JPH10508746A

JPH10508746A - ｒａｓがん遺伝子、特にＫ−ｒａｓがん遺伝子の検出方法

Info

Publication number: JPH10508746A
Application number: JP8515836A
Authority: JP
Inventors: ブレイヴィク、ヤルレ; グスタフガウデァナック
Original assignee: メディノバエスエフ
Priority date: 1994-11-11
Filing date: 1995-11-10
Publication date: 1998-09-02
Also published as: EP0791074A2; WO1996015262A2; EP0791074B1; GB9422814D0; WO1996015262A3; CA2205017A1; DE69525468D1; US6090546A; AU3851495A; ATE213276T1; AU704784B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、試験官内増幅の使用のためのオリゴヌクレオチドプライマー配列に関するものであり、特に、前記プライマー配列は、野生型のＫ−ｒａｓがん遺伝子のＢｓｔＸＩ制限位置の重複コドン（１２）および／またはＸｃｍＩ制限位置の重複コドン（１３）、または、Ｂｃｅ８３Ｉ制限位置の重複コドン（６１）を創出可能である。また、本発明は、Ｋ−ｒａｓがん遺伝子（１２および／または１３および／または６１）コドン中の活性化された突然変異を検出するための前記プライマー配列の使用方法に関し、また前記方法を実施するためのキットに関する。

Description

【発明の詳細な説明】ｒａｓがん遺伝子、特にK-ｒａｓがん遺伝子の検出方法本発明はｒａｓがん遺伝子、特にK-ｒａｓ遺伝子における突然変異の検出に関する。ｒａｓがん遺伝子はある範囲のガンの発生に関係している。特に、ｒａｓ遺伝子の特定の部位において体細胞的に誘導され活性化された突然変異は、腫瘍形成の過程において重要な原因事象であると考えられている。ｒａｓ遺伝子突然変異は、肺、甲状腺、結腸、直腸、膵臓および胸部のガンならびにある種の黒色腫と白血病を含むヒト腫瘍の約30％に認められるが、その発生率は腫瘍のタイプによって様々である。さらに、ある種の実験的腫瘍系は活性化したｒａｓ遺伝子を伴うことが示されている。より具体的には、K-ｒａｓ遺伝子の突然変異は膵臓癌腫の90％、肺腺癌の50％、結腸腺癌の40％にもなると報告されている。ｒａｓがん遺伝子の活性化は、ほとんどの場合、位置12での突然変異を伴うようであるが、例えば位置13や位置61などの他の位置での活性化も一般的に観察される。そこで近年、いくつかのｒａｓ突然変異検出用試験が、腫瘍形成経路におけるそれらの機能を解明するための手段として、さらにはガンの診断と予後における潜在的な用途のために開発されている。プライマー媒介制限断片長多形性（RFLP）分析は、突然変異ｒａｓ遺伝子を迅速簡便かつ大規模に検出するための迅速な非放射活性法として開発された（Kahn ら，1990，Amplifications，4，22-26）。この方法は、ｒａｓ配列増幅用のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）と、正常な（野生型）ｒａｓ配列のみの選択的制限切断（突然変異ｒａｓ配列は制限切断されない）を可能にする制限エンドヌクレアーゼ部位の導入によっている。この方法のPCR増幅に使用するｒａｓ遺伝子プライマーには、潜在的活性化部位（位置12、13または61など）に重なる制限部位を作成するよう機能する戦略的なヌクレオチド置換が組込まれている。標的コドンの診断的制限部位は活性化突然変異の存在下では失われるので、突然変異配列の検出が可能になる。しかし、突然変異配列と正常配列の両方がPCR段階によって増幅されて感度が損なわれるので（正常な野生型DNA中で突然変異ｒａｓ配列の数は極めて少ないだろう）、この手法によるｒａｓ突然変異の検出には限界がある。そこでさらに最近になって、突然変異ｒａｓ配列を選択的に増幅するというRFLP技術の改良法が開発された（例えばKahnら，1991，Oncogene，6 ;1079-1083を参照のこと）。これはこの技術の診断能力を著しく増進し、104までの野生型配列の存在下で突然変異ｒａｓ対立遺伝子が検出できるようになった。ｒａｓ突然変異検出はプライマー媒介RFLP分析を突然変異配列の選択的増幅と組み合わせることによってかなり進歩したが、それでもなお、例えばこの方法の感度や選択性などにはまだ改善の余地があり、そのような改善策が引き続き探求されている。このようにｒａｓ遺伝子内の突然変異検出法の改善が現在も必要とされており、本発明はそのような改善法を提供しようとするものである。本発明者らの努力は具体的にはK-ｒａｓ遺伝子に向けられ、さらに具体的には、多くの一般的なガン（とりわけ結腸直腸ガン）の発生に関係すると考えられているK-ｒａｓ遺伝子のコドン12、13および61における活性化突然変異の検出に向けられた。そこで本発明者らは、増幅またはRFLPに基づくｒａｓ突然変異検出法で使用する際に有利な新規プライマー系を設計した。このプライマー系はK-ｒａｓ遺伝子のコドン12および/または13における突然変異の検出を可能にする。もう1つのプライマー系はコドン61における突然変異の検出を可能にする。したがって本発明は、1つの側面として、そのプライマー配列が野生型K-ｒａｓがん遺伝子のコドン12に重なるBstX I制限部位および/またはコドン13に重なるXcm I制限部位を生じさせる能力をもつことを特徴とする試験管内増幅用オリゴヌクレオチドプライマー配列を提供する。野生型ヒトK-ｒａｓ遺伝子の配列を図1に示す。本発明のプライマーによる制限部位の形成は、そのプライマー内のある部位に、野生型遺伝子配列中に存在する塩基と一体となって所望の制限部位を生じさせるようなミスマッチを用意することによって達成される。したがって本発明のプライマー配列は、K-ｒａｓ遺伝子のコドン8の最後の塩基とコドン9の最初の2塩基にCCA置換を含むことができる。そのようなプライマーを用いて野生型K-ｒａｓ配列の試験管内（PCRなどによる）増幅を行うと、2つの制限部位が生成する。1つはコドン12の最初の2つの潜在的活性化塩基に重なり（つまり野生型コドン12に特異的）、もう1つはコドン1 3の最初の2つの潜在的活性化塩基に重なる（つまり野生型コドン13に特異的）。コドン12と13の最後の塩基位置における突然変異は、コード化されるアミノ酸の変化を引き起こさないので、活性化突然変異とは思われない。しかし、このようなプライマーを用いてコドン12および13内の活性化位置におけるK-ｒａｓ配列突然変異を増幅すると、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を完成するのに必要な「正しい」塩基が存在しないので、制限部位が生成しない。つまりこれによってコドン12および13に活性化突然変異を含有するK-ｒａｓ配列を野生型配列と識別することができるし、さらに重要なことには、野生型配列を除去することができるので、突然変異配列の選択的な増幅が可能になる。本発明のプライマーは、コドン12とコドン13の両方に重なる制限部位が生成し、これらの部位の一方または両方にある突然変異を同じ系で簡単に検出できるという点で有利である。つまり、単一のプライマーを使用して2つの部位の突然変異の有無を検出することができるので、操作がかなり簡便化され、迅速になる。両遺伝子座にある制限部位を利用することによって、両コドンにおける活性化を伴うガン（結腸直腸ガンなど）のスクリーニング効率やその技術の正確さが増大する。異なるガンには、K-ｒａｓ遺伝子中の異なる（冒されたコドンの位置だけでなく、その性質、すなわち関与する実際の塩基置換が異なる）突然変異が伴い得る。したがって突然変異の異なる組み合わせは異なる腫瘍に特有であり得る。また、考えうるすべての位置で突然変異を同定することは、個々の腫瘍を診断する際の助けとなるだろう。上述のようにK-ｒａｓ遺伝子のコドン61もよく冒されるが、これはしばしば、コドン12および/または13での突然変異によって引き起こされるガンとは異なるガンに伴う。したがって、コドン12および13における突然変異に加えて、コドン61における突然変異をも同定することができれば有益であろう。そこで、本発明のコドン12/13プライマーの使用をコドン61での突然変異を検出するように（すなわち野生型K-ｒａｓ遺伝子のコドン61に重なる制限部位を導入することによって）設計したプライマーの使用と組み合わせると有利である。つまり、例えばコドン61に重なるBce 83I制限部位を生じさせるプライマーを使用することができる。したがって本発明は、もう1つの側面として、そのプライマー配列が野生型K- ｒａｓがん遺伝子のコドン61に重なるBce 83I制限部位を生じさせる能力をもつことを特徴とする試験管内増幅用オリゴヌクレオチドプライマー配列を提供する。このようなプライマーはコドン61において考えうる突然変異をすべてカバーし、正確な診断を与えると期待できるので有利である。コドン61用の代表的プライマーはK-ｒａｓ遺伝子のコドン60の第2塩基でのC置換に対応する配列を含み得る。異なる位置における異なる突然変異を同定することは、関係する特定のガンに治療を集中させることが可能になるので、治療的にきわめて有利であろう。つまり例えば、同定されたK-ｒａｓ突然変異を保持する細胞を殺すようにT-細胞を刺激する免疫療法などによって、治療を特定の突然変異に向けることができる。そのような免疫治療技術はNorsk Hydro ASのWO92/14756に記述されている。さらに、突然変異が起こっているコドンだけでなく、関係する実際の突然変異をも決定することにも価値がある。上述のように、ある種のガンには特定の置換が伴い、さらに膵臓ガンなどのいくつかのガンについては、ある種の突然変異が他の突然変異よりもよい予後を与える。言い換えれば、ガンの予後は突然変異の正確な性質に依存しうるのである。したがって、冒されたコドンの同定に引き続いてその配列を決定することには臨床的な価値もある。本発明によって選択可能となり得る標的療法には、上述の免疫療法に加えて、リボザイム（JP-A-4235919）とアンチセンスRNA（WO92/15680）の使用が含まれる。ｒａｓがん遺伝子の産物は、それがその効果を発揮する前に、修飾（より具体的にはファルネシル化）によって活性化される。したがってもう1つの治療法には、ファルネシルトランスフェラーゼ酵素の阻害が含まれうる（例えばEP-A-5 37008を参照のこと）。本発明のプライマーの長さは、それが鋳型への正しいアニーリングが起こるのに十分である限り、重要でない。例えば20〜35塩基の長さが好適であり、好ましいプライマーは例えば22〜30ヌクレオチド長であり得る。また好ましいプライマーは潜在的活性化位置まで（もしくはその直前に）アニールしうる。例えば位置 12と13については、そのようなプライマーが3′末端配列：5′．．．CCATGGAGCT 3′（塩基CCAはK-ｒａｓ遺伝子のコドン8の最後の塩基とコドン9の最初の2塩基に対応する）を含みうる。プライマーに固体支持体への固定化手段を与えて、例えば増幅および/または検出段階におけるその後の取り扱いと操作を容易にすることができる。固定化手段と支持体の性質は選択の問題である。数多くの好適な支持体と、それにヌクレオチドを結合する方法が当該技術分野では良く知られており、文献に幅広く記述されている。例えばアガロース、セルロース、アルギン酸塩、テフロン、ラテックスまたはポリスチレン製の微量滴定ウェル、管、計量棒、粒子、繊維または毛細管などの形態の支持体を使用することができる。支持体が磁気粒子を含んでいれば、磁気凝集によって固定化物質を容易に分離できるので便利である。固体支持体はヌクレオチドを結合するために、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒドまたはアミノ基などの官能基を保持するだろう。これらは一般に、そのような官能基の1つを持つポリマー（例えばヒドロキシル基を与えるためのポリグリコールとポリウレタン、ヒドロキシル基を与えるためのセルロース誘導体、カルボキシル基を与えるためのアクリル酸やメタクリル酸のポリマーまたはコポリマー、アミノ基を与えるためのアミノアルキル化ポリマー）の表面皮膜を与えるように支持体を処理することによって提供することができる。米国特許第4, 654,267号には、数多くのそのような表面皮膜の導入が記述されている。あるいは、支持体が他の結合用部分、例えばアビジンやストレプタビジン（ヌクレオチド配列上のビオチンに結合する）、DNA結合タンパク質（例えば出発分子中に存在し得るlacオペレーター配列に結合するlac I抑制タンパク質）あるいは抗体または抗体断片（ヌクレオチド配列上のジゴキシゲニンのようなハプテンに結合する）を保持してもよい。分子生物学ではストレプタアビジン/ビオチン結合系が非常によく使用される。それはビオチンをヌクレオチド配列内に組込むことが比較的容易で、実際にビオチン標識ヌクレオチドが市販されているからである。したがってビオチンは特に好ましい固定化法である。固相増幅法を使用しようとする場合には、潜在的活性化位置の上流に1以上の制限部位を追加するようなミスマッチを、本発明のプライマーに追加することができる。そのような追加制限部位での切断を用いれば、ヌクレオチド配列を固体支持体から迅速かつ簡単な方法で分離することができる。本発明の好ましいプライマー配列は次の塩基配列を持ち、これをプライマー5K 1と命名する。 CCAはK-ｒａｓ遺伝子のコドン8の塩基3とコドン9の塩基1および2に対応するミスマッチであり、上述のように、野生型K-ｒａｓ遺伝子のコドン12と13中の活性化位置に重なる制限部位を導入するように機能する。上述のように、活性化位置の上流に制限部位を追加できるように、プライマー5K1を修飾してもよい。例えば、5K1-Dra Iと命名した修飾プライマーは、という塩基配列を持ち、K-ｒａｓ配列のコドン3の位置２に対応する追加のミスマッチTを含む。このプライマーは支持体からの切断用にDra I部位を導入するよう機能する。固相技術の利用を容易にするため、プライマーをビオチニル化してもよい。コドン61用の好ましいプライマーは次の塩基配列を持ち得る。 CはK-ｒａｓ遺伝子のコドン60の塩基2に対応するミスマッチであり、上述のように、野生型K-ｒａｓ遺伝子のコドン61に重なるBce 831制限部位を導入するよう機能する。エンドヌクレアーゼBce 83Iの切断部位は次の通りである。例えば他の異なる制限部位または追加制限部位を上流位置に作成したり、あるいは上述のように、所望の制限部位の形成を媒介する機能を持つ機能的に等価な類似プライマー配列を作成するように、プライマーを修飾してもよい。本発明のプライマーは、上述のように、調査しようとする（つまり活性化K-ｒａｓ突然変異を検出しようとする）試料中のK-ｒａｓ配列の（例えばKahnら（上記）に記載の方法による）試験管内増幅に使用される。そのような試料には例えば血液、血清、尿、つば、腹水や他の生物学的液体、組織生検（新鮮なものであってもよいし、固定したものであってもよい）やさらには便試料が含まれ、任意に標準的な技術を用いて核酸を放出するように適当に処理されたものであってもよいが、それらは一般に、圧倒的に多量の野生型K-ｒａｓ配列と微量の突然変異活性化K-ｒａｓ配列を含む。そこで、例えば本出願人の同時係属英国特許出願第 9323305.4号（1993年11月11日出願）の核酸単離技術を使用してもよい。これには試料を煮沸し、それを大表面積固体支持体上で冷却し、該支持体内に濃縮することが含まれる。良く知られていて文献に記述されている任意の試験管内増幅技術を使用することができる。しかし一般的にはPCRとその改良法が最もより抜きの方法であろう。古典的なPCRの場合は当然、標的DNAの対立する鎖にハイブリッド形成する2つのプライマーが必要である。本発明のプライマーはこの点では5′（または上流）増幅プライマーとして使用され、3′（または下流）増幅プライマーは適当に選択することができる。この第1増幅段階では、3′プライマーの選択は、それが特異的な増幅を可能にするに足る特異性で鋳型にアニールできる限り、特に重要ではない。好適な3′増幅プライマーには例えば次の配列を持つものが含まれる。上記プライマー5K1、3K1および3K3の野生型ヒトK-ｒａｓ遺伝子に関する配列と位置を図2に示す。図2には生成するそれぞれの制限エンドヌクレアーゼ認識部位も示してある。このようなプライマー配列の機能的に等価な修飾物も使用できる。古典的PCR法の改良法には、例えばネステッドプライマーの使用が含まれる。ここでは第1の「外側」プライマー対の間に「収まる（ネスト）」（またはハイブリッド形成する）さらに2つの「内部」プライマーを使用する。4つの独立した始動事象を用いることによって、増幅反応の特異性が増大する。言及する価値のある他の増幅技術には、自己持続配列複製（SSR）とQ-ベータレプリカーゼ増幅系が含まれる。 SSRでは、ポリメラーゼ結合部位を持ち逆転写酵素の作用による標的RNAまたは ssDNAの増幅を可能にするプライマーを使用する。 Q-ベータレプリカーゼ系では、固定化したプローブによって標的DNAの1つの鎖を捕らえた後、RNA依存性RNAポリメラーゼ（通常はQ-ベータレプリカーゼ）のために、MDV-1として知られている三次構造を鋳型領域として持つRNAプローブとのハイブリッド形成を起こさせる。この第1増幅段階の結果として、K-ｒａｓ断片群が生成する。増幅された野生型対立遺伝子断片はプライマー媒介制限部位を含有し、一方、突然変異対立遺伝子断片はこれを含有しない。次に、増幅混合物の一部を従来の条件下で適当な制限酵素で消化する。次に突然変異K-ｒａｓ対立遺伝子を検出すべく、その産物を、例えばKahnら，1990（上記）のRFLP分析法による直接分析にかけてもよいが、より好ましくは、例えばKahnら，1991（上記）の方法に従って、突然変異配列の選択的「濃縮」増幅のためのさらなる増幅工程にかける。この工程では、野生型配列は切断されているので、さらなる増幅を受け付けない。この第2の「濃縮」増幅段階の後、増幅混合物を突然変異K-ｒａｓ配列の検出にかけることができる。これは制限エンドヌクレアーゼ消化とKahnら，1990（上記）の方法によるRFLP分析または他の検出法によって行うことができる。これに関連して「固定化増幅核酸の検出」またはDIANAとして知られる検出法について特に言及しておく。この技術を使用することはとりわけ有利である（WO90/11369 を参照のこと）。 DIANA検出系では、ネステッドプライマー（つまり第１サイクル系列で標的核酸を増幅するための第1プライマー対と第2サイクル系列で第1プライマー対間にハイブリッド形成する第2プライマー対）を用いてさらにPCR増幅工程を行う。第 2サイクルで使用する内部プライマーはそれぞれ、増幅したDNAの捕捉を可能にするための固定化手段と、認識を可能にするための標識の結合手段または標識とを持つ。固定化手段は例えばビオチンやジゴキシゲニンのようなハプテンであってもよく、一方、シグナルの結合手段には、異なるハプテンや、あるいは好ましい態様としては、DNA結合タンパク質に結合する能力と適当な標識とを持つ5′-非ハイブリッド形成DNA配列（lacオペレーターなど）が含まれる。5′-非ハイブリッド形成DNA配列を介して固定化手段を結合してもよい。正確さに対するさらなる検査として、あるいは一次検出法として、増幅した断片を既知の配列決定技術による配列分析にかけて、突然変異を確かめることもできる。上述のように、これには診断的観点から利点がある。重要な弁別的診断情報が得られるからである。都合のよいことに、分析前の最終増幅をサイクル配列決定法で行うことができる。これには塩基置換情報が直接的に得られるという利点がある。このような段階は自動工程にとってはとりわけ有利であろう。したがって本発明は、もう1つの側面として、K-ｒａｓがん遺伝子のコドン12 および/または13および/または61内の活性化突然変異検出用の試験管内増幅法における、上に定義した本発明オリゴヌクレオチドプライマー配列の使用を提供する。本発明をもう1つの側面から見ると、検出しようとする標的K-ｒａｓDNAを含有する試料を、上に定義した本発明のオリゴヌクレオチドプライマー配列を増幅プライマーとして用いる1サイクル以上の試験管内増幅にかけた後、BstX Iおよび/ またはXcm Iおよび/またはBce 83Iによる野生型K-ｒａｓ配列の制限エンドヌクレアーゼ消化を行い、任意の工程として1サイクル以上の試験管内増幅をさらに行って該活性化突然変異を含む突然変異K-ｒａｓ配列を濃縮し、得られた該増幅突然変異K-ｒａｓ配列を検出することを含む、K-ｒａｓがん遺伝子のコドン12および/または13および/または61内の活性化突然変異検出法を、本発明が提供すると見ることもできる。本発明に従って増幅工程を行う際には、増幅断片中に1以上の「対照」制限部位を追加することが好ましい。これは、上記の本発明5′プライマーについて記述したのと同様の方法で3′増幅プライマーを用いることによって、プライマー媒介的に達成することができる。つまり、3′増幅プライマー中に存在するミスマッチを用いて所望の対照制限部位（これは本発明の5′プライマーによって導入される部位に対応する）を作成することができる。これによって、制限酵素切断の正確さを監視するための系が提供される。つまり、例えば次の3′増幅プライマー配列を使用することができる：5′GAAT GGTCCT CCACCAGTA TATGGATATT A5′（プライマー3K2と命名）。位置CとGにおけるミスマッチはそれぞれBstX I制限部位とXcm制限部位を生じさせるように機能する。プライマー3K2とその相対的位置も図2に示す。追加の選択的「濃縮」増幅段階を本発明に従って使用する場合は、一般に、「修飾」内部対照3′プライマーを濃縮増幅段階で使用するだけでよい。場合によっては、例えば特異性および/または感度を増大させるために、この方法にさらなる改良を加えることが望ましいこともあるだろう。つまり、野生型 K-ｒａｓ配列が酵素切断段階で完全には消化されず、未消化の野生型配列がいくらか残るということも時々起こるだろう。また、突然変異鎖と野生型鎖が再アニールして制限酵素によって認識されないヘテロ二本鎖を形成することもあるだろう。後の「濃縮」選択的増幅段階の特異性を増大させるために、例えば特異性をさらに増大させるためのネステッドプライマーを用いて、追加の増幅段階と制限切断段階を行ってもよい。これについては後述の実施例でより詳細に説明し、図 3に模式的に図示する。2つの制限エンドヌクレアーゼ切断段階を用いることによって、感受性を1:100,000まで改善できることが示された。さらなる改良には、上述のように、増幅産物を固定化するための固体支持体の使用が含まれる。この場合は、上述のように、増幅プライマーの一方または両方にビオチンやハプテンなどの固定化手段を与えることができる。このような固相系の使用は、それがよりきれいでより効果的であり、しかも全工程を一つの管中で行い得るので損失を最小限にとどめることができるという点で有利である。すべての増幅段階では、当該技術分野でよく知られている標準的な条件を用いて増幅サイクルを行うことができる。しかし、特異性と感度を増大させるには、総サイクル数を最小限にとどめ、高い厳密さで増幅プライマーをハイブリッド形成させることが好ましい。本発明のオリゴヌクレオチドは、Cyclone DNA合成装置（Biosearch Inc.）などの従来の機械合成装置を用いて既知の技術によって合成することができる。また本発明は、少なくとも1つの本発明オリゴヌクレオチドプライマー配列を含む、K-ｒａｓがん遺伝子のコドン12および/または13および/または61中の活性化突然変異検出用キットにも及び得る。このようなキットは通常次のような追加成分をも含むだろう。（a）PCR用には、ポリメラーゼと、少なくとも1つの他のオリゴヌクレオチドプライマー；オリゴヌクレオチドは共にDNAに基づき、標的DNAの反対鎖にハイブリッド形成する。（b）DIANA用には、ポリメラーゼと、固定化手段および標識手段を与えられた本発明のPCRオリゴヌクレオチドプライマー。（c）3SR用には、逆転写酵素と、もう１つのDNAオリゴヌクレオチドプライマー；オリゴヌクレオチドは共にポリメラーゼ結合部位を与えられている。（d）Q-ベータレプリカーゼ増幅用には、RNA依存性RNAポリメラーゼと、5′-MDV -1構造を持つRNAプローブ；捕捉オリゴヌクレオチドは固定化されているか、もしくは固定化が可能である。上述のキットではいずれの場合も、通常はヌクレオチド塩基が適当な緩衝液と共に供給されるだろう。以下の実施例は以下の図面を参照しつつ例示のために記載するに過ぎない。図1は、ヒト細胞がん原遺伝子K-ｒａｓ（c-ki-ｒａｓ2）のヌクレオチド配列と対応するアミノ酸配列を示す。突然変異多発部分に下線を付す。図2は、実施例で使用するプライマーの配列と野生型K-ｒａｓ遺伝子に関するそれらの位置を示す。制限エンドヌクレアーゼBstX IとXcm Iの切断部位をも示す。図3は、実施例1および2に記載の本発明K-ｒａｓ突然変異検出法を行う際に含まれる段階の模式図である。図4は、実施例２の増幅産物を臭化エチジウムを含む4％アガロースゲルで電気泳動して、UV光下で分析した結果を示す。図5は、実施例２の産物の配列分析の結果を示す（6％ポリアクリルアミドゲル）。3A面は針生検（試料3A）から得た突然変異産物の配列を示す。3B面は、同じ手法ではあるが、2回の非突然変異増幅産物中間破壊中にエンドヌクレアーゼ（B st XI）を加えなかった場合に、同じ試料から得られる配列を示す。実施例１本実施例は、本発明のプライマーを用いてK-ｒａｓ遺伝子のコドン12中の突然変異を検出する本発明方法の実施を一般的に説明するものであり、図3にはこれを模式的に表す。 1：DNAは異なるタイプの試料（つば、排泄物、固定組織、尿、腹水、血液など）から単離することができる。 2：少量の試料を、調べようとする遺伝子用のビオチニル化オリゴヌクレオチドプローブを含む塩緩衝液と混合する。次にその管を加熱し、ボルテックスにかけてDNA鎖を解き、変性させる。この実験では、正常DNA（過剰）とK-ｒａｓ遺伝子のコドン12の第2塩基に点変異（G→A）を持つDNAの混合物を使う。 3：溶液を冷却すると、プローブが変性DNAに結合する。 4：磁気ストレプタアビジン被覆ビーズを溶液に加えると、DNAがビーズに非特異的に結合すると共に、ストレプタアビジン-ビオチン結合によって結合する（ビオニチル化プライマーがある場合）。 5：結合したDNAを持つビーズを汚染した残渣と阻害物質から磁気分離によって単離し、鋳型としてPCR増幅に加える。 6：修飾5′プライマー（5K1）と通常の3′プライマー（3K1）を用いて増幅を行う。 7：誘導した修飾を含有する増幅産物が生成する。次にこの産物を、使用するエンドヌクレアーゼのタイプだけが異なる2つの並行操作に使用する。 8a：増幅産物を配列CCANNNNNNGTT（N＝G,T,AまたはC）に特異的なエンドヌクレアーゼ（BstX 1）と共にインキュベートする。 8b：増幅産物を配列CCANNNNNNNGTT（N＝G,T,AまたはC）に特異的なエンドヌクレアーゼ（Xcm 1）と共にインキュベートする。 9a：BstX 1は正常なコドン12を持つ産物を切断するが、突然変異産物を切断しない。いくつかの理由から、正常配列の完全な切断が起こらないことがある。 9b：コドン13には突然変異がないので、Xcm 1は正常産物と突然変異産物の両方を切断する。いくつかの理由から、産物の完全な切断が起こらないことがある。 10a/b〜13a/b：消化産物を段階6と同じ増幅の鋳型として用いる。ほとんどの正常産物は酵素によって切断されているので、突然変異産物が選択的に増幅される。エンドヌクレアーゼ消化は感度を増大させると報告されている。 14a/b：消化産物を、2つの制限部位の両方を含む修飾3'プライマー（3K2）とビオチニル化5′プライマー（5K1-ビオ）を用いる増幅の鋳型とする。 15a/b：修飾を含有する増幅産物が生成する。 16a/b：その産物をそれぞれのエンドヌクレアーゼで消化する。 17a：突然変異産物は3K2によって導入された対照部位でのみ切断され、正常産物は両方の部位で切断される。 17b：コドン13には突然変異がないので、産物のすべてが両部位で切断される。 18a：図は、試料中の突然変異対正常比の相違が消化した最終産物の電気泳動上でどのように見えるかを示している。133bpバンドは突然変異を示し、正常産物は107bpバンドをもたらす。未消化産物は152bpのバンドとして見える。 18b：コドン12に突然変異を持つ試料から得た産物のすべてがXcm 1によって切断される。この酵素は野生型コドン13を持つ増幅産物に特異的である。 19a/b：電気泳動から、突然変異があるかどうかと、どのコドンに突然変異があるかを決定できる。塩基置換のタイプを同定するため、産物のビオチニル化鎖を固相配列決定法で配列決定する。実施例２膵臓ガンから得たホルマリン固定パラフィン包埋針生検中のK-ｒａｓ突然変異の検出この実施例は実施例１に記載の一般的方法を用いて行った。試料と対照： 1：K-ｒａｓコドン12突然変異（GTT）を持ち、正常な対立遺伝子を持たないことがわかっている結腸癌細胞系SW480 2：正常な結腸粘膜から得たホルマリン固定パラフィン包埋組織 3：膵臓ガンから得たホルマリン固定パラフィン包埋針生検（1mm×10mm） 4：蒸留水（DNAを含まない対照） DNA調製：細胞系から： SW480のDNAを抽出（フェノール/クロロホルム）し、標準的な方法で定量する。このDNA 1μgを突然変異の陽性対照とする。パラフィンブロックから： 5μm厚のスライド2枚を各ブロックから切り取る。各切断の前に、ミクロトームの刃をキシロールで2回、エタノールで1回洗浄する。結合および洗浄緩衝液（Dynal,ノルウェイ），400μl： Tris-HCl 10mM，pH7.5 EDTA 1mM NaCl 2.0M 5K1-ビオ 3pmol を含む500μl微量遠心管にスライドを加える。遠心管をサーマルサイクラー中94℃で5〜10分間インキュベートする。このインキュベーション中に、内容物をボルテックス攪拌器で20秒間、2回混合する。遠心管が周囲温度に冷えたら（約3分間）、液相をピペットで取り出し、ストレプタビジン被覆常磁性ビーズ（Dynabeads（著作権）M-280ストレプタビジン， Dynal,ノルウェイ）20μgと混合する。その混合物を周囲温度に15分間放置する。ビーズを磁気分離（Dynal MPC（著作権）-E，Dynal,ノルウェイ）で単離し、増幅反応の鋳型として用いる。増幅： 3回（A1、A2およびB）の連続的PCRを、特異的エンドヌクレアーゼ（この場合はBstX 1）による2回の非突然変異対立遺伝子中間破壊と共に行う。誤始動を避けるため、「熱ショック」PCR法を行う（すなわち反応混合物がある温度に達するまで増幅反応を開始しない）。これは基本的な試薬を高温で融解するワックス（Para Clean II（融点範囲55〜57℃），Klinipath,オランダ,Zevenaar）の層で分割することによって達成される。 PCR増幅を総体積50μl中で行った： dNTP それぞれ0.025mM 塩化カリウム 50mM 塩化マグネシウム 1.5mM Tris-HCl 10mM pH8.4 ゼラチン 0.01％プライマーそれぞれ0.2μM Taqポリメラーゼ 2.5単位（AmpliTaq（登録商標）DNAポリメラーゼ，Perki n Elmer，米国コネティカット州）ワックス（17μl）で反応混合物を等体積の２区画に分割する。下側の区画のみがdNTPとプライマーを含み、ポリメラーゼと鋳型はワックス層の上に加える。熱サイクルは、GenAmp PCR System 9600（Perkin-Elmer，米国コネティカット州）を用いて200μl MicroAmp反応管中で行う。 1サイクルは、94℃で30秒間の変性、50℃で2分間のアニーリング、72℃で2分間の伸長からなる。最後のサイクル後、反応管を伸長温度で8分間維持した。非突然変異増幅産物の破壊： 5μlの増幅産物を、総体積20μl中の制限エンドヌクレアーゼBstX１（New Eng land Biolabs，米国マサチューセッツ州）を用いて、供給者の推奨する条件で消化する。消化溶液の5μlを次の増幅段階における鋳型として使用する。増幅／消化操作：第1PCR（A1）は、5K1と3K1をプライマーとし、ゲノムDNAを鋳型とする15サイクルからなる。さらなる増幅のために、増幅産物をBstX 1で消化して（A試料，B試料にも同じ操作を施すが、酵素（Bstx 1）を使わない）、コドン12が突然変異していない産物を破壊する。消化産物を鋳型とし、5K1と3K1をプライマーとしてさらに15サイクル行う。 2回目のBstX 1消化（A試料，B試料にも同じ操作を施すが、酵素（BstX 1）を使わない）を行って感度を増大させる。消化産物を鋳型とし、ビオチニル化プライマー（5K1-ビオ）と対照制限部位を導入するプライマー（3K2）を用いて35サイクル行う（PCRB）。 RFLP分析： PCR Bの増幅産物10μlを総体積20μl中のBstX 1で消化する。消化した増幅産物を、臭化エチジウムを含む4％アガロースゲルでの電気泳動にかけて、UV光で分析する（図4）。突然変異産物は133bpバンドとして同定される。非突然変異試料が上の操作で完全に除去されていない場合は、107bpバンドが現れる。未消化産物は152bp断片として現れる。固相配列決定：増幅産物のオリゴヌクレオチド配列を、ストレプタビジン被覆常磁性ビーズ（ Dynabeads M-280ストレプタビジン，Dynal，ノルウェイ）を固体支持体とする固相配列決定法で同定する。増幅産物（PCR B）のビオチニル化鎖をビーズの供給者が説明している通りに単離する（Technical Handbook，Molecular Biology,第1版，Dynal，ノルウェイ）。配列決定反応を、3K3を配列決定プライマーとして、キット（Sequenaseバージョン2.0，United States Biochemical ,米国オハイオ州）の供給者が説明している通りに行う。針生検（試料3A）から得た突然変異産物の配列を図5に示す。右側の配列（3B ）は、同じ手法ではあるが、2回の非突然変異増幅産物中間破壊中にエンドヌクレアーゼ（Bstx 1）を加えなかった場合に、同じ試料から得られる配列である。これは弱くて情報を与えない突然変異変異バンドがどのように濃縮され、正常対立遺伝子のバックグランドを除去するかを示すものである。エンドヌクレアーゼBstX 1の代わりにXcm 1を用いて同じ操作を行うと、コドン13中の突然変異を検出できる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年５月３日【補正内容】これによって、制限酵素切断の正確さを監視するための系が提供される。つまり、例えば次の3′増幅プライマー配列を使用することができる：5′GAAT GGTCCT CCACCAGTAA TATGGATATT A5′（プライマー3K2と命名）。位置CとGにおけるミスマッチはそれぞれBstX I制限部位とXcm制限部位を生じさせるように機能する。プライマー3K2とその相対的位置も図2に示す。追加の選択的「濃縮」増幅段階を本発明に従って使用する場合は、一般に、「修飾」内部対照3′プライマーを濃縮増幅段階で使用するだけでよい。場合によっては、例えば特異性および/または感度を増大させるために、この方法にさらなる改良を加えることが望ましいこともあるだろう。つまり、野生型 K-ｒａｓ配列が酵素切断段階で完全には消化されず、未消化の野生型配列がいくらか残るということも時々起こるだろう。また、突然変異鎖と野生型鎖が再アニールして制限酵素によって認識されないヘテロ二本鎖を形成することもあるだろう。後の「濃縮」選択的増幅段階の特異性を増大させるために、例えば特異性をさらに増大させるためのネステッドプライマーを用いて、追加の増幅段階と制限切断段階を行ってもよい。これについては後述の実施例でより詳細に説明し、図 3に模式的に図示する。2つの制限エンドヌクレアーゼ切断段階を用いることによって、感受性を1:100,000まで改善できることが示された。さらなる改良には、上述のように、増幅産物を固定化するための固体支持体の使用が含まれる。この場合は、上述のように、増幅プライマーの一方または両方にビオチンやハプテンなどの固定化手段を与えることができる。このような固相系の使用は、それがよりきれいでより効果的であり、しかも全工程を一つの管中で行い得るので損失を最小限にとどめることができるという点で有利である。 1：DNAは異なるタイプの試料（つば、排泄物、固定組織、尿、腹水、血液など）から単離することができる。 2：少量の試料を、調べようとする遺伝子用のビオチニル化オリゴヌクレオチドプローブを含む塩緩衝液と混合する。次にその管を加熱し、ボルテックスにかけてDNA鎖を解き、変性させる。この実験では、正常DNA（過剰）とK-ｒａｓ遺伝子のコドン12の第2塩基に点変異（G→A）を持つDNAの混合物を使う。 3：溶液を冷却すると、プローブが変性DNAに結合する。 4：磁気ストレプタアビジン被覆ビーズを溶液に加えると、DNAがビーズに非特異的に結合すると共に、ストレプタアビジン-ビオチン結合によって結合する（ビオニチル化プライマーがある場合）。 5：結合したDNAを持つビーズを汚染した残渣と阻害物質から磁気分離によって単離し、鋳型としてPCR増幅に加える。 6：修飾5′プライマー（5K1）と通常の3′プライマー（3K1）を用いて増幅を行う。 7：誘導した修飾を含有する増幅産物が生成する。次にこの産物を、使用するエンドヌクレアーゼのタイプだけが異なる2つの並行操作に使用する。 8a：増幅産物を配列CCANNNNNNTGG（N＝G,T,AまたはC）に特異的なエンドヌクレアーゼ（BstX 1）と共にインキュベートする。 8b：増幅産物を配列CCANNNNNNNNNTGG（N＝G,T,AまたはC）に特異的なエンドヌクレアーゼ（Xcm 1）と共にインキュベートする。 9a：BstX 1は正常なコドン12を持つ産物を切断するが、突然変異産物を切断しない。いくつかの理由から、正常配列の完全な切断が起こらないことがある。 9b：コドン13には突然変異がないので、Xcm 1は正常産物と突然変異産物の両方を切断する。いくつかの理由から、産物の完全な切断が起こらないことがある。 10a/b〜13a/b：消化産物を段階6と同じ増幅の鋳型として用いる。ほとんどの正常産物は酵素によって切断されているので、突然変異産物が選択的に増幅される。エンドヌクレアーゼ消化は感度を増大させると報告されている。 14a/b：消化産物を、2つの制限部位の両方を含む修飾3′プライマー（3K2）とビオチニル化5′プライマー（5K1-ビオ）を用いる増幅の鋳型とする。 15a/b：修飾を含有する増幅産物が生成する。 16a/b：その産物をそれぞれのエンドヌクレアーゼで消化する。 17a：突然変異産物は3K2によって導入された対照部位でのみ切断され、正常産物は両方の部位で切断される。 17b：コドン13には突然変異がないので、産物のすべてが両部位で切断される。 15．追加のプライマーの配列が、5′TTATCTGTAT CAAAGAATGG TCCTGCACCA 3′ と5′TATTAAAACA AGATTTAC 3′から選択される請求項14に記載の方法。 16．該追加のプライマーが少なくとも1つの制限部位を生じさせる能力を持つ請求項14に記載の方法。 17．該追加のプライマーがBstX I制限部位とXcm I制限部位を生じさせる能力を持つ請求項16に記載の方法。 18．該追加のプライマーが配列5′GAATGGTCCT CCACCAGTAA TATGGATATT A 5′ を持つ請求項17に記載の方法。 19．PCRを増幅に使用する請求項12から18までのいずれかに記載の方法。 20．請求項1から10までのいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプライマー配列を少なくとも1つは含む、K-ｒａｓがん遺伝子のコドン12および/または13および/または61中の活性化突然変異検出用キット。 21．増幅用の追加構成要素を含む請求項20に記載のキット。 22．該増幅が次に挙げるa）からd）までのいずれかを用いて行われる請求項21 に記載のキット： a）PCRと、ポリメラーゼおよび少なくとも1つの他のオリゴヌクレオチドプライマー配列を追加して含むキット（オリゴヌクレオチドは共にDNAに基づき、標的DNAの反対鎖にハイブリッド形成する）； b）DIANAと、ポリメラーゼおよび固定化手段と標識手段とを与えられた請求項 1から10までのいずれかに記載のPCRオリゴヌクレオチドプライマー配列を追加して含むキット；

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ガウデァナックグスタフノルウェー、オスロ、エヌ−0310、モンテベロ、ザノーウィジャンラディウムホスピタルイムノセラピーデパートメント

Claims

【特許請求の範囲】１．野生型K-ｒａｓがん遺伝子のコドン12に重なるBstX I制限部位および/またはコドン13に重なるXcm I制限部位を生じさせる能力を持つことを特徴とする試験管内増幅用オリゴヌクレオチドプライマー配列。２．該配列がK-ｒａｓ遺伝子のコドン8の最後の塩基とコドン9の最初の2塩基に対応するCCA置換を含有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプライマー配列。３．該配列が塩基配列5′ACTGAATATA AACTTGTGGT CCATGGAGCT 3′を含む請求項2に記載のオリゴヌクレオチドプライマー配列。４．野生型K-ｒａｓがん遺伝子のコドン61に重なるBce 83I制限部位を生じさせる能力を持つことを特徴とする試験管内増幅用オリゴヌクレオチドプライマー配列。５．該配列がK-ｒａｓ遺伝子のコドン60の第2塩基に対応するC置換を含有する請求項4に記載のオリゴヌクレオチドプライマー配列。６．該配列が塩基配列5′TGTCTCTTGG ATATTCTCGA CACAGCAGCT 3′を含む請求項5に記載のオリゴヌクレオチドプライマー配列。７．該プライマー配列がさらに1以上の追加制限部位を生じさせる能力を持つ請求項1から6までのいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプライマー配列。８．該追加制限部位が野生型K-ｒａｓがん遺伝子のコドン12および/またはコドン13に重なる制限部位の上流に位置するDra I制限部位である請求項７に記載のオリゴヌクレオチドプライマー配列。９．該配列が塩基配列5′ACTGAATTTA AACTTGTGGT CCATGGAGCT 3′を含む請求項８に記載のオリゴヌクレオチドプライマー配列。 10．該配列が22〜30ヌクレオチド長である請求項1〜9までのいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプライマー配列。 11．K-ｒａｓがん遺伝子のコドン12および/または13および/または61中の活性化突然変異の試験管内増幅に基づく検出法における請求項1から10までのいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプライマー配列の使用。 12．検出しようとする標的K-ｒａｓDNAを含む試料を、請求項1から10までのいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプライマー配列を増幅プライマーとして使用する1サイクル以上の試験管内増幅にかけ、次にBstX 1および/またはXcm Iおよび/またはBce 83Iを用いて野生型K-ｒａｓ配列を制限エンドヌクレアーゼ消化し、得られた該増幅突然変異K-ｒａｓ配列を検出することを含む、K-ｒａｓがん遺伝子のコドン12および/または13および/または61中の活性化突然変異検出法。 13．制限エンドヌクレアーゼ消化の後でさらに1サイクル以上の試験管内増幅をおこなって、該活性化突然変異を含む突然変異K-ｒａｓ配列を濃縮する請求項 12に記載の方法。 14．追加のプライマーを増幅に使用する請求項12または13に記載の方法。 15．追加のプライマーの配列が、5′TTATCTGTAT CAAAGAATGG TCCTGCACCA 3′ と5′TATTAAAACA AGATTTAC 3′から選択される請求項14に記載の方法。 16．該追加のプライマーが少なくとも1つの制限部位を生じさせる能力を持つ請求項14に記載の方法。 17．該追加のプライマーがBstX I制限部位とXcm I制限部位を生じさせる能力を持つ請求項16に記載の方法。 18．該追加のプライマーが配列5′GAATGGTCCT CCACCAGTA TATGGATATT A 5′を持つ請求項17に記載の方法。 19．PCRを増幅に使用する請求項12から18までのいずれかに記載の方法。 20．請求項1から10までのいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプライマー配列を少なくとも1つは含む、K-ｒａｓがん遺伝子のコドン12および/または13および/または61中の活性化突然変異検出用キット。 21．増幅用の追加構成要素を含む請求項20に記載のキット。 22．該増幅が次に挙げるa）からd）までのいずれかを用いて行われる請求項21 に記載のキット： a）PCRと、ポリメラーゼおよび少なくとも1つの他のオリゴヌクレオチドプライマー配列を追加して含むキット（オリゴヌクレオチドは共にDNAに基づき、標的DNAの反対鎖にハイブリッド形成する）； b）DIANAと、ポリメラーゼおよび固定化手段と標識手段とを与えられた請求項 1から10までのいずれかに記載のPCRオリゴヌクレオチドプライマー配列を追加して含むキット； c）3SRと、逆転写酵素およびもう1つのDNAオリゴヌクレオチドプライマー配列を追加して含むキット（両オリゴヌクレオチドにはポリメラーゼ結合部位が与えられている）； d）Q-ベータレプリカーゼと、RNA依存性RNAポリメラーゼおよび5′-MDV-1構造を持つRNAプローブ（この捕捉オリゴヌクレオチドは固定化されているか、もしくは固定化が可能である）を追加して含むキット。