧＳアダプター配列にアニーリングする３’ドメイン、およびそのアニーリング速度を増加させ、アニーリング時間を低減するために、そうでなければ従来のライブラリー増幅プライマーに追加された追加の特徴である５’ドメインを有する。５’ドメインは、モノ－、ジ－、トリ、テトラ－ヌクレオチド反復などの、低配列複雑性を有するＤＮＡ配列を含む。ＤＮＡ基質が、プライマーの５’ドメインの反復配列に相補的であり複雑性が低減された反復配列（および加えて、プライマーの３’部分に相補的な配列）を有する場合、その５’反復ドメインにより、鋳型の相補的な反復性対応部分とのプライマーアニーリングが迅速に生じ、この係留は、プライマーが、その３’ドメインにより、より高複雑性の配列にアニーリングすることを可能にする。５’ドメインの係留は、高い局所的プライマー濃度を生成し、プライマーの３’ドメインの迅速なアニーリングおよび伸長をもたらす。

アニーリング速度の増加を示すＮ－ＰＣＲプライマーの５’ドメインに使用されるいくつかの単純な反復配列が存在するが、それらのすべてが有用であるとは限らない。Ｎ－ＰＣＲプライマー間の交差相互作用を回避するため、５’ドメイン配列は、２つの非相補的反復、例えば、ホモポリマー配列の場合、ポリＡおよびポリＣまたはポリＴおよびポリＧから選択されるべきである。ジヌクレオチド反復の場合、プライマー対の５’ドメイン配列は、ポリＧＴおよびポリＧＡ、ポリＧＴおよびポリＣＴ、ポリＡＧおよびポリＣＡ、またはポリＣＴおよびポリＣＡなどの、２つの非相補的配列から選択される。ポリＡおよびポリＴまたはポリＧＴおよびポリＣＡなどの相補的尾部配列の選択は、プライマーの５’ドメインのアニーリングおよび加速効果の低減に結び付くことになるため、望ましくない。また、５’ドメイン配列は、５’ドメイン間の相補性を回避するために、同じ原理を用いて、トリ－ヌクレオチド、テトラ－ヌクレオチド、ペンタ－ヌクレオチド、およびヘキサ－ヌクレオチド反復組合せから選択することができる。５’末端にポリＡ、ポリＧＴ、ポリＡＣＧなどの同じ反復配列を有するＮ－ＰＣＲプライマーは、自己相補的ステム－ループ構造へとフォールディングするアンプリコン鎖の生成に、および同じ反復結合部位に対する２つのＰＣＲプライマー間の競合にも結び付くことになる。したがって、Ｎ－ＰＣＲプライマーの５’ドメインは、そのような部分が別の機能に必要である場合、非反復部分も含有してよい。図２３Ａは、限定されたプライマー濃度による制御された増幅をもたらすＮ－ＰＣＲプライマーの５’末端にポリ（ＧＡ）およびポリ（ＧＴ）尾部を使用する例示的な方法を示している。図２３Ｂは、同じ目的のために、ポリ（Ａ）およびポリ（Ｔ）尾部を使用する例示的な方法を示している。図２４Ａは、プライマーおよびライブラリーのモル濃度の、時間の関数としての仮想グラフを示している。図２４Ｂは、３つの異なるライブラリー入力濃度に関する同じタイプのグラフを示している。図２５は、ホモポリマー尾部、ジヌクレオチド尾部、およびトリヌクレオチド尾部を有するＮ－ＰＣＲプライマーの例を提供している。

Ｎ－ＰＣＲプライマーの低複雑性５’ドメインに加えて、対応するＤＮＡ鋳型は、Ｎ－ＰＣＲプライマーと鋳型との迅速なアニーリングを可能にするために、プライマーの５’末端の反復配列に相補的な反復配列を有するべきである。これらの配列は、反復配列を含有するＮＧＳアダプターをライゲートさせることにより、ライブラリー合成中にＮＧＳライブラリーの末端に付加することができる。この手法は、最初の２回のサイクルで長いアニーリング時間を実施することなくライブラリー増幅を可能にし、ＰＣＲにより低複雑性尾部を組み込むため、好ましい。代わりに、ライブラリーがアダプター末端に低複雑性配列を有していない場合、反復配列を含有するプライマーを使用して、ライブラリー増幅中に反復配列を導入してもよい。後者の場合、少なくとも２回の最初のＰＣＲサイクルは、ＤＮＡ鋳型に相補的反復配列が存在しない場合、プライマーの完全なアニーリング（および伸長）を保証するために、延長されたアニーリング時間を有するべきである。２回のＰＣＲサイクル後、両末端に反復配列を含有するライブラリーアンプリコンが生成されることになり、低減された従来のアニーリング時間を使用してＰＣＲサイクルを継続することができる。図２６は、Ｎ－ＰＣＲプライマーのアニーリング加速の提唱機序を示している。図２７および２８は、Ｎ－ＰＣＲプライマーを使用する増幅および正規化のための例示的な方法を示している。図２９Ａは、ホモポリマー尾部（最低複雑性）を有するＮ－ＰＣＲプライマーは、最大のアニーリング加速をもたらすことができるが、そのような尾部を使用するとある問題、つまり同じホモポリマー尾部を有するフォワードおよびリバースプライマーが、ステム－ループ構造を有するアンプリコンを生成し、その場合、相互に相補的な５’および３’尾部がステム領域を形成し、プライミングのための接近が容易に可能でなくなってしまうという問題が生じ得ることを示している。それらがアンプリコンに結合可能である場合でさえ、そのような二次構造は、リバースプライマーのホモポリマー尾部に、フォワードプライマーの結合との競合を引き起こさせ、その逆も同様である。図２９Ｂは、相補的なホモポリマー尾部を有するフォワードおよびリバースＮ－ＰＣＲプライマーは、二次構造を形成しないアンプリコンを生成するが、プライマー自体が、自身の尾部により相互作用することがあり、結合のために接近することができなくなることを示している。図２９Ｃは、ポリ（Ｔ）およびポリ（Ｇ）、ポリ（Ｔ）およびポリ（Ｃ）、ポリ（Ａ）およびポリ（Ｇ）、またはポリ（Ａ）およびポリ（Ｃ）などの非相補的ホモポリマー尾部を有するＮ－ＰＣＲプライマーは、５’末端または３’末端のいずれかが、プライマーおよび／または複製に耐性であるワトソン－クリック型の二次構造を形成することが可能なポリＧ配列（Ｇ－四重配列のような）を有するアンプリコンを生成することを示している。図２９Ｄは、好ましいものであり、使用することができる、Ｎ－ＰＣＲプライマーのジヌクレオチド反復尾部を示している。しかしながら（ＴＡ）_ｎおよび（ＧＣ）_ｎは、それらの相補性のため、使用されるべきでない。

一部の実施形態では、Ｎ－ＰＣＲプライマーは、他の応用、例えば、ウイルス性および細菌性ＤＮＡおよびＲＮＡ鋳型のＰＣＲ増幅の加速の診断に使用することができる。非常に低いコピー数のウイルス核酸の増幅が、３０回のＰＣＲサイクルを必要とし、約４５分以内に生じる場合（１サイクル当たり１．５分であると仮定して）、本開示に記載されているプライマーを用いた同じプロセスは、ほとんど６．５倍より迅速に、わずか７分以内に達成することができる。

正規化反応の成功、およびＮ－ＰＣＲ後のＮＧＳライブラリーのモル濃度は両方とも、５’末端にフルオロフォアを含有する少なくとも１つのＮ－ＰＣＲプライマーを用いて増幅したライブラリーの蛍光強度を測定することにより容易に決定することができる。そのような測定は、フルオロフォア含有Ｎ－ＰＣＲプライマーまたはその５’部分に相補的であり、３’末端にクエンチャー発色団を含有する過剰モル分量のクエンチングオリゴヌクレオチド（両プライマーがフルオロフォアを有する場合は、２つのクエンチングオリゴヌクレオチド）を添加する前後に実施される。蛍光性インターカレーター色素を使用する従来の濃度測定に対するこの方法の１つの利点は、この方法では、モル濃度の算出がインサートサイズに依存せず、したがって、幅広いまたは未知のインサートサイズ範囲を有する基質でも、モル分量を正確に測定することができるということである。別の利点は、この定量化法は、組み込まれたプライマー濃度と遊離プライマー濃度とを区別することができるため、測定前にＰＣＲプライマーの除去を必要としないということである。クエンチングオリゴヌクレオチドの添加前に第１の蛍光測定を実施し、それにより、ＰＣＲ中にライブラリーに組み込まれたプライマーおよび溶液中に依然として存在するプライマーを含むすべてのプライマーにより生成される合計蛍光シグナルＦ_１を確立する。クエンチングオリゴヌクレオチドを添加した後に第２の蛍光測定を実施して、ライブラリーに組み込まれたプライマーに由来する蛍光シグナルＦ_２を決定する。これら２つの測定値に基づき、ライブラリー画分および未利用プライマー画分は両方とも、それぞれＦ_２／Ｆ_１および（Ｆ_１－Ｆ_２）／Ｆ_１として決定することができる。増幅されたＮＧＳライブラリーの対応するモル濃度［ライブラリー］および未組込みプライマーのモル濃度［プライマー］は、それぞれ、［ライブラリー］＝Ｆ_２／Ｆ_１×［Ｐ_０］および［Ｐ］＝（Ｆ_１－Ｆ_Ｌ）／Ｆ_２×［Ｐ_０］として算出することができ、式中、［Ｐ_０］は、ＰＣＲ反応の開始時のモルプライマー濃度である。図３０は、そのような方法および計算を適用して、ＮＧＳライブラリーのモル濃度を決定するための例示的な方法を示している。

上記の式は、２つの仮定に基づく：ａ）フルオロフォアの量子収量が、未組込みおよび組込みプライマーの両方で同じであること、ならびにｂ）クエンチングオリゴヌクレオチドと溶液中に残留するプライマーとのアニーリングが、それらの蛍光を完全に抑制すること。第１の仮定を、相補的オリゴヌクレオチドの非存在下および存在下で、ＰＣＲプライマーの蛍光強度を実験的に測定することにより試験および確認した。第２の仮定に関しては、クエンチャー発色団によるフルオロフォア蛍光の抑制は、強力であるが、完全ではない場合があり、実際のフルオロフォア－クエンチャー対の場合、クエンチャーオリゴヌクレオチドのアニーリング時に、蛍光強度の約３０～１００分の１の低減に寄与することが周知である。この低減は、より良好なフルオロフォア－クエンチャー対の選択により、および３’末端に複数のクエンチャー基を有するクエンチングオリゴヌクレオチドを使用することにより、２～３倍増加させることができる可能性がある。しかしながら、現行の低減係数でさえ、正規化反応の成功に関する非常に正確な評価を提供することができ、未組込みプライマーを除去する必要のないＮＧＳライブラリー濃度の正確な測定をもたらすことができる（実施例１１を参照）。

表１．プライマー伸長反応オリゴヌクレオチド

表２．増幅オリゴヌクレオチド

表３．オリゴヌクレオチド結合動力学

表４．酵素に基づくライブラリー正規化オリゴヌクレオチド

表５．再会合動力学オリゴヌクレオチド

表６．ＰＣＲに基づく正規化ＰＣＲプライマー

表７．標識正規化ＰＣＲプライマーおよびクエンチャー

表中、ｒＵ－リボＵ、ｄＵ－デオキシリボＵ、ｒＡ－リボＡ、ｒＣ－リボＣ、ｒＧ－リボＧ、^＊－ホスホロチオエート結合、／３ＳｐＣ３／－３’末端Ｃ３スペーサー、／５ＩＡＢｋＦＱ／－５’末端ＩｏｗａＢｌａｃｋ（登録商標）ＦＱクエンチャー、／３６－ＦＡＭ／－３’末端フルオレセイン、および表中、／３ＩＡＢｋＦＱ／－３’末端ＩｏｗａＢｌａｃｋ（登録商標）ＦＱクエンチャー、／５６－ＦＡＭ／－５’末端フルオレセイン
表８合成法によるライブラリー正規化用のオリゴヌクレオチド

表９ＰａｃＢｉｏアンプリコンライブラリー合成用のオリゴヌクレオチド

表中、／５Ｐｈｏｓ／－５’ホスフェート基、ｒＵ－リボウリジン
表１０：ＮＧＳアダプター配列

表中、ＸＸＸＸＸＸは、インデックス配列である。
表１１実施例１７のオリゴヌクレオチド

（実施例１）
リボヌクレオチド複製ブロッカーを含有するＤＮＡ鋳型に対するプライマー伸長反応の概略図
プライマー伸長反応は、内部ＲＮＡ複製ブロッカーを含有し、またプライマーの５’末端での鋳型伸長を防止するために３’末端が保護されている鋳型ＤＮＡオリゴヌクレオチドからなる。反応の別の成分は、５’非相補的末端を有する伸長プライマーである（図３１Ａ～３１Ｂ）。プライマー伸長反応では、３つのタイプの産物を形成することができる。ポリメラーゼの処理能力が完全に阻害されている場合、伸長は観察されず、非伸長プライマーは、２５ｂサイズに移動することになる（産物１）。プライマー伸長反応が、複製ブロッカーの開始部または内部で停止する場合、伸長プライマーよりも上だが鋳型よりも下に移動する１つまたは複数の伸長産物を観察することができる（産物２）。ポリメラーゼが複製ブロッカーを迂回することができる場合、鋳型よりも上に移動する産物の形成がもたらされる（産物３）（図３１Ｂ）。

（実施例２）
ＤＮＡ鋳型に組み込まれているリボウリジン伸張は、プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼＱ５によるプライマー伸長をブロックする
物質
１０μΜ ｒＵ鋳型オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド１）
１０μΜ ｒ（Ｕ）_２鋳型オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド２）
１０μΜ ｒ（Ｕ）_３鋳型オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド３）
１０μΜ ｒ（Ｕ）_４鋳型オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド４）
１０μΜ ｒ（Ｕ）_６鋳型オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド５）
１０μΜ ｄＵ鋳型オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド６）
１０μΜ伸長プライマー（オリゴヌクレオチド１０）
Ｑ５（登録商標）ＨｏｔＳｔａｒｔＨｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ２ＸＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＮＥＢ、カタログ＃Ｍ０４９４Ｓ）
低ＴＥ緩衝液（Ｔｅｋｎｏｖａカタログ＃ＴＯ２２７）
２５ｂｐラダーＤＮＡサイズマーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃１０４８８－０２２）
１５％ＴＢＥ－尿素ゲル（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃ＥＣ６８８５２ＢＯＸ）
ＳＹＢＲＧｏｌｄ染色剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃Ｓ１１４９４）

方法
伸長反応を、１５μｌの２×Ｑ５（登録商標）ＨｏｔＳｔａｒｔＨｉｇｈ－ＦｉｄｅｌｉｔｙＭａｓｔｅｒＭｉｘ、２μｌの鋳型オリゴヌクレオチド、１μｌの伸長プライマー、および１２μｌの低ＴＥ緩衝液を含有する３０μｌの反応容積中で実施した。反応を、９８℃で４５秒間加熱して酵素を活性化させ、その後６０℃で３分間の伸長を行った。試料を、ホルムアミドローディング緩衝液中で煮沸し、２００ボルトの１５％ＴＢＥ－尿素ゲルで分離した。ゲルを、ＳＹＢＲＧｏｌｄ染色剤で染色し、ＤａｒｋＲｅａｄｅｒライトボックス（ＣｌａｒｅＣｈｅｍｉｃａｌＲｅｓｅａｃｈ）上で視覚化し、デジタルカメラを使用して写真を撮った。

結果
様々な数のリボウリジンまたはデオキシウリジンを複製ブロッカーとして含有する鋳型でのＱ５（登録商標）ＨｏｔＳｔａｒｔＨｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ酵素による伸長反応の産物の電気泳動分析が図３２に示されている。レーン２は伸長プライマーの移動を示し、レーン３～５は、ｒＵ、ｒ（Ｕ）_３、およびｒ（Ｕ）_６鋳型の移動を示す。レーン６は、単一のリボウリジンを含有する鋳型でのプライマーの完全伸長を示し、レーン７は、２つのリボウリジンを含有する鋳型での部分的なおよび完全な伸長産物を示し、レーン８～１０は、２つよりも多くの（３～６つの）リボウリジンを含有する鋳型での部分的伸長産物のみを示す。レーン１１は、単一のデオキシウリジンを含有する鋳型での、完全にブロックされた、Ｑ５酵素によるプライマー伸長を示す。レーン６から見て取ることができるように、Ｑ５ポリメラーゼは、鋳型に組み込まれている単一のリボウリジンを完全に迂回し、鋳型の上に移動し、２つの星印により示されている完全な伸長産物を生成することができる。１つよりも多くのリボウリジンがＤＮＡ鋳型に組み込まれていた場合、Ｑ５酵素によるプライマー伸長に対する顕著な影響が観察された。特に、２つのリボウリジンが伸長鋳型に組み込まれている場合（レーン７）、非常に少ない完全伸長を観察することができる。２つよりも多くのリボウリジンが鋳型オリゴヌクレオチドに組み込まれている場合、Ｑ５ポリメラーゼは、複製ブロッカーを迂回することができず、ゲルでは３つの星印で示されている部分的伸長産物のみが生成される（レーン８～１０）。レーン１１に示されているように、鋳型に組み込まれたデオキシウリジンは、Ｑ５ポリメラーゼ処理能力を完全にブロックすることができる。

結論
ＤＮＡ鋳型に組み込まれたリボウリジンは、プルーフリーディングポリメラーゼＱ５によるプライマー伸長を阻害することができる。プライマー伸長の効率的な阻止を達成するために、複製ブロックは、３つまたはそれよりも多くのリボウリジンを含有するべきである。

（実施例３）
４つの異なるリボヌクレオチドで構成される複製ブロッカーを含有するＤＮＡ鋳型での異なる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用したプライマー伸長反応。
物質
１０μΜ ｒ（Ｕ）_３鋳型オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド３）
１０μΜ ｒ（Ａ）_３鋳型オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド７）
１０μΜ ｒ（Ｃ）_３鋳型オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド８）
１０μΜ ｒ（Ｇ）_３鋳型オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド９）
１０μΜ伸長プライマー（オリゴヌクレオチド１０）
Ｔａｑ２ＸＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＮＥＢ、カタログ＃Ｍ０２７０Ｌ）
２×Ｑ５ｄＵバイパスポリメラーゼ（ＮＥＢ、カタログ＃不明）
ＫａｐａＨｉＦｉＨｏｔＳｔａｒｔＲｅａｄｙＭｉｘ（Ｋａｐａｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃ＫＫ２６０１）
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ＃Ｒ０５０Ａ）
Ｑ５（登録商標）ＨｏｔＳｔａｒｔＨｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ２ＸＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＮＥＢ、カタログ＃Ｍ０４９４Ｓ）
低ＴＥ緩衝液（Ｔｅｋｎｏｖａカタログ＃ＴＯ２２７）
２５ｂｐラダーＤＮＡサイズマーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃１０４８８－０２２）
１５％ＴＢＥ－尿素ゲル（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃ＥＣ６８８５２ＢＯＸ）
ＳＹＢＲＧｏｌｄ染色剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃Ｓ１１４９４）

方法
２×Ｔａｑ、２×Ｑ５ｄＵバイパスポリメラーゼ、またはＱ５（登録商標）ＨｏｔＳｔａｒｔＨｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ２ＸＭａｓｔｅｒＭｉｘを用いたプライマー伸長反応を、１５μｌのＭａｓｔｅｒＭｉｘ、２μｌの鋳型オリゴヌクレオチド、１μｌの伸長プライマー、および１２μｌの低ＴＥ緩衝液を含有する３０μｌの反応容積中で実施した。ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたプライマー伸長を、６μｌの５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＧＸＬＢｕｆｆｅｒ、２．５μｌのｄＮＴＰ混合物（各２．５ｍＭ）、２μｌの鋳型オリゴヌクレオチド、１μｌの伸長プライマー、１μｌのＰｒｉｍｅＳＴＡＲＧＸＬＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ、および１７．５μｌの低ＴＥ緩衝液を含有する３０μｌ反応容積中で実施した。２×Ｔａｑポリメラーゼの場合、反応を、９５℃で３分間加熱して酵素を活性化させ、その後６０℃で３分間の伸長を行った。２×Ｑ５ｄＵバイパスポリメラーゼの場合、Ｑ５（登録商標）ＨｏｔＳｔａｒｔＨｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ２ＸＭａｓｔｅｒＭｉｘまたはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ反応を、９８℃で４５秒間加熱して酵素を活性化させ、その後６０℃で３分間の伸長を行った。試料を、ホルムアミドローディング緩衝液中で煮沸し、２０μｌの各反応を、２００ボルトの１５％ＴＢＥ－尿素ゲルで分離した。ゲルを、ＳＹＢＲＧｏｌｄ染色剤で染色し、ＤａｒｋＲｅａｄｅｒライトボックス（ＣｌａｒｅＣｈｅｍｉｃａｌＲｅｓｅａｃｈ）上で視覚化し、デジタルカメラを使用して写真撮影した。

結果
様々なリボヌクレオチドを複製ブロッカーとして含有する鋳型でのＴａｑおよびＱ５ｄＵバイパス酵素による伸長反応の産物の電気泳動分析が図３３Ａに示されている。レーン２およびレーン７は、伸長プライマーの移動を示し、レーン３～６は、ｒ（Ｕ）_３、ｒ（Ａ）_３、ｒ（Ｃ）_３、およびｒ（Ｇ）_３伸張を含有する鋳型でのＴａｑポリメラーゼによるプライマー伸長反応の産物を示す。レーン３～６に示されているように、Ｔａｑポリメラーゼは、３つのリボウリジン、リボアデノシン、またはリボシトシンで構成される複製ブロッカーを部分的に迂回することができる。プライマー伸長は、完全に伸長されたプライマー（^＊＊）、ならびに複製が複製ブロッカーの開始部または内部で停止する場合に鋳型の下に移動する部分的に伸長されたプライマー（^＊＊＊）に対応する個別のバンドをもたらす。対照的に、リボグアノシン複製ブロッカーは、鋳型の５’末端に対する伸長をほぼ完全に防止する能力を有し、部分的に伸長した産物のみが形成される。レーン８～１１は、それぞれｒ（Ｕ）_３、ｒ（Ａ）_３、ｒ（Ｃ）_３、およびｒ（Ｇ）_３伸張を含有する鋳型でのＱ５ｄＵバイパスポリメラーゼによるプライマー伸長反応の産物を示す。この酵素は、Ｔａｑポリメラーゼと比較して、リボシトシンおよびリボグアノシン複製ブロッカーを迂回する能力がより大きいが（レーン１０および１１）、リボウリジンおよびリボアデノシンブロッカーを含有する鋳型での伸長は、ほとんどが、部分的なプライマー伸長に結び付く（レーン８および９）。

様々なリボヌクレオチドを複製ブロッカーとして含有する鋳型でのＫａｐａＨｉＦｉおよびＧＸＬＰｒｉｍｅＳＴＡＲ酵素による伸長反応の産物の電気泳動分析が図３３Ｂに示されている。レーン２およびレーン７は、伸長プライマーの移動を示し、レーン３～６は、ｒ（Ｕ）_３、ｒ（Ａ）_３、ｒ（Ｃ）_３、およびｒ（Ｇ）_３伸張を含有する鋳型でのＫａｐａＨｉＦｉポリメラーゼによるプライマー伸長反応の産物を示す。レーン３および４に見ることができるように、ＫａｐａＨｉＦｉ酵素は、３つのリボウリジンおよびリボアデノシンで構成される複製ブロッカーを部分的に迂回することができ、全長ならびに短縮プライマー伸長産物を生成する。プライマー伸長反応は、完全に伸長されたプライマー（^＊＊）、ならびに複製が複製ブロッカーの開始部または内部で停止する場合に鋳型の下に移動する部分的に伸長されたプライマー（^＊＊＊）に対応する個別のバンドをもたらす。対照的に、ＫａｐａＨｉＦｉ酵素は、リボシトシンおよびリボグアノシン複製ブロッカーを完全に迂回することができ、全長伸長産物のみを形成する。レーン８～１１は、それぞれｒ（Ｕ）_３、ｒ（Ａ）_３、ｒ（Ｃ）_３、およびｒ（Ｇ）_３伸張を含有する鋳型でのＧＸＬＰｒｉｍｅＳＴＡＲポリメラーゼによるプライマー伸長反応の産物を示す。この酵素の処理能力は、４つすべての複製ブロッカーによりほぼ完全に阻害される。

様々なリボヌクレオチドを複製ブロッカーとして含有する鋳型でのＱ５酵素による伸長反応の産物の電気泳動分析が図３３Ｃに示されている。レーン２は、伸長プライマーの移動を示し、レーン３～６は、ｒ（Ｕ）_３、ｒ（Ａ）_３、ｒ（Ｃ）_３、およびｒ（Ｇ）_３伸張を含有する鋳型でのＱ５ポリメラーゼによるプライマー伸長反応の産物を示す。レーン３および４に見られるように、Ｑ５酵素は、３つのリボウリジンまたはリボアデノシンで構成される複製ブロッカーを迂回することができず、短縮プライマー伸長産物のみを生成する。対照的に、Ｑ５ポリメラーゼは、リボシトシンおよびリボグアノシン複製ブロッカーを完全に迂回することができ、全長伸長産物のみを形成する（レーン５および６）。

結論
異なる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、３つのリボウリジン、リボアデノシン、リボシトシン、またはリボグアノシンで構成される複製ブロッカーを迂回する能力が異なる。例えば、Ｑ５ＤＮＡポリメラーゼは、ｒ（Ｃ）_３およびｒ（Ｇ）_３複製ブロッカーを容易に迂回することができるが、ｒ（Ｕ）_３、ｒ（Ａ）_３配列で完全に停止する。対照的に、ＫａｐａＨｉＦｉ酵素は、Ｑ５酵素と比較して、リボウリジンおよびリボアデノシン複製ブロッカーを越えて複製する能力がより大きい。非プルーフリーディングＴａｑＤＮＡポリメラーゼ以外のすべてのＤＮＡポリメラーゼは、リボウリジンで構成される複製ブロッカーを越える複製が効率的でないという共通の特性を共有しているため、この組成は、試験した４つの複製ブロッカーのうちで最もユニバーサルで有望なブロッカー組成である。同時に、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、３つの連続リボＧ塩基を越える複製に問題があることを示す。

（実施例４）
通常の増幅プライマー、ならびに複製ブロッカーおよび５’末端非相補的尾部を含有するプライマーを用いた増幅実験の概略
図３４Ａから見て取ることができるように、通常の相補的プライマー１、ならびに内部複製ブロッカーおよび非相補的尾部を含有するプライマー２を用いたＰＣＲ反応は、２つの異なるシナリオをもたらすことができる。ＤＮＡポリメラーゼが複製ブロッカーを迂回することができる場合、鋳型分子の３’末端は、プライマー２の５’末端へと伸長し、同じサイズの２つのＤＮＡ鎖を生成することになる。ＤＮＡポリメラーゼが複製ブロッカーを越えて複製することができない場合、これは異なるサイズの２つのＤＮＡ鎖を生成し、それらは、変性ゲルで視覚化することができる。

（実施例５）
通常のプライマー、ならびに複製ブロッカーおよび５’末端非相補的尾部を含有するプライマーを用いて、ＴａｑおよびＰｒｉｍｅＳＴＡＲＧＸＬＤＮＡポリメラーゼを使用した合成ＤＮＡ鋳型の増幅
物質
１０ｎΜの鋳型オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド１１）
ｒ（Ｕ）_４複製ブロッカーおよび５’末端非相補的尾部を有する６００ｎＭのフォワードプライマー（オリゴヌクレオチド１２）
６００ｎＭのリバースプライマー（オリゴヌクレオチド１３）
Ｔａｑ２ＸＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＮＥＢ、カタログ＃Ｍ０２７０Ｌ）
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ＃Ｒ０５０Ａ）
低ＴＥ緩衝液（Ｔｅｋｎｏｖａカタログ＃ＴＯ２２７）
２５ｂｐラダーＤＮＡサイズマーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃１０４８８－０２２）
１５％ＴＢＥ－尿素ゲル（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃ＥＣ６８８５２ＢＯＸ）
ＳＹＢＲＧｏｌｄ染色剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃Ｓ１１４９４）

方法
２ｘＴａｑｍａｓｔｅｒｍｉｘによる増幅反応を、２５μｌのＭａｓｔｅｒＭｉｘ、２μｌの鋳型オリゴヌクレオチド、２．５μｌの各増幅プライマー、および１８μｌの低ＴＥ緩衝液を含有する５０μｌの反応容積中で実施した。反応は、以下のサイクルパラメーターで実施した：９５℃で３分間の初回酵素活性化、次いで９５℃で２０秒間、６０℃で３０秒間、および６６℃で３０秒間からなる１０サイクル。また、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅによる増幅を、１０μｌの５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＧＸＬＢｕｆｆｅｒ、４μｌのｄＮＴＰ混合物（各２．５ｍＭ）、２μｌの鋳型オリゴヌクレオチド、２．５μｌの各プライマー、１μｌのＰｒｉｍｅＳＴＡＲＧＸＬＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ、および２８μｌの低ＴＥ緩衝液を含有する５０μｌの反応容積中で実施した。増幅は、以下のサイクルパラメーターで実施した：９８℃で３０秒間の初回酵素活性化、次いで９８℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、および６８℃で３０秒間からなる１０サイクル。試料を、ホルムアミドローディング緩衝液中で煮沸し、２０μｌの各反応を、２００ボルトの１５％ＴＢＥ－尿素ゲルで分離した。次いで、ゲルを、ＳＹＢＲＧｏｌｄ染色剤で染色し、ＤａｒｋＲｅａｄｅｒライトボックス（ＣｌａｒｅＣｈｅｍｉｃａｌＲｅｓｅａｃｈ）上で視覚化し、デジタルカメラを使用して写真撮影した。

結果
通常のプライマーならびにｒ（Ｕ）_４複製ブロッカーおよび５’末端非相補的尾部を含有するプライマーを用いた、合成鋳型でのＴａｑおよびＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅによる増幅反応の産物の電気泳動分析が図３４に示されている。レーン２は、合成オリゴヌクレオチド鋳型の移動を示し、レーン３は、プライマーの移動を示し、レーン４は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによる増幅反応の結果を示し、上部バンドは全長増幅産物を表し、単一の星印で標識されているわずかな底部バンドは、３’末端短縮産物を示す。対照的に、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅで増幅反応を実施した場合、完全なサイズならびに短縮ＤＮＡに対応する等強度の２つのバンドを見ることができる。

結論
図３４Ｂ、レーン５から見て取ることができるように、リボウリジン伸張は、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（およびＱ５ＤＮＡポリメラーゼなどのいくつかの他のもの、データ示さず）の効率的な複製ブロッカーとしての役目を果たすことができる。この現象は、ＰＣＲ反応中の、二本鎖ＤＮＡの一方または両方の末端からの所定の５’突出の生成を可能にする。リボウリジンを複製ブロッカーとして使用する利点は、従来の複製ブロッカーとは異なり、産生される接合部位が、その後のライゲーション反応での基質としての役目を果たすことができるということである。

（実施例６）
複雑な配列およびホモポリマー性配列に対するオリゴヌクレオチド結合動力学的分析
物質
５００ｎＭの複雑な基質（オリゴヌクレオチド１７）
５００ｎＭの複雑なプローブ（オリゴヌクレオチド１８）
５００ｎＭのホモポリマー性基質（オリゴヌクレオチド１９）
５００ｎＭのホモポリマー性プローブ（オリゴヌクレオチド２０）
２×ハイブリダイゼーション緩衝液：ＴＲＩＳｐＨ＝７．５２０ｍＭ、ＭｇＣｌ_２１０ｍＭ、ＮａＣｌ１００ｍＭ
Ｑｕｂｉｔ２．０蛍光計（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ＃Ｑ３２８６６）

方法
ハイブリダイゼーション反応を、１００μｌの２×ハイブリダイゼーション緩衝液、２０μｌの基質オリゴヌクレオチド（５０ｎＭ終濃度）、および１０μｌの蛍光プローブ（２５ｎＭ終濃度）を含有する２００μｌの容積中で実施した。測定は、青色励起（４３０～４９５ｎｍ）フィルターおよび緑色（５１０～５８０ｎｍ）発光フィルターを使用して１分ごとに行った。

結果
図３５Ａは、クエンチャーを含有する過剰量の対応する基質オリゴヌクレオチドに対する蛍光プローブの結合速度の、時間の関数としての概略図を示す。基質オリゴヌクレオチドに対する蛍光プローブの結合は、フルオロフォアをクエンチャーに近接近させる。これは、蛍光シグナルの減衰に結び付き、蛍光計により測定することができる。点線は、過剰量の相補的基質オリゴヌクレオチドに対する２５ｎＭの複雑な配列プローブの結合動力学を示し、実線は、その相補的基質に対する２５ｎＭのホモポリマー性配列プローブの結合を示す（図３５Ｂ）。

結論
基質に対する結合速度は、ホモポリマー性オリゴヌクレオチドプローブの場合、複雑な配列プローブと比較して劇的に増加することが明らかである。従来の研究からわかるように、２つのオリゴヌクレオチドのアニーリングは、部分的に対をなす領域の形成およびそれらの拡張を含む。２つの複雑な配列オリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション中に互いに接近する場合、初期複合体においてヌクレオチドが相補的である可能性は非常に低い。対照的に、２つの相補的ホモポリマー性オリゴヌクレオチドが互いに遭遇する場合、即時の核生成および二重鎖形成がもたらされる。これは、複雑な配列プローブと比較して、ホモポリマー性プローブの著しくより迅速な結合動力学を説明し、正規化反応における、対応する正規化プローブまたはプライマーとＮＧＳライブラリーとの非常により短いインキュベーションを可能にする。

（実施例７）
ヌクレアーゼ耐性を含むホモポリマー性プローブのライゲーションを使用し、その後エキソヌクレアーゼＩＩＩを使用して酵素的正規化を行う酵素に基づくＮＧＳライブラリー正規化。
物質
ＨａｐＭａｐＤＮＡＮＡ１２８７８（Ｃｏｒｉｅｌｌ）
Ａｃｃｅｌ－ＮＧＳ（登録商標）２ＳＰＣＲ－ＦｒｅｅＤＮＡＬｉｂｒａｒｙＫｉｔ（ＳｗｉｆｔＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ＃ＤＬ－ＩＬ２ＰＦ－４８、ＳＩ－ＩＬＭ２Ｓ－４８Ａ）
６００ｎＭのＰ５プレＮプライマー（オリゴヌクレオチド１４）
６００ｎＭのＰ７プレＮプライマー（オリゴヌクレオチド１５）
Ｑ５（登録商標）ＨｏｔＳｔａｒｔＨｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ２ＸＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＮＥＢ、カタログ＃Ｍ０４９４Ｓ）
ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔＤＮＡサイズ選択ビーズ（ＢＥＣＫＭＡＮＣＯＵＬＴＥＲカタログ＃Ｂ２３３１８）
低ＴＥ緩衝液（Ｔｅｋｎｏｖａカタログ＃ＴＯ２２７）
４８０ｎＭのホモポリマー性正規化Ｎ－プローブ（オリゴヌクレオチド１６）
正規化緩衝液Ｎ１：ＴＲＩＳｐＨ＝７．５６２．５ｍＭ、ＭｇＣｌ_２３１．２５ｍＭ、ＡＴＰ６．２５ｍＭ、ＤＴＴ６２．５ｍＭ
ＮａＣｌ３１２．５ｍＭ
正規化緩衝液Ｎ２：ＴＲＩＳｐＨ＝７．５１０ｍＭ、ＭｇＣｌ_２１ｍＭ
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓカタログ＃Ｌ６０３０－ＬＣ－Ｌ）
エキソヌクレアーゼＩＩＩ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓカタログ＃Ｘ８０２０Ｆ）
０．５ＭＥＤＴＡｐＨ＝８．０（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨカタログ＃Ｅ９８８４）
ＫＡＰＡＬｉｂｒａｒｙＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（ＫａｐａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ＃ＫＫ４８２４）

方法
ＮＧＳライブラリーを、１ｎｇのＣｏｒｉｅｌｌＤＮＡＮＡ１２８７８から、ＳｗｉｆｔＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＡｃｃｅｌ－ＮＧＳ（登録商標）２ＳＰＣＲ－ＦｒｅｅＤＮＡＬｉｂｒａｒｙＫｉｔを使用して構築した。ライブラリーを、２０μｌの低ＴＥ緩衝液で溶出し、Ｑ５ＨｏｔＳｔａｒｔＨｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ２ＸＭａｓｔｅｒＭｉｘならびにＰ５およびＰ７プレＮプライマーを用いた１０サイクルの増幅にかけた。ライブラリーを、ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔＤＮＡサイズ選択ビーズで、１．０のライブラリー対ビーズ比を使用して精製し、５０μｌの低ＴＥＤＮＡ再懸濁緩衝液で溶出した。増幅されたライブラリーを、ＫＡＰＡＬｉｂｒａｒｙＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔを使用して定量化し、１セットの指定されている濃度のライブラリー希釈物を調製した（図３６）。ライブラリー希釈物を４ｎＭ終濃度に正規化するために、２０μｌのライブラリーを、４μｌのＮ１正規化緩衝液、０．５μｌの正規化Ｎ－プローブ、および０．５μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼと混合し、３０℃で２０分間インキュベートした。次いで、４．５μｌのＮ２緩衝液で希釈した０．５μｌのエキソヌクレアーゼＩＩＩを各チューブに添加し、３０℃でさらに２０分間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、１μｌの０．５ＭＥＤＴＡを各チューブに添加し、次いで、酵素を不活化するために、試料を９５℃で３分間加熱した。ｑＰＣＲに基づくＫＡＰＡＬｉｂｒａｒｙＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔを製造業者の説明書に従って使用して、最終ライブラリー濃度を定量化した。

結果
正規化前後の配列決定ライブラリーの定量化結果は、図３６Ａ～３６Ｂに示されている。Ｑ５酵素で増幅したライブラリーを定量化し、低ＴＥ緩衝液で希釈して、２～１００ｎＭの指定されている濃度の２０μｌのアリコートを生成した。次いで、各アリコートを、上記に記載のライブラリー正規化手順にかけた。正規化反応の結果は、図３６Ａ～３６Ｂに見ることができる。１０ｎＭおよびそれよりも高い開始濃度を有するすべてのライブラリーを、４ｎＭ終濃度に０．２１の標準偏差で正規化することに成功した。予想通り、不十分な量の出発物質を有する第１のライブラリーは、０．９１ｎＭ濃度を有するライブラリーを産生する４ｎＭ終濃度に正規化することができない。

結論
異なる開始濃度を有するＮＧＳライブラリーの正規化反応は、ホモポリマー性正規化プローブの限定されたモル分量のため、同様の濃度を有するライブラリーをもたらし、配列決定前のＮＧＳライブラリー正規化の単純でロバストな方法であることを示す。

（実施例８）
フルオロセイン色素およびクエンチャー基を有するオリゴヌクレオチドを使用した再会合動力学は、反復性尾部を有するプライマーが、約１０倍迅速にアニーリングすることを示す。
物質
５００ｎＭの従来の鋳型（オリゴヌクレオチド２１）
５００ｎＭのＧＴ尾部付き鋳型（オリゴヌクレオチド２２）
５００ｎＭのＡＣ尾部付きプライマー（オリゴヌクレオチド２３）
２×ハイブリダイゼーション緩衝液：ＴＲＩＳｐＨ＝７．５２０ｍＭ、ＭｇＣｌ_２１０ｍＭ、ＮａＣｌ１００ｍＭ
ＳｙｎｅｒｇｙＨＴＸマルチモードリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）

方法
ハイブリダイゼーション反応を、５０μｌの２×ハイブリダイゼーション緩衝液、１０μｌの基質オリゴヌクレオチド（５０ｎＭ終濃度）、および５μｌの蛍光プローブ（２５ｎＭ終濃度）を含有する１００μｌの容積中で実施した。測定は、青色励起フィルターおよび緑色発光フィルターを使用して１分ごとに行った。

結果
図３７Ａは、過剰量の２つの異なる基質オリゴヌクレオチドに対する蛍光プローブの結合速度を、時間の関数として示す。基質オリゴヌクレオチドに対する蛍光プローブの結合は、フルオロフォアをクエンチャーに近接近させる。これは、蛍光シグナルの減衰に結び付き、蛍光計により測定することができる。図３７。点線レーンは、２５ｎＭのプローブと過剰量の従来の鋳型オリゴとの結合動力学を示し、実線レーンは、プローブと、ＧＴ反復を含有する鋳型オリゴヌクレオチドとの結合を示す（プローブおよびオリゴ対の概略図は、図３７Ｂ～３７Ｃを参照）。

結論
基質に対する結合速度は、ＧＴ反復を含有する鋳型の場合、従来の複雑な鋳型と比較して劇的に増加することは明白である。２つのオリゴヌクレオチドのアニーリングは、部分的に対をなす領域の形成およびそれらの拡張を含むことが以前に示されている。２つの複雑な配列オリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション中に互いに接近する場合、初期複合体においてヌクレオチドが一致する可能性は非常に低い。対照的に、一致するＧＴおよびＡＣ反復を含有する２つのオリゴヌクレオチドが互いに遭遇する場合、非常により迅速な核生成および二重鎖形成がもたらされる。これは、従来の鋳型と比較して、プローブとＧＴ反復を含有する鋳型とのより迅速な結合動力学を説明し、正規化ＰＣＲ反応における正規化プライマーおよびＮＧＳライブラリーの非常により短いアニーリング時間を可能にする。

（実施例９）
ＰＣＲに基づく正規化（Ｎ－ＰＣＲプライマー）を使用した８つのＡｃｃｅｌ－ＮＧＳ２Ｓライブラリーの正規化。
物質
４００ｎＭの従来のＰＣＲプライマー１（オリゴヌクレオチド２４）
４００ｎＭの従来のＰＣＲプライマー２（オリゴヌクレオチド２５）
４００ｎＭのＮ－ＰＣＲプライマー１（オリゴヌクレオチド２６）
４００ｎＭのＮ－ＰＣＲプライマー２（オリゴヌクレオチド２７）
ＨａｐＭａｐＤＮＡＮＡ１２８７８（Ｃｏｒｉｅｌｌ）
Ａｃｃｅｌ－ＮＧＳ（登録商標）２ＳＰＣＲ－ＦｒｅｅＤＮＡＬｉｂｒａｒｙＫｉｔ（ＳｗｉｆｔＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ＃ＤＬ－ＩＬ２ＰＦ－４８、ＳＩ－ＩＬＭ２Ｓ－４８Ａ）
Ｑ５（登録商標）ＨｏｔＳｔａｒｔＨｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ２ＸＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＮＥＢ、カタログ＃Ｍ０４９４Ｓ）
低ＴＥ緩衝液（Ｔｅｋｎｏｖａカタログ＃ＴＯ２２７）
ＫＡＰＡＬｉｂｒａｒｙＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（ＫａｐａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ＃ＫＫ４８２４）

方法
配列決定ライブラリーを、１００ｎｇのＣｏｒｉｅｌｌＤＮＡＮＡ１２８７８から、ＳｗｉｆｔＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＡｃｃｅｌ－ＮＧＳ（登録商標）２ＳＰＣＲ－ＦｒｅｅＤＮＡＬｉｂｒａｒｙＫｉｔを使用して構築した。ライブラリーを、２０μｌの低ＴＥ緩衝液で溶出し、ＫＡＰＡＬｉｂｒａｒｙＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔを使用して定量化し、次いで、１セットの指定されている濃度のライブラリー希釈物を調製した（図３８Ａ～３８Ｂ）。ライブラリー希釈物を４０ｎＭ終濃度に正規化するために、ライブラリーを、１５μｌのライブラリー希釈物、２５μｌのＱ５（登録商標）ＨｏｔＳｔａｒｔＨｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ２ＸＭａｓｔｅｒＭｉｘ、および５μｌの各従来のプライマーまたはＮ－ＰＣＲプライマー（４０ｎＭのプライマー濃度）を含有する正規化ＰＣＲ反応にかけた。ライブラリーは、以下のサイクルパラメーターで増幅した：９８℃で４５秒間の初回酵素活性化、次いで、９８℃で１０秒間、６０℃で５分間、７２℃で１分間からなる４サイクル、その後、９８℃で１０秒間、６０℃で１分間、７２℃で１分間からなる１８サイクル。ＫＡＰＡＬｉｂｒａｒｙＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔを使用して、増幅されたライブラリーを定量化した。

結果
正規化前後の配列決定ライブラリーの定量化結果は、図３８Ａ～３８Ｄに示されている。ＮＧＳＤＮＡライブラリーを定量化し、低ＴＥ緩衝液で希釈して、１０００～７．８ｐＭの指定されている濃度の１５μｌのアリコートを生成した。次いで、各アリコートを、上記に記載のライブラリー正規化ＰＣＲにかけた。Ｎ－ＰＣＲプライマーで増幅されたすべてのライブラリーは、およそ同じ濃度への正規化に成功した。対照的に、従来のプライマーによる同じ試料の正規化増幅は、ほぼ１００％のばらつきを示す。

結論
Ｎ－ＰＣＲプライマーを使用した８つのＡｃｃｅｌ－ＮＧＳ２Ｓライブラリーの正規化は、１００倍を超えて変動する２Ｓライブラリー入力で、約１０％の相対偏差を示す。同じ試料で、従来のプライマーは、ほとんど１００％のばらつきを示し、ＰＣＲプライマー濃度が反応でのＰＣＲ産物収量を限定する場合、指定分量のＰＣＲ産物を増幅するためには、従来のプライマーよりもＮ－ＰＣＲプライマーを使用した方が有利であることを示す。

（実施例１０）
ＰＣＲに基づく正規化（Ｎ－ＰＣＲプライマーを使用）によりＮＧＳライブラリーを標的としたＡｃｃｅｌ－アンプリコンの正規化。
物質
４００ｎＭのＮ－ＰＣＲプライマー１（オリゴヌクレオチド２６）
４００ｎＭのＮ－ＰＣＲプライマー２（オリゴヌクレオチド２７）
ＨａｐＭａｐＤＮＡＮＡ１２８７８（Ｃｏｒｉｅｌｌ）
Ａｃｃｅｌ－アンプリコン５６Ｇオンコロジーパネル＋試料ＩＤ（ＳｗｉｆｔＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ＃ＡＬ－５６２４８）
Ｑ５（登録商標）ＨｏｔＳｔａｒｔＨｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ２ＸＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＮＥＢ、カタログ＃Ｍ０４９４Ｓ）
低ＴＥ緩衝液（Ｔｅｋｎｏｖａカタログ＃ＴＯ２２７）
ＫＡＰＡＬｉｂｒａｒｙＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（ＫａｐａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ＃ＫＫ４８２４）

方法
アンプリコンライブラリーを、ＳｗｉｆｔＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＡｃｃｅｌ－アンプリコン５６Ｇオンコロジーパネルキットを製造業者の説明書に従って使用して、１０ｎｇのＣｏｒｉｅｌｌＤＮＡＮＡ１２８７８から構築した。ライブラリーを、２０μｌの低ＴＥ緩衝液で溶出し、ＫＡＰＡＬｉｂｒａｒｙＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔを使用して定量化し、次いで、１セットの指定されている濃度のライブラリー希釈物を調製した（図３９）。ライブラリー希釈物を４０ｎＭ終濃度に正規化するために、ライブラリーを、１５μｌのライブラリー希釈物、２５μｌのＱ５（登録商標）ＨｏｔＳｔａｒｔＨｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ２ＸＭａｓｔｅｒＭｉｘ、および５μｌの各Ｎ－ＰＣＲプライマー（４０ｎＭのプライマー濃度）を含有する正規化ＰＣＲ反応にかけた。ライブラリーは、以下のサイクルパラメーターで増幅した：９８℃で４５秒間の初回酵素活性化、次いで、９８℃で１０秒間、６０℃で５分間、７２℃で１分間からなる４サイクル、その後、９８℃で１０秒間、６０℃で１分間、７２℃で１分間からなる１６サイクル。ＫＡＰＡＬｉｂｒａｒｙＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔを使用して、増幅されたライブラリーを定量化した。次いで、ライブラリーを１０倍希釈し、一緒にプールし、ＭｉＳｅｑ試薬ナノキットＶ２を使用して、２０ｐＭのローディング濃度でＭｉＳｅｑシーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で配列決定した。プールに存在する各ライブラリーについて、フローセルで形成される達成可能なクラスター％をＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定分析ビュワーソフトウェアを使用して算出した。

結果
５６Ｇアンプリコンライブラリーを、キットプロトコールに従って構築し、定量化し、低ＴＥ緩衝液で１８０、６０、３０、および１８倍希釈した。次いで、ライブラリーを、上記に記載されているように、正規化ＰＣＲ、定量化、および配列決定にかけた。図３９Ａ～３９Ｃに見ることができるように、８つすべてのライブラリーは、予想４０ｎＭ濃度への正規化に成功した。また、配列決定結果は、各ライブラリーのフローセルで形成され、およそ１２．５％に等しい、クラスターの予測％を示す。

結論
ＰＣＲに基づくＮＧＳライブラリー正規化は、シーケンサーにローディングするためのライブラリーを調製する際のワークフローを簡素化するための、標準的方法の単純な代替法である。各ライブラリーで達成されたライブラリー収量は、Ｎ－ＰＣＲプライマー濃度に比例し、Ｉｌｌｕｍｉｎａフローセルに等しくローディングされたことを示したライブラリーのプールが生成された。

（実施例１１）
Ｎ－ＰＣＲプライマーを使用した１６個のＩｌｌｕｍｉｎａライブラリーの正規化は、ｑＰＣＲに基づくおよび蛍光に基づく定量化法を使用した相対的定量化が正確であることを示す。
物質
４００ｎＭの蛍光標識Ｎ－ＰＣＲプライマー１（オリゴヌクレオチド２８）
４００ｎＭのＮ－ＰＣＲプライマー２（オリゴヌクレオチド２９）
２００ｎＭのクエンチャーオリゴ（オリゴヌクレオチド３０）
共同研究者らにより提供された１６個のＩｌｌｕｍｉｎａライブラリー
Ｑ５（登録商標）ＨｏｔＳｔａｒｔＨｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ２ＸＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＮＥＢ、カタログ＃Ｍ０４９４Ｓ）
低ＴＥ緩衝液（Ｔｅｋｎｏｖａカタログ＃ＴＯ２２７）
ＫＡＰＡＬｉｂｒａｒｙＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（ＫａｐａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ＃ＫＫ４８２４）
ＳｙｎｅｒｇｙＨＴＸマルチモードリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）

方法
Ｉｌｌｕｍｉｎａライブラリーを、ＫＡＰＡＬｉｂｒａｒｙＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔを使用して定量化し、２０倍希釈した。ライブラリー希釈物を４０ｎＭ終濃度に正規化するために、ライブラリーを、２μｌのライブラリー希釈物、２５μｌのＱ５（登録商標）ＨｏｔＳｔａｒｔＨｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ２ＸＭａｓｔｅｒＭｉｘ、および５μｌの各プライマー（４０ｎＭの終濃度）、および１３μｌの低ＴＥ緩衝液を含有する正規化ＰＣＲ反応にかけた。ライブラリーは、以下のサイクルパラメーターで増幅した：９８℃で４５秒間の初回酵素活性化、次いで、９８℃で１０秒間、６０℃で５分間、７２℃で１分間からなる４サイクル、その後、９８℃で１０秒間、６０℃で１分間、７２℃で１分間からなる７サイクル。ＫＡＰＡＬｉｂｒａｒｙＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔまたはＳｙｎｅｒｇｙＨＴＸマルチモードリーダーを使用して、増幅されたライブラリーを定量化した。

結果
ｑＰＣＲによる正規化されたライブラリーの定量化結果は、実施例１１の結果に示されている（図４０Ａ～４０Ｄ）。この図に示されているように、Ｎ－ＰＣＲプライマーで増幅されたすべてのライブラリーは、およそ同じ濃度への正規化に成功した。より一貫した相対的定量化は、ＳｙｎｅｒｇｙＨＴＸマルチモードリーダーでの蛍光定量的アッセイにより達成された。全体的な蛍光レベルは、クエンチングオリゴヌクレオチドを添加したところ、およそ１０％低下した。この観察は、正規化プライマーのすべてが正規化ＰＣＲ反応で利用された訳ではなかったという事実を反映し、１０％低下は、約１０％の未組込み標識プライマーに相当する。

結論
上記に示されているデータは、蛍光標識プライマーをクエンチングオリゴヌクレオチドと共に利用する蛍光定量的アッセイは、未利用のプライマーからのライブラリーの精製を実施する必要がなく、ライブラリーインサートサイズが未知であるかまたは幅広いインサートサイズ分布を有する場合、モル濃度を計算するためにライブラリーインサートサイズに関する情報を必要としない、ライブラリー定量化のための迅速で信頼性の高い方法であり得ることを示す。

（実施例１２）
正規化アダプター－プローブと短縮アダプター配列を有するライブラリーとのライゲーションを含む、合成によるＩｌｌｕｍｉｎａＮＧＳライブラリーの正規化
この実施例は、図４２Ｅおよび４２Ｇに一般的な用語で記載されている合成方法によるＮＧＳライブラリー正規化の実現可能性を示し、ライブラリー正規化は、指定モル量の二本鎖または一本鎖正規化プローブと、ＤＮＡライブラリー（Ｔ－ライブラリー）の一方の末端にある短縮ＮＧＳアダプターとをライゲーションさせて、当量の機能的ＮＧＳライブラリーを産生することによる単一の酵素的ステップで達成することができることを示す。

物質
ＳｗｉｆｔＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＡｃｃｅｌ－ＮＧＳ（登録商標）２ＳＰＣＲ－ＦｒｅｅＤＮＡＬｉｂｒａｒｙＫｉｔ、カタログ＃２００２４
６ｕＭのプライマーＰ７（オリゴヌクレオチド３１）
６ｕＭのプライマーＰＴ１（オリゴヌクレオチド３２）
１００ｎΜの二本鎖プローブＮＴ１（オリゴヌクレオチド３３および３４のアニーリングにより形成される）
６ｕＭのプライマーＰＴ２（オリゴヌクレオチド３５）
１００ｎΜの一本鎖プローブＮＴ２（オリゴヌクレオチド３６）
Ｑ５（登録商標）ＨｏｔＳｔａｒｔＨｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ２ＸＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＮＥＢ、カタログ＃Ｍ０４９４Ｓ）
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、１２０，０００Ｕ／ｍｌ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓカタログ＃Ｌ６０３０－ＬＣ－Ｌ）
１０×Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓカタログ＃Ｂ６０３０Ｌ）
低ＴＥ緩衝液（Ｔｅｋｎｏｖａカタログ＃ＴＯ２２７）
ＨａｐＭａｐヒトＤＮＡ（ＣｏｒｉｅｌｌＢｉｏｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙカタログ＃ＮＡ１２８７８）
ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＱｕｂｉｔ２．０蛍光計、カタログ＃Ｑ３２８６６
ＱｕｂｉｔｄｓＤＮＡＢＲアッセイキット、カタログ＃Ｑ３２８５３
ＫＡＰＡライブラリーＱｕａｎｔＩｌｌｕｍｉｎａキット、カタログ＃ＫＫ４８２４
ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔＤＮＡサイズ選択ビーズ（ＢＥＣＫＭＡＮＣＯＵＬＴＥＲカタログ＃Ｂ２３３１８）

方法
ＮＧＳライブラリーを、ヒトＣｏｒｉｅｌｌＮＡ１２８７８ＤＮＡから、ＳｗｉｆｔＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＡｃｃｅｌ－ＮＧＳ（登録商標）２ＳＰＣＲ－ＦｒｅｅＤＮＡＬｉｂｒａｒｙＫｉｔを使用して調製した。ライブラリーは、プライマーＰ７およびプライマーＰＴ１またはプライマーＰＴ２を使用したＰＣＲにより、図４３ａおよび４３ｂに示されているように増幅した。ＰＣＲ反応は、２５ｕｌのＱ５２ｘＨｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙｍａｓｔｅｒｍｉｘ、５ｕｌのオリゴヌクレオチド３１（６００ｎＭ）、５ｕｌのオリゴヌクレオチド３２（６００ｎＭ）、１：５００希釈した５ｕｌの２ＳＮＧＳライブラリー、および１０ｕｌの低ＴＥ（１０ｍＭＴｒｉｓ、０．１ｍＭＥＤＴＡ）を含有する５０ｕｌの容積中で実施した。増幅条件は、９８℃－４５秒間、その後９８℃で１０秒間および６６℃で１分間の３０サイクルであった。ＰＣＲ反応の終了後、ライブラリーを、１．０のＤＮＡ：ビーズ比を使用してＳＰＲＩビーズで精製し、５０μｌの低ＴＥＤＮＡ緩衝液で溶出し、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＱｕｂｉｔ２．０蛍光計およびＱｕｂｉｔｄｓＤＮＡＢＲアッセイ相補キットを使用して定量化した。２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、および２５ｎＭ濃度の希釈された短縮ライブラリー（Ｔ－ライブラリー）を、１２０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼおよび１０ｎＭの正規化Ｎ－プローブと共にＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液中で３０℃にて１時間インキュベートした。プライマーＰＴ１を用いて増幅したＴ－ライブラリーを、二本鎖正規化プローブＮＴ１と共にインキュベートし、プライマーＰＴ２を用いて増幅したＴ－ライブラリーを、一本鎖プローブＮＴ２と共にインキュベートした。産生された機能的ＮＧＳライブラリーのモル濃度を測定するために、ライゲーション産物を、ＫＡＰＡｑＰＣＲに基づくライブラリーＱｕａｎｔＩｌｌｕｍｉｎａキットで定量化した。

結果
実験ワークフローは、図４３ａに示されており、正規化プロセス、ならびに対応するプライマー、アダプター、およびプローブ配列は、図４３ｂおよび４３ｃに提示されている。１０ｎＭの二本鎖正規化プローブＮＴ１のライゲーション（図４３ｂ）または１０ｎＭの一本鎖プローブＮＴ２のライゲーション（図４３ｃ）は、完全サイズのライブラリーを産生し、その場合、短縮アダプター（Ｐ５）はその全長に回復され、機能的ＮＧＳライブラリーになる。ライブラリー合成および正規化の完全性を、ｑＰＣＲ定量化により評価した。図４３ｄに示されているように、産生されたライブラリーのモル濃度は、Ｔ－ライブラリーの入力量が２００から２５ｎＭまで様々であったという事実にも関わらず、使用した定量化法の精度内（約２０％）の予想１０ｎＭ値である。この研究で使用した元のライブラリーは、完全サイズのＮＧＳライブラリーであったが、それを５００倍希釈し、次いでプライマーＰＴ１またはＰＴ２を用いて増幅して、短縮Ｔ－ライブラリーを生成した。したがって、ｑＰＣＲ定量化に対する元のライブラリーの予想寄与は無視できる程度である。

結論
提示されているデータは、制御された合成によるＮＧＳライブラリー正規化が、単純でロバストであり、配列決定前のライブラリー調製に使用することができ、時間および労力のかかるライブラリー定量化および濃度調整に取って代わるという証拠を提供する。

（実施例１３）
二本鎖ＤＮＡ画分に特異的な蛍光色素を使用した、合成により正規化されたＮＧＳライブラリーの定量化
本開示の実施例１２および他所に提示されている合成によるライブラリー正規化法は、二本鎖であり、原理的に、二本鎖ＤＮＡに特異的な蛍光色素で染色することができる機能的ＮＧＳライブラリーを産生する。残念ながら、残りの非機能的ライブラリー画分も二本鎖であり、それも染色される場合があり、結果として、完全で機能的なライブラリー画分の定量化を不明確にし得る。

この問題は、定量化の前に、ライブラリーをエキソヌクレアーゼＩＩＩと共にインキュベートすることにより解決することができる。この手順の詳細な説明は、図４４に提示されている。提示されている方法では、一方のアダプター末端が短縮されているＮＧＳライブラリーを、本開示の他の部分に記載されているように、ポリｒＵまたはポリｒＡ複製ブロックを含有するＰＣＲプライマーで増幅する。特に、一方のプライマーは、実施例１２のＰＴ１プライマーの場合と同じ短縮アダプター配列を含み、Ｐ７プライマーは、ポリ（ｒＵ）またはポリ（ｒＡ）塩基を有する追加の５’尾部を有する。Ｑ５、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＧＸＬ、またはＫＡＰＡＨｉＦｉなどの高フィデリティーＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ増幅は、両アダプター末端に５’突出を有するライブラリー分子をもたらす。短縮Ｐ５アダプター末端の突出配列は、Ｐ５アダプター配列により決定付けられるが、完全なサイズのＰ７アダプター末端の突出配列は、正規化プローブにアニーリングするための相補性を有しないように選択することができる。その３’末端に１つまたは複数のヌクレアーゼ耐性塩基（ライゲーション反応に関与しない）も有する正規化プローブに加えて、正規化反応ミックスは、保護キャップ分子も含有する。保護キャップ分子は、Ｐ７アダプター末端に存在する５’突出に相補的な５’突出を有し（ＰＣＲ中に生成される）、ヌクレアーゼ耐性であり、モル過剰で存在し、すべてのＰ７アダプター末端にエキソヌクレアーゼＩＩＩに対する保護を提供するように設計されている。キャップは、小型であり、Ｉｌｌｕｍｉｎａ機器でのクラスター形成および／または配列決定プロセス中に、ライブラリー性能に影響を及ぼす可能性は少ない。

両３’末端にヌクレアーゼ耐性塩基を含有する正規化されたライブラリー画分は、エキソヌクレアーゼＩＩＩ処理に耐性であり、二本鎖のままである。その一方で、一方のアダプター末端のみにヌクレアーゼ耐性塩基を有するすべての短縮ライブラリー分子は、ＳＹＢＲまたはＱｕｂｉｔのような二本鎖特異的色素で検出できない一本鎖形態へと変換される。この場合、正規化された画分を含むすべてのライブラリー分子は、染色不能な一本鎖形態へと変換されることになるため、提示されているプロトコールは、保護キャップ分子の非存在下では実現可能ではない。

（実施例１４）
単一分子配列決定のためのロングレンジアンプリコンライブラリーの合成
単一分子配列決定は、非常に長いＤＮＡ分子の配列分析を可能にする、非常に有望で急速に成長しているＮＧＳ分野である。ＩｌｌｕｍｉｎａおよびＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ配列決定プラットフォームの場合と同様に、単一分子配列決定も、ＤＮＡ断片を、一方または両方の末端に特殊なアダプター配列を保持するプラットフォーム特異的ＮＧＳライブラリーへと変換することを必要とする。ＰａｃｉｆｉｃＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓプラットフォームの場合、アダプターは、両末端が単一のステム－ループであるが、ＯｘｆｏｒｄＮａｎｏｐｏｒｅプラットフォームの場合、アダプターは、タンパク質分子が共有結合で付着されているＹ形状のＤＮＡ構造である。多くの場合、配列決定プロセスは、多重化ＤＮＡ試料を含み、アダプターとインサートＤＮＡ配列との間に挿入される追加の試料ＩＤ配列（インデックスまたはバーコード）を使用する。アダプターおよび試料インデックス付与の現行方法は、時間がかかるか、および／または非付着アダプター分子を除去するためのいくつかのラウンドのＳＰＲＩビーズ精製を必要とするかいずれかである。ここで、本発明者らは、配列決定前にニックシーリングまたはギャップフィリング反応しか必要としないように、ＰＣＲ中にステム－ループアダプター配列の付着を可能にする単純なプロトコールを提案する（図４５～４７）。また、ギャップフィリング反応を使用して、多重化応用のためのインデックス付与配列を挿入することができる。ステム－ループアダプターは、修飾特異的エンドヌクレアーゼによりループを切断することによりＹ形状アダプターへと容易に変換することができる。

物質
６ｕＭのプライマー（オリゴヌクレオチド３７）
６ｕＭのプライマー（オリゴヌクレオチド３８）
１０ｕＭの線形ユニバーサルプライマー（オリゴヌクレオチド３９）
１０ｕＭのステム－ループユニバーサルプライマー（オリゴヌクレオチド４０）
１ｕＭのステム－ループアダプター（オリゴヌクレオチド４１）
１ｕＭのインデックス付与リンカー（オリゴヌクレオチド４２）
Ｅ．ＣｏｌｉＭｉｇｕｌａゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ、カタログ＃ＭＧ１６５５）
ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔＤＮＡサイズ選択ビーズ（ＢＥＣＫＭＡＮＣＯＵＬＴＥＲ、カタログ＃Ｂ２３３１８）
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、１２０，０００Ｕ／ｍｌ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓカタログ＃Ｌ６０３０－ＬＣ－Ｌ）
１０×Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓカタログ＃Ｂ６０３０Ｌ）
低ＴＥ緩衝液（Ｔｅｋｎｏｖａカタログ＃ＴＯ２２７）
エキソヌクレアーゼＩＩＩ、１００，０００Ｕ／ｍｌ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ、カタログ＃Ｘ８０２０Ｆ）
エキソヌクレアーゼＶＩＩ、１０，０００Ｕ／ｍｌ（ＮＥＢカタログ＃ＭＯ２６３Ｓ）
Ｑ５（登録商標）ＨｏｔＳｔａｒｔＨｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ２ＸＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＮＥＢ、カタログ＃Ｍ０４９４Ｓ）
２１００ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ、カタログ＃Ｇ２９３９ＢＡ）
高感度ＤＮＡチップ（Ａｇｉｌｅｎｔ、カタログ＃５０６７－４６２６）

方法
一次Ｅ．ｃｏｌｉアンプリコンを、尾部付きプライマー（オリゴヌクレオチド３７および３８を使用した、２５ｕｌのＱ５２ｘＨｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙｍａｓｔｅｒｍｉｘ、５ｕｌのオリゴ３７、５ｕｌのオリゴ３８、５ｕｌのＥ．ｃｏｌｉＤＮＡストック、および１０ｕｌの低ＴＥ緩衝液を含有する５０ｕｌの容積中でのＰＣＲ反応により産生した。増幅条件は、９８℃－４５秒間、その後９８℃で１０秒間および６６℃で１分間の２６サイクルであった。ＰＣＲ反応の終了後、ライブラリーを、１．２のＤＮＡ：ビーズ比を使用してＳＰＲＩビーズで精製し、５０μｌの低ＴＥ緩衝液で溶出した。

一次アンプリコン産物を、ユニバーサル線形プライマー（オリゴヌクレオチド３９）またはユニバーサルステム－ループプライマー（オリゴヌクレオチド４０）のいずれかを用いて以下の条件で再増幅した：１００倍希釈した第１のＰＣＲ反応に由来する５ｕｌのアンプリコンＤＮＡ、２５ｕｌのＱ５２ｘＨｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙｍａｓｔｅｒｍｉｘ、５ｕｌのユニバーサルプライマー、および１５ｕｌの低ＴＥ緩衝液、最終容積は５０ｕｌ。増幅条件は、９８℃－４５秒間、その後９８℃で１０秒間および６６℃で１分間の３０サイクルであった。ＰＣＲ産物を、１．２のＤＮＡ：ビーズ比を使用してＳＰＲＩビーズで精製し、２０μｌの低ＴＥ緩衝液で溶出した。

アダプター付着およびギャップフィリング反応（線形ユニバーサルプライマー、図４５ａ）またはギャップフィリング反応のみ（ステム－ループユニバーサルプライマー、図４５ｂ）を、線形ユニバーサルプライマーのＰＣＲ産物を、ステム－ループアダプター（オリゴヌクレオチド４１）およびインデックス付与リンカーオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド４２）と共に、ならびにステム－ループユニバーサルプライマーのＰＣＲ産物をインデックス付与リンカーオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド４２）と共に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、以下の条件でインキュベートすることにより実施した：総反応容積４０ｕｌ中、３ｕｌのＰＣＲ産物、５ｕｌのオリゴヌクレオチド４１、１０ｕｌのオリゴヌクレオチド４２、４ｕｌの１０×Ｔ４ライゲーション緩衝液、２ｕｌのＴ４リガーゼ、および低ＴＥ緩衝液。ライゲーション反応を３０℃で３０分間実施し、次いで、反応の半分をさらに１５分間、エキソヌクレアーゼＩＩＩ／エキソヌクレアーゼＶＩＩミックスで処理した。エキソヌクレアーゼ処理の後、反応を、１．２のライブラリー：ビーズ比を使用してＳＰＲＩビーズで精製し、高感度ＤＮＡチップを使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで分離した。

結果
第２のＰＣＲ反応中に、（リボＵ）_４複製ブロックを含有する線形（図４５ａ）またはステム－ループ（図４５ｂ）ユニバーサルプライマーを使用することにより、配列（ＧＴ）_６（Ｔ）_２２（ｒＵ）_４（配列番号６１）を含有する一本鎖５’突出（図４５ａ）または配列（Ｔ）_２２（ｒＵ）_４（配列番号６２）を含有するステム－ループ突出および一本鎖ギャップ領域（図４５ｂ）のいずれかを有するＤＮＡ分子が生成される。第１の場合の一本鎖尾部および第２の場合の一本鎖ギャップは、ステム－ループアダプターのアニーリングおよびライゲーションのための鋳型ならびにインデックス付与リンカー（第１の場合）またはインデックス付与リンカーのみ（第２の場合）になる。

Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒデータは、図４５ｃに提示されており、線形プライマーを用いたＰＣＲ後のアダプター／リンカーライゲーションの産物（レーン５）、およびステム－ループプライマーを用いたＰＣＲ後のリンカーライゲーションの産物（レーン７）は両方とも、エキソヌクレアーゼＩＩＩ／エキソヌクレアーゼ（exonyclease）ＶＩＩの併用処理に対する耐性を有する（それぞれ、レーン６および８）ことを示す。これは、ライブラリー末端に予想されるダンベル構造を示す。データは、ＰＣＲアンプリコンの５０％よりも多くが、エキソヌクレアーゼ耐性分子に変換されたことを示す。レーン１、２、３、および４は、それぞれ、ＤＮＡラダー、第１のＰＣＲ反応の産物、および上記に記載されている第２のＰＣＲ反応の２つの産物を示す。

結論
提示されているデータは、両末端にステム－ループアダプターを有するアンプリコンライブラリーを調製するための新しい非常に効率的な方法を記載している。また、方法は、長いバーコード化アダプターオリゴヌクレオチドの合成を必要としないように、ＩＤ配列をリンカーオリゴヌクレオチドに含めることにより試料ＩＤ配列を組み込む効率的な方法を含む。ステム－ループプライマー法は、限定なしに、修飾された切断可能な塩基（ｄＵ、ＲＮＡ、デオキシイノシン、メチル化シトシンなど）をＰＣＲプライマーのループ領域に導入し、修飾特異的エンドヌクレアーゼ（ＵＳＥＲ酵素ミックス、ＲＮａｓｅ、エンドヌクレアーゼＶ、メチル化特異的エンドヌクレアーゼなど）により塩基を切断することにより、末端にＹ形状アダプターを有するアンプリコンライブラリーを生成することに適用することができる。そのような切断を、インデックス付与／バーコード付与リンカーライゲーションステップと組み合わせて、プロセス全体を単一のインキュベーション反応に限定してもよい。

図４６ａおよび４６ｂに示されているように、実施例１４に提示されている方法は、共有結合で閉環されたＤＮＡ構造を作製するためのリンカーオリゴヌクレオチドライゲーションに限定されない。方法は、これに限定されないが、図４７ａに示されているように、ホモポリマーまたは／およびジヌクレオチド反復配列を５’突出に使用して、ステム－ループまたはＹ形状アダプター付着を達成することが好ましい。図中、５’突出配列Ｘは、任意のＤＮＡ配列であってもよい。本開示で提示されているデータによると、高フィデリティーＤＮＡポリメラーゼと組み合わせて使用する場合、３つまたはそれよりも多くの塩基のｒＵおよびｒＡ伸張が最良の複製終結を提供する。その一方で、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの場合、３つまたはそれよりも多くのｒＧ塩基が複製の終結を提供する。

また、図４７ｂに示されているように、ステム－ループアダプター付着には、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより生成される５’突出を利用することができる。この場合、ＰＣＲプライマーは、アンプリコンを産生し、２つの異なるＤＮＡ配列：低減複雑性配列Ｘ、およびＸ領域に存在しない塩基を含有する緩衝配列Ｂを含有する尾部を組み込む。例えば、配列Ｘは、ホモポリマーＡＡＡ．．．ＡＡＡであり、配列Ｂは、ＧおよびＣ塩基のみを含有する。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、および緩衝ヌクレオチド（例えば、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ）を含有するが、領域Ｘに相補的な塩基（ｄＴＴＰ）を含有しない制限ヌクレオチドミックスの存在下では、ＰＣＲアンプリコンの末端がトリミングされて、Ｘ突出（ポリＡ尾部）が産生されるだろう。尾部配列Ｘに相補的な配列Ｘ’を有するステム－ループアダプターは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの熱不活性化後にライゲートすることができる。代わりに、ステム－ループアダプターが、類似の塩基組成を有するが、必ずしも同じ配列ではない緩衝配列Ｂを有する場合、ライゲーション反応は、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼトリミング反応と組み合わせてもよい。緩衝領域は、アンプリコン末端で作用するのと同じ方法で、ステム－ループアダプターを、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ媒介性エキソヌクレアーゼ消化から保護する。

（実施例１５）
より効率的な単一分子（ＰａｃｉｆｉｃＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓおよびＯｘｆｏｒｄＮａｎｏｐｏｒｅ）配列決定のためのロングレンジアンプリコンのオリゴマー化
固定化されたＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼにより触媒されるプライマー伸長反応中にＤＮＡに組み込まれる蛍光性塩基の連続検出を使用するＰａｃｉｆｉｃＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ法、またはＤＮＡをナノ細孔に通す際の配列特異的電流変動を検出するＯｘｆｏｒｄＮａｎｏｐｏｒｅ法などの、単一分子配列決定のために開発された方法は、最大５０（ＰａｃＢｉｏ）キロベースまたはさらに８００（ＯＮＴ）キロベースの非常に長いＤＮＡ配列を配列決定することができる。実質的により短いＤＮＡ分子を、そのような機器により分析する場合、それらの利用効率は著しく低下する。この問題を克服するため、ＤＮＡ分子をより長いコンカテマー構造へとライゲートすることができる。また、ＤＮＡオリゴマー化は、ＰａｃＢｉｏ機器で顕著なチップローディングのサイズバイアスを克服するために使用することができる。短いおよび長いＤＮＡ分子でローディング効率が異なることにより、サイズ分布が１から１０ｋｂまで変動する（約２ｋｂにピークを有する）ｃＤＮＡ分子の発現分析では、同時配列決定する場合、著しいサイズバイアスがもたらされる。

本出願に記載されている５’突出を効率的に生成するための方法を使用して、コンカテマーアンプリコン分子を生成することができる。本発明者らは、アンプリコンオリゴマー化のためのいくつかの戦略を起想する。１つの戦略では、図４８ａ、４８ｃ、および４８ｄに示されている、ＰＣＲ単独（リボＵ含有プライマーを用いる。図４８ａ、４８ｃ）またはＰＣＲおよびその後のＴ４ＤＮＡポリメラーゼとのインキュベーション（図４８ａ、４８ｄ）は、実施例１４に記載されているステム－ループアダプターライゲーションのためのそのような突出の生成と同様に、相補的５’突出ＡおよびＡ’を有するＤＮＡ分子を生成する。相補的突出を有するＤＮＡ分子は、ＤＮＡリガーゼの存在下で、末端に相補的１２塩基突出を有する完全なバクテリオファージラムダＤＮＡのオリゴマー化と同様に、長い共有結合コンカテマーを生成するだろう。図４８ｂに示されている別の戦略では、ＰＣＲ単独（リボＵ含有プライマーを用いた）またはＰＣＲおよびその後のＴ４ＤＮＡポリメラーゼとのインキュベーションは、非相補的５’突出ＡおよびＢを有するＤＮＡ分子を生成する。この場合、ＤＮＡオリゴマー化は、アンプリコンを、突出Ａ’およびＢ’を含有する化学量論的に等モル量の二本鎖リンカーＤＮＡと混合することにより達成される。さらに別の戦略では、リボＵ含有プライマーを用いたＰＣＲ増幅は、図４８ｅに示されているように、部分的に相補的な突出を有するアンプリコンを生成する。この場合、２つの５’突出の５’部分のみが、相互に相補的であり、ＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴ（配列番号６３）およびＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣ（配列番号６４）配列を有する。アンプリコンのアニーリングは、ｒＵ塩基に隣接するホモポリマーポリＴ配列を含有する一本鎖ギャップ領域を有する、非共有結合的に会合したオリゴマーを生成する。ポリＡホモポリマー配列を含有するリンカーオリゴヌクレオチドの付加およびライゲーションは、共有結合オリゴマーの形成をもたらす。リンカーオリゴヌクレオチドは、アンプリコンオリゴマーの形成を完成させるためだけでなく、試料多重化のためのインデックス付与配列を組み込むためにも使用することができる。

（実施例１６）
ハイブリダイゼーション捕捉により標的を濃縮するための再増幅可能な一本鎖プローブの生成。
ＰＣＲ増幅ＤＮＡから選択された鎖のみを含有する一本鎖分子の調製には高い需要が存在する。二本鎖ＰＣＲ産物からの一本鎖ＤＮＡの調製は、指数関数的な濃縮によるリガンドの系統的進化（ＳＥＬＥＸ）（Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment）によるアプタマーの特定に必須のステップである。また、それは、遺伝子型決定およびＤＮＡに基づく診断アッセイにおいてに頻繁に使用される。一部の方法では、ラムダ５’エキソヌクレアーゼを利用して、非リン酸化鎖を保存しつつ、５’ホスフェート基を含有するＤＮＡ鎖を消化する。残念ながら、リン酸化ＤＮＡ末端に対するラムダエキソヌクレアーゼの特異性は、絶対的ではなく、非リン酸化ＤＮＡ鎖の非特異的分解がもたらされる。他の方法は、ビオチン含有ＰＣＲ産物の、ストレプトアビジン磁気ビーズでの固定化を使用し、目的の鎖をＮａＯＨ処理によりビーズから選択的に放出し、その後酸中和する。この手法は、ビオチン化ＤＮＡの調製または任意の大規模一本鎖ＤＮＡ調製に好適ではない。

ここで、本発明者らは、ＰＣＲ産物から、一本鎖ＤＮＡ分子および特にビオチン化一本鎖分子を大規模生成するための新規な方法を提案する。提案される方法は、高度に効率的であり、生産コストが低く、大容積およびプローブ数に大規模化可能であり、その結果として、ＮＧＳ分析のためにＤＮＡおよびＲＮＡを標的濃縮するためのハイブリダイゼーション捕捉プローブの調製に理想的に好適である。また、それは他のリガンドまたは発色団で標識された一本鎖ＤＮＡの産生に使用することができる。方法は、鎖特異的であり、両ＤＮＡ鎖に対するプローブの調製を可能にする。

方法は、いくつかのステップを含む（図４９ａ）。第１に、ユニバーサル配列ＡおよびＢを含有するプライマーならびに熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用するＰＣＲにより、ゲノムまたはベクターＤＮＡから選択領域を増幅すること。第２に、ＰＣＲ産物を希釈し、ユニバーサルプライマーＡおよびＢ、ならびにＱ５、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＧＸＬ、またはＫａｐａＨｉＦｉなどの高フィデリティーＤＮＡポリメラーゼを用いて再増幅し、その場合、プライマーＡがビオチン基を有し、プライマーＢが、（ｒＵ）_４複製ブロック、それに続き５’末端に１０～１６ｄＴ塩基（配列番号６５）の伸張を有すること。ＰＣＲは、一方の末端に５’突出を有する二本鎖ＤＮＡ分子を産生する。また、５’突出を有する標的ＤＮＡ分子の産生は、それらの５’末端にビオチンおよび（ｒＵ）_４（ｄＴ）_{１２～１６}配列（配列番号６６）を有する標的特異的プライマーを使用して、１つのＰＣＲステップで達成することができる。複製終結のためのリボヌクレオチド塩基の選択は、ｒＵ塩基のみに限定されず、ポリ（ｒＡ）であってもよく、または増幅のために選択したＤＮＡポリメラーゼの効率的な重合停止を提供し、ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーションに十分な５’突出を生成する任意の他のリボヌクレオチド配列であってもよい。第３に、１０～２０個のＡ塩基（配列番号５９）、５’ホスフェート基、および少なくとも１つのホスホロチオエート結合を５’末端付近に含有するヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドをアニーリングおよびライゲーションすること。好ましくは、エキソヌクレアーゼに対するより良好な保護のために、少なくとも４つのホスホロチオエート結合が存在する。プライマーＢの５’尾部配列およびヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドＣの相補的配列は、ポリＴおよびポリＡ配列に限定されず、任意の他の相互に相補的な配列により置換することができる。ポリＴおよびポリＡ配列の選択は、実施例６に示されたように、迅速なアニーリングおよびライゲーション時間により正当化される。第４に、ＡＭＰｕｒｅＸＰビーズによる精製を実施して、組み込まれなかったＰＣＲプライマーおよび保護オリゴヌクレオチドを除去する。オリゴヌクレオチドＣの量は、ＰＣＲ反応により産生されるすべてのＤＮＡ分子を保護するために過剰であってもよく、または指定量の一本鎖プローブのみを産生することが目標である場合は、限定され、指定モル濃度で存在していてもよい。第５に、エキソヌクレアーゼＩＩＩによる消化を実施して、非保護ＤＮＡ鎖を除去する。および、最後に、エキソヌクレアーゼＩＩＩ熱不活性化、またはスピンカラムもしくは任意の他の利用可能な方法によるプローブ精製を実施する。

記載されている方法は、鎖特異性がユニバーサルプライマーにおけるビオチン基および（ｒＵ）_４（ｄＴ）_{１２～１６}配列（配列番号６６）の位置により決定付けられるビオチン化一本鎖ＤＮＡ捕捉プローブを産生する。ビオチン基をプライマーＢへと、および（ｒＵ）_４（ｄＴ）_{１２～１６}配列（配列番号６６）をプライマーＡへと、それぞれ移動させることにより、第２のＤＮＡ鎖に相補的な捕捉プローブを生成することが可能である（図４９ｂ）。

ビオチン化鎖特異的プローブをプールして、変性ＮＧＳライブラリーとのハイブリダイゼーションにより複数の標的領域を単離するためのパネルを形成することができる。プローブが等濃度で存在することを保証するために、標準的方法を使用してそれらの量を定量化し、希釈により濃度を調整するべきである。複数のプローブのプール化は、プローブの量が、ヌクレアーゼ耐性プローブＣの制御されたライゲーションにより正規化されれば、単純化され得る。この場合、プールする前のプローブ濃度測定および調整を省略することができる。

記載されている方法は、プローブ生成のための無限の供給源を提供する。それは、図４９ｃに示されているように、プールされたＤＮＡプローブを、２つのユニバーサルプライマーを用いてＰＣＲにより繰り返し増幅し、ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドとライゲートさせ、エキソヌクレアーゼＩＩＩで消化して、一本鎖の鎖特異的なビオチン含有ＤＮＡ捕捉プローブを生成することができるからである。

（実施例１７）
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ媒介性突出生成のための緩衝領域の必要条件
この実施例で提示されているデータは、最も安定なＧおよびＣ塩基で構成される緩衝ＤＮＡ領域は、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによる不可逆的ＤＮＡ末端トリミングを防止するために、少なくとも４塩基長であるべきであることを示す。

物質
オリゴヌクレオチド４８
オリゴヌクレオチド４９
オリゴヌクレオチド５０
オリゴヌクレオチド５１
オリゴヌクレオチド５２
オリゴヌクレオチド５３
オリゴヌクレオチド５４
オリゴヌクレオチド５５
１０×Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓカタログ＃Ｂ６０３０Ｌ）
低ＴＥ緩衝液（Ｔｅｋｎｏｖａカタログ＃ＴＯ２２７）
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、３００００ｕ／ｍｌ、カタログ＃Ｍ０２０３Ｌ）
ｄＧＴＰ、１００ｍＭ（カタログ＃５５０８４）
ｄＣＴＰ、１００ｍＭ（カタログ＃５５０８４）
１５％ＴＢＥ－尿素ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃ＥＣ６８８５２ＢＯＸ）
ＳＹＢＲＧｏｌｄ染色剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃Ｓ１１４９４）

方法
図５０に示されている、一方のＤＮＡ末端に８塩基長緩衝ＧＣ領域、中間に可変長緩衝ＧＣ領域、および他方のＤＮＡ末端にポリＴ／ポリＡ配列を有する二本鎖オリゴヌクレオチド構築物ａ、ｂ、ｃ、およびｄを、５□Ｍオリゴ４８を５□Ｍオリゴ４９と、５□Ｍオリゴ５０を５□Ｍオリゴ５１と、５□Ｍオリゴ５２を５□Ｍオリゴ５３と、および５□Ｍオリゴ５４を５□Ｍオリゴ５５と、５０ｍＭＮａＣｌ中で３０分間２５℃にてアニーリングすることにより調製した。試料を、ホルムアミドローディング緩衝液中で煮沸し、２００ボルトの１５％ＴＢＥ－尿素ゲルで分離した。ゲルを、ＳＹＢＲＧｏｌｄ染色剤で染色し、ＤａｒｋＲｅａｄｅｒライトボックス（ＣｌａｒｅＣｈｅｍｉｃａｌＲｅｓｅａｃｈ）上で視覚化し、デジタルカメラを使用して写真撮影した。

結果
オリゴヌクレオチド構築物、およびＴ４ＤＮＡポリメラーゼとのインキュベーション前後の変性ゲル分析の結果が、図５０ａ～ｂに示されている。最初の４つのレーンは、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートする前の、構築物ａ～ｂを構成するオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド４８～５５）の移動度を示す。相補的オリゴヌクレオチドは、類似のサイズを有していたため、単一のバンドとして移動した。ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰヌクレオチドの存在下でのＴ４ＤＮＡポリメラーゼによる処理の後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによりトリミングされたポリＡ配列に対応する、新しいより速く移動するバンドが出現した。第２の鎖は、９塩基のＧＧＣＧＧＣＧＧＣ緩衝配列が構築物の反対側の末端にあるため、完全なままであった。それぞれ緩衝領域ＧＧＣＧＧＣおよびＧＧＣＧを含有する構築物ａおよびｂは、緩衝領域での顕著なポリメラーゼ停止を示す鋭い電気泳動バンドをもたらした。２塩基緩衝領域ＧＧを含有する構築物ｃは、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを予想位置で停止せず、ＧＧ部位の下流に位置する第２の３塩基緩衝配列ＧＣＧに対応する、より短いぼやけた電気泳動バンドをもたらした。興味深いことには、単一Ｇ塩基を緩衝領域として含有する構築物ｄは、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを、内部３塩基配列ＧＣＧで停止しなかった。この結果は、構築物ｃの観察されたぼやけたバンドが、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼとの１５分間のインキュベーション後に検出された、ＧＧジヌクレオチドにより提供された上流トリミングブロックの存在による一時的な中間状態を表していることを示唆する。

結論
この実施例で提示されているデータは、４つのＧ／Ｃ塩基が、ＤＮＡポリメラーゼによる緩衝領域を越えたトリミングを防止するための、緩衝領域の最小サイズであることを示す。３つのＧ／Ｃ塩基は十分でなく、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの３’エキソヌクレアーゼ活性に対する一時的ブロックのみ提供した。この結論は、緩衝部がＧ／Ｃ組成の場合に当てはまり、ＴおよびＡ塩基を緩衝領域として使用する場合、より長いサイズを必要とする可能性がある。より高い温度でのトリミングは、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性がより高いため、より長い緩衝領域を必要とする可能性が高い。この必要条件は、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼおよび制限ヌクレオチドミックスを使用して５’突出を生成するために、典型的には単一のシトシン塩基が使用される、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いたライゲーション非依存性クローニングの当技術分野で公知であった必要条件とは実質的に異なる。本発明者らのデータは、正確な５’突出の長さおよび配列が必要とされる応用の場合、５つまたはそれよりも多くの緩衝Ｇ／Ｃ塩基、および恐らくは６つまたはそれよりも多くのＡ／Ｔ塩基を使用して、予測可能なＤＮＡ突出末端構造の生成を保証することが得策であることを示す。

したがって、本発明は、言及されている目的および利点ならびにそれらに備わるものを達成するのに良好に適応されている。当業者であれば多数の変更をなすことができるが、そのような変更は、部分的には添付の特許請求の範囲により示されている本発明の趣旨内に包含される。

本開示の具体的な実施形態の上述の記載は、例示および説明のために提示されている。例示的な実施形態は、本開示の原理およびその実用的な応用を最もよく説明するために選択および記載されており、それにより当業者であれば、本主題を最も良好に利用することができ、種々の改変を有する種々の実施形態が、企図される特定の使用に好適である。本開示内の種々の実施形態の異なる特徴および開示は、本開示の範囲内で組み合わせることができる。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
配列決定アッセイにおいて後に使用するために、標的分量の処理された核酸分子を、開始分量から得る方法であって、
前記開始分量の処理された核酸分子を含む試料を提供するステップであって、前記開始分量が、前記標的分量よりも大きい、ステップと、
リガーゼおよびプローブを前記試料に添加して、第１の反応混合物を得るステップであって、前記プローブが、前記標的分量と等しい量で添加される、ステップと、
前記第１の反応混合物を、前記プローブと前記処理された核酸分子の一部分とのライゲーションを可能にするのに十分な条件下でインキュベートするステップであって、プローブにライゲートされた前記処理された核酸分子の前記一部分が、前記標的分量の処理された核酸分子である、ステップと
を含む方法。
（項目２）
前記開始分量の処理された核酸分子を含む前記試料を提供する前に、
（ｉ）複数の少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子であって、各少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子が第１の鎖および第２の鎖を含む核酸分子、
（ｉｉ）前記複数の核酸分子の各核酸分子の前記第１の鎖の標的部分に配列が相補的である第１の部分を含む第１のプライマー、
（ｉｉｉ）前記複数の核酸分子の各核酸分子の前記第２の鎖の標的部分に相補的な配列を含む第２のプライマー、
（ｉｖ）デオキシヌクレオチド、ならびに
（ｖ）ＤＮＡポリメラーゼ
を含むＰＣＲ混合物を提供するステップと、
前記ＰＣＲ混合物を、前記ＤＮＡポリメラーゼが前記第１のプライマーおよび第２のプライマーの伸長を可能にし、それにより前記処理された核酸分子を産出するのに十分な条件下でインキュベートするステップと、
前記ＰＣＲ混合物を精製して、未使用の第１のプライマーおよび第２のプライマーを除去し、それにより、前記開始分量の処理された核酸分子を含む前記試料を得るステップとをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、平滑末端ＰＣＲ産物をもたらす３’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、単一塩基突出を有するＰＣＲ産物をもたらす３’アデニル化活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである、項目２に記載の方法。
（項目５）
前記第１のプライマーが、前記プライマーの３’末端に位置する、前記複数の核酸分子の各核酸分子の前記第１の鎖の標的部分に配列が相補的である第１の部分、前記第１の部分に５’隣接して位置する、３つまたはそれよりも多くの連続リボヌクレオチド塩基を含む第２の部分、および前記第２の部分に５’隣接して位置し、２つまたはそれよりも多くのデオキシヌクレオチドを含む第３の部分を含み、前記ＤＮＡポリメラーゼが、３’エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を有し、前記ＰＣＲ混合物をインキュベートした後で産出される前記処理された核酸分子が各々、前記第１のプライマーの前記第３の部分および前記３つまたはそれよりも多くの連続リボヌクレオチド塩基の少なくとも１つを含む５’突出を含む、項目２に記載の方法。
（項目６）
前記３つまたはそれよりも多くの連続リボヌクレオチド塩基が、ｒＵまたはｒＡ塩基を含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼＱ５である、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ＰＲＩＭＥＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅである、項目５に記載の方法。
（項目９）
前記第１プライマーが、前記プライマーの３’末端に位置する、前記複数の核酸分子の各核酸分子の前記第１の鎖の標的部分に配列が相補的な第１の部分、前記第１の部分に５’隣接して位置する、緩衝配列を含む第２の部分、および前記第２の部分に５’隣接して位置する、前記緩衝配列のヌクレオチドとは異なるヌクレオチドからなる尾部配列を含む第３の部分を含み、前記第２のプライマーが、前記プライマーの３’末端に位置する、前記複数の核酸分子の各核酸分子の前記第２の鎖の前記標的部分に配列が相補的な第４の部分、および前記第４の部分に５’隣接して位置する、前記緩衝配列と同じヌクレオチド組成を有する配列を含む第５の部分を含む、項目２に記載の方法。
（項目１０）
前記ＰＣＲ混合物を精製して、未使用の第１のプライマーおよび第２のプライマーを除去した後に、
前記開始分量の処理された核酸分子を含む前記試料に、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、および前記緩衝配列の前記ヌクレオチドに相補的であるが、前記尾部配列の前記ヌクレオチドには相補的でないデオキシヌクレオチドを添加するステップ、
前記開始分量の処理された核酸分子、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、および前記緩衝配列の前記ヌクレオチドに相補的であるが、前記尾部配列の前記ヌクレオチドには相補的でないデオキシヌクレオチドを含む前記試料を、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ３’エキソヌクレアーゼ活性が、前記尾部配列をトリミングし、前記緩衝配列の位置に５’突出を産生することを可能にするのに十分な条件下でインキュベートするステップであって、前記Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼが、そのポリメラーゼ活性および前記相補的デオキシヌクレオチドの存在のため、前記緩衝配列を越える３’エキソヌクレアーゼ消化を防止する、ステップ
をさらに含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記第１の反応混合物をインキュベートするステップが、前記開始分量の処理された核酸分子、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、および前記緩衝配列の前記ヌクレオチドに相補的であるが、前記尾部配列の前記ヌクレオチドには相補的でないデオキシヌクレオチドを含む前記試料をインキュベートするステップと同時に実施され、それにより、前記処理された核酸分子の５’突出の生成、および前記プローブと前記処理された核酸分子とのライゲーションを可能にする、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記プローブが、前記緩衝配列と同じデオキシヌクレオチドからなる３’末端緩衝配列を含み、それにより前記プローブに、前記Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの３’エキソヌクレアーゼ活性に対する耐性を提供する、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記緩衝配列が、ホモポリマー、ジヌクレオチド、またはトリヌクレオチド反復配列を含む、項目９に記載の方法。
（項目１４）
前記緩衝配列および前記第２のプライマーの前記第５の部分が、５～１０塩基の長さである、項目９に記載の方法。
（項目１５）
前記尾部配列が、１０～２０塩基の長さである、項目９に記載の方法。
（項目１６）
前記ＰＣＲ混合物をインキュベートした後に、
前記開始分量の処理された核酸分子を含む前記試料にヌクレアーゼを添加するステップと、
前記ヌクレアーゼおよび前記開始分量の処理された核酸分子を含む前記試料を、前記ヌクレアーゼが、前記処理された核酸分子の塩基を切断して３’突出を産出するのに十分な条件下でインキュベートするステップと
をさらに含み、
前記第１のプライマーが、切断可能な塩基をさらに含む、項目２に記載の方法。
（項目１７）
前記切断可能な塩基が、デオキシウリジン、リボヌクレオチド、イノシン、およびそれらの組合せからなる群から選択され、前記ヌクレアーゼが、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、ＲＮａｓｅ、およびエンドヌクレアーゼＶからなる群から選択される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記ＰＣＲ混合物をインキュベートした後に、
前記開始分量の処理された核酸分子を含む前記試料に５’エキソヌクレアーゼを添加するステップと、
前記５’エキソヌクレアーゼおよび前記開始分量の処理された核酸分子を含む前記試料を、各処理された核酸分子の一部分を消化して３’突出を産出するのに十分な条件下でインキュベートするステップと
をさらに含み、
前記第１のプライマーが、５’エキソヌクレアーゼ耐性修飾をさらに含む、項目２に記載の方法。
（項目１９）
前記処理された核酸分子が、次世代配列決定（ＮＧＳ）ライブラリーである、項目１～１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記処理された核酸分子の各々が、前記分子の第１の末端に第１のアダプター配列、および前記第１の末端の反対側の第２の末端に第２のアダプター配列を含み、前記第１のアダプター配列および前記第２のアダプター配列が、同じであるかまたは異なる、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記第１のアダプター配列が、第１の次世代配列決定アダプターであり、第２のアダプターが、第２の次世代配列決定アダプターである、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記プローブが、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾を含む、項目１～１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾が、３つまたはそれよりも多くの連続ホスホロチオエート連結を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記第１の反応混合物をインキュベートした後に、
エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を前記第１の反応混合物に添加して、第２の反応混合物を得るステップと、
前記第２の反応混合物を、前記プローブにライゲートされていない前記処理された核酸分子の消化を可能にし、それにより、選択された標的分量の処理された核酸分子を単離するのに十分な条件下でインキュベートするステップと
をさらに含む、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
前記処理された核酸分子が、完全なＮＧＳアダプター配列の一部分を欠如する非機能的次世代配列決定（ＮＧＳ）アダプターを含み、前記プローブが、前記ＮＧＳアダプターが機能的であるために必要な、前記ＮＧＳアダプター配列の前記一部分を含むポリヌクレオチド配列を含む、項目１～１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記処理された核酸分子とのプローブライゲーションが、平滑末端ライゲーションであり、前記処理された核酸分子の各々が平滑末端を含み、前記プローブが、前記処理された核酸分子の各々の前記平滑末端と適合性の平滑末端を含む、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
各処理された核酸分子が５’突出を含み、前記処理された核酸分子とのプローブライゲーションが、付着末端ライゲーションである、項目１～２および５～１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
各処理された核酸分子が３’突出を含み、前記処理された核酸分子とのプローブライゲーションが、付着末端ライゲーションである、項目１～２および１６～１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
各処理された核酸分子が、低複雑性配列を含み、前記プローブが、前記低複雑性配列に相補的な配列を含み、複雑なヌクレオチド配列のハイブリダイゼーション速度と比較して、低プローブ濃度での、前記処理された核酸分子との前記プローブのハイブリダイゼーション速度の増加を提供する、項目１～２および５～１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記低複雑性配列が、ポリ（Ａ）、ポリ（Ｔ）、ポリ（Ｇ）、ポリ（Ｃ）、ポリ（ＡＧ）、ポリ（ＡＣ）、ポリ（ＧＴ）、ポリ（ＣＴ）、ポリ（ＡＴ）、ポリ（ＧＣ）、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、およびペンタヌクレオチドからなる群から選択される配列を含み、低複雑性ヌクレオチド配列が、前記突出の末端位置にある、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記低複雑性配列が、前記処理された核酸分子の内部に位置するか、または前記処理された核酸分子の末端に位置する、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記プローブが、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドである、項目１～１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記ＰＣＲ混合物を精製して、未使用の第１のプライマーおよび第２のプライマーを除去するステップが、固相可逆的固定化により実施される、項目１～１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記リガーゼが、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ＤＮＡリガーゼ、ＥｓｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ、９°Ｎリガーゼ、およびＰｆｕＤＮＡリガーゼからなる群から選択される、項目１～１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記プローブが、一本鎖ＤＮＡを含む、項目１～１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記プローブが、一本鎖ＤＮＡを含み、ヘアピン構造を形成する、項目１～１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記プローブが、少なくとも部分的に二本鎖のＤＮＡを含む、項目１～１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記プローブが、５’ホスフェート、３’ヒドロキシル基、または５’ホスフェートおよび３’ヒドロキシル基の両方を含む、項目１～１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記プローブが、３’末端にＣ３スペーサーまたは３’ホスフェートをさらに含む、項目１～１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
各処理された核酸分子が、５’突出を含み、前記５’突出が、８～５０塩基を含む、項目１～２および５～１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
各処理された核酸分子が、３’突出を含み、前記３’突出が、８～５０塩基を含む、項目１～２および１６～１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
各処理された核酸分子が、５’突出を含み、前記プローブの少なくとも一部分が、前記５’突出の少なくとも一部分に相補的である、項目１～２および５～１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
各処理された核酸分子が、３’突出を含み、前記プローブの少なくとも一部分が、前記３’突出の少なくとも一部分に相補的である、項目１～２および１６～１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
配列決定アッセイでその後使用するために、標的分量の機能的ＮＧＳライブラリーを、開始分量の非機能的ＮＧＳライブラリーから得る方法であって、
前記開始分量の前記非機能的ＮＧＳライブラリーを含む試料を提供するステップであって、前記非機能的ＮＧＳライブラリーが核酸ライブラリー分子を含み、各核酸ライブラリー分子が、少なくとも部分的に二本鎖であり、ＮＧＳアダプターが機能的であるために必要な、完全なＮＧＳアダプター配列の一部分を欠如する短縮ＮＧＳアダプター配列を含む、ステップ、
リガーゼおよびプローブを前記試料に添加して第１の反応混合物を得るステップであって、前記プローブが、前記標的分量と等しい量で添加され、前記プローブが、前記ＮＧＳアダプターが機能的であるために必要な、前記ＮＧＳアダプター配列の前記一部分を含むポリヌクレオチド配列を含む、ステップ、
前記第１の反応混合物を、前記プローブと前記非機能的ＮＧＳライブラリーの一部分とのライゲーションを可能にするのに十分な条件下でインキュベートするステップであって、前記プローブとライゲートした前記非機能的ＮＧＳライブラリーの前記一部分が前記標的分量であり、それにより前記標的分量の前記機能的ＮＧＳライブラリーを産出する、ステップ
を含む方法。
（項目４５）
開始分量の処理された核酸分子を含む試料を提供する前に、
（ｉ）複数の少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子であって、各少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子が第１の鎖および第２の鎖を含む核酸分子、
（ｉｉ）前記複数の核酸分子の各核酸分子の前記第１の鎖の標的部分に配列が相補的である第１の部分を含む第１のプライマー、
（ｉｉｉ）前記複数の核酸分子の各核酸分子の前記第２の鎖の標的部分に相補的な配列を含む第２のプライマー、
（ｉｖ）デオキシヌクレオチド、および
（ｖ）ＤＮＡポリメラーゼ
を含むＰＣＲ混合物を提供するステップと、
前記ＰＣＲ混合物を、前記ＤＮＡポリメラーゼが前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーの伸長を可能にし、それにより前記非機能的ＮＧＳライブラリーを産出するのに十分な条件下でインキュベートするステップと、
前記ＰＣＲ混合物を精製して、未使用の第１のプライマーおよび第２のプライマーを除去し、それにより、前記開始分量の前記非機能的ＮＧＳライブラリーを含む試料を得るステップと
をさらに含み、
前記第１のプライマーが、前記ＮＧＳアダプターが機能的であるために必要な、前記完全なＮＧＳアダプター配列の一部分を欠如する前記短縮ＮＧＳアダプター配列を含む、項目４４に記載の方法
（項目４６）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、平滑末端ＰＣＲ産物をもたらす３’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、単一塩基突出を有するＰＣＲ産物をもたらす３’アデニル化活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである、項目４５に記載の方法。
（項目４８）
前記第１のプライマーが、前記プライマーの３’末端に位置する、前記複数の核酸分子の各核酸分子の前記第１の鎖の標的部分に配列が相補的である第１の部分、前記第１の部分に５’隣接して位置する、３つまたはそれよりも多くの連続リボヌクレオチド塩基を含む第２の部分、および前記第２の部分に５’隣接して位置し、２つまたはそれよりも多くのデオキシヌクレオチドを含む第３の部分を含み、前記ＤＮＡポリメラーゼが、３’エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を有し、前記ＰＣＲ混合物をインキュベートした後で産出される前記処理された核酸分子が各々、前記第１のプライマーの前記第３の部分および前記３つまたはそれよりも多くの連続リボヌクレオチド塩基の少なくとも１つを含む５’突出を含む、項目４５に記載の方法。
（項目４９）
前記３つまたはそれよりも多くの連続リボヌクレオチド塩基が、ｒＵまたはｒＡ塩基を含む、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼＱ５である、項目４８に記載の方法。
（項目５１）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ＰＲＩＭＥＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅである、項目４８に記載の方法。
（項目５２）
前記第１プライマーが、前記プライマーの３’末端に位置する、前記複数の核酸分子の各核酸分子の前記第１の鎖の標的部分に配列が相補的な第１の部分、前記第１の部分に５’隣接して位置する、緩衝配列を含む第２の部分、および前記第２の部分に５’隣接して位置する、前記緩衝配列のヌクレオチドとは異なるヌクレオチドからなる尾部配列を含む第３の部分を含み、前記第２のプライマーが、前記プライマーの３’末端に位置する、前記複数の核酸分子の各核酸分子の前記第２の鎖の前記標的部分に配列が相補的な第４の部分、および前記第４の部分に５’隣接して位置する、前記緩衝配列と同じヌクレオチド組成を有する配列を含む第５の部分を含む、項目４５に記載の方法。
（項目５３）
前記ＰＣＲ混合物を精製して、未使用の第１のプライマーおよび第２のプライマーを除去した後に、
前記開始分量の処理された核酸分子を含む試料に、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、および前記緩衝配列の前記ヌクレオチドに相補的であるが、前記尾部配列の前記ヌクレオチドには相補的でないデオキシヌクレオチドを添加するステップと、
前記開始分量の処理された核酸分子、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、および前記緩衝配列の前記ヌクレオチドに相補的であるが、前記尾部配列の前記ヌクレオチドには相補的でないデオキシヌクレオチドを含む前記試料を、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ３’エキソヌクレアーゼ活性が、前記尾部配列をトリミングし、前記緩衝配列の位置に５’突出を産生することを可能にするのに十分な条件下でインキュベートするステップであって、前記Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼが、そのポリメラーゼ活性および前記相補的デオキシヌクレオチドの存在のため、前記緩衝配列を越える３’エキソヌクレアーゼ消化を防止する、ステップとをさらに含む、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記第１の反応混合物をインキュベートするステップが、前記開始分量の処理された核酸分子、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、および前記緩衝配列の前記ヌクレオチドに相補的であるが、前記尾部配列の前記ヌクレオチドには相補的でないデオキシヌクレオチドを含む前記試料をインキュベートするステップと同時に実施され、それにより、前記処理された核酸分子の５’突出の生成、および前記プローブと前記処理された核酸分子とのライゲーションを可能にする、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記プローブが、前記緩衝配列と同じデオキシヌクレオチドからなる３’末端緩衝配列を含み、それにより前記プローブに、前記Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの３’エキソヌクレアーゼ活性に対する耐性を提供する、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記緩衝配列が、ホモポリマー、ジヌクレオチド、またはトリヌクレオチド反復配列を含む、項目５２に記載の方法。
（項目５７）
前記緩衝配列および前記第２のプライマーの前記第５の部分が、５～１０塩基の長さである、項目５２に記載の方法。
（項目５８）
前記尾部配列が、１０～２０塩基の長さである、項目５２に記載の方法。
（項目５９）
前記ＰＣＲ混合物をインキュベートした後に、
ヌクレアーゼを前記ＰＣＲ混合物に添加するステップと、
前記ヌクレアーゼおよび前記ＰＣＲ混合物を、前記ヌクレアーゼが、前記処理された核酸分子の塩基を切断して３’突出を産出するのに十分な条件下でインキュベートするステップと
をさらに含み、
前記第１のプライマーが、切断可能な塩基をさらに含む、項目４５に記載の方法。
（項目６０）
前記切断可能な塩基が、デオキシウリジン、リボヌクレオチド、イノシン、およびそれらの組合せからなる群から選択され、前記ヌクレアーゼが、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、ＲＮａｓｅ、およびエンドヌクレアーゼＶからなる群から選択される、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記ＰＣＲ混合物をインキュベートした後に、
５’エキソヌクレアーゼを前記ＰＣＲ混合物に添加するステップと、
前記５’エキソヌクレアーゼおよび前記ＰＣＲ混合物を、各処理された核酸分子の一部分を消化して３’突出を産出するのに十分な条件下でインキュベートするステップと
をさらに含み、
前記第１のプライマーが、５’エキソヌクレアーゼ耐性修飾をさらに含む、項目４５に記載の方法。
（項目６２）
各核酸ライブラリー分子が、第２の末端の反対側の第１の末端に完全なＮＧＳアダプター配列をさらに含み、前記短縮ＮＧＳアダプター配列が、前記第２の末端に位置する、項目４４～６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
前記プローブが、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾を含む、項目４４～６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
前記処理された核酸分子とのプローブライゲーションが、平滑末端ライゲーションであり、前記処理された核酸分子の各々が平滑末端を含み、前記プローブが、前記処理された核酸分子の各々の前記平滑末端と適合性の平滑末端を含む、項目４４～４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
各処理された核酸分子が５’突出を含み、前記処理された核酸分子とのプローブライゲーションが、付着末端ライゲーションである、項目４４～４５および４８～５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６６）
各処理された核酸分子が３’突出を含み、前記処理された核酸分子とのプローブライゲーションが、付着末端ライゲーションである、項目４４～４５および５９～６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６７）
各処理された核酸分子が、低複雑性配列を含み、前記プローブが、前記低複雑性配列に相補的な配列を含み、複雑なヌクレオチド配列のハイブリダイゼーション速度と比較して、低プローブ濃度での、前記処理された核酸分子との前記プローブのハイブリダイゼーション速度の増加を提供する、項目４４～４５および４８～６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６８）
前記低複雑性配列が、ポリ（Ａ）、ポリ（Ｔ）、ポリ（Ｇ）、ポリ（Ｃ）、ポリ（ＡＧ）、ポリ（ＡＣ）、ポリ（ＧＴ）、ポリ（ＣＴ）、ポリ（ＡＴ）、ポリ（ＧＣ）、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、およびペンタヌクレオチドからなる群から選択される配列を含み、低複雑性ヌクレオチド配列が、前記突出の末端位置にある、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
前記低複雑性配列が、前記処理された核酸分子の内部に位置するか、または前記処理された核酸分子の末端に位置する、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
前記プローブが、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドである、項目４４～６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目７１）
前記ＰＣＲ混合物を精製して、未使用の第１のプライマーおよび第２のプライマーを除去するステップが、固相可逆的固定化により実施される、項目４４～６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目７２）
前記リガーゼが、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ＤＮＡリガーゼ、ＥｓｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ、９°Ｎリガーゼ、およびＰｆｕＤＮＡリガーゼからなる群から選択される、項目４４～６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目７３）
前記プローブが、一本鎖ＤＮＡを含む、項目４４～６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目７４）
前記プローブが、一本鎖ＤＮＡを含み、ヘアピン構造を形成する、項目４４～６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目７５）
前記プローブが、少なくとも部分的に二本鎖のＤＮＡを含む、項目４４～６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目７６）
前記プローブが、５’ホスフェート、３’ヒドロキシル基、または５’ホスフェートおよび３’ヒドロキシル基の両方を含む、項目４４～６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目７７）
前記プローブが、３’末端にＣ３スペーサーまたは３’ホスフェートをさらに含む、項目４４～６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目７８）
各処理された核酸分子が、５’突出を含み、前記５’突出が、８～５０塩基を含む、項目４４～４５および４８～６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目７９）
各処理された核酸分子が、３’突出を含み、前記３’突出が、８～５０塩基を含む、項目４４～４５および５９～６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目８０）
各処理された核酸分子が、５’突出を含み、前記プローブの少なくとも一部分が、前記５’突出の少なくとも一部分に相補的である、項目４４～４５および４８～６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目８１）
各処理された核酸分子が、３’突出を含み、前記プローブの少なくとも一部分が、前記３’突出の少なくとも一部分に相補的である、項目４４～４５および５９～６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目８２）
配列決定アッセイでその後使用するために、標的分量の機能的ＮＧＳライブラリーを、開始分量の非機能的ＮＧＳライブラリーから得る方法であって、
前記開始分量の前記非機能的ＮＧＳライブラリーを含む試料を提供するステップであって、前記非機能的ＮＧＳライブラリーが核酸分子を含み、各核酸ライブラリー分子が、少なくとも部分的に二本鎖であり、ＮＧＳアダプターが機能的であるために必要な、完全なＮＧＳアダプター配列の一部分を欠如する短縮ＮＧＳアダプター配列を含み、前記短縮ＮＧＳアダプター配列の３つまたはそれよりも多くの連続塩基が、対応するリボヌクレオチド塩基により置換され、前記３つまたはそれよりも多くの連続塩基が、前記短縮ＮＧＳアダプター配列の５’末端にない、ステップ、
リガーゼおよびプローブを前記試料に添加して第１の反応混合物を得るステップであって、前記プローブが、前記標的分量と等しい量で添加され、前記プローブが、前記ＮＧＳアダプターが機能的であるために必要な、前記ＮＧＳアダプター配列の前記一部分を含むポリヌクレオチド配列を含む、ステップ、
前記第１の反応混合物を、前記プローブと前記非機能的ＮＧＳライブラリーの一部分とのライゲーションを可能にするのに十分な条件下でインキュベートするステップであって、前記非機能的ＮＧＳライブラリーの前記一部分が前記標的分量であり、それにより前記標的分量の前記機能的ＮＧＳライブラリーを産出する、ステップ
を含む方法。
（項目８３）
３つまたはそれよりも多くの連続リボヌクレオチド塩基が、ｒＵまたはｒＡ塩基を含む、項目８２に記載の方法。
（項目８４）
前記核酸ライブラリー分子が、少なくとも１つの突出を含み、前記第１の反応混合物をインキュベートするステップが、前記プローブの少なくとも一部分と前記突出とのアニーリングを可能にするのに十分な条件下で実施される、項目８２～８４のいずれか一項に記載の方法。
（項目８５）
前記突出が５’突出である、項目８４に記載の方法。
（項目８６）
前記突出が３’突出である、項目８４に記載の方法。
（項目８７）
前記突出が、ポリ（Ａ）、ポリ（Ｔ）、ポリ（Ｇ）、ポリ（Ｃ）、ポリ（ＡＧ）、ポリ（ＡＣ）、ポリ（ＧＴ）、ポリ（ＣＴ）、ポリ（ＡＴ）、ポリ（ＧＣ）、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、およびペンタヌクレオチドからなる群から選択される低複雑性ヌクレオチド配列をさらに含み、前記低複雑性ヌクレオチド配列が、前記突出の末端位置にある、項目８２に記載の方法。
（項目８８）
前記突出が５’突出である、項目８７に記載の方法。
（項目８９）
前記突出が３’突出である、項目８７に記載の方法。
（項目９０）
前記プローブが、前記ＮＧＳアダプターが機能的であるために必要な、前記ＮＧＳアダプター配列の前記一部分の３’に位置する、前記低複雑性ヌクレオチド配列の少なくとも一部分に相補的な配列をさらに含む、項目８８に記載の方法。
（項目９１）
前記プローブが、前記ＮＧＳアダプターが機能的であるために必要な、前記ＮＧＳアダプター配列の前記一部分の３’に位置する、前記低複雑性ヌクレオチド配列に相補的な配列を含む、項目９０に記載の方法。
（項目９２）
前記プローブが、前記ＮＧＳアダプターが機能的であるために必要な、前記ＮＧＳアダプター配列の前記一部分の５’に位置する、前記低複雑性ヌクレオチド配列の少なくとも一部分に相補的な配列をさらに含む、項目８９に記載の方法。
（項目９３）
前記プローブが、前記ＮＧＳアダプターが機能的であるために必要な、前記ＮＧＳアダプター配列の前記一部分の５’に位置する、前記低複雑性ヌクレオチド配列に相補的な配列を含む、項目９２に記載の方法。
（項目９４）
低複雑性配列が、ポリ（Ａ）を含む、項目８７～９３のいずれか一項に記載の方法。
（項目９５）
低複雑性配列が、ポリ（Ｔ）を含む、項目８７～９３のいずれか一項に記載の方法。
（項目９６）
前記突出が、８～５０塩基を含む、項目８４～９５のいずれか一項に記載の方法。
（項目９７）
前記リガーゼが、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ＤＮＡリガーゼ、ＥｓｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ、９°Ｎリガーゼ、およびＰｆｕＤＮＡリガーゼからなる群から選択される、項目８２～９６のいずれか一項に記載の方法。
（項目９８）
前記プローブが、一本鎖ＤＮＡを含む、項目８２～９７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９９）
前記プローブが、ヘアピン構造を形成する、項目８２～９８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１００）
前記プローブが、突出を含む二本鎖ＤＮＡを含む、項目８２～９７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０１）
前記プローブが、５’ホスフェート、３’ヒドロキシル基、または５’ホスフェートおよび３’ヒドロキシル基の両方を含む、項目８２～１００のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０２）
前記プローブが、３’末端にＣ３スペーサーまたは３’ホスフェートをさらに含む、項目８２～１０１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０３）
前記プローブが、前記核酸ライブラリー分子の前記突出よりも長い、項目８４～１０２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０４）
配列決定アッセイで後に使用するために、標的分量の処理された核酸分子を開始分量から得る方法であって、
前記開始分量の処理された核酸分子を含む試料を提供するステップであって、前記処理された核酸分子の各々が、少なくとも部分的に二本鎖であり、前記開始分量が、前記標的分量よりも大きい、ステップ、
リガーゼおよびプローブを前記試料に添加して、第１の反応混合物を得、前記プローブが、前記標的分量と等しい量で添加され、前記プローブが、突出配列の少なくとも一部分とハイブリダイズするのに十分に相補的であるポリヌクレオチド配列を含み、前記プローブが、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾を含む、ステップ、
前記第１の反応混合物を、前記プローブと前記突出配列とのアニーリングを可能にして、前記プローブと前記処理された核酸分子の一部分とのライゲーションを可能にするのに十分な条件下でインキュベートするステップであって、プローブにライゲートされた前記処理された核酸分子の前記一部分が、前記標的分量の処理された核酸分子である、ステップ、
前記反応混合物を前記プローブおよび前記リガーゼと共にインキュベートした後、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を、前記第１の反応混合物に添加して第２の反応混合物を得るステップ、
前記第２の反応混合物を、前記プローブにライゲートされていない前記処理された核酸分子の消化を可能にし、それにより前記標的分量の処理された核酸分子を産出するのに十分な条件下でインキュベートするステップ
を含む方法。
（項目１０５）
前記開始分量の処理された核酸分子を含む前記試料を提供する前に、
（ｉ）複数の少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子であって、各少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子が第１の鎖および第２の鎖を含む核酸分子、
（ｉｉ）前記複数の核酸分子の各核酸分子の前記第１の鎖の標的部分に配列が相補的である第１の部分を含む第１のプライマー、
（ｉｉｉ）前記複数の核酸分子の各核酸分子の前記第２の鎖の標的部分に相補的な配列を含む第２のプライマー、
（ｉｖ）デオキシヌクレオチド、ならびに
（ｖ）ＤＮＡポリメラーゼ
を含むＰＣＲ混合物を提供するステップと、
前記ＰＣＲ混合物を、前記ＤＮＡポリメラーゼが前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーの伸長を可能にし、それにより前記処理された核酸分子を産出するのに十分な条件下でインキュベートするステップと、
前記ＰＣＲ混合物を精製して、未使用の第１のプライマーおよび第２のプライマーを除去し、それにより、前記開始分量の処理された核酸分子を含む試料を得るステップと
をさらに含む、項目１０４に記載の方法。
（項目１０６）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、平滑末端ＰＣＲ産物をもたらす３’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである、項目１０５に記載の方法。
（項目１０７）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、単一塩基突出を有するＰＣＲ産物をもたらす３’アデニル化活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである、項目１０５に記載の方法。
（項目１０８）
前記第１のプライマーが、前記プライマーの３’末端に位置する、前記複数の核酸分子の各核酸分子の前記第１の鎖の標的部分に配列が相補的である第１の部分、前記第１の部分に５’隣接して位置する、３つまたはそれよりも多くの連続リボヌクレオチド塩基を含む第２の部分、および前記第２の部分に５’隣接して位置し、２つまたはそれよりも多くのデオキシヌクレオチドを含む第３の部分を含み、前記ＤＮＡポリメラーゼが、３’エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を有し、前記ＰＣＲ混合物をインキュベートした後で産出される前記処理された核酸分子が各々、前記第１のプライマーの前記第３の部分および前記３つまたはそれよりも多くの連続リボヌクレオチド塩基の少なくとも１つを含む５’突出を含む、項目１０５に記載の方法。
（項目１０９）
前記３つまたはそれよりも多くの連続リボヌクレオチド塩基が、ｒＵまたはｒＡ塩基を含む、項目１０８に記載の方法。
（項目１１０）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼＱ５である、項目１０８に記載の方法。
（項目１１１）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ＰＲＩＭＥＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅである、項目１０８に記載の方法。
（項目１１２）
前記第１プライマーが、前記プライマーの３’末端に位置する、前記複数の核酸分子の各核酸分子の前記第１の鎖の標的部分に配列が相補的な第１の部分、前記第１の部分に５’隣接して位置する、緩衝配列を含む第２の部分、および前記第２の部分に５’隣接して位置する、前記緩衝配列のヌクレオチドとは異なるヌクレオチドからなる尾部配列を含む第３の部分を含み、前記第２のプライマーが、前記プライマーの３’末端に位置する、前記複数の核酸分子の各核酸分子の前記第２の鎖の前記標的部分に配列が相補的な第４の部分、および前記第４の部分に５’隣接して位置する、前記緩衝配列と同じヌクレオチド組成を有する配列を含む第５の部分を含む、項目１０５に記載の方法。
（項目１１３）
前記ＰＣＲ混合物を精製して、未使用の第１のプライマーおよび第２のプライマーを除去した後に、
前記開始分量の処理された核酸分子を含む前記試料に、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、および前記緩衝配列の前記ヌクレオチドに相補的であるが、前記尾部配列の前記ヌクレオチドには相補的でないデオキシヌクレオチドを添加するステップ、
前記開始分量の処理された核酸分子、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、および前記緩衝配列の前記ヌクレオチドに相補的であるが、前記尾部配列の前記ヌクレオチドには相補的でないデオキシヌクレオチドを含む前記試料を、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ３’エキソヌクレアーゼ活性が、前記尾部配列をトリミングし、前記緩衝配列の位置に５’突出を産生することを可能にするのに十分な条件下でインキュベートするステップであって、前記Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼが、そのポリメラーゼ活性および前記相補的デオキシヌクレオチドの存在のため、前記緩衝配列を越える３’エキソヌクレアーゼ消化を防止するステップ
をさらに含む、項目１１２に記載の方法。
（項目１１４）
前記第１の反応混合物をインキュベートするステップが、前記開始分量の処理された核酸分子、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、および前記緩衝配列の前記ヌクレオチドに相補的であるが、前記尾部配列の前記ヌクレオチドには相補的でないデオキシヌクレオチドを含む前記試料をインキュベートするステップと同時に実施され、それにより、前記処理された核酸分子の５’突出の生成、および前記プローブと前記処理された核酸分子とのライゲーションを可能にする、項目１１３に記載の方法。
（項目１１５）
前記プローブが、前記緩衝配列と同じデオキシヌクレオチドからなる３’末端緩衝配列を含み、それにより前記プローブに、前記Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの３’エキソヌクレアーゼ活性に対する耐性を提供する、項目１１４に記載の方法。
（項目１１６）
前記緩衝配列が、ホモポリマー、ジヌクレオチド、またはトリヌクレオチド反復配列を含む、項目１１２に記載の方法。
（項目１１７）
前記緩衝配列および前記第２のプライマーの前記第５の部分が、５～１０塩基の長さである、項目１１２に記載の方法。
（項目１１８）
前記尾部配列が、１０～２０塩基の長さである、項目１１２に記載の方法。
（項目１１９）
前記ＰＣＲ混合物をインキュベートした後に、
ヌクレアーゼを前記ＰＣＲ混合物に添加するステップと、
前記ヌクレアーゼおよび前記ＰＣＲ混合物を、前記ヌクレアーゼが、前記処理された核酸分子の塩基を切断して３’突出を産出するのに十分な条件下でインキュベートするステップと
をさらに含み、
前記第１のプライマーが、切断可能な塩基をさらに含む、項目１０５に記載の方法。
（項目１２０）
前記切断可能な塩基が、デオキシウリジン、リボヌクレオチド、イノシン、およびそれらの組合せからなる群から選択され、前記ヌクレアーゼが、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、ＲＮａｓｅ、およびエンドヌクレアーゼＶからなる群から選択される、項目１１９に記載の方法。
（項目１２１）
前記ＰＣＲ混合物をインキュベートした後に、
５’エキソヌクレアーゼを前記ＰＣＲ混合物に添加するステップと、
前記５’ヌクレアーゼおよび前記ＰＣＲ混合物を、各処理された核酸分子の一部分を消化して３’突出を産出するのに十分な条件下でインキュベートするステップと
をさらに含み、
前記第１のプライマーが、５’エキソヌクレアーゼ耐性修飾をさらに含む、項目１０５に記載の方法。
（項目１２２）
前記処理された核酸分子が、次世代配列決定（ＮＧＳ）ライブラリーである、項目１０４～１２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２３）
前記処理された核酸分子の各々が、前記分子の第１の末端に第１のアダプター配列、および前記第１の末端の反対側の第２の末端に第２のアダプター配列を含み、前記第１のアダプター配列および前記第２のアダプター配列が、同じであるかまたは異なる、項目１２２に記載の方法。
（項目１２４）
前記第１のアダプター配列が、第１の次世代配列決定アダプターであり、第２のアダプターが、第２の次世代配列決定アダプターである、項目１２３に記載の方法。
（項目１２５）
前記プローブが、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾を含む、項目１０４～１２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２６）
前記エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾が、３つまたはそれよりも多くの連続ホスホロチオエート連結を含む、項目１２５に記載の方法。
（項目１２７）
前記第１の反応混合物をインキュベートした後に、
エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を前記第１の反応混合物に添加して、第２の反応混合物を得るステップと、
前記第２の反応混合物を、前記プローブにライゲートされていない前記処理された核酸分子の消化を可能にし、それにより、選択された標的分量の処理された核酸分子を単離するのに十分な条件下でインキュベートするステップと
をさらに含む、項目１２５に記載の方法。
（項目１２８）
前記処理された核酸分子とのプローブライゲーションが、平滑末端ライゲーションであり、前記処理された核酸分子の各々が平滑末端を含み、前記プローブが、前記処理された核酸分子の各々の前記平滑末端と適合性の平滑末端を含む、項目１０４～１０６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２９）
各処理された核酸分子が５’突出を含み、前記処理された核酸分子とのプローブライゲーションが、付着末端ライゲーションである、項目１０４～１０５および１０８～１１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３０）
各処理された核酸分子が３’突出を含み、前記処理された核酸分子とのプローブライゲーションが、付着末端ライゲーションである、項目１０４～１０５および１１９～１２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３１）
各処理された核酸分子が、低複雑性配列を含み、前記プローブが、前記低複雑性配列に相補的な配列を含み、複雑なヌクレオチド配列のハイブリダイゼーション速度と比較して、低プローブ濃度での、前記処理された核酸分子との前記プローブのハイブリダイゼーション速度の増加を提供する、項目１０４～１０５および１１８～１２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３２）
前記低複雑性配列が、ポリ（Ａ）、ポリ（Ｔ）、ポリ（Ｇ）、ポリ（Ｃ）、ポリ（ＡＧ）、ポリ（ＡＣ）、ポリ（ＧＴ）、ポリ（ＣＴ）、ポリ（ＡＴ）、ポリ（ＧＣ）、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、およびペンタヌクレオチドからなる群から選択される配列を含み、低複雑性ヌクレオチド配列が、前記突出の末端位置にある、項目１３１に記載の方法。
（項目１３３）
前記低複雑性配列が、前記処理された核酸分子の内部に位置するか、または前記処理された核酸分子の末端に位置する、項目１３２に記載の方法。
（項目１３４）
前記プローブが、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドである、項目１０４～１２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３５）
前記ＰＣＲ混合物を精製して、未使用の第１のプライマーおよび第２のプライマーを除去するステップが、固相可逆的固定化により実施される、項目１０４～１２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３６）
前記リガーゼが、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ＤＮＡリガーゼ、ＥｓｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ、９°Ｎリガーゼ、およびＰｆｕＤＮＡリガーゼからなる群から選択される、項目１０４～１２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３７）
前記プローブが、一本鎖ＤＮＡを含む、項目１０４～１２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３８）
前記プローブが、一本鎖ＤＮＡを含み、ヘアピン構造を形成する、項目１０４～１２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３９）
前記プローブが、少なくとも部分的に二本鎖のＤＮＡを含む、項目１０４～１２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４０）
前記プローブが、５’ホスフェート、３’ヒドロキシル基、または５’ホスフェートおよび３’ヒドロキシル基の両方を含む、項目１０４～１２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４１）
前記プローブが、３’末端にＣ３スペーサーまたは３’ホスフェートをさらに含む、項目１０４～１２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４２）
各処理された核酸分子が、５’突出を含み、前記５’突出が、８～５０塩基を含む、項目１０４～１０５および１０８～１１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４３）
各処理された核酸分子が、３’突出を含み、前記３’突出が、８～５０塩基を含む、項目１０４～１０５および１１９～１２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４４）
各処理された核酸分子が、５’突出を含み、前記プローブの少なくとも一部分が、前記５’突出の少なくとも一部分に相補的である、項目１０４～１０５および１０８～１１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４５）
各処理された核酸分子が、３’突出を含み、前記プローブの少なくとも一部分が、前記３’突出の少なくとも一部分に相補的である、項目１０４～１０５および１１９～１２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４６）
前記エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾が、前記プローブの５’末端に位置する、項目１０４～１４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４７）
前記エキソヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、およびエキソヌクレアーゼＩからなる群から選択される、項目１０４～１４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４８）
前記反応混合物を前記プローブおよび前記リガーゼと共にインキュベートした後、アピラーゼジホスファターゼを、前記エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素と共に前記第１の反応混合物に添加して第２の反応混合物を得るステップをさらに含み、前記エキソヌクレアーゼが、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼである、項目１４７に記載の方法。
（項目１４９）
前記プローブが、前記突出よりも長い、項目１０４～１４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５０）
標的分量の増幅された核酸分子を産生する方法であって、
（ｉ）標的分量の増幅された核酸分子を選択するステップ、
（ｉｉ）複数の核酸分子を含む試料を提供するステップであって、前記複数の核酸分子の各核酸分子が、前記核酸分子の第１の末端に第１のアダプター配列、および前記第１の末端の反対側に位置する前記核酸分子の第２の末端に第２のアダプター配列を含む、ステップ、
（ｉｉｉ）デオキシヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、標的分量の第１のプライマーおよび標的分量の第２のプライマーを前記試料に添加して、第１のＰＣＲ反応混合物を得るステップであって、前記第１のプライマーが、前記第１のアダプター配列の少なくとも第１の部分に相補的な第１の低複雑性ヌクレオチド配列を含む第１の５’末端ドメイン、および前記第１の部分の５’に位置する、前記第１のアダプター配列の少なくとも第２の部分に相補的な第１の３’末端ドメインを含み、前記第２のプライマーが、前記第２のアダプター配列の少なくとも第３の部分に相補的な第２の低複雑性ヌクレオチド配列を含む第２の５’末端ドメイン、および前記第３の部分の５’に位置する、前記第２のアダプター配列の少なくとも第４の部分に相補的な第２の３’末端ドメインを含み、前記第１の低複雑性ヌクレオチド配列および前記第２の低複雑性ヌクレオチド配列が、同じではなく、相補的でない、ステップ、
（ｉｖ）前記第１のＰＣＲ反応混合物を、前記ＤＮＡポリメラーゼが前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーの伸長を可能にし、それにより前記標的分量の増幅された核酸分子を産出するのに十分な条件下で、前記プライマーが利用されるまでインキュベートするステップ
を含み、
前記低複雑性ヌクレオチド配列が、ホモポリマー配列、ジヌクレオチド配列、反復ジヌクレオチドエレメント、トリヌクレオチド配列、反復トリヌクレオチドエレメント、テトラヌクレオチド反復配列エレメント、およびペンタヌクレオチド反復配列エレメントからなる群から選択される、方法。
（項目１５１）
前記第１の５’末端ドメインおよび前記第２の５’末端ドメインが、約８から１００ヌクレオチドまでの長さである、項目１５０に記載の方法。
（項目１５２）
前記第１の５’末端ドメインおよび前記第２の５’末端ドメインが、約８から９０ヌクレオチドまでの長さである、項目１５１に記載の方法。
（項目１５３）
前記第１の５’末端ドメインおよび前記第２の５’末端ドメインが、約８から８０ヌクレオチドまでの長さである、項目１５２に記載の方法。
（項目１５４）
前記第１の５’末端ドメインおよび前記第２の５’末端ドメインが、約８から７０ヌクレオチドまでの長さである、項目１５３に記載の方法。
（項目１５５）
前記第１の５’末端ドメインおよび前記第２の５’末端ドメインが、約８から６０ヌクレオチドまでの長さである、項目１５４に記載の方法。
（項目１５６）
前記第１の５’末端ドメインおよび前記第２の５’末端ドメインが、約８から５０ヌクレオチドまでの長さである、項目１５５に記載の方法。
（項目１５７）
前記第１の５’末端ドメインおよび前記第２の５’末端ドメインが、約８から４０ヌクレオチドまでの長さである、項目１５６に記載の方法。
（項目１５８）
前記第１の５’末端ドメインおよび前記第２の５’末端ドメインが、約８から３０ヌクレオチドまでの長さである、項目１５７に記載の方法。
（項目１５９）
前記第１の５’末端ドメインおよび前記第２の５’末端ドメインが、約８から２０ヌクレオチドまでの長さである、項目１５８に記載の方法。
（項目１６０）
前記第１の５’末端ドメインおよび／または前記第２の５’末端ドメインが、デオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、ロックド核酸、またはそれらの組合せを含む、項目１５０～１５９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６１）
前記第１のアダプター配列が、Ｐ５配列を含むＩｌｌｕｍｉｎａアダプターである、項目１５０～１６０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６２）
前記第２のアダプター配列が、Ｐ７配列を含むＩｌｌｕｍｉｎａアダプターである、項目１５０～１６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６３）
前記第１のプライマーが、前記第１のプライマーの５’末端に第１のフルオロフォアを含む、項目１５０～１６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６４）
前記第１の反応混合物をインキュベートした後に、
（ｖ）前記第１のフルオロフォアに対応する波長で、前記インキュベートされた第１の反応混合物の蛍光強度を測定して、第１の蛍光シグナル（Ｆ１）を得るステップ、
（ｖｉ）前記第１のプライマーの少なくとも一部分に相補的な過剰分量のクエンチングオリゴヌクレオチドを、前記インキュベートされた第１の反応混合物に添加して、クエンチされた混合物を得るステップ、
（ｖｉｉ）前記第１のフルオロフォアに対応する前記波長で、前記クエンチされた混合物の蛍光強度を測定して、第２の蛍光シグナル（Ｆ２）を得るステップ
をさらに含み、
Ｆ２がＦ１未満である場合、ステップ（ｉｖ）を繰り返す、項目１６３に記載の方法。
（項目１６５）
前記第２のプライマーが、前記第２のプライマーの５’末端に前記第１のフルオロフォアを含む、項目１６４に記載の方法。
（項目１６６）
前記ＤＮＡポリメラーゼが前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーを伸長するのを可能にし、それにより前記標的分量の増幅された核酸分子を産出するのに十分な条件が、その後のＰＣＲサイクルでのアニーリング期間よりも長い、最初の２回のＰＣＲサイクルでのアニーリング期間を含む、項目１５０～１６５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６７）
前記最初の２回のＰＣＲサイクルでのアニーリング期間が、１分よりも長く、前記その後のＰＣＲサイクルでのアニーリング期間が１分またはそれ未満である、項目１５０～１６６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６８）
前記プライマーが、１００％利用される、項目１５０～１６７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６９）
前記プライマーが、９０％利用される、項目１５０～１６７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７０）
前記プライマーが、８０％利用される、項目１５０～１６７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７１）
前記プライマーが、７０％利用される、項目１５０～１６７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７２）
前記プライマーが、６０％利用される、項目１５０～１６７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７３）
前記プライマーが、５０％利用される、項目１５０～１６７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７４）
（ｉ）第１のＮＧＳアダプターが機能的であるために必要な、第１の次世代配列決定（ＮＧＳ）アダプター配列の一部分を含むポリヌクレオチド配列を含むプローブ、
（ｉｉ）前記プローブの前記第１のＮＧＳアダプター配列の前記一部分ではない、前記第１のＮＧＳアダプター配列の一部分を含む第１のプライマー、
（ｉｉｉ）第２のＮＧＳアダプター配列を含む第２のプライマー、
（ｉｖ）ポリメラーゼ、
（ｖ）デオキシヌクレオチド、および
（ｖｉ）リガーゼを含み、
前記第１のＮＧＳアダプター配列および前記第２のＮＧＳアダプター配列が、同じであるかまたは異なる、キット。
（項目１７５）
第２のデオキシヌクレオチド混合物をさらに含み、前記第１のプライマーが、尾部配列および緩衝配列をさらに含み、前記尾部配列のヌクレオチド組成および前記緩衝配列のヌクレオチド組成が異なり、前記第２のデオキシヌクレオチド混合物が、前記緩衝配列に相補的なヌクレオチドのみを含み、前記ポリメラーゼが、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼであり、前記プローブが、前記尾部配列の少なくとも一部分に相補的な配列をさらに含む、項目１７４に記載のキット。
（項目１７６）
前記第１のプライマーが、前記第１のプライマーの５’末端にない３つまたはそれよりも多くの連続リボヌクレオチド塩基をさらに含む、項目１７４に記載のキット。
（項目１７７）
ＲＮａｓｅ、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、またはエンドヌクレアーゼＶをさらに含み、前記第１のプライマーが、リボヌクレオチド、ウラシル、またはイノシンを含む切断可能な塩基をさらに含む、項目１７４に記載のキット。
（項目１７８）
５’エキソヌクレアーゼをさらに含み、前記第１のプライマーが、１つまたは複数のホスホロチオエート連結を含む、内部に配置されているヌクレアーゼ耐性修飾をさらに含む、項目１７４に記載のキット。
（項目１７９）
前記ポリメラーゼが、３’エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を有する熱安定性高フィデリティーポリメラーゼまたはＴａｑポリメラーゼである、項目１７４に記載のキット。
（項目１８０）
（ｉ）第１のＮＧＳアダプターが機能的であるために必要な、第１の次世代配列決定（ＮＧＳ）アダプター配列の一部分を含むポリヌクレオチド配列を含むプローブ、
（ｉｉ）前記プローブの前記第１のＮＧＳアダプター配列の前記一部分ではない前記第１のＮＧＳアダプター配列の一部分を含み、前記第１のＮＧＳアダプター配列の前記一部分の３つまたはそれよりも多くの連続塩基が、対応するリボヌクレオチド塩基により置換されている、第１のプライマー、
（ｉｉｉ）第２のＮＧＳアダプター配列を含む第２のプライマー、
（ｉｖ）３’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性高フィデリティーポリメラーゼ、
（ｖ）デオキシヌクレオチド、および
（ｖｉ）リガーゼを含み、
前記第１のＮＧＳアダプター配列および前記第２のＮＧＳアダプター配列が、同じであるかまたは異なる、キット。
（項目１８１）
前記第１のプライマーが、前記対応するリボヌクレオチド塩基により置換されている前記第１のＮＧＳアダプター配列の前記一部分の前記３つまたはそれよりも多くの連続塩基に対して５’に尾部配列をさらに含み、前記プローブが、前記尾部配列の少なくとも一部分に相補的な配列をさらに含む、項目１８０に記載のキット。
（項目１８２）
前記第１のプライマーが、ポリ（Ａ）、ポリ（Ｔ）、ポリ（Ｇ）、ポリ（Ｃ）、ポリ（ＡＧ）、ポリ（ＡＣ）、ポリ（ＧＴ）、ポリ（ＣＴ）、ポリ（ＡＴ）、ポリ（ＧＣ）、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、およびペンタヌクレオチドからなる群から選択される低複雑性配列をさらに含み、前記プローブが、前記低複雑性ヌクレオチド配列に相補的な配列を含む、項目１７４および１７６～１８１のいずれか一項に記載のキット。
（項目１８３）
前記低複雑性配列が、前記ＮＧＳアダプター配列の前記一部分の５’に位置し、第１のＮＧＳアダプターが機能的であるために必要な、第１の次世代配列決定（ＮＧＳ）アダプター配列の前記一部分が、前記低複雑性配列に相補的な前記配列の５’に位置する、項目１８２に記載のキット。
（項目１８４）
前記プローブが、８～５０塩基を含む、項目１７４～１８３のいずれか一項に記載のキット。
（項目１８５）
前記リガーゼが、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ＤＮＡリガーゼ、ＥｓｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ、９°Ｎリガーゼ、およびＰｆｕＤＮＡリガーゼからなる群から選択される、項目１７４～１８４のいずれか一項に記載のキット。
（項目１８６）
前記プローブが、５’ホスフェート、３’ヒドロキシル基、または５’ホスフェートおよび３’ヒドロキシル基の両方をさらに含む、項目１７４～１８５のいずれか一項に記載のキット。
（項目１８７）
前記プローブが、一本鎖ＤＮＡを含む、項目１７４～１８６のいずれか一項に記載のキット。
（項目１８８）
前記プローブが、ヘアピン構造を形成する、項目１７４～１８７のいずれか一項に記載のキット。
（項目１８９）
前記プローブが、少なくとも部分的に二本鎖である、項目１７４～１８６のいずれか一項に記載のキット。
（項目１９０）
前記プローブが、５’突出をさらに含む、項目１８９に記載のキット。
（項目１９１）
（ｉ）３’末端に第１の部分、前記第１の部分の５’に位置し、３つまたはそれよりも多くの連続リボヌクレオチドを含む第２の部分、および前記第２の部分の５’に位置し、２つまたはそれよりも多くのデオキシヌクレオチドを含む第３の部分を含む第１のプライマー、
（ｉｉ）デオキシヌクレオチド、
（ｉｉｉ）３’エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、
（ｉｖ）前記第１の部分ではない前記第１のプライマーの少なくとも一部分に相補的なポリヌクレオチド配列、および３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾を含むプローブ、
（ｖ）リガーゼ、
（ｖｉ）３’エキソヌクレアーゼ、ならびに任意選択で
（ｖｉｉ）エキソヌクレアーゼＩまたは固相可逆的固定化ビーズを含むキット。
（項目１９２）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼＱ５である、項目１９１に記載のキット。
（項目１９３）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ＰＲＩＭＥＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅである、項目１９１に記載のキット。
（項目１９４）
前記３つまたはそれよりも多くの連続リボヌクレオチドが、ｒＵまたはｒＡ塩基を含む、項目１９１～１９３のいずれか一項に記載のキット。
（項目１９５）
前記第１のプライマーの少なくとも一部分に相補的な前記ポリヌクレオチド配列が、ポリ（Ａ）、ポリ（Ｔ）、ポリ（Ｇ）、ポリ（Ｃ）、ポリ（ＡＧ）、ポリ（ＡＣ）、ポリ（ＧＴ）、ポリ（ＣＴ）、ポリ（ＡＴ）、ポリ（ＧＣ）、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、およびペンタヌクレオチドからなる群から選択される低複雑性配列である、項目１９１～１９４のいずれか一項に記載のキット。
（項目１９６）
前記プローブが、８～５０塩基を含む、項目１９１～１９５のいずれか一項に記載のキット。
（項目１９７）
前記第１のプライマーの前記第２の部分および前記第３の部分が合わせて８～５０塩基を含む、項目１９１～１９６のいずれか一項に記載のキット。
（項目１９８）
前記リガーゼが、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ＤＮＡリガーゼ、ＥｓｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ、９°Ｎリガーゼ、およびＰｆｕＤＮＡリガーゼからなる群から選択される、項目１９１～１９７のいずれか一項に記載のキット。
（項目１９９）
前記プローブが、５’ホスフェート、３’ヒドロキシル基、または５’ホスフェートおよび３’ヒドロキシル基の両方をさらに含む、項目１９１～１９８のいずれか一項に記載のキット。
（項目２００）
前記３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾が、３つまたはそれよりも多くのヌクレアーゼ耐性修飾を含む、項目１９１～１９９のいずれか一項に記載のキット。
（項目２０１）
前記３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾が、３つまたはそれよりも多くのホスホロチオエート連結を含む、項目２００に記載のキット。
（項目２０２）
前記３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾が、前記プローブの３’末端に位置する、項目１９１～２０１のいずれか一項に記載のキット。
（項目２０３）
前記３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾が、前記プローブの５’末端、前記プローブの３’末端または内部部分に位置する、項目１９１～２０１のいずれか一項に記載のキット。
（項目２０４）
前記エキソヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、およびエキソヌクレアーゼＩからなる群から選択される、項目１９１～２０３のいずれか一項に記載のキット。
（項目２０５）
前記プローブが、一本鎖ＤＮＡを含む、項目１９１～２０４のいずれか一項に記載のキット。
（項目２０６）
前記プローブが、ヘアピン構造を形成する、項目１９１～２０５のいずれか一項に記載のキット。
（項目２０７）
前記プローブが、少なくとも部分的に二本鎖である、項目１９１～２０４のいずれか一項に記載のキット。
（項目２０８）
前記プローブが、５’突出をさらに含む、項目２０７に記載のキット。
（項目２０９）
第２のプライマーをさらに含む、項目１９１～２０８のいずれか一項に記載のキット。
（項目２１０）
前記第２のプライマーが、第４の部分、前記第１のプライマーの前記第２の部分と同一である、前記第４の部分の５’に位置する第５の部分、および前記第１のプライマーの前記第３の部分と同一である、前記第５の部分の５’に位置する第６の部分を含む、項目２０９に記載のキット。
（項目２１１）
（ｉ）３’末端に第１の部分、前記第１の部分の５’に位置し、緩衝配列を含む第２の部分、および前記第２の部分の５’に位置し、前記緩衝配列のヌクレオチドとは異なるヌクレオチドからなる尾部配列を含む第３の部分を含む第１のプライマー、
（ｉｉ）前記緩衝配列の前記ヌクレオチドに相補的であり、前記尾部配列の前記ヌクレオチドには相補的でないデオキシヌクレオチド、
（ｉｉｉ）Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、
（ｉｖ）前記第１の部分ではない前記第１のプライマーの少なくとも一部分に相補的なポリヌクレオチド配列、および３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾を含むプローブ、
（ｖ）リガーゼ、
（ｖｉ）３’エキソヌクレアーゼ、
（ｖｉｉ）３’エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を有する熱安定性高フィデリティーポリメラーゼ、
（ｖｉｉｉ）デオキシヌクレオチド、ならびに任意選択で
（ｖｉｉ）エキソヌクレアーゼＩまたは固相可逆的固定化ビーズを含むキット。
（項目２１２）
前記尾部配列が、ポリ（Ａ）、ポリ（Ｔ）、ポリ（Ｇ）、ポリ（Ｃ）、ポリ（ＡＧ）、ポリ（ＡＣ）、ポリ（ＧＴ）、ポリ（ＣＴ）、ポリ（ＡＴ）、ポリ（ＧＣ）、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、およびペンタヌクレオチドからなる群から選択される低複雑性配列である、項目２１１に記載のキット。
（項目２１３）
前記緩衝配列が、ホモポリマー、ジヌクレオチド、またはトリヌクレオチド組成を含む、項目２１１～２１２のいずれか一項に記載のキット。
（項目２１４）
前記尾部配列が、１０～２０塩基の長さである、項目２１１～２１３のいずれか一項に記載のキット。
（項目２１５）
前記緩衝配列が、５～１０塩基の長さである、項目２１１～２１４のいずれか一項に記載のキット。
（項目２１６）
前記プローブが、８～５０塩基を含む、項目２１１～２１５のいずれか一項に記載のキット。
（項目２１７）
前記第１のプライマーの前記第２の部分および前記第３の部分が合わせて８～５０塩基を含む、項目２１１～２１６のいずれか一項に記載のキット。
（項目２１８）
前記リガーゼが、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ＤＮＡリガーゼ、ＥｓｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ、９°Ｎリガーゼ、およびＰｆｕＤＮＡリガーゼからなる群から選択される、項目２１１～２１７のいずれか一項に記載のキット。
（項目２１９）
前記プローブが、５’ホスフェート、３’ヒドロキシル基、または５’ホスフェートおよび３’ヒドロキシル基の両方をさらに含む、項目２１１～２１８のいずれか一項に記載のキット。
（項目２２０）
前記３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾が、３つまたはそれよりも多くのヌクレアーゼ耐性修飾を含む、項目２１１～２１９のいずれか一項に記載のキット。
（項目２２１）
前記３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾が、３つまたはそれよりも多くのホスホロチオエート連結を含む、項目２２０に記載のキット。
（項目２２２）
前記３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾が、前記プローブの３’末端、前記プローブの５’末端または内部部分に位置する、項目２１１～２２１のいずれか一項に記載のキット。
（項目２２３）
前記エキソヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、およびエキソヌクレアーゼＩからなる群から選択される、項目２１１～２２２のいずれか一項に記載のキット。
（項目２２４）
前記プローブが、一本鎖ＤＮＡを含む、項目２１１～２２３のいずれか一項に記載のキット。
（項目２２５）
前記プローブが、ヘアピン構造を形成する、項目２１１～２２４のいずれか一項に記載のキット。
（項目２２６）
前記プローブが、少なくとも部分的に二本鎖である、項目２１１～２２３のいずれか一項に記載のキット。
（項目２２７）
前記プローブが、５’突出をさらに含む、項目２２６に記載のキット。
（項目２２８）
第４の部分、前記第４の部分の５’に位置し、前記第１のプライマーの前記緩衝配列と同じヌクレオチド組成を有する配列を含む第５の部分を含む第２のプライマーをさらに含む、項目２１１～２２７のいずれか一項に記載のキット。
（項目２２９）
前記第２のプライマーが、前記第５の部分の５’に位置し、前記尾部配列と同一の配列を含む第６の部分をさらに含む、項目２２８に記載のキット。
（項目２３０）
前記第２のプライマーの前記第５の部分が、５～１０塩基の長さである、項目２２８～２２９のいずれか一項に記載のキット。
（項目２３１）
切断酵素をさらに含む、項目２１１～２３０のいずれか一項に記載のキット。
（項目２３２）
配列決定アッセイで後に使用するために、標的分量の処理された核酸分子を開始分量から得る方法であって、
前記開始分量の処理された核酸分子を含む試料を提供するステップであって、前記処理された核酸分子の各々が、少なくとも部分的に二本鎖であり、５’配列を含む５’突出を含み、前記開始分量が、前記標的分量よりも大きい、ステップ、
リガーゼおよびプローブを前記試料に添加して、第１の反応混合物を得るステップであって、前記プローブが、前記標的分量と等しい量で添加され、前記プローブが、前記５’配列の少なくとも一部分とハイブリダイズするのに十分に相補的であるポリヌクレオチド配列を含み、前記プローブが、３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾を含む、ステップ、
前記第１の反応混合物を、前記プローブと前記５’配列とのアニーリングを可能にして、前記プローブと前記処理された核酸分子の一部分とのライゲーションを可能にするのに十分な条件下でインキュベートするステップであって、前記処理された核酸分子の前記一部分が、前記標的分量の処理された核酸分子である、ステップ、
前記反応混合物を前記プローブおよび前記リガーゼと共にインキュベートした後、３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を、前記第１の反応混合物に添加して第２の反応混合物を得るステップ、
前記第２の反応混合物を、前記プローブにライゲートされていない前記処理された核酸分子の消化を可能にし、それにより前記標的分量の処理された核酸分子を産出するのに十分な条件下でインキュベートするステップ
を含む方法。
（項目２３３）
前記開始分量の処理された核酸分子を含む前記試料を提供する前に、
（ｉ）複数の少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子であって、各少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子が第１の鎖および第２の鎖を含む核酸分子、
（ｉｉ）第１のプライマーであって、前記プライマーの３’末端に位置する、前記複数の核酸分子の各核酸分子の第１の鎖の標的部分に配列が相補的な第１の部分、前記第１の部分に５’隣接して位置する、３つまたはそれよりも多くの連続リボヌクレオチド塩基を含む第２の部分、および前記第２の部分に５’隣接して位置し、２つまたはそれよりも多くのデオキシヌクレオチドを含む第３の部分を含む第１のプライマー、
（ｉｉｉ）前記複数の核酸分子の各核酸分子の前記第２の鎖の標的部分に相補的な配列を含む第２のプライマー、
（ｉｖ）デオキシヌクレオチド、ならびに
（ｖ）３’エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、
を含むＰＣＲ混合物を提供するステップ、
前記ＰＣＲ混合物を、前記ＤＮＡポリメラーゼが前記第１のプライマーおよび第２のプライマーの伸長を可能にし、それにより前記処理された核酸分子を産出するのに十分な条件下でインキュベートするステップ、；
前記ＰＣＲ混合物を精製して、未使用の第１のプライマーおよび第２のプライマーを除去し、それにより、前記開始分量の処理された核酸分子を含む前記試料を得るステップ
をさらに含む、項目２３２に記載の方法。
（項目２３４）
前記開始分量の処理された核酸分子を含む前記試料を提供する前に、
（ｉ）複数の少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子であって、各少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子が第１の鎖および第２の鎖を含む核酸分子、
（ｉｉ）第１のプライマーであって、前記プライマーの３’末端に位置する、前記複数の核酸分子の各核酸分子の第１の鎖の標的部分に配列が相補的な第１の部分、前記第１の部分に５’隣接して位置する、緩衝配列を含む第２の部分、および前記第２の部分に５’隣接して位置する、前記緩衝配列のヌクレオチドと異なるヌクレオチドからなる尾部配列を含む第３の部分を含む第１のプライマー、
（ｉｉｉ）第２のプライマーであって、前記プライマーの３’末端に位置する、前記複数の核酸分子の各核酸分子の前記第２の鎖の標的部分に配列が相補的な第４の部分、および前記第４の部分に５’隣接して位置する、前記緩衝配列と同じヌクレオチド組成を有する配列を含む第５の部分を含む第２のプライマー、
（ｉｖ）デオキシヌクレオチド、ならびに
（ｖ）ＤＮＡポリメラーゼ
を含むＰＣＲ混合物を提供するステップと、
前記ＰＣＲ混合物を、前記ＤＮＡポリメラーゼが前記第１のプライマーおよび第２のプライマーの伸長を可能にし、それにより前記処理された核酸分子を産出するのに十分な条件下でインキュベートするステップと、
前記ＰＣＲ混合物を精製して、未使用の第１のプライマーおよび第２のプライマーを除去し、それにより、前記開始分量の処理された核酸分子を含む前記試料を得るステップと、
前記開始分量の処理された核酸分子を含む前記試料に、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、および前記緩衝配列の前記ヌクレオチドに相補的であるが、前記尾部配列の前記ヌクレオチドには相補的でないデオキシヌクレオチドを添加するステップと、
前記ＰＣＲ混合物、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、および前記緩衝配列の前記ヌクレオチドに相補的であるが、前記尾部配列の前記ヌクレオチドには相補的でないデオキシヌクレオチドを、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ３’エキソヌクレアーゼ活性が、前記尾部配列をトリミングし、前記緩衝配列の位置に５’突出を産生することを可能にするのに十分な条件下でインキュベートするステップであって、前記Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼが、そのポリメラーゼ活性および前記相補的デオキシヌクレオチドの存在のため、前記緩衝配列を越える３’エキソヌクレアーゼ消化を防止する、ステップと
をさらに含む、項目２３２に記載の方法。
（項目２３５）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼＱ５である、項目２３３に記載の方法。
（項目２３６）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ＰＲＩＭＥＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅである、項目２３３に記載の方法。
（項目２３７）
前記ＰＣＲ混合物を精製して、未使用の第１のプライマーおよび第２のプライマーを除去するステップが、固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）により実施される、項目２３３に記載の方法。
（項目２３８）
前記ＰＣＲ混合物を精製して、未使用の第１のプライマーおよび第２のプライマーを除去するステップが、固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）により実施される、項目２３４に記載の方法。
（項目２３９）
前記緩衝配列が、ホモポリマー、ジヌクレオチド、またはトリヌクレオチド組成を含む、項目２３４に記載の方法。
（項目２４０）
前記緩衝配列および前記第２のプライマーの前記第５の部分が、５～１０塩基の長さである、項目２３８に記載の方法。
（項目２４１）
前記尾部配列が、１０～２０塩基の長さである、項目２３４および２３８～２４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４２）
前記処理された核酸分子が、次世代配列決定（ＮＧＳ）ライブラリーである、項目２３２～２４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４３）
前記処理された核酸分子の各々が、前記分子の第１の末端に第１のアダプター配列、および前記第１の末端の反対側の第２の末端に第２のアダプター配列を含み、前記第１のアダプター配列および前記第２のアダプター配列が、同じであるかまたは異なる、項目２４２に記載の方法。
（項目２４４）
前記５’突出が、前記５’突出の５’末端に位置していない３つまたはそれよりも多くの連続リボヌクレオチド塩基を含む、項目２３２～２３３および２３５～２３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４５）
前記処理された核酸分子が、次世代配列決定（ＮＧＳ）ライブラリーである、項目２４４に記載の方法。
（項目２４６）
前記処理された核酸分子の各々が、前記分子の第１の末端に第１のアダプター配列、および前記第１の末端の反対側の第２の末端に第２のアダプター配列を含み、前記第１のアダプター配列および前記第２のアダプター配列が、同じであるかまたは異なる、項目２４５に記載の方法。
（項目２４７）
前記３つまたはそれよりも多くの連続リボヌクレオチド塩基が、ｒＵまたはｒＡ塩基を含む、項目２４４～２４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４８）
前記５’配列が、ポリ（Ａ）、ポリ（Ｔ）、ポリ（Ｇ）、ポリ（Ｃ）、ポリ（ＡＧ）、ポリ（ＡＣ）、ポリ（ＧＴ）、ポリ（ＣＴ）、ポリ（ＡＴ）、ポリ（ＧＣ）、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、およびペンタヌクレオチドからなる群から選択される低複雑性配列をさらに含む、項目２３２～２４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４９）
前記５’配列が、８～５０塩基を含む、項目２３２～２４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５０）
前記リガーゼが、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ＤＮＡリガーゼ、ＥｓｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ、９°Ｎリガーゼ、およびＰｆｕＤＮＡリガーゼからなる群から選択される、項目２３２～２４９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５１）
前記プローブが、一本鎖ＤＮＡを含む、項目２３２～２５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５２）
前記プローブが、ヘアピン構造を形成する、項目２３２～２５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５３）
前記プローブが、５’突出を含む二本鎖ＤＮＡを含む、項目２３２～２５２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５４）
前記プローブの前記５’突出が、前記５’配列の少なくとも一部分に相補的である、項目２５３に記載の方法。
（項目２５５）
前記プローブが、５’ホスフェート、３’ヒドロキシル基、または５’ホスフェートおよび３’ヒドロキシル基の両方を含む、項目２３２～２５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５６）
前記３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾が、３つまたはそれよりも多くのヌクレアーゼ耐性修飾を含む、項目２３２～２５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５７）
前記３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾が、３つまたはそれよりも多くのホスホロチオエート連結を含む、項目２５６に記載の方法。
（項目２５８）
前記３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾が、前記プローブの３’末端に位置する、項目２３２～２５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５９）
前記３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾が、前記プローブの５’末端に位置する、項目２３２～２５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６０）
前記エキソヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、およびエキソヌクレアーゼＩからなる群から選択される、項目２３２～２５９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６１）
前記反応混合物を前記プローブおよび前記リガーゼと共にインキュベートした後、アピラーゼジホスファターゼを、前記３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素と共に前記第１の反応混合物に添加して第２の反応混合物を得るステップをさらに含み、前記エキソヌクレアーゼが、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼである、項目２６０に記載の方法。
（項目２６２）
前記プローブが、部分的に二本鎖である、項目２３２～２５０および２５３～２６０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６３）
前記プローブが、一本鎖であり、前記５’配列の３’部分に少なくとも部分的に相補的な、前記５’末端に位置する第１の部分、前記５’配列に相補的でない、前記第１の部分に３’隣接して位置する第２の部分、および前記５’配列の前記３’部分の５’に位置する前記５’配列の一部分に少なくとも部分的に相補的な、前記第２の部分に３’隣接して位置する第３の部分を含む、項目２３２～２５３および２５５～２６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６４）
前記プローブが、前記３’末端にＣ３スペーサーまたは３’ホスフェートをさらに含む、項目２３２～２６３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６５）
前記プローブが、前記５’突出よりも長い、項目２３２～２６４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６６）
配列決定アッセイで後に使用するために、標的分量の処理された核酸分子を開始分量から産生する方法であって、
前記開始分量の処理された核酸分子を含む試料を提供するステップであって、前記処理された核酸分子の各々が、少なくとも部分的に二本鎖であり、５’配列を含む第１の５’突出および前記５’配列を含む第２の５’突出を含み、前記開始分量が、前記標的分量よりも大きい、ステップ、
リガーゼおよびプローブを前記試料に添加して、第１の反応混合物を得るステップであって、前記プローブが、前記標的分量の２倍の量で添加され、前記プローブが、前記５’配列の少なくとも一部分とハイブリダイズするのに十分相補的であるポリヌクレオチド配列を含み、前記プローブが、３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾を含む、ステップ、
前記第１の反応混合物を、前記プローブと前記第１および／または第２の５’突出の前記５’配列とのアニーリングを可能にして、前記プローブと前記処理された核酸分子の一部分とのライゲーションを可能にするのに十分な条件下でインキュベートするステップであって、プローブにライゲートされた前記処理された核酸分子の前記一部分が、前記標的分量の処理された核酸分子である、ステップ、
前記反応混合物を前記プローブおよび前記リガーゼと共にインキュベートした後、３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を、前記第１の反応混合物に添加して第２の反応混合物を得るステップ、
前記第２の反応混合物を、前記プローブにライゲートされていない核酸分子の消化を可能にし、それにより前記標的分量の処理された核酸分子を産出するのに十分な条件下でインキュベートするステップ
を含む方法。
（項目２６７）
前記開始分量の処理された核酸分子を含む前記試料を提供する前に、
（ｉ）複数の少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子であって、各少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子が第１の鎖および第２の鎖を含む核酸分子、
（ｉｉ）第１のプライマーであって、前記プライマーの３’末端に位置する、前記複数の核酸分子の各核酸分子の第１の鎖の標的部分に配列が相補的な第１の部分、前記第１の部分に５’隣接して位置する、３つまたはそれよりも多くの連続リボヌクレオチド塩基を含む第２の部分、および前記第２の部分に５’隣接して位置し、２つまたはそれよりも多くのデオキシヌクレオチドを含む第３の部分を含む第１のプライマー、
（ｉｉｉ）第２のプライマーであって、前記プライマーの３’末端に位置する、前記複数の核酸分子の各核酸分子の前記第２の鎖の標的部分に配列が相補的な第４の部分、前記第４の部分に５’隣接して位置する、前記第１のプライマーの前記第２の部分と同一の配列を有する第５の部分、および前記第５の部分に５’隣接して位置する、前記第１のプライマーの前記第３の部分と同一の配列を有する第６の部分を含む第２のプライマー、
（ｉｖ）デオキシヌクレオチド、ならびに
（ｖ）３’エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を有するＤＮＡポリメラーゼ
を含むＰＣＲ混合物を提供するステップ、
前記ＰＣＲ混合物を、前記ＤＮＡポリメラーゼが前記第１のプライマーおよび第２のプライマーの伸長を可能にし、それにより前記処理された核酸分子を産出するのに十分な条件下でインキュベートするステップ、
前記ＰＣＲ混合物を精製して、未使用の第１のプライマーおよび第２のプライマーを除去し、それにより、前記開始分量の処理された核酸分子を含む前記試料を得るステップをさらに含む、項目２６６に記載の方法。
（項目２６８）
前記開始分量の処理された核酸分子を含む前記試料を提供する前に、
（ｉ）複数の少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子であって、各少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子が第１の鎖および第２の鎖を含む核酸分子、
（ｉｉ）第１のプライマーであって、前記プライマーの３’末端に位置する、前記複数の核酸分子の各核酸分子の第１の鎖の標的部分に配列が相補的な第１の部分、前記第１の部分に５’隣接して位置する、緩衝配列を含む第２の部分、および前記第２の部分に５’隣接して位置する、前記緩衝配列のヌクレオチドと異なるヌクレオチドからなる尾部配列を含む第３の部分を含む第１のプライマー、
（ｉｉｉ）第２のプライマーであって、前記プライマーの３’末端に位置する、前記複数の核酸分子の各核酸分子の前記第２の鎖の標的部分に配列が相補的な第４の部分、前記第４の部分に５’隣接して位置する、前記第１のプライマーの前記緩衝配列を有する第５の部分、および前記第１のプライマーの前記尾部配列を有する第６の部分を含む第２のプライマー、
（ｉｖ）デオキシヌクレオチド、ならびに
（ｖ）ＤＮＡポリメラーゼ
を含むＰＣＲ混合物を提供するステップと、
前記ＰＣＲ混合物を、前記ＤＮＡポリメラーゼが前記第１のプライマーおよび第２のプライマーの伸長を可能にし、それにより前記処理された核酸分子を産出するのに十分な条件下でインキュベートするステップと、
前記ＰＣＲ混合物を精製して、未使用の第１のプライマーおよび第２のプライマーを除去し、それにより、前記開始分量の処理された核酸分子を含む前記試料を得るステップと、
前記開始分量の処理された核酸分子を含む前記試料に、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、および前記緩衝配列の前記ヌクレオチドに相補的であるが、前記尾部配列の前記ヌクレオチドには相補的でないデオキシヌクレオチドを添加するステップと、
前記ＰＣＲ混合物、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、および前記緩衝配列の前記ヌクレオチドに相補的であるが、前記尾部配列の前記ヌクレオチドには相補的でないデオキシヌクレオチドを、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ３’エキソヌクレアーゼ活性が、前記尾部配列をトリミングし、前記緩衝配列の位置に５’突出を産生することを可能にするのに十分な条件下でインキュベートするステップであって、前記Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼが、そのポリメラーゼ活性および前記相補的デオキシヌクレオチドの存在のため、前記緩衝配列を越える３’エキソヌクレアーゼ消化を防止する、ステップと
をさらに含む、項目２６６に記載の方法。
（項目２６９）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼＱ５である、項目２６７に記載の方法。
（項目２７０）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ＰＲＩＭＥＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅである、項目２６７に記載の方法。
（項目２７１）
前記ＰＣＲ混合物を精製して、未使用の第１のプライマーおよび第２のプライマーを除去するステップが、固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）により実施される、項目２６７または項目２６８に記載の方法。
（項目２７２）
前記緩衝配列が、ホモポリマー、ジヌクレオチド、またはトリヌクレオチド組成を含む、項目２６８に記載の方法。
（項目２７３）
前記緩衝配列および前記第２のプライマーの前記第５の部分が、５～１０塩基の長さである、項目２７２に記載の方法。
（項目２７４）
前記尾部配列が、１０～２０塩基の長さである、項目２６８および２７２～２７３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７５）
前記処理された核酸分子が、次世代配列決定（ＮＧＳ）ライブラリーである、項目２６６～２７４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７６）
前記処理された核酸分子の各々が、前記分子の第１の末端に第１のアダプター配列、および前記第１の末端の反対側の第２の末端に第２のアダプター配列を含み、前記第１のアダプター配列および前記第２のアダプター配列が、同じであるかまたは異なる、項目２７５に記載の方法。
（項目２７７）
前記第１の５’突出および前記第２の５’突出が、前記第１または第２の５’突出の５’末端に位置していない３つまたはそれよりも多くの連続リボヌクレオチド塩基を含む、項目２６６～２６７および２６９～２７１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７８）
前記処理された核酸分子が、次世代配列決定（ＮＧＳ）ライブラリーである、項目２７７に記載の方法。
（項目２７９）
前記処理された核酸分子の各々が、前記分子の第１の末端に第１のアダプター配列、および前記第１の末端の反対側の第２の末端に第２のアダプター配列を含み、前記第１のアダプター配列および前記第２のアダプター配列が、同じであるかまたは異なる、項目２７８に記載の方法。
（項目２８０）
前記３つまたはそれよりも多くの連続リボヌクレオチド塩基が、ｒＵまたはｒＡ塩基を含む、項目２７７～２７９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８１）
前記５’配列が、ポリ（Ａ）、ポリ（Ｔ）、ポリ（Ｇ）、ポリ（Ｃ）、ポリ（ＡＧ）、ポリ（ＡＣ）、ポリ（ＧＴ）、ポリ（ＣＴ）、ポリ（ＡＴ）、ポリ（ＧＣ）、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、およびペンタヌクレオチドからなる群から選択される低複雑性配列をさらに含む、項目２６６～２８０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８２）
前記５’配列が、８～５０塩基を含む、項目２６６～２８１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８３）
前記リガーゼが、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ＤＮＡリガーゼ、ＥｓｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ、９°Ｎリガーゼ、およびＰｆｕＤＮＡリガーゼからなる群から選択される、項目２６６～２８２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８４）
前記プローブが、一本鎖ＤＮＡを含む、項目２６６～２８３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８５）
前記プローブが、ヘアピン構造を形成する、項目２６６～２８４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８６）
前記プローブが、５’突出を含む二本鎖ＤＮＡを含む、項目２６６～２８５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８７）
前記プローブの前記５’突出が、前記５’配列の少なくとも一部分に相補的である、項目２８６に記載の方法。
（項目２８８）
前記プローブが、５’ホスフェート、３’ヒドロキシル基、または５’ホスフェートおよび３’ヒドロキシル基の両方を含む、項目２６６～２８７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８９）
前記３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾が、３つまたはそれよりも多くのヌクレアーゼ耐性修飾を含む、項目２６６～２８８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９０）
前記３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾が、３つまたはそれよりも多くのホスホロチオエート連結を含む、項目２８９に記載の方法。
（項目２９１）
前記３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾が、前記プローブの３’末端に位置する、項目２６６～２９０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９２）
前記３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾が、前記プローブの５’末端に位置する、項目２６６～２９０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９３）
前記エキソヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、およびエキソヌクレアーゼＩからなる群から選択される、項目２６６～２９２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９４）
前記反応混合物を前記プローブおよび前記リガーゼと共にインキュベートした後、アピラーゼジホスファターゼを、前記３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素と共に前記第１の反応混合物に添加して第２の反応混合物を得るステップをさらに含み、前記エキソヌクレアーゼが、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼである、項目２９３に記載の方法。
（項目２９５）
前記プローブが、部分的に二本鎖である、項目２６６～２８３および２８６～２９４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９６）
前記プローブが、一本鎖であり、前記５’配列の３’部分に少なくとも部分的に相補的な、前記５’末端に位置する第１の部分、前記５’配列に相補的でない、前記第１の部分に３’隣接して位置する第２の部分、および前記５’配列の前記３’部分の５’に位置する前記５’配列の一部分に少なくとも部分的に相補的な、前記第２の部分に３’隣接して位置する第３の部分を含む、項目２６６～２８５および２８８～２９４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９７）
前記プローブが、前記３’末端にＣ３スペーサーまたは３’ホスフェートをさらに含む、項目２６６～２９６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９８）
前記プローブが、前記第１の５’突出および／または前記第２の５’突出よりも長い、項目２６６～２９７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９９）
配列決定アッセイで後に使用するために、標的分量の処理された核酸分子を開始分量から産生する方法であって、
前記開始分量の処理された核酸分子を含む試料を提供するステップであって、前記処理された核酸分子の各々が、少なくとも部分的に二本鎖であり、５’配列を含む第１の５’突出および前記５’配列を含む第２の５’突出を含み、前記開始分量が、前記標的分量よりも大きい、ステップ、
リガーゼおよびプローブを前記試料に添加して、第１の反応混合物を得るステップであって、前記プローブが、前記標的分量の２倍の量で添加され、前記プローブが、前記５’配列の少なくとも一部分とハイブリダイズするのに十分相補的であるポリヌクレオチド配列を含み、前記プローブが、３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾を含む、ステップ、
前記第１の反応混合物を、前記プローブと前記第１および／または第２の５’突出の前記５’配列とのアニーリングを可能にして、前記プローブと前記処理された核酸分子の一部分とのライゲーションを可能にするのに十分な条件下でインキュベートするステップであって、プローブにライゲートされた前記処理された核酸分子の前記一部分が、前記標的分量の処理された核酸分子である、ステップ、
前記反応混合物を前記プローブおよび前記リガーゼと共にインキュベートした後、３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を、前記第１の反応混合物に添加して第２の反応混合物を得るステップ、
前記第２の反応混合物を、前記プローブにライゲートされていない核酸分子の消化を可能にし、それにより前記標的分量の処理された核酸分子を産出するのに十分な条件下でインキュベートするステップ
を含む方法。
（項目３００）
前記開始分量の処理された核酸分子を含む前記試料を提供する前に、
（ｉ）複数の少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子であって、各少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子が第１の鎖および第２の鎖を含む核酸分子、
（ｉｉ）プライマーであって、前記プライマーの３’末端に位置する、前記複数の核酸分子の各核酸分子の第１の鎖の標的部分に配列が相補的な第１の部分、前記第１の部分に５’隣接して位置する、３つまたはそれよりも多くの連続リボヌクレオチド塩基を含む第２の部分、および前記第２の部分に５’隣接して位置し、２つまたはそれよりも多くのデオキシヌクレオチドを含む第３の部分を含むプライマー、
（ｉｉｉ）デオキシヌクレオチド、ならびに
（ｉｖ）３’エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を有するＤＮＡポリメラーゼ
を含むＰＣＲ混合物を提供するステップ、
前記ＰＣＲ混合物を、前記ＤＮＡポリメラーゼが前記第１のプライマーの伸長を可能にし、それにより前記処理された核酸分子を産出するのに十分な条件下でインキュベートするステップ、
前記ＰＣＲ混合物を精製して、未使用の第１のプライマーおよび第２のプライマーを除去し、それにより、前記開始分量の処理された核酸分子を含む前記試料を得るステップ
をさらに含む、項目２９９に記載の方法。
（項目３０１）
前記開始分量の処理された核酸分子を含む前記試料を提供する前に、
（ｉ）複数の少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子であって、各少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子が第１の鎖および第２の鎖を含む核酸分子、
（ｉｉ）プライマーであって、前記プライマーの３’末端に位置する、前記複数の核酸分子の各核酸分子の第１の鎖の標的部分に配列が相補的な第１の部分、前記第１の部分に５’隣接して位置する、緩衝配列を含む第２の部分、および前記第２の部分に５’隣接して位置する、前記緩衝配列のヌクレオチドと異なるヌクレオチドからなる尾部配列を含む第３の部分を含むプライマー、
（ｉｉｉ）前記緩衝配列の前記ヌクレオチドに相補的であり、前記尾部配列の前記ヌクレオチドには相補的でないデオキシヌクレオチド、ならびに
（ｉｖ）ＤＮＡポリメラーゼ
を含むＰＣＲ混合物を提供するステップと、
前記ＰＣＲ混合物を、前記ＤＮＡポリメラーゼが前記第１のプライマーの伸長を可能にし、それにより前記処理された核酸分子を産出するのに十分な条件下でインキュベートするステップと、
前記ＰＣＲ混合物を精製して、未使用の第１のプライマーおよび第２のプライマーを除去し、それにより、前記開始分量の処理された核酸分子を含む前記試料を得るステップと、
前記開始分量の処理された核酸分子を含む前記試料に、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、および前記緩衝配列の前記ヌクレオチドに相補的であるが、前記尾部配列の前記ヌクレオチドには相補的でないデオキシヌクレオチドを添加するステップと、
前記ＰＣＲ混合物、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、および前記緩衝配列の前記ヌクレオチドに相補的であるが、前記尾部配列の前記ヌクレオチドには相補的でないデオキシヌクレオチドを、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ３’エキソヌクレアーゼ活性が、前記尾部配列をトリミングし、前記緩衝配列の位置に５’突出を産生することを可能にするのに十分な条件下でインキュベートするステップであって、前記Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼが、そのポリメラーゼ活性および前記相補的デオキシヌクレオチドの存在のため、前記緩衝配列を越える３’エキソヌクレアーゼ消化を防止する、ステップと
をさらに含む、項目２９９に記載の方法。
（項目３０２）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼＱ５である、項目３００に記載の方法。
（項目３０３）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ＰＲＩＭＥＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅである、項目３００に記載の方法。
（項目３０４）
前記ＰＣＲ混合物を精製して、未使用のプライマーを除去するステップが、固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）により実施される、項目３００または項目３０１に記載の方法。
（項目３０５）
前記緩衝配列が、ホモポリマー、ジヌクレオチド、またはトリヌクレオチド組成を含む、項目３０１に記載の方法。
（項目３０６）
前記尾部配列が、１０～２０塩基の長さである、項目２９９～３０５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０７）
前記処理された核酸分子が、次世代配列決定（ＮＧＳ）ライブラリーである、項目２９９～３０６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０８）
前記処理された核酸分子の各々が、前記分子の第１の末端に第１のアダプター配列、および前記第１の末端の反対側の第２の末端に第２のアダプター配列を含み、前記第１のアダプター配列および前記第２のアダプター配列が、同じである、項目３０７に記載の方法。
（項目３０９）
前記第１の５’突出および前記第２の５’突出が、前記第１または第２の５’突出の５’末端に位置していない３つまたはそれよりも多くの連続リボヌクレオチド塩基を含む、項目２９９～３００および３０２～３０４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１０）
前記３つまたはそれよりも多くの連続リボヌクレオチド塩基が、ｒＵまたはｒＡ塩基を含む、項目３０９に記載の方法。
（項目３１１）
前記５’配列が、ポリ（Ａ）、ポリ（Ｔ）、ポリ（Ｇ）、ポリ（Ｃ）、ポリ（ＡＧ）、ポリ（ＡＣ）、ポリ（ＧＴ）、ポリ（ＣＴ）、ポリ（ＡＴ）、ポリ（ＧＣ）、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、およびペンタヌクレオチドからなる群から選択される低複雑性配列をさらに含む、項目２９９～３１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１２）
前記５’配列が、８～５０塩基を含む、項目２９９～３１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１３）
前記リガーゼが、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ＤＮＡリガーゼ、ＥｓｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ、９°Ｎリガーゼ、およびＰｆｕＤＮＡリガーゼからなる群から選択される、項目２９９～３１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１４）
前記プローブが、一本鎖ＤＮＡを含む、項目２９９～３１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１５）
前記プローブが、ヘアピン構造を形成する、項目２９９～３１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１６）
前記プローブが、５’突出を含む二本鎖ＤＮＡを含む、項目２９９～３１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１７）
前記プローブの前記５’突出が、前記５’配列の少なくとも一部分に相補的である、項目３１６に記載の方法。
（項目３１８）
前記プローブが、５’ホスフェート、３’ヒドロキシル基、または５’ホスフェートおよび３’ヒドロキシル基の両方を含む、項目２９９～３１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１９）
前記３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾が、３つまたはそれよりも多くのヌクレアーゼ耐性修飾を含む、項目２９９～３１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２０）
前記３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾が、３つまたはそれよりも多くのホスホロチオエート連結を含む、項目３１９に記載の方法。
（項目３２１）
前記３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾が、前記プローブの３’末端に位置する、項目２９９～３２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２２）
前記３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾が、前記プローブの５’末端に位置する、項目２９９～３２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２３）
前記エキソヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、およびエキソヌクレアーゼＩからなる群から選択される、項目２９９～３２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２４）
前記反応混合物を前記プローブおよび前記リガーゼと共にインキュベートした後、アピラーゼジホスファターゼを、前記３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素と共に前記第１の反応混合物に添加して第２の反応混合物を得るステップをさらに含み、前記エキソヌクレアーゼが、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼである、項目３２３に記載の方法。
（項目３２５）
前記プローブが、部分的に二本鎖である、項目２９９～３１３および３１６～３２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２６）
前記プローブが、一本鎖であり、前記５’配列の３’部分に少なくとも部分的に相補的な、前記５’末端に位置する第１の部分、前記５’配列に相補的でない、前記第１の部分に３’隣接して位置する第２の部分、および前記５’配列の前記３’部分の５’に位置する前記５’配列の一部分に少なくとも部分的に相補的な、前記第２の部分に３’隣接して位置する第３の部分を含む、項目２９９～３１５および３１７～３２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２７）
前記プローブが、前記３’末端にＣ３スペーサーまたは３’ホスフェートをさらに含む、項目２９９～３２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２８）
前記プローブが、前記第１の５’突出および／または第２の５’突出よりも長い、項目２９９～３２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２９）
配列決定アッセイで後に使用するために、標的分量の処理された核酸分子を開始分量から産生する方法であって、
前記開始分量の処理された核酸分子を含む試料を提供するステップであって、前記処理された核酸分子の各々が、少なくとも部分的に二本鎖であり、第１の５’配列を含む第１の５’突出および第２の５’配列を含む第２の５’突出を含み、前記開始分量が、前記標的分量よりも大きい、ステップ、
リガーゼ、標的分量の第１のプローブ、および標的分量の第２のプローブを前記試料に添加して、第１の反応混合物を得るステップであって、前記第１のプローブが、前記第１の５’配列の少なくとも一部分とハイブリダイズするのに十分に相補的なポリヌクレオチド配列を含み、前記プローブが、３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾を含み、前記第２のプローブが、前記第２の５’配列の少なくとも一部分とハイブリダイズするのに十分に相補的なポリヌクレオチド配列を含み、前記第２のプローブが、３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾を含む、ステップ、
前記第１の反応混合物を、前記第１のプローブと前記第１の５’配列とのアニーリングおよび前記第２のプローブと前記第２の５’配列とのアニーリングを可能にして、前記プローブと前記処理された核酸分子の一部分とのライゲーションを可能にするのに十分な条件下でインキュベートするステップであって、プローブにライゲートされた前記処理された核酸分子の前記一部分が、前記標的分量の処理された核酸分子である、ステップ、
前記反応混合物を前記第１のプローブ、第２のプローブ、および前記リガーゼと共にインキュベートした後、３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を、前記第１の反応混合物に添加して第２の反応混合物を得るステップ、
前記第２の反応混合物を、前記第１のプローブおよび第２のプローブにライゲートされていない核酸分子の消化を可能にし、それにより前記標的分量の処理された核酸分子を産出するのに十分な条件下でインキュベートするステップ
を含む方法。
（項目３３０）
前記開始分量の処理された核酸分子を含む前記試料を提供する前に、
（ｉ）複数の少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子であって、各少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子が第１の鎖および第２の鎖を含む核酸分子、
（ｉｉ）第１のプライマーであって、前記プライマーの３’末端に位置する、前記複数の核酸分子の各核酸分子の第１の鎖の標的部分に配列が相補的な第１の部分、前記第１の部分に５’隣接して位置する、３つまたはそれよりも多くの連続リボヌクレオチド塩基を含む第２の部分、および前記第２の部分に５’隣接して位置し、２つまたはそれよりも多くのデオキシヌクレオチドを含む第３の部分を含む第１のプライマー、
（ｉｉｉ）第２のプライマーであって、前記プライマーの３’末端に位置する、前記複数の核酸分子の各核酸分子の前記第２の鎖の標的部分に配列が相補的な第４の部分、前記第４の部分に５’隣接して位置する、３つまたはそれよりも多くの連続リボヌクレオチド塩基を含む第５の部分、および２つまたはそれよりも多くのデオキシヌクレオチドを含む第６の部分を含む第２のプライマー、
（ｉｖ）デオキシヌクレオチド、ならびに
（ｖ）３’エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を有するＤＮＡポリメラーゼ
を含むＰＣＲ混合物を提供するステップ、
前記ＰＣＲ混合物を、前記ＤＮＡポリメラーゼが前記第１のプライマーおよび第２のプライマーの伸長を可能にし、それにより前記処理された核酸分子を産出するのに十分な条件下でインキュベートするステップ、
前記ＰＣＲ混合物を精製して、未使用の第１のプライマーおよび第２のプライマーを除去し、それにより、開始分量の処理された核酸分子を含む前記試料を得るステップ
をさらに含む、項目３２９に記載の方法。
（項目３３１）
前記開始分量の処理された核酸分子を含む前記試料を提供する前に、
（ｉ）複数の少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子であって、各少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子が第１の鎖および第２の鎖を含む核酸分子、
（ｉｉ）第１のプライマーであって、前記プライマーの３’末端に位置する、前記複数の核酸分子の各核酸分子の第１の鎖の標的部分に配列が相補的な第１の部分、前記第１の部分に５’隣接して位置する、緩衝配列を含む第２の部分、および前記第２の部分に５’隣接して位置する、前記緩衝配列のヌクレオチドと異なるヌクレオチドからなる第１の尾部配列を含む第３の部分を含む第１のプライマー、
（ｉｉｉ）第２のプライマーであって、前記プライマーの３’末端に位置する、前記複数の核酸分子の各核酸分子の前記第２の鎖の標的部分に配列が相補的な第４の部分、前記第４の部分に５’隣接して位置する、前記第１のプライマーの前記緩衝配列の同じヌクレオチド組成を含有する配列を有する第５の部分、および第２の尾部配列を有する第６の部分を含む第２のプライマー、
（ｉｖ）デオキシヌクレオチド、ならびに
（ｖ）ＤＮＡポリメラーゼ
を含むＰＣＲ混合物を提供するステップと、
前記ＰＣＲ混合物を、前記ＤＮＡポリメラーゼが前記第１のプライマーおよび第２のプライマーの伸長を可能にし、それにより前記処理された核酸分子を産出するのに十分な条件下でインキュベートするステップと、
前記ＰＣＲ混合物を精製して、未使用の第１のプライマーおよび第２のプライマーを除去し、それにより、前記開始分量の処理された核酸分子を含む前記試料を得るステップと、
前記開始分量の処理された核酸分子を含む試料に、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、および前記緩衝配列の前記ヌクレオチドに相補的であるが、前記尾部配列の前記ヌクレオチドには相補的でないデオキシヌクレオチドを添加するステップと、
前記ＰＣＲ混合物、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、および前記緩衝配列の前記ヌクレオチドに相補的であるが、前記尾部配列の前記ヌクレオチドには相補的でないデオキシヌクレオチドを、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ３’エキソヌクレアーゼ活性が、前記尾部配列をトリミングし、前記緩衝配列の位置に５’突出を産生することを可能にするのに十分な条件下でインキュベートするステップであって、前記Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼが、そのポリメラーゼ活性および前記相補的デオキシヌクレオチドの存在のため、前記緩衝配列を越える３’エキソヌクレアーゼ消化を防止する、ステップと
をさらに含む、項目３２９に記載の方法。
（項目３３２）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼＱ５である、項目３３０に記載の方法。
（項目３３３）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ＰＲＩＭＥＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅである、項目３３０に記載の方法。
（項目３３４）
前記ＰＣＲ混合物を精製して、未使用の第１のプライマーおよび第２のプライマーを除去するステップが、固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）により実施される、項目３３０または項目３３１に記載の方法。
（項目３３５）
前記緩衝配列および前記第２のプライマーの前記第５の部分が、独立してホモポリマー、ジヌクレオチド、またはトリヌクレオチド組成を含む、項目３３１に記載の方法。
（項目３３６）
前記緩衝配列および前記第２のプライマーの前記第５の部分が、５～１０塩基の長さである、項目３３５に記載の方法。
（項目３３７）
前記第１の尾部配列および前記第２の尾部配列が、１０～２０塩基の長さである、項目３３１および３３５～３３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３８）
前記処理された核酸分子が、次世代配列決定（ＮＧＳ）ライブラリーである、項目３２９～３３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３９）
前記処理された核酸分子の各々が、前記分子の第１の末端に第１のアダプター配列、および前記第１の末端の反対側の第２の末端に第２のアダプター配列を含み、前記第１のアダプター配列および前記第２のアダプター配列が、同じであるかまたは異なる、項目３３８に記載の方法。
（項目３４０）
前記第１の５’突出および前記第２の５’突出が、前記第１または第２の５’突出の５’末端に位置していない３つまたはそれよりも多くの連続リボヌクレオチド塩基を含む、項目３２９～３３０および３３２～３３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４１）
前記処理された核酸分子が、次世代配列決定（ＮＧＳ）ライブラリーである、項目３４０に記載の方法。
（項目３４２）
前記処理された核酸分子の各々が、前記分子の第１の末端に第１のアダプター配列、および前記第１の末端の反対側の第２の末端に第２のアダプター配列を含み、前記第１のアダプター配列および前記第２のアダプター配列が、同じであるかまたは異なる、項目３４１に記載の方法。
（項目３４３）
前記緩衝配列および前記第２のプライマーの前記第５の部分の前記３つまたはそれよりも多くの連続リボヌクレオチド塩基が、ｒＵまたはｒＡ塩基を含む、項目３４０～３４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４４）
前記５’配列が、ポリ（Ａ）、ポリ（Ｔ）、ポリ（Ｇ）、ポリ（Ｃ）、ポリ（ＡＧ）、ポリ（ＡＣ）、ポリ（ＧＴ）、ポリ（ＣＴ）、ポリ（ＡＴ）、ポリ（ＧＣ）、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、およびペンタヌクレオチドからなる群から選択される低複雑性配列をさらに含む、項目３２９～３４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４５）
前記第１の５’配列および前記第２の５’配列が、８～５０塩基を含む、項目３２９～３４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４６）
前記リガーゼが、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ＤＮＡリガーゼ、ＥｓｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ、９°Ｎリガーゼ、およびＰｆｕＤＮＡリガーゼからなる群から選択される、項目３２９～３４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４７）
前記第１のプローブおよび／または第２のプローブが、一本鎖ＤＮＡを含む、項目３２９～３４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４８）
前記第１のプローブおよび／または第２のプローブが、ヘアピン構造を形成する、項目３２９～３４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４９）
前記第１のプローブおよび／または第２のプローブが、５’突出を含む二本鎖ＤＮＡを含む、項目３２９～３４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５０）
前記第１のプローブおよび／または第２のプローブの前記５’突出が、前記５’配列の少なくとも一部分に相補的である、項目３４９に記載の方法。
（項目３５１）
前記第１のプローブおよび／または第２のプローブが、５’ホスフェート、３’ヒドロキシル基、または５’ホスフェートおよび３’ヒドロキシル基の両方を含む、項目３２９～３５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５２）
前記第１のプローブおよび／または前記第２のプローブの前記３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾が、３つまたはそれよりも多くのヌクレアーゼ耐性修飾を含む、項目３２９～３５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５３）
前記第１のプローブおよび／または前記第２のプローブの前記３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾が、３つまたはそれよりも多くのホスホロチオエート連結を含む、項目３５２に記載の方法。
（項目３５４）
前記３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾が、前記第１のプローブおよび／または第２のプローブの３’末端に位置する、項目３２９～３５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５５）
前記第１のプローブおよび／または前記第２のプローブの前記３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾が、前記プローブの５’末端に位置する、項目３２９～３５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５６）
前記エキソヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、およびエキソヌクレアーゼＩからなる群から選択される、項目３２９～３５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５７）
前記反応混合物を、前記プローブおよび前記リガーゼと共にインキュベートした後、アピラーゼジホスファターゼを、前記３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素と共に前記第１の反応混合物に添加して第２の反応混合物を得るステップをさらに含み、前記エキソヌクレアーゼが、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼである、項目３５６に記載の方法。
（項目３５８）
前記第１のプローブおよび／または前記第２のプローブが、部分的に二本鎖である、項目３２９～３４６および３４９～３５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５９）
前記第１のプローブが、一本鎖であり、前記第１の５’配列の３’部分に少なくとも部分的に相補的な、前記５’末端に位置する第１の部分、前記第１の５’配列に相補的でない、前記第１の部分に３’隣接して位置する第２の部分、および前記５’配列の前記３’部分の５’に位置する前記第１の５’配列の一部分に少なくとも部分的に相補的な、前記第２の部分に３’隣接して位置する第３の部分を含む、項目３２９～３４８および３５１～３５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６０）
前記第２のプローブが、一本鎖であり、前記第２の５’配列の３’部分に少なくとも部分的に相補的な、前記５’末端に位置する第１の部分、前記第２の５’配列に相補的でない、前記第１の部分に３’隣接して位置する第２の部分、および前記第２の５’配列の前記３’部分の５’に位置する前記５’配列の一部分に少なくとも部分的に相補的な、前記第２の部分に３’隣接して位置する第３の部分を含む、項目３５９に記載の方法。
（項目３６１）
前記第１のプローブおよび／または第２のプローブが、前記３’末端にＣ３スペーサーまたは３’ホスフェートをさらに含む、項目３２９～３６０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６２）
前記第１のプローブが、前記第１の５’突出よりも長い、項目３２９～３６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６３）
前記第２のプローブが、前記第２の５’突出よりも長い、項目３２９～３６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６４）
配列決定アッセイで後に使用するために、標的分量の処理された核酸分子を開始分量から得る方法であって、
前記開始分量の処理された核酸分子を含む試料を提供するステップであって、前記処理された核酸分子の各々が、少なくとも部分的に二本鎖であり、突出配列を含む突出を含み、前記開始分量が、前記標的分量よりも大きい、ステップ、
リガーゼおよびプローブを前記試料に添加して、第１の反応混合物を得るステップであって、前記プローブが、前記標的分量と等しい量で添加され、前記プローブが、前記突出配列の少なくとも一部分とハイブリダイズするのに十分に相補的であるポリヌクレオチド配列を含み、前記プローブが、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾を含む、ステップ、
前記第１の反応混合物を、前記プローブと前記突出配列とのアニーリングを可能にして、前記プローブと前記処理された核酸分子の一部分とのライゲーションを可能にするのに十分な条件下でインキュベートするステップであって、プローブにライゲートされた前記処理された核酸分子の前記一部分が、前記標的分量の処理された核酸分子である、ステップ、
前記反応混合物を前記プローブおよび前記リガーゼと共にインキュベートした後、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を、前記第１の反応混合物に添加して第２の反応混合物を得るステップ、
前記第２の反応混合物を、前記プローブにライゲートされていない前記処理された核酸分子の消化を可能にし、それにより前記標的分量の処理された核酸分子を産出するのに十分な条件下でインキュベートするステップを含む方法。
（項目３６５）
前記開始分量の処理された核酸分子を含む前記試料を提供する前に、
（ｉ）複数の少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子であって、各少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子が第１の鎖および第２の鎖を含む核酸分子、
（ｉｉ）第１のプライマーであって、前記プライマーの３’末端に位置する、前記複数の核酸分子の各核酸分子の第１の鎖の標的部分に配列が相補的な第１の部分、前記第１の部分に５’隣接して位置する、３つまたはそれよりも多くの連続リボヌクレオチド塩基を含む第２の部分、および前記第２の部分に５’隣接して位置し、２つまたはそれよりも多くのデオキシヌクレオチドを含む第３の部分を含む第１のプライマー、
（ｉｉｉ）前記複数の核酸分子の各核酸分子の前記第２の鎖の標的部分に相補的な配列を含む第２のプライマー、
（ｉｖ）デオキシヌクレオチド、ならびに
（ｖ）３’エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を有するＤＮＡポリメラーゼ
を含むＰＣＲ混合物を提供するステップ、
前記ＰＣＲ混合物を、前記ＤＮＡポリメラーゼが前記第１のプライマーおよび第２のプライマーの伸長を可能にし、それにより前記処理された核酸分子を産出するのに十分な条件下でインキュベートするステップ、
前記ＰＣＲ混合物を精製して、未使用の第１のプライマーおよび第２のプライマーを除去し、それにより、前記開始分量の処理された核酸分子を含む試料を得るステップ
をさらに含む、項目３６４に記載の方法。
（項目３６６）
前記開始分量の処理された核酸分子を含む前記試料を提供する前に、
（ｉ）複数の少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子であって、各少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子が第１の鎖および第２の鎖を含む核酸分子、
（ｉｉ）第１のプライマーであって、前記プライマーの３’末端に位置する、前記複数の核酸分子の各核酸分子の第１の鎖の標的部分に配列が相補的な第１の部分、前記第１の部分に５’隣接して位置する、緩衝配列を含む第２の部分、および前記第２の部分に５’隣接して位置する、前記緩衝配列のヌクレオチドと異なるヌクレオチドからなる尾部配列を含む第３の部分を含む第１のプライマー、
（ｉｉｉ）第２のプライマーであって、前記プライマーの３’末端に位置する、前記複数の核酸分子の各核酸分子の前記第２の鎖の標的部分に配列が相補的な第４の部分、および前記第４の部分に５’隣接して位置する、前記緩衝配列と同じヌクレオチド組成を有する配列を含む第５の部分を含む第２のプライマー、
（ｉｖ）デオキシヌクレオチド、ならびに
（ｖ）ＤＮＡポリメラーゼ
を含むＰＣＲ混合物を提供するステップと、
前記ＰＣＲ混合物を、前記ＤＮＡポリメラーゼが前記第１のプライマーおよび第２のプライマーの伸長を可能にし、それにより前記処理された核酸分子を産出するのに十分な条件下でインキュベートするステップと、
前記ＰＣＲ混合物を精製して、未使用の第１のプライマーおよび第２のプライマーを除去し、それにより、前記開始分量の処理された核酸分子を含む前記試料を得るステップと、
前記開始分量の処理された核酸分子を含む前記試料に、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、および前記緩衝配列の前記ヌクレオチドに相補的であるが、前記尾部配列の前記ヌクレオチドには相補的でないデオキシヌクレオチドを添加するステップと、
前記ＰＣＲ混合物、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、および前記緩衝配列の前記ヌクレオチドに相補的であるが、前記尾部配列の前記ヌクレオチドには相補的でないデオキシヌクレオチドを、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ３’エキソヌクレアーゼ活性が、前記尾部配列をトリミングし、前記緩衝配列の位置に５’突出を産生することを可能にするのに十分な条件下でインキュベートするステップであって、前記Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼが、そのポリメラーゼ活性および前記相補的デオキシヌクレオチドの存在のため、前記緩衝配列を越える３’エキソヌクレアーゼ消化を防止する、ステップと
をさらに含む、項目３６４に記載の方法。
（項目３６７）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼＱ５である、項目３６５に記載の方法。
（項目３６８）
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ＰＲＩＭＥＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅである、項目３６５に記載の方法。
（項目３６９）
前記ＰＣＲ混合物を精製して、未使用の第１のプライマーおよび第２のプライマーを除去するステップが、固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）により実施される、項目３６５または項目３６６に記載の方法。
（項目３７０）
前記緩衝配列が、ホモポリマー、ジヌクレオチド、またはトリヌクレオチド組成を含む、項目３６６に記載の方法。
（項目３７１）
前記緩衝配列および前記第２のプライマーの前記第５の部分が、５～１０塩基の長さである、項目３７０に記載の方法。
（項目３７２）
前記尾部配列が、１０～２０塩基の長さである、項目３６６および３７０～３７１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７３）
前記突出が３’突出である、項目３６４に記載の方法。
（項目３７４）
前記突出が、プライマーを介して切断可能な塩基をＰＣＲで組み込み、その後切断して３’突出を産出することにより得られる３’突出である、項目３７３に記載の方法。
（項目３７５）
前記突出が、プライマーを介してヌクレアーゼ耐性塩基をＰＣＲで組み込み、その後エキソヌクレアーゼ消化して３’突出を産出することにより得られる３’突出である、項目３７３に記載の方法。
（項目３７６）
前記処理された核酸分子が、次世代配列決定（ＮＧＳ）ライブラリーである、項目３６４～３７５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７７）
前記処理された核酸分子の各々が、前記分子の第１の末端に第１のアダプター配列、および前記第１の末端の反対側の第２の末端に第２のアダプター配列を含み、前記第１のアダプター配列および前記第２のアダプター配列が、同じであるかまたは異なる、項目３７６に記載の方法。
（項目３７８）
前記突出が、前記突出の末端に位置していない３つまたはそれよりも多くの連続リボヌクレオチド塩基を含む、項目３６４～３６５および３６７～３６９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７９）
前記処理された核酸分子が、次世代配列決定（ＮＧＳ）ライブラリーである、項目３７８に記載の方法。
（項目３８０）
前記処理された核酸分子の各々が、前記分子の第１の末端に第１のアダプター配列、および前記第１の末端の反対側の第２の末端に第２のアダプター配列を含み、前記第１のアダプター配列および前記第２のアダプター配列が、同じであるかまたは異なる、項目３７９に記載の方法。
（項目３８１）
前記３つまたはそれよりも多くの連続リボヌクレオチド塩基が、ｒＵまたはｒＡ塩基を含む、項目３７８～３８０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８２）
前記突出配列が、ポリ（Ａ）、ポリ（Ｔ）、ポリ（Ｇ）、ポリ（Ｃ）、ポリ（ＡＧ）、ポリ（ＡＣ）、ポリ（ＧＴ）、ポリ（ＣＴ）、ポリ（ＡＴ）、ポリ（ＧＣ）、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、およびペンタヌクレオチドからなる群から選択される低複雑性配列をさらに含む、項目３６４～３８１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８３）
前記突出配列が、８～５０塩基を含む、項目３６４～３８２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８４）
前記リガーゼが、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ＤＮＡリガーゼ、ＥｓｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ、９°Ｎリガーゼ、およびＰｆｕＤＮＡリガーゼからなる群から選択される、項目３６４～３８３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８５）
前記プローブが、一本鎖ＤＮＡを含む、項目３６４～３８４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８６）
前記プローブが、ヘアピン構造を形成する、項目３６４～３８５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８７）
前記プローブが、前記処理された核酸分子の前記突出に相補的な突出を含む二本鎖ＤＮＡを含む、項目３６４～３８６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８８）
前記プローブの前記突出が、前記突出配列の少なくとも一部分に相補的である、項目３８７に記載の方法。
（項目３８９）
前記プローブが、５’ホスフェート、３’ヒドロキシル基、または５’ホスフェートおよび３’ヒドロキシル基の両方を含む、項目３６４～３８８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９０）
前記エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾が、３つまたはそれよりも多くのヌクレアーゼ耐性修飾を含む、項目３６４～３８９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９１）
前記エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾が、３つまたはそれよりも多くのホスホロチオエート連結を含む、項目３９０に記載の方法。
（項目３９２）
前記エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾が、前記プローブの３’末端に位置する、項目３６４～３９１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９３）
前記エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾が、前記プローブの５’末端に位置する、項目３６４～３９２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９４）
前記エキソヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、およびエキソヌクレアーゼＩからなる群から選択される、項目３６４～３９３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９５）
前記反応混合物を前記プローブおよび前記リガーゼと共にインキュベートした後で、アピラーゼジホスファターゼを、前記エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素と共に前記第１の反応混合物に添加して第２の反応混合物を得るステップをさらに含み、前記エキソヌクレアーゼが、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼである、項目３９４に記載の方法。
（項目３９６）
前記プローブが、部分的に二本鎖である、項目３６４～３８４および３８９～３９５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９７）
前記プローブが、一本鎖であり、前記５’配列の３’部分に少なくとも部分的に相補的な、前記５’末端に位置する第１の部分、前記５’配列に相補的でない、前記第１の部分に３’隣接して位置する第２の部分、および前記５’配列の前記３’部分の５’に位置する前記５’配列の一部分に少なくとも部分的に相補的な、前記第２の部分に３’隣接して位置する第３の部分を含む、項目３６４～３８６および３８９～３９５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９８）
前記プローブが、前記３’末端にＣ３スペーサーまたは３’ホスフェートをさらに含む、項目３６４～３９７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９９）
前記プローブが、前記突出よりも長い、項目３６４～３９８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４００）
指定モル分量の次世代配列決定（ＮＧＳ）ライブラリーを作製する方法であって、
第１のプライマーおよび第２のプライマーを、それぞれそれらの５’および３’末端に第１のアダプター配列および第２のアダプター配列を保持する核酸分子のプールを含む前記ＮＧＳライブラリーに添加することによりＰＣＲ反応混合物を調製するステップであって、前記第１および第２のプライマーが各々、低複雑性ヌクレオチド配列を含む５’末端ドメイン、ならびにそれぞれ前記第１および第２のアダプター配列に十分に相補的であり、それらにハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む３’末端ドメインを有し、前記第１のプライマーの前記低複雑性ヌクレオチド配列が、前記第２のプライマーの前記低複雑性ヌクレオチド配列とは異なり、それに相補的でなく、前記第１および第２のプライマーが、前記指定モル分量の前記ＮＧＳライブラリーと等しい濃度で添加される、ステップと、
前記ＰＣＲ反応混合物を、前記指定モル分量の前記ＮＧＳライブラリーを生成するのに十分な条件下で、ＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートするステップと
を含む方法。
（項目４０１）
前記低複雑性ヌクレオチド配列が、ホモポリマー配列である、項目４００に記載の方法。
（項目４０２）
前記低複雑性ヌクレオチド配列が、ジヌクレオチド配列である、項目４００に記載の方法。
（項目４０３）
前記ジヌクレオチド配列が、反復ジヌクレオチドエレメントである、項目４０２に記載の方法。
（項目４０４）
低複雑性配列が、トリヌクレオチド配列である、項目４００に記載の方法。
（項目４０５）
前記トリヌクレオチド配列が、反復エレメントを含む、項目４０４に記載の方法。
（項目４０６）
低複雑性配列が、テトラヌクレオチドまたはペンタヌクレオチド反復配列エレメントである、項目４００に記載の方法。
（項目４０７）
前記５’末端ドメインが、約８から約１００、または約８から約９０、または約８から約８０、または約８から約７０、または約８から約６０、または約８から約５０、または約８から約４０、または約８から約３０、または約８から約２０ヌクレオチドの長さである、項目４００～４０６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０８）
前記５’末端ドメインが、デオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、ロックド核酸、またはそれらの組合せを含む、項目４００～４０７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０９）
前記第１のアダプター配列がＰ５アダプター配列であり、前記第２のアダプター配列がＰ７アダプター配列である、項目４００～４０８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１０）
前記十分な条件が、その後のＰＣＲサイクルでのアニーリング期間よりも長い、最初の２回のＰＣＲサイクルでのアニーリング期間を含む、項目４００に記載の方法。
（項目４１１）
前記最初の２回のＰＣＲサイクルでのアニーリング期間が、１分よりも長く、前記その後のＰＣＲサイクルでのアニーリング期間が１分またはそれ未満である、項目４１０に記載の方法。
（項目４１２）
指定モル分量の次世代配列決定（ＮＧＳ）ライブラリーを作製する方法であって、
第１のプライマーおよび第２のプライマーを、それぞれそれらの５’および３’末端に第１のアダプターおよび第２のアダプターを保持する核酸分子のプールを含む前記ＮＧＳライブラリーに添加して、ＰＣＲ反応混合物を得るステップであって、前記第１および第２のアダプターが、それぞれそれらの５’末端および３’末端にアダプター配列および低複雑性ヌクレオチド配列を含み、前記第１および第２のプライマーが各々、それぞれ、前記アダプター配列の少なくとも一部分に、ならびに前記第１および第２のアダプターの低複雑性配列にハイブリダイズするのに十分に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記第１のアダプターの前記低複雑性ヌクレオチド配列が、前記第２のアダプターの前記低複雑性ヌクレオチド配列とは異なり、それに相補的でなく、前記第１および第２のプライマーが、前記指定モル分量の前記ＮＧＳライブラリーと等しい濃度で添加される、ステップと、
前記ＰＣＲ反応混合物を、前記指定モル分量の前記ＮＧＳライブラリーを生成するのに十分な条件下で、ＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートするステップと
を含む方法。
（項目４１３）
前記十分な条件が、すべてのＰＣＲサイクルで同じであるアニーリング期間を含む、項目４１２に記載の方法。
（項目４１４）
各処理された核酸分子が、３’突出を含む、項目１に記載の方法。
（項目４１５）
前記３’突出が、プライマーを介して塩基をＰＣＲで組み込み、その後切断して前記３’突出を産出することにより得られる、項目４１４に記載の方法。
（項目４１６）
切断可能な塩基が、デオキシウリジン、リボヌクレオチド、およびイノシンからなる群から選択される、項目４１５に記載の方法。
（項目４１７）
前記３’突出が、プライマーを介してヌクレアーゼ耐性修飾をＰＣＲで組み込み、その後前記組み込まれたプライマーを前記ヌクレアーゼ耐性修飾へと５’エキソヌクレアーゼ消化して３’突出を産出することにより得られる、項目４１４に記載の方法。

Claims

配列決定アッセイにおいて後に使用するために、プローブにライゲートされた標的分量の処理された核酸分子を、開始分量の処理された核酸分子から得る方法であって、
処理された核酸分子を含む試料を提供するステップであって、前記処理された核酸分子が、前記開始分量で前記試料に存在し、前記開始分量が、前記標的分量よりも大きい、ステップと、
リガーゼおよび前記プローブを前記試料に添加して、第１の反応混合物を得るステップであって、前記プローブが、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する修飾を含み、前記プローブが、前記プローブにライゲートされた前記標的分量の処理された核酸分子を得るのに十分な量で添加される、ステップと、
前記第１の反応混合物を、前記プローブと前記標的分量の処理された核酸分子とのライゲーションを可能にするのに十分な条件下でインキュベートするステップと、
前記第１の反応混合物をインキュベートした後に、
エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を前記第１の反応混合物に添加して、第２の反応混合物を得るステップと、
前記第２の反応混合物を、前記プローブにライゲートされていない前記処理された核酸分子の消化を可能にするのに十分な条件下でインキュベートし、それにより、前記プローブにライゲートされた前記標的分量の処理された核酸分子を得るステップと
を含み、
前記処理された核酸分子が第１の５’突出を含み、前記プローブの少なくとも一部分が前記５’突出の少なくとも一部分に相補的であり、前記酵素が３’エキソヌクレアーゼ活性を有するか；または
前記処理された核酸分子が３’突出を含み、前記プローブの少なくとも一部分が前記３’突出の少なくとも一部分に相補的であり、前記酵素が５’エキソヌクレアーゼ活性を有する、
方法。
前記開始分量の処理された核酸分子を含む前記試料を提供する前に、
（ｉ）複数の核酸分子、
（ｉｉ）第１の部分、第２の部分および第３の部分を含む第１のプライマーであって、前記第１の部分が、前記第１のプライマーの３’末端に位置し、前記複数の核酸分子の各核酸分子の第１の標的部分に配列が相補的であり、前記第２の部分が、３つまたはそれよりも多くの連続リボヌクレオチド塩基を含み、前記第１の部分に５’隣接して位置し、前記第３の部分が、前記第２の部分に５’隣接して位置し、２つまたはそれよりも多くのデオキシヌクレオチドを含む、第１のプライマー、
（ｉｉｉ）前記複数の核酸分子の各核酸分子の第２の標的部分と同一である、第４の部分を含む第２のプライマー、
（ｉｖ）デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、ならびに
（ｖ）３’－５’エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである、ＤＮＡポリメラーゼ
を含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）混合物を提供するステップと、
前記ＰＣＲ混合物を、前記ＤＮＡポリメラーゼが前記第１のプライマーおよび第２のプライマーの伸長を可能にするのに十分な条件下でインキュベートし、それにより、処理された核酸分子を含む前記試料を得るステップであって、前記第１のプライマーおよび第２のプライマーが、前記複数の核酸分子の少なくとも一部を増幅するのに十分であり、
前記ＰＣＲ混合物のインキュベート後に産生された前記処理された核酸分子が、前記第１のプライマーの前記第３の部分、および前記第１のプライマーの前記第２の部分の３つまたはそれよりも多くの連続リボヌクレオチド塩基の少なくとも１つを含む、前記第１の５’突出をそれぞれ含む、ステップと
をさらに含む、請求項１に記載の方法であって、前記３つまたはそれよりも多くの連続リボヌクレオチド塩基が、ｒＵまたはｒＡ塩基を含む、方法。
エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対する耐性を提供する前記修飾が、少なくとも１つのホスホロチオエート連結を含む、請求項１に記載の方法。
各処理された核酸分子が前記第１の５’突出を含み、前記処理された核酸分子とのプローブライゲーションが、付着末端ライゲーションである、請求項１に記載の方法。
前記第１の５’突出が、ポリ（Ａ）、ポリ（Ｔ）、ポリ（Ｇ）、ポリ（Ｃ）、ポリ（ＡＧ）、ポリ（ＡＣ）、ポリ（ＧＴ）、ポリ（ＣＴ）、ポリ（ＡＴ）、ポリ（ＧＣ）、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、およびペンタヌクレオチドからなる群から選択される低複雑性配列を含む、請求項４に記載の方法。
前記低複雑性ヌクレオチド配列が、前記第１の５’突出の末端位置にある、請求項５に記載の方法。
処理された核酸分子を含む前記試料を精製して、未使用の第１のプライマーおよび第２のプライマーを除去するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
前記リガーゼが、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ＤＮＡリガーゼ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ、９°Ｎリガーゼ、およびＰｆｕＤＮＡリガーゼからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
前記プローブが、一本鎖ＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
前記第２のプライマーが、前記第４の部分に５’隣接して位置する、３つまたはそれよりも多くの連続リボヌクレオチド塩基を含む第５の部分、および前記第５の部分に５’隣接して位置し、２つまたはそれよりも多くのデオキシヌクレオチドを含む第６の部分をさらに含み、前記ＰＣＲ混合物のインキュベート後に産生された前記処理された核酸分子が、前記第２のプライマーの前記第６の部分、および前記第２のプライマーの前記第５の部分の３つまたはそれよりも多くの連続リボヌクレオチド塩基の少なくとも１つを含む、第２の５’突出をそれぞれ含む、請求項２に記載の方法。
前記プローブが、５’ホスフェートと、３’末端におけるＣ３スペーサーまたはホスフェートとをさらに含む、請求項１に記載の方法。
各処理された核酸分子が、前記第１の５’突出を含み、前記第１の５’突出が、５～５０塩基を含む、請求項１に記載の方法。
各処理された核酸分子が、前記第１の５’突出を含み、前記プローブの少なくとも一部分が、前記第１の５’突出の少なくとも一部分に相補的である、請求項１に記載の方法。
前記第１のプライマー；
前記第２のプライマー；
前記リガーゼ；
前記プローブ；および
前記エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素であって、３’エキソヌクレアーゼ活性を有する、酵素
を含む、請求項２、７または１０に記載の方法において使用するためのキット。
前記リガーゼがＴ４ＤＮＡリガーゼである、請求項１４に記載のキット。
前記エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素がエキソヌクレアーゼＩＩＩである、請求項１４に記載のキット。
前記プローブが、前記第１のプライマーの前記第３の部分の少なくとも一部に相補的である、請求項１４に記載のキット。
前記第２のプライマーが、第４の部分、前記第４の部分に５’隣接して位置する３つまたはそれよりも多くの連続リボヌクレオチド塩基を含む第５の部分、および前記第５の部分に５’隣接して位置し、２つまたはそれよりも多くのデオキシヌクレオチドを含む第６の部分をさらに含む、請求項１４に記載のキット。
３’－５’エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を有する熱安定性ポリメラーゼをさらに含む、請求項１４に記載のキット。
前記第１のプライマーの前記第３の部分が、ポリ（Ａ）、ポリ（Ｔ）、ポリ（Ｇ）、ポリ（Ｃ）、ポリ（ＡＧ）、ポリ（ＡＣ）、ポリ（ＧＴ）、ポリ（ＣＴ）、ポリ（ＡＴ）、ポリ（ＧＣ）、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、およびペンタヌクレオチドからなる群から選択される低複雑性配列を含む、請求項１４に記載のキット。
前記プローブが、前記低複雑性配列に相補的な配列を含む、請求項２０に記載のキット。
前記プローブが、一本鎖ＤＮＡを含み、前記プローブが、５’ホスフェートを含む、請求項１４に記載のキット。