JP2002539765A - 糞便サンプル調製のための方法 - Google Patents

糞便サンプル調製のための方法

Info

Publication number
JP2002539765A
JP2002539765A JP2000584110A JP2000584110A JP2002539765A JP 2002539765 A JP2002539765 A JP 2002539765A JP 2000584110 A JP2000584110 A JP 2000584110A JP 2000584110 A JP2000584110 A JP 2000584110A JP 2002539765 A JP2002539765 A JP 2002539765A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
sample
dna
probe
solvent
allele
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2000584110A
Other languages
English (en)
Inventor
アンソニー ピー． シュバー，
スタンリー エヌ． ラピダス，
ゲイル イー． ラドクリッフェ，
Original Assignee
エグザクト サイエンシーズ コーポレイション
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by エグザクト サイエンシーズ コーポレイション filed Critical エグザクト サイエンシーズ コーポレイション
Publication of JP2002539765A publication Critical patent/JP2002539765A/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、関連するＤＮＡの収率を増加させるための糞便サンプルの調製のための方法を提供し、さらに結腸直腸癌を示す特徴に関して標的ＤＮＡを単離および分析するための方法を提供する。癌性結腸直腸病巣または前癌性結腸直腸病巣の存在について患者をスクリーニングするための方法もまた、提供される。好ましい実施形態では、本発明の方法は、代表的な糞便サンプルを溶媒中でホモジナイズして、少なくとも５：１の溶媒体積の糞便質量に対する比を有するホモジナイズされたサンプル混合物を形成する工程、次いで標的（ヒト）ＤＮＡに関してホモジナイズされたサンプルを濃縮する工程を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （関連出願） 本願は、１９９７年６月１５日に出願された米国特許出願番号０８／８７６，
６３８の一部継続出願である。
【０００２】 （発明の分野） 本発明は、患者における結腸癌を早期検出するための方法、より詳細には、核
酸の収率を増加させるための糞便サンプルを調製するための方法に関する。
【０００３】 （発明の背景） 糞便サンプルは頻繁に、医学的な診断分析のために調製されなければならない
。糞便サンプルは、寄生虫感染、細菌感染または細菌感染から炎症性腸疾患およ
び結腸直腸癌の範囲である医学的状態の診断のために分析され得る。
【０００４】 結腸直腸癌は、西側社会では死亡の主な原因である。しかし、早期に診断され
た場合、癌性組織の除去により効果的に処置され得る。結腸直腸癌は、結腸直腸
上皮に由来し、代表的には、発生の初期段階の間は、広範囲には血管化されない
（そして従って、侵襲性ではない）。結腸直腸癌は、結腸または直腸の上皮内層
の単一変異細胞のクローン増殖から生じると考えられる。身体中に広がる高度に
血管化した、侵襲性、および最終的には転移性の癌への遷移は、通常、十年以上
かかる。癌が侵襲性の前に検出される場合、癌性組織の外科的な除去は、効果的
な治療である。しかし、結腸直腸癌は、疼痛および黒タール様便のような臨床的
な症状の発現の際にのみ、しばしば検出される。一般的に、そのような症状は、
疾患が十分に確立され、そしてしばしば転移が起こった後の場合のみに存在する
。従って、結腸直腸癌の早期の検出は、その罹患率を有意に減少させるために重
要である。
【０００５】 内視鏡的検査のような侵襲的な診断方法は、潜在的に癌性増殖の直接的な目視
同定、除去、および生検を可能にする。内視鏡は、高価で、不快で、本質的に危
険であり、従って、結腸直腸癌を有する集団を同定するために集団をスクリーニ
ングするための実用的な手段ではない。結腸直腸癌または結腸直腸前癌の存在を
示す特徴についての糞便サンプルの非侵襲的分析は、早期診断に関して好ましい
代替法であるが、この目的を信頼性良く達成する公知の診断方法は、利用可能で
はない。
【０００６】 現在の非侵襲的スクリーニング方法は、糞便の潜血の存在について、または癌
胎児性抗原の上昇したレベルについて糞便サンプルをアッセイする工程を包含し
、その両方は、結腸直腸癌の存在を示唆する。さらに、分子生物学の最近の発展
は、結腸直腸癌を示すある範囲のＤＮＡ変異または変化の存在を検出する可能性
の大きい方法を提供する。そのような変異の存在は、結腸直腸癌の種々の段階中
の糞便サンプル中で見出されるＤＮＡにおいて検出され得る。しかし、糞便は、
患者由来、微生物由来、および食物由来の細胞および細胞の細片を含み、不均質
な細胞集団を生じる。これは、小規模の特異的な部分集団の検出が信頼性良く検
出されることを困難にする。
【０００７】 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用は、核酸の検出をより慣用的にしたが
、いずれのＰＣＲも、サンプル中のＤＮＡの存在量により制限される。最小限の
物質の量が、特異的分析のために提示されなければならず、そしてサンプル中の
他の核酸に対して低い比率でサンプル中に提示される核酸を検出することを望む
場合（それはしばしば、結腸直腸癌のＤＮＡ特徴を検出するために糞便サンプル
を分析する場合である）、この制限はより関連する。低頻度の変異鎖が、ＰＣＲ
の最初の数回において増幅されない場合、より後の回において変異鎖から得られ
る任意のシグナルは、バックグラウンドにより、または遍在性の野生型鎖の増幅
由来のシグナルと競合することにより不明瞭である。
【０００８】 結腸直腸癌の検出のための糞便サンプルの調製において遭遇するさらなる問題
は、糞便から十分な量の関連するＤＮＡを抽出することの困難性である。糞便サ
ンプルは、慣用的に細胞細片、酵素、細菌（および関連した核酸）、および伝統
的なＤＮＡ抽出手順を妨害し得、そしてＤＮＡ収率を減少させ得る種々の他の化
合物を含む。さらに、糞便中のＤＮＡは、しばしば消化されているかまたは部分
的に消化されているようであり、これは抽出方法の効率を減少させ得る。
【０００９】 （発明の要旨） 糞便サンプルからの核酸の収率が、サンプル中の糞便質量に対して最適な比の
溶媒体積を提供することにより増加することは、現在、認識されている。従って
、本発明は、サンプルの核酸収率を増加させるための糞便サンプル調製プロトコ
ールを提供する。
【００１０】 好ましい実施形態では、本発明の方法は、代表的な糞便サンプルを溶媒中でホ
モジナイズして、少なくとも５：１の溶媒体積の糞便質量に対する比を有するホ
モジナイズされたサンプル混合物を形成する工程、次いで標的（ヒト）ＤＮＡに
関してホモジナイズされたサンプルを濃縮する工程を包含する。次いで、ヒトＤ
ＮＡは、疾患の特徴について分析され得る。溶媒体積の糞便質量に対する適切な
比を提供することは、そのサンプルから得られる核酸の収率を増加させる。溶媒
体積の糞便質量に対する特に好ましい比は、約１０：１と約３０：１との間であ
り、より好ましくは、約１０：１から約２０：１までであり、そして最も好まし
くは、１０：１である。
【００１１】 本発明に従って糞便サンプルを調製するための好ましい溶媒は、Ｔｒｉｓ−Ｅ
ＤＴＡ−ＮａＣｌを含む緩衝液のような生理学的に適合性の緩衝液である。好ま
しい緩衝液は、約ｐＨ９．０で、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭのＴｒｉｓ、約１０
ｍＭ〜約２０ｍＭのＥＤＴＡ、および約５ｍＭ〜約１５ｍＭのＮａＣｌを含むＴ
ｒｉｓ−ＥＤＴＡ−ＮａＣｌ緩衝液である。特に好ましい緩衝液は、ｐＨ９．０
で、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１６ｍＭ ＥＤＴＡおよび１０ｍＭ ＮａＣｌである
。別の好ましい溶媒は、グアニジンイソチオシアネート（ＧＩＴＣ）である。好
ましいＧＩＴＣ緩衝液は、約１Ｍ〜約５Ｍの濃度を有する。特に好ましいＧＩＴ
Ｃ緩衝液は、約３Ｍの濃度を有する。
【００１２】 好ましい実施形態ではまた、方法は、例えば、標的ヒトＤＮＡにハイブリダイ
ズする配列特異的な核酸プローブを用いて、ホモジナイズされたサンプル混合物
をヒトＤＮＡに関して濃縮する工程をさらに包含する。
【００１３】 代替的な好ましい実施形態において、本発明の方法は、ＤＮＡについて生理学
的に受容可能な溶媒中で糞便サンプルをホモジナイズして、少なくとも５：１の
溶媒体積の糞便質量に対する比を有するホモジナイズされたサンプル混合物を形
成する工程；ホモジナイズされたサンプルが、少なくとも最小数Ｎの総ＤＮＡ分
子を有することを確認して、低頻度の標的ＤＮＡ分子の検出を容易にする工程；
および、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応を用いて標的ＤＮＡを増幅することに
より、疾患の特徴に関して標的ＤＮＡを分析する工程を包含する。
【００１４】 別の実施形態においては、本発明は、糞便から抽出されたＤＮＡを分析するた
めの方法を提供し、この方法は、ＤＮＡについての溶媒中で糞便サンプルをホモ
ジナイズして、少なくとも５：１の溶媒体積の糞便質量に対する比を有するホモ
ジナイズされたサンプル混合物を形成する工程；ホモジナイズされたサンプルを
ヒトＤＮＡに関して濃縮する工程；ホモジナイズされ濃縮されたサンプルが、少
なくとも最小数Ｎの総ＤＮＡ分子を有することを確認して、低頻度の標的ＤＮＡ
分子の検出を与える工程；および疾患を示すＤＮＡ特徴に関して標的ＤＮＡを分
析する工程を包含する。
【００１５】 本発明の方法は、結腸直腸癌を示す核酸の糞便サンプル中での存在についてス
クリーニングすることに有用である。このような方法は、代表的な糞便サンプル
（すなわち、少なくとも断面）を得る工程；少なくとも５：１の溶媒体積の糞便
質量に対する比を有する溶媒中でサンプルをホモジナイズする工程；サンプルを
標的ヒトＤＮＡに関して濃縮する工程；および結腸直腸癌の特徴に関してＤＮＡ
を分析する工程を包含する。本発明書中で参考として援用される共有に係る同時
係属中の米国特許出願番号０８／７００，５８３において開示された方法のよう
なＤＮＡ特徴の種々の分析方法が存在する、。
【００１６】 本発明の方法はまた、糞便の代表的な（すなわち、断面の）サンプルを得る工
程、ならびに界面活性剤およびプロテイナーゼおよび必要に応じてＤＮａｓｅイ
ンヒビターを含む緩衝液のような緩衝液中で糞便サンプルをホモジナイズする工
程を包含する。
【００１７】 本発明の方法は、代表的な糞便サンプル中の形質転換された細胞の部分集団を
示すＤＮＡ特徴を検出するために、特におよび最も好ましく有用である。そのＤ
ＮＡ特徴は、例えば、点変異を含む変異、欠失、付加、転座、置換、およびヘテ
ロ接合性の喪失であり得る。本発明の方法は、さらに結腸の目視検査を含み得る
。最終的に、異常な組織の外科的な切除は、癌性組織または前癌性組織の広がり
を妨げるために行われ得る。
【００１８】 従って、本発明の方法は、糞便サンプルのような不均質なサンプル中で癌性ま
たは前癌性の細胞の部分集団の存在についてスクリーニングする手段を提供する
。本発明の方法は、結腸上皮の病巣に関連する罹患率および死亡率を減少させる
。さらに、本発明の方法は、当該分野で現在利用可能な方法よりさらに正確かつ
簡便なスクリーニング方法を含む。なぜならば、そのような方法は、関連するＤ
ＮＡの増加した収率を利用するからである。
【００１９】 従って、本発明の方法は、不均質なサンプル中の低頻度のＤＮＡの予想外およ
び増強された検出および分析を提供し、本明細書中で記載される方法の適用を介
して容易にされる。すなわち、その標的分子が低頻度のＤＮＡ分子であっても、
少なくとも５：１（体積対質量）の比で溶媒中での糞便サンプルのホモジナイゼ
ーション単独で、または本明細書中で開示されるサンプルの濃縮のための方法と
組み合せて、効果的かつ効率的な分析のために十分な数のＤＮＡ分子を得るため
の信頼できる方法を提供する。本発明のさらなる局面および利点は、本発明の以
下の詳細な説明に含まれる。
【００２０】 （発明の詳細な説明） 本発明は、糞便からの核酸の抽出および分析のための改良された方法を提供す
る。本発明の方法に従い、糞便から抽出される核酸の収率は、糞便質量に対する
緩衝液体積の最適な比で緩衝液中で糞便をホモジナイズすることにより増加する
。収率は、ヒトＤＮＡに関して濃縮することによりさらに改良される。改良され
た核酸収率は、糞便サンプルの核酸分析が、より少ない糞便体積について、より
効率的に行われることを可能にする。
【００２１】 本発明の好ましい方法において、分析のために得られた糞便サンプルは、糞便
全体のうちの少なくとも断面を含む。本明細書中で参考として援用される米国特
許第５，７４１，６５０号において提供されるように、結腸上皮由来の細胞およ
び細胞の細片は、長手方向の線条において糞便上へ、および糞便中へ堆積する。
糞便のうちの少なくとも断面を得ることは、結腸上皮細胞および細胞の細片の代
表的なサンプリングが分析されることを確実にする。
【００２２】 一旦、糞便サンプルが収集されると、それは、生理学的に受容可能な溶媒中で
ホモジナイズされる。好ましいホモジナイゼーションの手段は、ガラスビーズを
用いる攪拌を用いる。生理学的に受容可能な溶媒は、生物学的サンプル物質の分
散のために適切であると当業者に一般的に公知である溶媒を含む。そのような溶
媒としては、２０ｍＭ〜１００ｍＭのＮａＣｌまたはＫＣｌのような塩、および
必要に応じて１〜１０％のＳＤＳまたはＴｒｉｔｏｎTMのような界面活性剤、お
よび／またはプロテイナーゼＫのようなプロテイナーゼを（例えば、約２０ｍｇ
／ｍｌで）含むリン酸緩衝化生理食塩水が挙げられる。好ましい溶媒は、例えば
、１ＭのＴｒｉｓ、０．５ＭのＥＤＴＡ、５ＭのＮａＣｌ、およびｐＨ９で、最
終濃度５００ｍＭのＴｒｉｓ、１６ｍＭのＥＤＴＡおよび１０ｍＭのＮａＣｌに
するための水を含む、生理学的に適合性の緩衝液である。この緩衝液は、ホモジ
ナイゼーションの間に固体の糞便サンプルを分散する溶媒として作用する。出願
人は、このサンプルの固体質量に対する溶媒体積を増加させることが増加したＤ
ＮＡ収率を生じることを発見した。
【００２３】 本発明の方法によれば、溶媒（緩衝液）は、少なくとも約５：１の溶媒体積の
固体質量に対する比で、この固体サンプルに添加される。この溶媒体積の固体質
量に対する比は、好ましくは約１０：１〜約３０：１の範囲内であり、そしてよ
り好ましくは約１０：１〜約２０：１の範囲内である。最も好ましくは、この溶
媒体積の固体質量に対する比は、約１０：１である。代表的に、溶媒体積はミリ
リットルで測定され得、そして固体質量は、ミリグラムで測定される得が、実施
者は、特定の質量単位および体積単位のスケールアップまたはスケールダウンに
かかわらず、質量に対する体積の比が一定のままであることを認識する。すなわ
ち、溶媒体積の固体質量に対する比はミリリットル：グラムまたはμｌ：μｇと
して測定され得る。
【００２４】 本発明の好ましい実施形態では、このホモジナイズされたサンプルは、標的（
ヒト）ＤＮＡに関して濃縮される。本発明の文脈において、サンプルの「濃縮」
は、標的ヒトＤＮＡの量に対して、サンプル中の所望でない非ヒトＤＮＡの量を
減少させるためにサンプルを操作することを意味する。濃縮の技術は、標的ＤＮ
Ａの配列特異的捕獲、または細菌の核酸の除去を含む。
【００２５】 本発明の好ましい実施形態では、濃縮の工程は、グアニジンイソチオシアネー
ト（ＧＩＴＣ）などの生理学的に適合性の緩衝液中で行われる。次いで、捕獲プ
ローブは、混合物に添加されて標的ＤＮＡにハイブリダイズして、このサンプル
からの標的ＤＮＡの選択的な除去を容易にする。
【００２６】 標的ＤＮＡの配列特異的捕獲は、最初にサンプルＤＮＡを変性させて、一本鎖
ＤＮＡを形成することにより、達成され得る。次いで、標的ポリヌクレオチドの
少なくとも一部分（例えば、ｐ５３対立遺伝子中、またはその近くの配列）に対
して相補的である十分な量の配列特異的オリゴヌクレオチドプローブが、添加さ
れる。この（ビオチンで標識された）プローブ配列を、相補的標的ＤＮＡ配列に
ハイブリダイズさせる。次いで、アビジンまたはストレプトアビジンでコートさ
れたビーズが、添加され、そしてビオチン化されたハイブリッドに親和性結合に
より付着する。このビーズは、単離を容易にするために磁化され得る。
【００２７】 プローブ−標的ハイブリッドの分離後、得られたＤＮＡは、捕獲プローブ技術
を介して通常導入されるインヒビターを含み、インヒビターを除去するために繰
り返し洗浄される。本発明の方法において、洗浄は好ましくは、１ＭのＧＩＴＣ
および０．１％の界面活性剤（例えば、Ｉｇｅｐａｌ（Ｓｉｇｍａ））を用いて
約４回行われる。ＧＩＴＣは、ＰＣＲに関連するＤＮＡポリメラーゼを含むＤＮ
Ａポリメラーゼの公知のインヒビターであるので、次いで、最初の洗浄には好ま
しくは、この混合物からＧＩＴＣを除去するための、標準の洗浄緩衝液（例えば
、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ−ＮａＣｌ）を用いた二回の洗浄が続く。
【００２８】 最終的に、標的ＤＮＡは、加熱することにより、少ない体積の蒸留水の中に溶
出される。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いたアッセイ、制限酵素断片長
多型（ＲＦＰＬ）分析または他の核酸分析方法は、結腸直腸癌または結腸直腸前
癌のような障害を示すＤＮＡの特徴を検出するために用いられ得る。特に有用な
いくつかの分析技術は、同時係属中の出願である出願番号０８／７００，５８３
、０８／８１５，５７６および０８／８７７，３３３に記載され、これらの開示
は、参考として本明細書中に援用される。
【００２９】 代替的な実施形態では、ホモジナイズされたサンプルは、このサンプルが低頻
度の標的ＤＮＡ分子の検出を与える少なくとも最小数（Ｎ）の総ＤＮＡ分子を有
することを決定するために実験される。サンプル中の分析された分子の数は、こ
の分析が低頻度の事象を検出する能力を決定する。ＰＣＲの場合では、ＰＣＲ効
率が１００％に近い場合、投入した分子の数は、約５００でなければならない。
ＰＣＲ効率が低下するにつれて、必要とされる投入分子の数は増加する。初めの
数回では分子は増幅されないので、投入分子の最小数を分析することは、ＰＣＲ
において低頻度の事象が検出されない可能性を減少させる。従って、本発明の方
法は、規定された信頼レベルで低頻度の分子事象を検出するために、分析されな
ければならないサンプル分子の閾値の数を決定する工程を包含する。
【００３０】 同時係属中の出願番号 ［代理人文書番号ＥＸＴ−０２１］（これは参考
として本明細書中に援用される）においてより十分に記載されるように、低頻度
標的ＤＮＡ分子の増幅および分析を可能にするためにサンプル中に存在しなけれ
ばならないＤＮＡ分子の最少数Ｎの決定は、ＰＣＲにおける確率過程のモデルに
基づく。ＰＣＲ効率についての予め設定または決定された値、およびサンプルに
おける野生型ＤＮＡに対する変異ＤＮＡの比を利用して、このモデルは、規定の
統計学的な信頼レベル内で、低頻度分子が増幅されることを確実にするためにＰ
ＣＲに提示されなければならない分子数を予測する。
【００３１】 当業者は、サンプル中に存在する分子の最少数Ｎの決定が、上記に詳細に記載
された濃縮技術の代わりに、またはそれに加えて用いられ得、本発明の方法にお
ける信頼の置ける結果を確実にすることを認識する。
【００３２】 あるいは、本発明の方法はまた、糞便ホモジネートからの総ＤＮＡを単離する
ために用いられ得る。ホモジナイズされた混合物は、細胞の細片および糞便物か
ら作製されたペレット、および核酸および会合したタンパク質、脂質などを含む
上清を形成するために遠心分離される。この上清は、２０％ＳＤＳのような界面
活性剤、およびタンパク質を分解できる酵素（例えば、プロテイナーゼＫ）で処
理される。次いで、上清は、フェノール−クロロホルム抽出される。次いで、得
られた、精製された核酸は当該分野で公知の手段によって沈澱される。次いで、
当該分野の種々の技術は、得られた核酸を操作するために用いられ得、その技術
としては特定の核酸のさらなる精製または単離が挙げられる。
【００３３】 本発明の方法はまた、プールされたＤＮＡサンプルの分析のために有用である
。出願番号０９／０９８，１８０、および米国特許第５，６７０，３２５号（こ
れらの両方は、本明細書中で、参考として援用される）においてより詳細に記載
されているように、プールされたゲノムＤＮＡサンプルの列挙する分析は、疾患
の存在または見込みを決定するために使用される。集団の健康なメンバー由来の
プールされたゲノムＤＮＡおよび集団の病的なメンバー由来のプールされたゲノ
ムＤＮＡが得られる。一ヌクレオチド多型部位での各々の改変体の数または量は
、各々のサンプルで決定される。その数または量は、健康な集団から得られたサ
ンプル中に存在する改変体と病的な集団から得られたサンプルに存在する改変体
との間に統計学的有意差が存在するか否かを決定するために分析される。統計学
的有意差は、この多型遺伝子座が疾患のマーカーであることを示す。
【００３４】 これらの方法は、疾患と関連する核酸（例えば、多型改変体）を同定するため
に使用され得る。このような方法は、病的な集団のメンバーにおいて核酸（好ま
しくは、一塩基）の数を計数するまたはその量を決定する工程、および、健康な
集団のメンバーにおいて同じ核酸の数を計数するまたはその量を決定する工程を
含む。２つの集団の間の核酸の数における統計学的有意差は、問い合わせられた
遺伝子座が疾患に関連することを示す。
【００３５】 一旦、本発明の方法によるか、または適切なデータベースを調査することのい
ずれかにより多型遺伝子座が同定されると、このような方法は、多型遺伝子座で
いずれの改変体が疾患に関連しているのかを決定するために有用である。この場
合、列挙する方法は、病的な集団のメンバーにおける第一の改変体の数と、健康
な集団のメンバーにおける同じ遺伝子座での第二の改変体の数との間の統計学的
有意差が存在するか否かを決定するために使用される。統計学的有意差は、病的
な集団のメンバーにおけるこの改変体が疾患に関するマーカーとして有用である
ことを示す。この情報を使用して、患者は、疾患と関連すると考えられる改変体
の存在についてスクリーニングされ、そのような改変体の存在は疾患の存在また
は疾患に対する素因を示す。
【００３６】 本発明の方法は、ｋｒａｓのような結腸直腸癌において推定される変異を有す
る遺伝子を含む核酸の単離および分析に対して特に有用である。ｋｒａｓ遺伝子
は、３０ｋｂｐを超える長さを有し、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質として特徴
付けられる１８９アミノ酸タンパク質をコードする。この遺伝子は、単一の点変
異により悪性の性質を獲得し、最も一般的な単一点変異は、１２番目のアミノ酸
で起こる。いくつかの研究は、ヒトにおける原発性結腸直腸腺癌細胞の約４０％
が変異形態のｋｒａｓ遺伝子を含むことを確認している。従って、ｋｒａｓ遺伝
子は、本発明の結腸直腸癌の検出方法に対して特に適切な標的である。
【００３７】 この目的に向けて、出願人は、ｋｒａｓヌクレオチド配列に関する適切で例示
的な捕獲プローブを構築した。ＣＰ１と命名された捕獲プローブは以下の配列：
５’ＧＣＣ ＴＧＣ ＴＧＡ ＡＡＡ ＴＧＡ ＣＴＧ ＡＡＴ ＡＴＡ ＡＡ
Ｃ ＴＴＧ ＴＧＧ ＴＡＧ Ｔ３’（配列番号１）を有し、好ましくは、単離
を容易にするために５’末端でビオチン化される。以下により十分に例示される
ように、ＣＰ１は、ｋｒａｓＤＮＡの配列特異的捕獲において効果的である。
【００３８】 抽出されたｋｒａｓＤＮＡ配列の分析のための適切なＰＣＲプライマーもまた
、決定された。プライマーＡ１は、配列：５’Ｃ ＣＴＧ ＣＴＧ ＡＡＡ Ａ
ＴＧ ＡＣＴ ＧＡＡ３’（配列番号２）を有し、そしてプライマーＢ１は配列
：５’ＣＡＴ ＧＡＡ ＡＡＴ ＧＧＴ ＣＡＧ ＡＧＡ ＡＡ３’（配列番号
３）を有する。このＰＣＲプライマーＡ１およびＢ１、ならびに捕獲プローブＣ
Ｐ１は、図１に示され、図１は、ｋｒａｓヌクレオチド配列（塩基対６２８２〜
６５７１（配列番号４））に対するそれらの関連性を示している。当業者は、当
該分野で周知の技術を使用して、ｋｒａｓあるいは他の標的遺伝子またはヌクレ
オチド配列に対する他の適切な捕獲プローブおよびＰＣＲプライマーを構築し得
る。
【００３９】 従って、溶媒体積の糞便質量に対する比が少なくとも５：１であるような体積
の溶媒中で糞便サンプルをホモジナイズする工程、および／またはヒトＤＮＡに
関してそのサンプルを濃縮する工程を包含する、本発明の方法は、最少数Ｎの総
ＤＮＡ分子を有するサンプルを得るための手段を提供し、低頻度の標的ＤＮＡ分
子の検出を容易にする。従って、これらの方法は、不均質サンプルにおいて低頻
度のＤＮＡの小さい部分を信頼がおけるように検出することが今や可能であると
いう意外な結果を提供する。
【００４０】 以下の実施例は、本発明に従う方法のさらなる詳細を提供する。しかし、本発
明の多数のさらなる局面は、以下の実施例を考慮すれば明らかとなる。
【００４１】 （実施例１：糞便サンプルの調製） 排泄された糞便を、患者から収集し、サンプルとして使用するためにこの糞便
の断面部分を取り出した。サンプルの質量を決定した後、約１０×体積のＴｒｉ
ｓ−ＥＤＴＡ−ＮａＣｌ溶解緩衝液を試験管中の固体サンプルに加えた。緩衝液
の最終濃度は、約９．０のｐＨで、５００ｍＭのＴｒｉｓ、１６ｍＭのＥＤＴＡ
、および１０ｍＭのＮａＣｌであった。４つの１０ｍｍのガラス玉をその管の中
に置き、その内容物をＥｘａｃｔｏｒＩＩシェーカー中で１５分間ホモジナイズ
した。次いで、そのホモジナイズした混合物を、室温で５分間、静置した。次い
で、その管をＳｏｒｖａｌｌ遠心分離機中で、１０，０００ｒｐｍで５分間、遠
心し、そしてその上清を清浄な試験管に移した。その管に２０％ ＳＤＳ水溶液
を０．５％の最終濃度になるように加えた。プロテイナーゼＫをまた、５００ｍ
ｇ／ｍｌの最終濃度になるようにその管に加えた。次いで、その管を３７℃で一
晩インキュベートした。
【００４２】 インキュベーション後、その管の内容物を同体積のフェノール／クロロホルム
を用いて抽出し、３５００ｒｐｍで３分間で遠心分離した。次いで、水層を新し
い管に移し、同体積のクロロホルムで３回抽出し、３５００ｒｐｍで３分間遠心
した。次いで、水層を新しい管に移し、その水性部分に０．１×体積の３ＭのＮ
ａＯＡｃを加え、次いで、それを、同体積のイソプロパノールを用いて抽出し、
１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットを１０ｍｌの
７０％エタノールを用いて洗浄し、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
上清を捨て、単離されたＤＮＡを含むそのペレットを、管を逆さにすることによ
り乾燥した。
【００４３】 （実施例２） 質量に対する溶媒体積の比の比較分析を行った。３つの異なる糞便サンプルを
上記のように調製した。ＳＳ８８−３×と命名した第一のサンプルを、３：１と
いう体積の質量に対する比の緩衝液中でホモジナイズした。ＳＳ８８−５×と命
名した第二のサンプルを、５：１の比でホモジナイズし、ＳＳ８８−１０×と命
名した第三のサンプルを、１０：１の比でホモジナイズした。
【００４４】 各々のサンプル由来の総ＤＮＡを、１００μｌの１００ｍＭのＴｒｉｓ、１０
ｍＭのＥＤＴＡ緩衝液中で再懸濁し、１２５Ｖの定電圧で約１時間の電気泳動の
ために１０μｌのアリコートを４％アガロースゲルへロードした。その結果を図
２に示す。図２に示すように、溶媒の質量に対する比が３×から１０×まで増加
するにつれて、総ＤＮＡの収率は、増加した。
【００４５】 （実施例３） ４つの等価なサンプルの第二のセットを、単一の糞便サンプルから調製した。
４つのサンプルの各々は、同質量であり、実施例１に記載するように、各々５：
１、１０：１、２０：１、および３０：１の溶媒体積の糞便質量に対する比でホ
モジナイズした。ホモジナイゼーション後、各々のサンプルを８つのアリコート
に細分し、４つはＲＮａｓｅを用いて処理し、そして４つは未処理とした。次い
で、総ＤＮＡを上記のように単離し、アガロースゲルで分析した。
【００４６】 その結果を図３に示す。示されるように、１０：１の比は、核酸の最も高い収
率を生じた。図３はまた、各々の糞便サンプルからのＤＮＡの収率に対するＲＮ
ａｓｅ処理の効果を示す。この図に示されるように、ＲＮａｓｅ処理は、サンプ
ルからＲＮＡを実質的に除去するが、ＤＮＡは無傷のままである。この結果は、
溶媒体積の糞便質量に対する最適な比が、糞便サンプルからのＤＮＡの収率を大
きく増加させることを示す。
【００４７】 （実施例４：標的ＤＮＡの配列特異的捕獲） 一旦、糞便から抽出されたら、配列特異的捕獲プローブを用いて、特異的核酸
を単離する。総ＤＮＡを、実施例１に記載される方法に従って、糞便サンプルか
ら抽出した。そのペレット化したＤＮＡを、１ｍｌのＴＥ緩衝液に再懸濁した。
この溶液の１００μｌのアリコートを取り出して新しい管に入れ、最終濃度が３
ＭのＧＩＴＣになるように、６Ｍのグアニジンイソチオシアネート（ＧＩＴＣ）
１００μｌを加えた。大過剰のビオチン化したｋｒａｓ捕獲プローブＣＰ１を、
そのサンプルに加えた。その混合物を９５℃で５分間加熱し、ＤＮＡを変性し、
次いで３７℃で５分間冷却した。最終的に、プローブおよび標的ＤＮＡを室温で
３０分間ハイブリダイズさせた。ストレプトアビジンでコートされた磁化ビーズ
（３２０ｍｇ）（Ｄｙｎａｌ Ｃｏｒｐ．）を、４００μｌの蒸留水に懸濁し、
そして混合物に加えた。簡単に混合した後、その管を室温で３０分間維持した。
【００４８】 一旦、親和性結合が完了したら、サンプルに磁界を適用し、（サンプルからハ
イブリダイズした複合体を用いて、および用いずにの、両方で）磁化した単離ビ
ーズをサンプルの外に引き出した。次いで、そのビーズを、１ＭのＧＩＴＣ／０
．１％ Ｉｇｅｐａｌ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）溶液中で１５分
間で４回洗浄し、その後、洗浄緩衝液（１ＭのＮａＣｌを含むＴＥ）を用いて１
５分間で２回洗浄し、複合化したストレプトアビジンを単離した。最終的に、そ
のビーズに１０μｌの蒸留水を加え、９５℃で３分間加熱し、そのＤＮＡを溶出
した。配列決定および／またはゲル電気泳動は、ｋｒａｓ特異的ＤＮＡの捕獲の
確認を可能にする。
【００４９】 従って、本発明の方法は、糞便からのＤＮＡの収率の増加を生じ、それにより
、標的核酸のより効率的な配列特異的捕獲を可能にする。本発明の方法は、糞便
中に存在する疾患関連核酸変異を検出する能力における改良を提供する。当業者
は、本発明の上記の説明の検査について有用な本発明のさらなる適用および実施
形態を見出す。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲の範囲によってのみ限
定される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ｋｒａｓ遺伝子（塩基対６２８２〜６５７１）の部分ヌクレオチド配
列、およびｋｒａｓヌクレオチド配列に対する捕獲プローブＣＰ１、ＰＣＲプラ
イマーＡ１、およびＰＣＲプライマーＢ１の位置の提示である。
【図２】 図２は、実施例２に記載されているように抽出した非切断ＤＮＡを用いてゲル
電気泳動を行った結果の、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｅａｇｌｅ Ｅｙｅ ＩＩ
Ｓｔｉｌｌ Ｖｉｄｅｏ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ，Ｊｏ
ｌｌａ，ＣＡ）を用いて作成された画像である。
【図３】 図３は、実施例３に記載されているように抽出したＤＮＡを用いてゲル電気泳
動を行った結果の、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｅａｇｌｅ Ｅｙｅ ＩＩ Ｓｔｉ
ｌｌ Ｖｉｄｅｏ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ，Ｊｏｌｌａ
，ＣＡ）を用いて作成された画像である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 ラピダス， スタンリー エヌ． アメリカ合衆国 ニューハンプシャー 03110， ベッドフォード， オールド エバーグリーン ロード 12 (72)発明者 ラドクリッフェ， ゲイル イー． アメリカ合衆国 マサチューセッツ 01604， ウスター， パリサデス スト リート 11 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 CA09 HA12 HA13 4B063 QA01 QA12 QA13 QQ62 QR16 QR31 QR41 QR50 QR51 QR56 QR66 QR83 QS10 QS11 QS25

Claims (48)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 糞便から抽出されたＤＮＡを分析するための方法であって、
    以下： 糞便サンプルをＤＮＡについての溶媒中でホモジナイズして、少なくとも５：
    １の溶媒体積の糞便質量に対する比を有するホモジナイズされたサンプル混合物
    を形成する工程； 該ホモジナイズされたサンプルをヒトＤＮＡに関して濃縮する工程；および 疾患の特徴に関して該ヒトＤＮＡを分析する工程、 を包含する、方法。
  2. 【請求項２】 前記溶媒体積の糞便質量に対する比が約１０：１〜約３０：
    １である、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記溶媒体積の糞便質量に対する比が約１０：１〜約２０：
    １である、請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記溶媒体積の糞便質量に対する比が約１０：１である、請
    求項２に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記溶媒が生物学的物質を分散させる緩衝液を含む、請求項
    １に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記緩衝液がＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ−ＮａＣｌを含む、請求項
    ５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ−ＮａＣｌ緩衝液が、約ｐＨ９．０
    で最終濃度が約５０ｍＭのＴｒｉｓ、約１６ｍＭのＥＤＴＡおよび約１０ｍＭの
    ＮａＣｌを含む、請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記溶媒がグアニジンイソチオシアネート緩衝液を含む、請
    求項１に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記グアニジンイソチオシアネート緩衝液が約１Ｍ〜約５Ｍ
    の最終濃度を含む、請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記グアニジンイソチオシアネート緩衝液が約３Ｍの最終
    濃度を含む、請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記濃縮する工程が、前記ＤＮＡと配列特異的捕獲プロー
    ブとを接触させることを包含する、請求項１に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記溶媒が界面活性剤およびプロテイナーゼを含む、請求
    項１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記ＤＮＡがヒトＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 患者における結腸直腸癌性病巣または結腸直腸前癌性病巣
    の存在についてのスクリーニングの方法であって、該方法は、以下の工程： 該患者によって排泄された、糞便の少なくとも断面の部分を含むサンプルを得
    る工程； 溶媒中で該サンプルをホモジナイズして、少なくとも５：１の溶媒体積の糞便
    質量に対する比を有するホモジナイズされたサンプル混合物を形成する工程； 標的ヒトＤＮＡに関して該サンプルを濃縮する工程；および 該結腸直腸癌性病巣または結腸直腸前癌性病巣の存在を示すＤＮＡ特徴に関し
    て、該標的ヒトＤＮＡを分析する工程、 を包含する、方法。
  15. 【請求項１５】 前記分析する工程がポリメラーゼ連鎖反応を用いて前記Ｄ
    ＮＡを増幅することを包含する、請求項１４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記ＤＮＡ特徴が多型の遺伝子座を含むヘテロ接合性の喪
    失を含む、請求項１４に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記ＤＮＡ特徴が変異である、請求項１４に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記変異がヘテロ接合性の喪失およびマイクロサテライト
    不安定性からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記ＤＮＡ特徴が癌抑制対立遺伝子の欠失を含む、請求項
    １４に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１４に記載の方法であって、前記分析する工程が、
    前記サンプル中の細胞の部分集団において変異していることが公知または疑われ
    る番号Ｘの第一の対立遺伝子と、該サンプル中の細胞の部分集団において変異し
    ていないことが公知または疑われる番号Ｙの第二の対立遺伝子との間に差が該サ
    ンプル中に存在するか否かを決定する工程を含み、統計学的有意差の存在は、該
    サンプル中の細胞の部分集団における変異および癌性病巣または前癌性病巣の潜
    在的な存在を示す、方法。
  21. 【請求項２１】 請求項１４に記載の方法であって、前記分析する工程が、
    前記サンプル中の多くの標的癌抑制対立遺伝子と、該サンプル中の多くの非癌関
    連参照対立遺伝子との間で差が存在するか否かを決定する工程を含み、統計学的
    有意差の存在は、該サンプル中の細胞の部分集団における標的癌抑制対立遺伝子
    の欠失および癌性病巣または前癌性病巣の潜在的な存在を示す、方法。
  22. 【請求項２２】 請求項１４に記載の方法であって、前記分析する工程がさ
    らに以下の工程： ａ）前記サンプル中多型遺伝子座で、母性対立遺伝子の量を検出する工程； ｂ）該サンプル中多型遺伝子座で、父性対立遺伝子の量を検出する工程；およ
    び ｃ）母性対立遺伝子の量と父性対立遺伝子の量との間で、差が存在するか否か
    を決定する工程、 を包含し、統計学的有意差の存在は、該サンプル中の細胞の部分集団における多
    型遺伝子座での欠失および病巣の潜在的な存在を示す、方法。
  23. 【請求項２３】 前記多型遺伝子座が一塩基多型であり、そして該多型遺伝
    子座が前記母性対立遺伝子と前記父性対立遺伝子との間でヘテロ接合性である、
    請求項２２に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 請求項２２に記載の方法であって、前記検出する工程が以
    下： ａ）前記一塩基多型に隣接する母性対立遺伝子および父性対立遺伝子の両方の
    前記多型遺伝子座の一部分にプローブをハイブリダイズする工程； ｂ）前記サンプルを検出可能に標識されたジデオキシヌクレオシド三リン酸の
    混合物に、該ジデオキシヌクレオシド三リン酸の該一塩基多型への適切な結合を
    可能にする条件下で曝す工程； ｃ）該サンプルを洗浄する工程；および ｄ）該サンプルに残存する、各々の検出可能に標識されたジデオキシヌクレオ
    シド三リン酸の量を計数する工程、 を包含する、方法。
  25. 【請求項２５】 前記検出可能な標識が、放射性同位体、蛍光化合物、およ
    び粒子からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 請求項１４に記載の方法であって、前記分析する工程が一
    ヌクレオチド多型遺伝子座においてヘテロ接合性を検出するための方法を含み、
    以下の工程： ａ）プローブを一塩基多型に隣接する配列にハイブリダイズする工程； ｂ）前記サンプルを、複数の異なる標識されたジデオキシヌクレオチドに曝す
    工程； ｃ）該サンプルを洗浄する工程； ｄ）いずれの該ジデオキシヌクレオチドが該プローブ中へ組み込まれるかを決
    定する工程；および ｅ）該一ヌクレオチド多型部位におけるヘテロ接合性を該プローブに取り込ま
    れた２つのジデオキシヌクレオチドの検出として検出する工程、 を包含する、方法。
  27. 【請求項２７】 請求項１４に記載の方法であって、前記分析する工程が以
    下： （ａ）前記サンプルをハイブリダイゼーション条件下で複数の第一のオリゴヌ
    クレオチドプローブおよび複数の第二のオリゴヌクレオチドプローブに曝し、そ
    れにより以下： （１）該第一のオリゴヌクレオチドプローブを、該生物の野生型細胞に特有
    の第一のポリヌクレオチドセグメントのコピーに対してハイブリダイズし、そし
    て （２）該第二のオリゴヌクレオチドプローブを、結腸直腸癌細胞で欠失また
    は変異していると疑われる野生型ゲノム領域に特有の第二のポリヌクレオチドセ
    グメントのコピーに対してハイブリダイズする、工程； （ｂ）該第一のプローブと該第一のセグメントとの間で形成された二重鎖の第
    １の数および該第二のプローブと該第二のセグメントとの間で形成された二重鎖
    の第２の数を検出する工程；ならびに （ｃ）該第一のプローブと該第一のセグメントとの間で形成された二重鎖の数
    と、該第二のプローブと第二のセグメントとの間で形成された二重鎖の数との間
    に差が存在するか否かを決定する工程、 を包含し、統計学的有意差の存在は、該サンプルにおける結腸直腸癌性病巣また
    は前癌性病巣の存在を示す、方法。
  28. 【請求項２８】 前記第一のオリゴヌクレオチドプローブおよび前記第二の
    オリゴヌクレオチドプローブが各々異なる検出可能な標識に結合する、請求項２
    ７に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 請求項２７に記載の方法であって、ここで、 前記第一のオリゴヌクレオチドプローブが第一の粒子に、１つの粒子に対して
    １つの第一のオリゴヌクレオチドプローブの比で付着し、そして前記第二のオリ
    ゴヌクレオチドプローブが該第一の粒子とは検出可能に異なる第二の粒子に、１
    つの第二の粒子に対して１つの第二のオリゴヌクレオチドプローブの比で付着し
    、ここで、 該検出する工程は、ハイブリダイズしてない第一のオリゴヌクレオチドプロー
    ブおよび第二のオリゴヌクレオチドプローブからハイブリダイズした第一のオリ
    ゴヌクレオチドプローブおよび第二のオリゴヌクレオチドプローブを分離する工
    程、続いて、ハイブリダイズした第一のオリゴヌクレオチドプローブおよび第二
    のオリゴヌクレオチドプローブを検出器に通過させて、該第１の数および該第２
    の数を決定する工程を含む、方法。
  30. 【請求項３０】 前記第一の粒子および前記第二の粒子が検出可能に異なる
    サイズの粒子である、請求項２９に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 前記第一の粒子および前記第二の粒子が検出可能に異なる
    色の粒子である、請求項２９に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 請求項２７に記載の方法であって、その工程（ａ）の前に
    さらに、前記サンプル中の二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変換する工程、ならび
    に前記第一のポリヌクレオチドセグメントおよび前記第二のポリヌクレオチドセ
    グメントに対する相補体を除去する工程を包含する、方法。
  33. 【請求項３３】 請求項３２に記載の方法であって、前記除去する工程が、
    前記相補体を磁気粒子に付着した核酸プローブにハイブリダイズさせる工程、お
    よび続いて前記サンプルから該磁気粒子を除去する工程を包含する、方法。
  34. 【請求項３４】 請求項１４に記載の方法であって、前記分析する工程が前
    記サンプル中の標的対立遺伝子での核酸配列の変化を検出するための方法を包含
    し、以下の工程： （ａ）（ｉ）該サンプル中の野生型標的対立遺伝子の量および （ｉｉ）該サンプル中の参照対立遺伝子の量 を決定する工程；ならびに （ｂ）該サンプル中の該標的対立遺伝子における核酸配列の変化を検出する工
    程、 を包含し、該決定する工程において得られた該野生型標的対立遺伝子の量と該参
    照対立遺伝子の量との間の統計学的有意差が、核酸配列の変化を示す、方法。
  35. 【請求項３５】 請求項３４に記載の方法であって、前記決定する工程が、
    前記サンプルを、前記野生型対立遺伝子の一部分とのハイブリダイズが可能であ
    る第一のオリゴヌクレオチドプローブ、および前記参照対立遺伝子の一部分への
    ハイブリダイズが可能である第二のオリゴヌクレオチドプローブに曝す工程、な
    らびに該サンプルからハイブリダイズしてない第一のオリゴヌクレオチドプロー
    ブまたは第二のオリゴヌクレオチドプローブのどれをも除去する工程を包含する
    、方法。
  36. 【請求項３６】 患者における結腸直腸癌性病巣または前癌性病巣の存在に
    ついてスクリーニングするための方法であって、該方法は以下の工程： 該患者により排泄された糞便の少なくとも断面部分を含むサンプルを得る工程
    ； 該サンプルを溶媒中でホモジナイズして、少なくとも５：１の溶媒体積の糞便
    質量に対する比を有するホモジナイズされたサンプル混合物を形成する工程； 該サンプルが少なくとも最小限の数Ｎの総ＤＮＡ分子を有するか否かを決定し
    て、低頻度の標的ＤＮＡ分子の検出を与える工程； 前記結腸直腸癌性病巣または前記前癌性病巣の存在を示すＤＮＡ特徴に関して
    、該標的ＤＮＡを分析する工程、 を包含する方法。
  37. 【請求項３７】 患者における結腸直腸癌性病巣または前癌性病巣の存在に
    ついてスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下の工程： 該患者によって排泄された糞便の少なくとも断面部分を含むサンプルを得る工
    程； 該サンプルを溶媒中でホモジナイズして、少なくとも５：１の溶媒体積の糞便
    質量に対する比を有するホモジナイズされたサンプル混合物を形成する工程； 該ホモジナイズされたサンプルを標的ヒトＤＮＡに関して濃縮する工程； 該サンプルが少なくとも最小限の数Ｎの総ＤＮＡ分子を有するか否かを決定し
    て、低頻度の標的ＤＮＡ分子の検出を与える、工程； 該結腸直腸癌性病巣または該前癌性病巣の存在を示すＤＮＡ特徴に関して、該
    標的ヒトＤＮＡを分析する工程、 を包含する、方法。
  38. 【請求項３８】 前記分析する工程が、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて前記
    ＤＮＡを増幅する工程を含む、請求項３６に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 前記分析する工程が、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて前記
    ＤＮＡを増幅する工程を含む、請求項３７に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 前記濃縮する工程が、前記ＤＮＡと配列特異的捕獲プロー
    ブとを接触させる工程を包含する、請求項３７に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 前記溶媒が、約１０ｍＭと約２０ｍＭとの間のＥＤＴＡを
    含む、請求項１に記載の方法。
  42. 【請求項４２】 前記溶媒が、約１６ｍＭのＥＤＴＡを含む、請求項１に記
    載の方法。
  43. 【請求項４３】 前記溶媒が、約１０ｍＭと約２０ｍＭとの間のＥＤＴＡを
    含む、請求項１４に記載の方法。
  44. 【請求項４４】 前記溶媒が、約１６ｍＭのＥＤＴＡを含む、請求項１４に
    記載の方法。
  45. 【請求項４５】 前記溶媒が、約１０ｍＭと約２０ｍＭとの間のＥＤＴＡを
    含む、請求項３６に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 前記溶媒が、約１６ｍＭのＥＤＴＡを含む、請求項３６に
    記載の方法。
  47. 【請求項４７】 前記溶媒が、約１０ｍＭと約２０ｍＭとの間のＥＤＴＡを
    含む、請求項３７に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 前記溶媒が、約１６ｍＭのＥＤＴＡを含む、請求項３７に
    記載の方法。
JP2000584110A 1998-11-23 1999-11-22 糞便サンプル調製のための方法 Withdrawn JP2002539765A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/198,083 US6268136B1 (en) 1997-06-16 1998-11-23 Methods for stool sample preparation
US09/198,083 1998-11-23
PCT/US1999/027732 WO2000031303A2 (en) 1998-11-23 1999-11-22 Methods for stool sample preparation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2002539765A true JP2002539765A (ja) 2002-11-26

Family

ID=22731925

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000584110A Withdrawn JP2002539765A (ja) 1998-11-23 1999-11-22 糞便サンプル調製のための方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US6268136B1 (ja)
EP (1) EP1343917A2 (ja)
JP (1) JP2002539765A (ja)
AU (1) AU774214B2 (ja)
CA (1) CA2352455C (ja)
WO (1) WO2000031303A2 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012014694A1 (ja) * 2010-07-26 2012-02-02 オリンパス株式会社 糞便由来核酸の合成方法
JP5710969B2 (ja) * 2008-07-23 2015-04-30 オリンパス株式会社 糞便試料からの核酸回収方法

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6406857B1 (en) 1997-06-16 2002-06-18 Exact Sciences Corporation Methods for stool sample preparation
US6818404B2 (en) * 1997-10-23 2004-11-16 Exact Sciences Corporation Methods for detecting hypermethylated nucleic acid in heterogeneous biological samples
WO2000050640A1 (en) 1999-02-25 2000-08-31 Exact Laboratories, Inc. Methods for preserving dna integrity
AU767983B2 (en) * 1999-04-09 2003-11-27 Esoterix Genetic Laboratories, Llc Methods for detecting nucleic acids indicative of cancer
US6849403B1 (en) 1999-09-08 2005-02-01 Exact Sciences Corporation Apparatus and method for drug screening
US6586177B1 (en) 1999-09-08 2003-07-01 Exact Sciences Corporation Methods for disease detection
US6919174B1 (en) 1999-12-07 2005-07-19 Exact Sciences Corporation Methods for disease detection
CA2394921A1 (en) 1999-12-07 2001-06-14 Anthony P. Shuber Supracolonic aerodigestive neoplasm detection
US20050272085A1 (en) * 2000-09-06 2005-12-08 Hodge Timothy A Methods for forensic and congenic screening
US6911308B2 (en) 2001-01-05 2005-06-28 Exact Sciences Corporation Methods for detecting, grading or monitoring an H. pylori infection
US6428964B1 (en) 2001-03-15 2002-08-06 Exact Sciences Corporation Method for alteration detection
US20060258856A1 (en) * 2002-02-13 2006-11-16 Medimolecular Pty. Ltd. Method of isolating nucleic acids from stool samples
WO2003071252A2 (en) 2002-02-15 2003-08-28 Exact Sciences Corporation Methods for analysis of molecular events
US7482116B2 (en) 2002-06-07 2009-01-27 Dna Genotek Inc. Compositions and methods for obtaining nucleic acids from sputum
US20040086895A1 (en) * 2002-11-06 2004-05-06 Crothers Donald M. Method of electrochemical detection of somatic cell mutations
US20090305294A1 (en) * 2003-02-13 2009-12-10 Medimolecular Pty Ltd Method of isolating nucleic acids from stool samples
US20040259101A1 (en) * 2003-06-20 2004-12-23 Shuber Anthony P. Methods for disease screening
CN2718561Y (zh) * 2003-07-11 2005-08-17 艾康生物技术(杭州)有限公司 用于取样签的保护套
US20050014165A1 (en) * 2003-07-18 2005-01-20 California Pacific Medical Center Biomarker panel for colorectal cancer
WO2005111244A2 (en) * 2004-05-10 2005-11-24 Exact Sciences Corporation Methods for detecting a mutant nucleic acid
US20080124714A1 (en) * 2004-05-14 2008-05-29 Exact Sciences Corporation Method for Stabilizing Biological Samples for Nucleic Acid Analysis
US7981607B2 (en) 2004-08-27 2011-07-19 Esoterix Genetic Laboratories LLC Method for detecting recombinant event
WO2006047787A2 (en) 2004-10-27 2006-05-04 Exact Sciences Corporation Method for monitoring disease progression or recurrence
WO2006065598A2 (en) * 2004-12-13 2006-06-22 Geneohm Sciences, Inc. Fluidic cartridges for electrochemical detection of dna
US9777314B2 (en) * 2005-04-21 2017-10-03 Esoterix Genetic Laboratories, Llc Analysis of heterogeneous nucleic acid samples
US8062901B2 (en) 2005-04-30 2011-11-22 Alere Switzerland Gmbh Devices and methods for sample collection and analysis
US20090117660A1 (en) * 2005-04-30 2009-05-07 Oakville Hong Kong Co., Limited Devices and methods for sample collection and analysis
US8114587B2 (en) * 2005-06-23 2012-02-14 Ambergen, Inc. Methods for the detection of colorectal cancer
US20070092401A1 (en) * 2005-10-26 2007-04-26 Feier Liao Devices and methods for sample collection and analysis
AU2008260075A1 (en) 2007-05-31 2008-12-11 California Pacific Medical Center Method to predict or diagnose a gastrointestinal disorder or disease
US8883440B2 (en) 2007-07-26 2014-11-11 Nancy M. Lee Method to predict or diagnose a gastrointestinal disorder or disease
JP5917144B2 (ja) * 2009-12-07 2016-05-11 アークレイ株式会社 疾患関連遺伝子の多型検出用プローブおよびその用途
EP2670893B1 (en) 2011-02-02 2018-06-27 Exact Sciences Development Company, LLC Digital sequence analysis of dna methylation
GB201107466D0 (en) 2011-05-05 2011-06-15 Loktionov Alexandre Device and method for non-invasive collection of colorectal mucocellular layer and disease detection
EP3928715A1 (en) 2011-06-19 2021-12-29 DNA Genotek, Inc. Devices, solutions and methods for sample collection
US20140322706A1 (en) 2012-10-24 2014-10-30 Jon Faiz Kayyem Integrated multipelx target analysis
JP1628115S (ja) 2012-10-24 2019-04-01
US9222623B2 (en) 2013-03-15 2015-12-29 Genmark Diagnostics, Inc. Devices and methods for manipulating deformable fluid vessels
USD881409S1 (en) 2013-10-24 2020-04-14 Genmark Diagnostics, Inc. Biochip cartridge
US9498778B2 (en) 2014-11-11 2016-11-22 Genmark Diagnostics, Inc. Instrument for processing cartridge for performing assays in a closed sample preparation and reaction system
WO2015066695A1 (en) 2013-11-04 2015-05-07 Exact Sciences Corporation Multiple-control calibrators for dna quantitation
EP3084004A4 (en) 2013-12-19 2017-08-16 Exact Sciences Corporation Synthetic nucleic acid control molecules
CA2941764C (en) 2014-03-07 2023-10-24 Dna Genotek Inc. Composition and method for stabilizing nucleic acids in biological samples
US10005080B2 (en) 2014-11-11 2018-06-26 Genmark Diagnostics, Inc. Instrument and cartridge for performing assays in a closed sample preparation and reaction system employing electrowetting fluid manipulation
US9598722B2 (en) 2014-11-11 2017-03-21 Genmark Diagnostics, Inc. Cartridge for performing assays in a closed sample preparation and reaction system
AU2017299597B2 (en) 2016-07-19 2023-08-24 Exact Sciences Corporation Methylated control DNA
WO2018017710A1 (en) 2016-07-19 2018-01-25 Exact Sciences Development Company, Llc Nucleic acid control molecules from non-human organisms
CN107937391B (zh) * 2017-11-29 2021-07-09 上海透景生命科技股份有限公司 人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液及其制备方法和应用
CN109486809B (zh) * 2018-12-29 2020-08-21 厦门艾德生物医药科技股份有限公司 一种大量提取转化粪便dna的方法
CN109762877B (zh) * 2019-01-21 2021-03-09 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） 从粪便中富集胃幽门螺杆菌治疗相关基因的方法及试剂盒

Family Cites Families (96)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4101279A (en) 1977-04-06 1978-07-18 Muhammed Javed Aslam Device for the collection and processing of stool specimens
US4333734A (en) 1980-01-18 1982-06-08 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Diagnostic device for fecal occult blood and method of use
US4535058A (en) 1982-10-01 1985-08-13 Massachusetts Institute Of Technology Characterization of oncogenes and assays based thereon
US4309782A (en) 1980-09-11 1982-01-12 Esteban Paulin Device for collecting fecal specimens
US4358535A (en) 1980-12-08 1982-11-09 Board Of Regents Of The University Of Washington Specific DNA probes in diagnostic microbiology
US5482834A (en) 1982-05-17 1996-01-09 Hahnemann University Evaluation of nucleic acids in a biological sample hybridization in a solution of chaotrophic salt solubilized cells
US4445235A (en) 1982-09-13 1984-05-01 Pearl Slover Stool specimen collector
US4578358A (en) 1983-05-03 1986-03-25 Warner-Lambert Company Collection of specimens and detection of occult blood therein
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4871838A (en) 1985-07-23 1989-10-03 The Board Of Rijks Universiteit Leiden Probes and methods for detecting activated ras oncogenes
US4705050A (en) 1985-10-02 1987-11-10 Markham Charles W Moisture-activated floatation device
US5348855A (en) 1986-03-05 1994-09-20 Miles Inc. Assay for nucleic acid sequences in an unpurified sample
CA1284931C (en) 1986-03-13 1991-06-18 Henry A. Erlich Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids
US4981783A (en) 1986-04-16 1991-01-01 Montefiore Medical Center Method for detecting pathological conditions
CA1341576C (en) 1986-08-11 2008-07-08 Thaddeus P. Dryja Diagnosis of retinoblastoma
US4735905A (en) 1986-08-15 1988-04-05 V-Tech, Inc. Specimen-gathering apparatus and method
US4935342A (en) * 1986-12-01 1990-06-19 Syngene, Inc. Method of isolating and purifying nucleic acids from biological samples
AU625169B2 (en) 1987-03-23 1992-07-02 Imperial Chemical Industries Plc Molecular markers
US4857300A (en) 1987-07-27 1989-08-15 Cytocorp, Inc. Cytological and histological fixative formulation and methods for using same
IL89964A0 (en) 1988-04-15 1989-12-15 Montefiore Med Center Method for determining malignant progression,cdna,polypeptides encoded thereby and pharmaceutical compositions containing the same
FR2630000A1 (fr) 1988-04-18 1989-10-20 Sultan Bernard Flacon destine a recueillir un echantillon biologique urinaire pour examen cytobacteriologique
US5272057A (en) 1988-10-14 1993-12-21 Georgetown University Method of detecting a predisposition to cancer by the use of restriction fragment length polymorphism of the gene for human poly (ADP-ribose) polymerase
CA2044591C (en) 1989-02-13 2002-08-13 James Langham Dale Detection of a nucleic acid sequence or a change therein
US5248671A (en) 1989-02-15 1993-09-28 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for treatment of cancer using oligonucleotides
US5087617A (en) 1989-02-15 1992-02-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for treatment of cancer using oligonucleotides
US5380645A (en) 1989-03-16 1995-01-10 The Johns Hopkins University Generalized method for assessment of colorectal carcinoma
US5362623A (en) 1991-06-14 1994-11-08 The John Hopkins University Sequence specific DNA binding by p53
DE69032864T3 (de) 1989-03-29 2013-01-31 The Johns Hopkins University Nachweis des Ausfalls des Wildtyps des p53-Gens
US5527676A (en) 1989-03-29 1996-06-18 The Johns Hopkins University Detection of loss of the wild-type P53 gene and kits therefor
US5196167A (en) 1989-04-04 1993-03-23 Helena Laboratories Corporation Fecal occult blood test product with positive and negative controls
US5192501A (en) 1989-04-04 1993-03-09 Helena Laboratories Corporation Method of formulating a test ink for a fecal occult blood test product
US5589335A (en) 1989-04-05 1996-12-31 Amoco Corporation Hybridization promotion reagents
ES2059895T3 (es) 1989-06-23 1994-11-16 Canon Kk Metodo para la deteccion de acido nucleico.
US5302509A (en) 1989-08-14 1994-04-12 Beckman Instruments, Inc. Method for sequencing polynucleotides
CA2029219A1 (en) 1989-11-08 1991-05-09 Mary K. Estes Methods and reagents to detect and characterize norwalk and related viruses
US5137806A (en) 1989-12-11 1992-08-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the detection of sequences in selected DNA molecules
WO1991009964A1 (en) 1990-01-04 1991-07-11 The Johns Hopkins University Gene deleted in colorectal cancer of humans
US5126239A (en) 1990-03-14 1992-06-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Process for detecting polymorphisms on the basis of nucleotide differences
US5200314A (en) 1990-03-23 1993-04-06 Chiron Corporation Polynucleotide capture assay employing in vitro amplification
JP3179481B2 (ja) 1990-06-27 2001-06-25 プリンストン ユニバーシティ 突然変異体ｐ５３検出用プローブ
AU8951191A (en) 1990-10-29 1992-05-26 Dekalb Plant Genetics Isolation of biological materials using magnetic particles
US5846710A (en) 1990-11-02 1998-12-08 St. Louis University Method for the detection of genetic diseases and gene sequence variations by single nucleotide primer extension
DE69231734T2 (de) 1991-01-16 2001-09-20 Japan Found Cancer Geerbte und somatische mutationen des apc-gens bei menschlichem colorectal-krebs
US5352775A (en) 1991-01-16 1994-10-04 The Johns Hopkins Univ. APC gene and nucleic acid probes derived therefrom
WO1992013971A1 (en) 1991-02-05 1992-08-20 Lifecodes Corporation Molecular genetic identification using probes that recognize polymorphic loci
WO1992014157A1 (en) 1991-02-05 1992-08-20 Kamal Bahar Simple test for detecting carcinoembryonic antigen
WO1992016657A1 (en) 1991-03-13 1992-10-01 E.I. Du Pont De Nemours And Company Method of identifying a nucleotide present at a defined position in a nucleic acid
US5330892A (en) 1991-03-13 1994-07-19 The Johns Hopkins University MCC gene (mutated in colorectal cancer) used for diagnosis of cancer in humans
US5378602A (en) 1991-05-29 1995-01-03 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Highly informative microsatellite repeat polymorphic DNA markers twenty-[seven]six
US5468610A (en) 1991-05-29 1995-11-21 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Three highly informative microsatellite repeat polymorphic DNA markers
US5149506A (en) 1991-08-09 1992-09-22 Sage Products, Inc. Stool collection and transport device
US5506105A (en) 1991-12-10 1996-04-09 Dade International Inc. In situ assay of amplified intracellular mRNA targets
ATE205542T1 (de) 1992-03-04 2001-09-15 Univ California Vergleichende genomhybridisierung
AU3919293A (en) 1992-03-27 1993-11-08 University Of Maryland At Baltimore Detection of gene mutations with mismatch repair enzymes
ES2210239T3 (es) * 1992-04-01 2004-07-01 The Johns Hopkins University School Of Medicine Metodo para detectar acidos nucleicos de mamiferos aislados en heces y reactivos para el mismo.
US5489508A (en) 1992-05-13 1996-02-06 University Of Texas System Board Of Regents Therapy and diagnosis of conditions related to telomere length and/or telomerase activity
DE69333202T2 (de) 1992-06-26 2004-03-18 The Trustees Of Princeton University Verfahren zur erkennung von krebszellen oder ihren vorstadien mittels p90 und p53-antikörper oder p90 und p53-sonden
WO1994001447A1 (en) 1992-07-02 1994-01-20 Eriphyle B.V. Methods of single nucleotide primer extension to detect specific alleles and kits therefor
US5409586A (en) 1992-08-26 1995-04-25 Hitachi, Ltd. Method for analyzing nucleic acid or protein and apparatus therefor
US6214542B1 (en) 1992-10-20 2001-04-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Quantification of indicators of fibrosis
IL103600A0 (en) 1992-10-30 1993-03-15 Yeda Res & Dev Method and kit for cancer diagnosis
US5436142A (en) 1992-11-12 1995-07-25 Cold Spring Harbor Laboratory Methods for producing probes capable of distingushing variant genomic sequences
US5331973A (en) 1993-03-15 1994-07-26 Fiedler Paul N Method for obtaining stool samples for gastrointestinal cancer testing
US5492808A (en) 1993-05-05 1996-02-20 The Johns Hopkins University Means for detecting familial colon cancer (FCC)
US5466576A (en) 1993-07-02 1995-11-14 Fred Hutchinson Cancer Research Center Modulation of PIF-1-type helicases
EP0648845B1 (en) 1993-07-08 2002-10-09 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Method for coamplification of two different nucleic acid sequences using polymerase chain reaction
WO1995002068A1 (fr) 1993-07-09 1995-01-19 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Methode de discrimination des acides nucleiques et necessaire d'essai a cette fin
FR2709761B1 (fr) 1993-09-10 1995-11-24 Pasteur Institut Procédé de détection de molécules contenant des mésappariements nucléotidiques et de localisation de ces mésappariements, et application à la détection de substitutions ou de délétions de bases .
WO1995009928A1 (en) 1993-10-06 1995-04-13 The Regents Of The University Of California Methods for detecting cancer-associated chromosome deletions using in situ hybridization
US5472842A (en) 1993-10-06 1995-12-05 The Regents Of The University Of California Detection of amplified or deleted chromosomal regions
US5416025A (en) 1993-11-29 1995-05-16 Krepinsky; Jiri J. Screening test for early detection of colorectal cancer
US5681697A (en) 1993-12-08 1997-10-28 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assays having reduced background noise and kits therefor
US5709998A (en) 1993-12-15 1998-01-20 The Johns Hopkins University Molecular diagnosis of familial adenomatous polyposis
US5538851A (en) 1993-12-22 1996-07-23 Institut Pasteur And Cneva Primers for the amplification of genes coding for the enterotoxin and the lecithinase of Clostridium perfringens and their application to the determination of the presence and numeration of these bacteriae
US5496470A (en) 1994-05-27 1996-03-05 Barnes International, Inc. Magnetic separator
US6037465A (en) * 1994-06-14 2000-03-14 Invitek Gmbh Universal process for isolating and purifying nucleic acids from extremely small amounts of highly contaminated various starting materials
US5702886A (en) 1994-10-05 1997-12-30 The Johns Hopkins University Chromosome I8Q loss and prognosis in colorectal cancer
US5512441A (en) 1994-11-15 1996-04-30 American Health Foundation Quantative method for early detection of mutant alleles and diagnostic kits for carrying out the method
US5463782A (en) 1994-11-21 1995-11-07 Eric V. Carlson Foldable stool sample collection device
DE19530132C2 (de) * 1995-08-16 1998-07-16 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur Reinigung, Stabilisierung oder Isolierung von Nukleinsäuren aus biologischen Materialien
GB9518156D0 (en) * 1995-09-06 1995-11-08 Medical Res Council Method of isolating cells
DE29514502U1 (de) * 1995-09-08 1995-11-23 Siemens AG, 80333 München Steckkarte für einen Rechner
US5670325A (en) 1996-08-14 1997-09-23 Exact Laboratories, Inc. Method for the detection of clonal populations of transformed cells in a genomically heterogeneous cellular sample
US5612473A (en) 1996-01-16 1997-03-18 Gull Laboratories Methods, kits and solutions for preparing sample material for nucleic acid amplification
US5741650A (en) 1996-01-30 1998-04-21 Exact Laboratories, Inc. Methods for detecting colon cancer from stool samples
US6143529A (en) * 1996-08-14 2000-11-07 Exact Laboratories, Inc. Methods for improving sensitivity and specificity of screening assays
US5928870A (en) 1997-06-16 1999-07-27 Exact Laboratories, Inc. Methods for the detection of loss of heterozygosity
US5952178A (en) * 1996-08-14 1999-09-14 Exact Laboratories Methods for disease diagnosis from stool samples
US6100029A (en) 1996-08-14 2000-08-08 Exact Laboratories, Inc. Methods for the detection of chromosomal aberrations
US6146828A (en) 1996-08-14 2000-11-14 Exact Laboratories, Inc. Methods for detecting differences in RNA expression levels and uses therefor
US6020137A (en) 1996-08-14 2000-02-01 Exact Laboratories, Inc. Methods for the detection of loss of heterozygosity
DE19737917B4 (de) * 1996-08-26 2008-11-06 InViTek Gesellschaft für Biotechnik & Biodesign mbH Verfahren zum Nachweis klinisch relevanter Veränderungen der DNS-Sequenz des Ki-ras-Onkogens, seine Verwendung und Testkit zur Früherkennung von Tumoren
US5856104A (en) 1996-10-28 1999-01-05 Affymetrix, Inc. Polymorphisms in the glucose-6 phosphate dehydrogenase locus
US5830665A (en) 1997-03-03 1998-11-03 Exact Laboratories, Inc. Contiguous genomic sequence scanning
US5888778A (en) 1997-06-16 1999-03-30 Exact Laboratories, Inc. High-throughput screening method for identification of genetic mutations or disease-causing microorganisms using segmented primers
WO1998058081A1 (en) * 1997-06-16 1998-12-23 Exact Laboratories, Inc. Methods for stool sample preparation

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5710969B2 (ja) * 2008-07-23 2015-04-30 オリンパス株式会社 糞便試料からの核酸回収方法
WO2012014694A1 (ja) * 2010-07-26 2012-02-02 オリンパス株式会社 糞便由来核酸の合成方法

Also Published As

Publication number Publication date
AU1919500A (en) 2000-06-13
WO2000031303A2 (en) 2000-06-02
CA2352455C (en) 2009-02-17
WO2000031303A3 (en) 2003-07-03
CA2352455A1 (en) 2000-06-02
AU774214B2 (en) 2004-06-17
US6268136B1 (en) 2001-07-31
EP1343917A2 (en) 2003-09-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6268136B1 (en) Methods for stool sample preparation
US6406857B1 (en) Methods for stool sample preparation
EP1169479B1 (en) Methods for detecting nucleic acids indicative of cancer
US5952178A (en) Methods for disease diagnosis from stool samples
US5741650A (en) Methods for detecting colon cancer from stool samples
US20040106140A1 (en) Methods of identification and isolation of polynucleotides containing nucleic aicd differences
CN102628082B (zh) 基于高通量测序技术进行核酸定性定量检测的方法
WO1998058081A1 (en) Methods for stool sample preparation
JP2002543855A (ja) Ｂａｔ−２６遺伝子座における変異を検出するアッセイを実施することによって結腸直腸疾患を検出する方法
US20240309434A1 (en) Targeted rare allele crispr enrichment
WO2021185275A1 (zh) 一种检测11种癌症的探针组合物
AU4233399A (en) Methods for detecting colon cancer from stool samples
EP1291657A2 (en) Methods for detecting colon cancer from stool samples

Legal Events

Date Code Title Description
A300 Application deemed to be withdrawn because no request for examination was validly filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300

Effective date: 20070206