WO2013051710A1 - 消化器癌診断用マーカー、および消化器癌の検査方法 - Google Patents

消化器癌診断用マーカー、および消化器癌の検査方法 Download PDF

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祥次 夏越
泰斗 内門
照人 橋口
洋之 新地
公成 前村
雄弘 又木
紀親 森脇
勝 関島
秀行 島岡
碧 阪口
雅夫 福島
幸太 五十嵐
皓基 阿部
大知 相原
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国立大学法人鹿児島大学
住友ベークライト株式会社
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    • G01N33/57469—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving tumor associated glycolinkage, i.e. TAG

Definitions

  • the present invention relates to a marker for diagnosis of digestive organ cancer and a method for examining digestive organ cancer.
  • the digestive organ is an organ responsible for food intake, transport, digestion, nutrient absorption and excretion.
  • the pancreas is an organ having a length of about 15 cm on the back side of the stomach.
  • the main diseases include pancreatic cancer and pancreatitis.
  • pancreatic cancer is known as one of cancers in which the death rate of Japanese people has increased in recent years.
  • pancreatic cancer has not been fully elucidated.
  • the risk factors are considered to be excessive intake of animal fats, proteins, alcohol, etc. due to westernization of eating habits, or smoking.
  • people with a history of chronic pancreatitis, pancreatic stone disease, diabetes, and acute pancreatitis are also considered to belong to a high-risk group with a high risk of developing pancreatic cancer.
  • Pancreatic cancer is a type of cancer that develops from cells that have an exocrine function, particularly cells of the pancreatic duct through which pancreatic juice flows. Over 90% of pancreatic cancers are classified as this type of cancer. Pancreatic cancer is extremely high in malignancy, and metastasis to other organs occurs at an early stage, so early detection is an issue.
  • pancreas is surrounded by many organs such as the stomach, duodenum, spleen, small intestine, large intestine, liver, gallbladder, and exists in the retroperitoneum. For this reason, it is extremely difficult to find an early stage cancer even if various types of image diagnosis are used. Accordingly, pancreatic cancer is often found as an advanced cancer.
  • Peritoneal dissemination is one of the main causes of recurrence after curative resection of advanced cancer. Advances in chemotherapy have also seen therapeutic effects on recurrence of peritoneal dissemination. However, the 5-year survival rate of patients who have relapsed peritoneal dissemination is still low. It is known that many steps and many genes are involved in the mechanism of peritoneal dissemination of gastric cancer. It is reported that adhesion molecule-related genes, apoptosis-related genes and other genes are deeply involved in peritoneal dissemination of gastric cancer. Further research is also needed to elucidate the mechanism of gastric cancer metastasis, including peritoneal dissemination of gastric cancer.
  • esophageal cancers occur in the middle thoracic esophagus.
  • Over 90% of Japanese esophageal cancers are squamous cell carcinomas. Men have higher morbidity and mortality of esophageal cancer than women, more than five times more than women.
  • Regarding the occurrence of esophageal cancer the involvement of drinking and smoking has been reported for a long time.
  • the involvement of ALDH2 has also been reported for the development of esophageal cancer.
  • Esophageal cancer is a disease that is highly invasive in its operation and has a poor prognosis.
  • pancreatic cancer marker genes PANCIA and PANCIB (see Patent Document 1) and KCCR13L (see Patent Document 2) have been disclosed as pancreatic cancer marker genes.
  • pancreatic cancer cells there are DNA amplifications and deletions at specific sites of the chromosome. Diagnosis of pancreatic cancer by detecting the amplification and deletion of chromosome sites specific to the pancreatic cancer A method to do this has also been proposed.
  • gastric cancer there is a method characterized by using a change in the expression level of a known type I collagen C-terminal non-triple chain telopeptide (ICTP) as a marker.
  • ICTP type I collagen C-terminal non-triple chain telopeptide
  • an appropriate diagnostic marker for advanced gastric cancer, particularly Skills gastric cancer see Patent Document 3
  • the number of demethylated DNA present in a DNA repeat sequence obtained from a cancerous or non-cancerous tissue sample A method for determining whether the prognosis of various cancer diseases including gastric cancer is good based on the ratio has been proposed (see, for example, Patent Document 4).
  • Patent Document 5 Furthermore, a method for screening metastatic colorectal cancer, primary or metastatic gastric cancer or esophageal cancer using the expression of SI, CDX1, or CDX2 as an index has been proposed (see Patent Document 5).
  • tumor markers are currently used to understand the dynamics of advanced malignant tumors, and cancer screening / diagnosis methods using tumor markers that can be used for early diagnosis have been established. Absent. In particular, early diagnosis of pancreatic cancer is difficult, and treatment results are poor. Therefore, there is an urgent need to develop a method that can be applied to screening for pancreatic cancer.
  • An object of the present invention is to provide a marker for diagnosing digestive organ cancer that can be used in an inspection method for inspecting digestive organ cancer early and easily, and a method for inspecting digestive organ cancer that can early and easily inspect digestive organ cancer There is to do.
  • a marker for diagnosis of digestive organ cancer used for identifying the presence or absence of digestive organ cancer comprises an N-linked sugar chain released from a glycoprotein contained in blood, The marker for digestive cancer diagnosis, wherein the N-linked sugar chain is at least one of those represented by the following formulas (1) to (6).
  • the mass spectrum of the N-linked sugar chain represented by the formula (1) obtained by mass spectrometry using a MALDI-TOF-MS analyzer has a peak with a mass-to-charge ratio of 2521 m / z.
  • the mass spectrum of the N-linked sugar chain represented by the formula (2) obtained by mass spectrometry using a MALDI-TOF-MS analyzer has a peak with a mass-to-charge ratio of 2216 m / z.
  • the mass spectrum of the N-linked sugar chain represented by the above formula (3) obtained by mass spectrometry using a MALDI-TOF-MS analyzer has a peak with a mass-to-charge ratio of 2216 m / z.
  • the mass spectrum of the N-linked sugar chain represented by the above formula (4) obtained by mass spectrometry using a MALDI-TOF-MS analyzer has a peak with a mass-to-charge ratio of 2054 m / z.
  • the mass spectrum of the N-linked sugar chain represented by the formula (5) obtained by mass spectrometry using a MALDI-TOF-MS analyzer has a peak with a mass-to-charge ratio of 2681 m / z.
  • the mass spectrum of the N-linked sugar chain represented by the above formula (6) obtained by mass spectrometry using a MALDI-TOF-MS analyzer has a peak with a mass-to-charge ratio of 3108 m / z.
  • the detection of the N-linked sugar chain represented by the formula (1) to the formula (6) is performed by mass spectrometry obtained by mass spectrometry using a MALDI-TOF-MS type analyzer.
  • the detection value of at least one of the peak having a mass-to-charge ratio [m / z] of 2681 and the peak having a mass-to-charge ratio [m / z] of 3108 is higher than that of a healthy person.
  • a marker for diagnosis of digestive organ cancer of the present invention that is, a specific N-linked sugar chain, from blood collected from a subject, it is possible to easily test for digestive organ cancer at an early stage. It becomes possible.
  • the digestive cancer test method using such a marker for digestive cancer diagnosis it is possible to easily perform digestive cancer test at an early stage and to treat early digestive cancer. it can.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of quantifying the abundance in each sample of sugar chains determined to have a significant difference by T-test performed between two groups of healthy subjects and pancreatic cancer patients. It is. (Refer to the description of Examples for the correction of the sugar chain abundance)
  • FIG. 2 is a graph showing the results of quantifying the abundance in each sample of sugar chains determined to have a significant difference by T-test performed between two groups of healthy subjects and esophageal cancer patients. It is. (Refer to the description of Examples for the correction of the sugar chain abundance)
  • FIG. 3 is a graph showing the results of quantifying the abundance in each sample of sugar chains determined to have a significant difference by T-test performed between two groups of healthy subjects and stomach cancer patients. is there.
  • FIG. 4 is a graph showing the peaks that can be separated into two groups (patient group and healthy group) by performing multivariate analysis of the area of each peak of the mass spectrum obtained as a result of mass spectrometry of specimens of pancreatic cancer patients and healthy individuals. It is a figure which shows the result of having identified the combination.
  • a sugar chain is a general term for molecules in which monosaccharides such as glucose, galactose, mannose, fucose, xylose, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, sialic acid, and derivatives thereof are linked in a chain by glycosidic bonds. .
  • Sugar chains are very diverse and are substances involved in various functions of naturally occurring organisms. Sugar chains often exist as complex carbohydrates bound to proteins, lipids, and the like in vivo, and are one of the important components in vivo. It is becoming clear that sugar chains in living organisms are deeply involved in cell-to-cell information transmission, protein functions and interactions.
  • biopolymers having sugar chains include proteoglycans on the cell walls of plant cells that contribute to cell stabilization, cell differentiation, cell proliferation, cell adhesion, cell migration, and the like, and Examples thereof include glycoproteins involved in cell-cell interaction and cell recognition.
  • proteoglycans on the cell walls of plant cells that contribute to cell stabilization, cell differentiation, cell proliferation, cell adhesion, cell migration, and the like
  • glycoproteins involved in cell-cell interaction and cell recognition The mechanisms by which these high-molecular sugar chains control sophisticated and precise biological reactions while substituting, assisting, amplifying, regulating, or inhibiting each other's functions are gradually being clarified.
  • sugar chains present on the cell surface play an important role as scaffolds for various biological reactions.
  • sugar chains are said to be involved in the occurrence of diseases due to abnormal interaction with receptors, infection with AIDS virus, influenza virus, etc., and the entry of pathogenic E. coli O157 toxin and cholera toxin into cells.
  • specific sugar chains appear on the cell surface in certain types of cancer cells.
  • sugar chains on the cell surface are considered to be important molecules that give a cell a personality.
  • the “N-linked sugar chain” is a sugar chain bonded to the nitrogen atom of the side chain amide group of the asparagine residue of the protein, and is N-type. It is also called a sugar chain or asparagine-linked sugar chain.
  • the present inventor paid attention to such an N-linked sugar chain, in particular, an N-linked sugar chain contained in a blood sample of a digestive cancer patient. Tried development.
  • pancreatic cancer patients 17 pancreatic cancer patients, 34 esophageal cancer patients and 22 gastric cancer patients with consent were taken as subjects, blood was collected from each subject, and N-linked sugar chains in plasma were collected. Mass spectrometry was performed. As a result, the N-linked sugar chain (hereinafter simply referred to as “sugar chain”) in which the abundance is significantly changed in the blood sample of the subject (cancer patient) compared to the healthy person. ) was successfully identified, and the present invention was completed.
  • sucgar chain the N-linked sugar chain in which the abundance is significantly changed in the blood sample of the subject (cancer patient) compared to the healthy person.
  • the identified N-linked sugar chain can be used as a marker for digestive cancer diagnosis for identifying presence or absence of digestive cancer.
  • This N-linked sugar chain is released from a glycoprotein contained in blood, and is characterized in that it is at least one of those represented by the following formulas (1) to (6).
  • Such a sugar chain can be identified, for example, by mass spectrometry using a MALDI-TOF-MS type analyzer.
  • Each N-linked sugar chain has the following characteristic peaks in the mass spectrum obtained by mass analysis using a MALDI-TOF-MS type analyzer.
  • the mass spectrum of the N-linked sugar chain represented by the formula (1) includes a peak having a mass-to-charge ratio (m / z) of 2521, and N represented by the formula (2).
  • the mass spectrum of the conjugated sugar chain includes a peak having a mass-to-charge ratio (m / z) of 2216, and the mass spectrum of the N-linked glycan represented by the formula (3) is a mass-to-charge ratio (m / z).
  • the mass spectrum of the N-linked sugar chain represented by the formula (4) includes a peak having a mass-to-charge ratio (m / z) of 2054.
  • the mass spectrum of the N-linked sugar chain represented by the formula (5) includes a peak having a mass-to-charge ratio (m / z) of 2681, and the N-linked sugar represented by the formula (6)
  • the mass spectrum of the chain includes a peak with a mass to charge ratio (m / z) of 3108.
  • the mass spectrum obtained further has a mass-to-charge ratio (m / z) of 2695. It contains a certain peak. Therefore, if the N-linked sugar chain that is the origin of this peak can be identified, this N-linked sugar chain can also be used as a digestive cancer diagnostic marker for identifying the presence or absence of digestive cancer. .
  • MALDI-TOF-MS is a method of measuring mass based on time of flight using the MALDI method. Specifically, in the MALDI method, after spotting a sample on a plate, a matrix solution (2,5-dihydroxybenzoic acid) is added, dried to a crystalline state, and then a large amount of energy is applied to the matrix by pulse laser irradiation. And (M + H) + , (M + Na) + and other sample-derived ions and matrix-derived ions are desorbed.
  • Digestive system cancer can be examined by the following digestive system cancer test method of the present invention.
  • the method for examining digestive organ cancer comprises a detection step of detecting an N-linked sugar chain represented by the above formulas (1) to (6) released from a glycoprotein contained in blood; And an identification step for identifying the presence or absence of digestive organ cancer based on the detection result of the detection step.
  • N-linked sugar chains represented by the above formulas (1) to (6) that are released from glycoproteins contained in blood are detected (detection step).
  • blood is collected from a subject as a sample.
  • the “blood collected from the subject (sample)” may be whole blood containing all blood components, or serum or plasma separated from blood. Of these, serum and plasma are preferable as the sample, and plasma is particularly preferable. Thereby, the N-linked sugar chain can be detected from the sample with excellent detection sensitivity.
  • sugar chains are released from glycoproteins in blood.
  • a release method is not particularly limited.
  • an enzyme method using N-glycosidase F also referred to as glycopeptidase, PNGase, glycanase, glycoamidase, etc.
  • an enzyme method using N-glycosidase F can be suitably used as the release method.
  • a protease such as trypsin can be used in combination.
  • the sugar chain released in the blood is purified.
  • a purification method is not particularly limited as long as it is a method for selectively capturing and purifying sugar chains from a mixture in a sample.
  • BlotGlyco registered trademark
  • a sugar chain-carrying bead capture carrier
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • N-linked sugar chains represented by the above formulas (1) to (6) are detected from the purified sugar chains.
  • Such detection of the N-linked sugar chain represented by the above formulas (1) to (6) is performed by mass spectrometry using the MALDI-TOF-MS type analyzer as described above. It can be performed with excellent accuracy.
  • the presence or absence of the digestive organ cancer is identified based on the detection result of the detection step (identification step).
  • mass spectrometry of N-linked sugar chains in the plasma of 17 pancreatic cancer patients, 34 esophageal cancer patients, and 22 stomach cancer patients described above revealed that the mass-to-charge ratio (m / z) was 2521, 2216, and 2054.
  • the detection value of at least one of the peaks that is is significantly lower than the detection value of the healthy subject.
  • the detection value of at least one of the peaks having a mass-to-charge ratio (m / z) of 2681 and 3108 was significantly higher than the detection value of the healthy person.
  • the detected value of at least one of the peaks having a mass-to-charge ratio [m / z] of 2521, 2216, and 2054 is lower than the detected value of the healthy subject, Can be identified as suspected of having gastrointestinal cancer.
  • the detection value of at least one of the peaks having a mass-to-charge ratio [m / z] of 2681 and 3108 is higher than that of a healthy person, the subject is diagnosed with digestive cancer. Can be identified as suspected.
  • the detection value of the peak having a mass-to-charge ratio (m / z) of 2695 originating from a sugar chain whose structure is not specified was significantly higher than the detection value of a healthy person. Therefore, when the detected value is higher than the detected value of a healthy person, it is possible to identify the subject as suspected of having digestive organ cancer.
  • the following results have been obtained by the study of the present inventor. That is, divided into two groups of pancreatic cancer patients and healthy individuals, N-linked sugar chains released from glycoproteins contained in the collected blood were subjected to mass spectrometry using a MALDI-TOF-MS type analyzer, The peaks contained in the obtained mass spectrum were identified. Then, common peaks in the mass spectrum obtained in the pancreatic cancer patient group can be collected, and the area of each peak of the pancreatic cancer patient and the healthy person can be analyzed into a multivariate analysis to be separated into two groups (patient group and healthy person group). Peak combinations were determined.
  • the detected value of at least one of the peaks is different from the detected value of the healthy subject.
  • a person can improve the accuracy of a test for digestive cancer by identifying that the disease is further suspected.
  • the structural formula of the sugar chain that is the origin of the peak having a mass-to-charge ratio (m / z) of 1326 is estimated as (Hex) 2 (HexNAc) 2 (Deoxyhexose) 1 (Table 1).
  • the structural formula of the sugar chain that is the origin of the peak having a mass-to-charge ratio (m / z) of 1892 is estimated as (HexNAc) 2 (Deoxyhexose) 1 + (Man) 3 (GlcNAc) 2 (Table 1).
  • the structural formula of the sugar chain which is the origin of the peak having a mass-to-charge ratio (m / z) of 2257 is estimated as (Hex) 1 (HexNAc) 3 (Deoxyhexose) 1 + (Man) 3 (GlcNAc) 2 ( Table 1).
  • the structural formula of the sugar chain that is the origin of the peak having a mass-to-charge ratio (m / z) of 2334 is estimated as (Hex) 3 (HexNAc) 1 (NeuAc) 1 + (Man) 3 (GlcNAc) 2 ( Table 1).
  • the structural formula of the sugar chain that is the origin of the peak having a mass-to-charge ratio (m / z) of 2639 is estimated as (Hex) 3 (HexNAc) 4 + (Man) 3 (GlcNAc) 2 (Table 1).
  • the structure of the sugar chain that is the origin of the peak having a mass-to-charge ratio (m / z) of 2703 is the Na adduct of the sugar chain that is the origin of the peak having a mass-to-charge ratio (m / z) of 2681 m / z. Estimated (Table 1).
  • the structural formula of the sugar chain that is the origin of the peak having a mass to charge ratio (m / z) of 2725 is (Hex) 2 (HexNAc) 3 (Deoxyhexose) 1 (NeuAc) 1 + (Man) 3 (GlcNAc) 2 Estimated (Table 1).
  • the structural formula of the sugar chain that is the origin of the peak having a mass-to-charge ratio (m / z) of 2827 is (Hex) 2 (HexNAc) 2 (Deoxyhexose) 1 (NeuAc) 2 + (Man) 3 (GlcNAc) 2 Estimated (Table 1).
  • the digestive cancer diagnostic marker and digestive cancer test method of the present invention have been described above based on the embodiments, but the present invention is not limited thereto.
  • an optional step may be added to the digestive cancer test method of the present invention as necessary.
  • the “digestive system cancer” to which the digestive cancer test method of the present invention is applied is not particularly limited.
  • the present invention is particularly useful in pancreatic cancer and esophageal cancer, which are intractable cancers, and gastric cancer, which is a frequently occurring cancer.
  • an analyzer other than the MALDI-TOF-MS type analyzer can be used.
  • the ion source for example, an electron ionization method, a chemical ionization method, an electric field separation method, a fast atom collision method, an electrospray ionization method, an atmospheric pressure chemical ionization method, or the like can be used.
  • the analysis method for example, a magnetic field deflection type, a quadrupole type, an ion trap type, a Fourier transform ion cyclotron resonance type, or the like can be used.
  • high performance liquid chromatography can be used, and the mass spectrometry and high performance liquid chromatography can be used in combination.
  • Example 1 Collection of blood Blood was collected from subjects with informed consent, including 17 pancreatic cancer patients, 34 esophageal cancer patients and 22 stomach cancer patients, and 11 healthy subjects as controls. The plasma was centrifuged. The obtained specimen (plasma) was anonymized to be connectable and then stored frozen at ⁇ 80 ° C.
  • Plasma for each subject was treated with N-glycosidase F and trypsin for the purpose of releasing modified sugar chains from proteins. Specifically, pure water (165 ⁇ L), 1M ammonium bicarbonate (25 ⁇ L), and 120 mM dithiothreitol (25 ⁇ L) were added to 100 ⁇ L of plasma, allowed to stand at 60 ° C. for 30 minutes, and then 123 mM iodoacetamide (50 ⁇ L). ) And left at room temperature for 1 hour under light shielding. Subsequently, trypsin (2000 units, 25 ⁇ L) was added thereto, left standing at 37 ° C. for 1 hour, and then heated at 80 ° C.
  • trypsin 2000 units, 25 ⁇ L
  • N-glycosidase F (10 units, 10 ⁇ L) was added, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. overnight. Furthermore, this was heated at 80 ° C. for 15 minutes to denature the enzyme, and a final amount of 400 ⁇ L of the enzyme-treated plasma sample was obtained.
  • an internal standard sugar chain solution was prepared by dissolving the internal standard glucose oligomer (1-20) (Seikagaku Corporation # 800111) in pure water at 10 mg / mL. Next, 5 ⁇ L of internal standard sugar chain solution (corresponding to 50 ⁇ g) was added to 95 ⁇ L of the enzyme-treated plasma sample to prepare a total solution of 100 ⁇ L. Of these, 20 ⁇ L was treated with a sugar chain supplemented bead (BlotGlyco (registered trademark) for MALDI (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.)) to capture the released sugar chain. Thereafter, the captured sugar chain was labeled.
  • a sugar chain supplemented bead BlotGlyco (registered trademark) for MALDI (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.)
  • the software attached to the device (for example, flexControl, flexAnalysis) was used for data collection and analysis.
  • Laser ionization was usually performed in positive ion mode and detected in reflector mode.
  • each sugar chain was quantified by analyzing 6 types of sugar chains excluding internal standard sugar chains and comparing them with internal standard sugar chains. . Furthermore, for each sugar chain, the areas of all the peaks (signals) derived from the sugar chains were summed, and the amount (abundance) of each quantified sugar chain was corrected using the ratio of the obtained values.
  • T-test was performed between two groups of healthy subjects and pancreatic cancer patients, healthy subjects and esophageal cancer patients, and healthy subjects and gastric cancer patients, and sugar chains showing significant differences were identified.
  • pancreatic cancer and esophageal cancer the sugar chain that was the origin of the peaks having a mass-to-charge ratio (m / z) of 2521, 2216, 2054, 2681, 3108 and 2695 was identified.
  • gastric cancer the sugar chain that originated the peaks with mass-to-charge ratios (m / z) of 2521, 2216 and 2054 was identified (see FIGS. 1 to 3).
  • the peak area / total peak area (%) was significantly lower in cancer patients in the sugar chain that is the origin of the peak having a mass-to-charge ratio (m / z) of 2521, 2216, or 2054.
  • the sugar chain that is the origin of the peak having a mass-to-charge ratio (m / z) of 2681, 3108, or 2695 was significantly higher in cancer patients.
  • the correct answer rate when using the sugar chain that is the origin of the peaks with mass-to-charge ratios (m / z) of 2521 and 2216 the six classifiers (Compound Covariate Predictor, Diagonal Linear Discriminant Analysis, 1-Nearest Neighbor Predictor, 3-Nearest Neighbor Predictor, Nearest Centroid Predictor, Support Vector Machine Predictor).
  • m / z mass-to-charge ratios
  • the structural formula of the sugar chain was predicted from the peak (signal) of the mass spectrum obtained as a result of mass spectrometry.
  • the sugar chain that is the origin of the peak having a mass-to-charge ratio (m / z) of 2521 has the structure:
  • the sugar chain that is the origin of the peak that is expected to have a mass-to-charge ratio (m / z) of 2216 has the structure
  • the sugar chain that is the origin of the peak that is expected to have a mass-to-charge ratio (m / z) of 2054 has the structure
  • the sugar chain that is the origin of the peak that is expected to have a mass-to-charge ratio (m / z) of 2681 has the structure
  • the sugar chain that is the origin of the peak that is expected to have a mass-to-charge ratio (m / z) of 3108 has the structure
  • Example 2 Collection of blood Blood was collected from subjects including informed consent, 17 patients with pancreatic cancer and 11 healthy subjects as controls, and the plasma was centrifuged. The obtained specimen (plasma) was anonymized to be connectable and then stored frozen at ⁇ 80 ° C.
  • Plasma for each subject was treated with N-glycosidase F and trypsin for the purpose of releasing the modified sugar chain from the protein. Specifically, pure water (165 ⁇ L), 1M ammonium bicarbonate (25 ⁇ L), and 120 mM dithiothreitol (25 ⁇ L) were added to 100 ⁇ L of plasma, allowed to stand at 60 ° C. for 30 minutes, and then 123 mM iodoacetamide (50 ⁇ L). ) And left at room temperature for 1 hour under light shielding. Subsequently, trypsin (2000 units, 25 ⁇ L) was added thereto, left standing at 37 ° C.
  • an internal standard sugar chain solution was prepared by dissolving the internal standard glucose oligomer (1-20) (Seikagaku Corporation # 800111) in pure water at 10 mg / mL. Next, 5 ⁇ L of internal standard sugar chain solution (corresponding to 50 ⁇ g) was added to 95 ⁇ L of the enzyme-treated plasma sample to prepare a total solution of 100 ⁇ L. Of these, 20 ⁇ L was treated with a sugar chain supplemented bead (BlotGlyco (registered trademark) for MALDI (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.)) to capture the released sugar chain. Thereafter, the captured sugar chain was labeled.
  • a sugar chain supplemented bead BlotGlyco (registered trademark) for MALDI (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.)
  • the software attached to the device (for example, flexControl, flexAnalysis) was used for data collection and analysis.
  • Laser ionization was usually performed in positive ion mode and detected in reflector mode.
  • Peaks common to pancreatic cancer patients are collected, and the areas of each peak of pancreatic cancer patients and healthy subjects are analyzed using multivariate analysis software SIMCA-P / P + (manufactured by UMETRICS), and two groups (patient group, healthy) The combination of peaks that can be separated into a group of individuals was determined.
  • the mass to charge ratio (m / z) is 1326, 1892, 2054, 2172, 2216, 2257, 2334, 2375, 2521, 2639, 2681, 2703, 2725, 2827, Peaks at 3030 and 3108 were detected ( Figure 4, Table 1).
  • Hex hexose (mannose)
  • HexNAc N-acetylhexosamine (N-acetylglucosamine)
  • Deoxyhexose fucose
  • Man mannose
  • GlcNAc N-acetylglycosamine
  • NeuAc N-acetylneuraminic acid
  • the present invention uses a specific N-linked sugar chain released from a glycoprotein contained in blood as a marker for diagnosis of digestive organ cancer used for identifying the presence or absence of digestive organ cancer. This makes it possible to easily perform a test for digestive organ cancer at an early stage. Therefore, the present invention has industrial applicability.

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Abstract

　本発明の消化器癌診断用マーカーは、消化器癌の罹患の有無を識別するために用いられる消化器癌診断用マーカーであって、該消化器癌診断用マーカーは、血液中に含まれる糖タンパク質から遊離されるＮ結合型糖鎖を含み、該Ｎ結合型糖鎖は、下記式（１）～下記式（６）で表されるもののうち少なくとも１種であることを特徴とする。これにより、消化器癌を早期かつ簡便に検査する検査方法に用いることができる消化器癌診断用マーカー、および消化器癌を早期かつ簡便に検査し得る消化器癌の検査方法を提供することができる。

Description

消化器癌診断用マーカー、および消化器癌の検査方法
　本発明は、消化器癌診断用マーカー、および消化器癌の検査方法に関する。
　消化器は、食物の摂取、運搬、消化および栄養素の吸収、排泄の働きを担う器官である。消化器のうち膵臓は、胃の背側にある長さが約１５ｃｍの臓器である。その主な疾患としては膵臓癌と膵炎がある。特に膵臓癌は、近年日本人の死亡率が上昇してきている癌の一つとして知られている。
　膵臓癌の原因は完全には解明されていない。そのリスクファクターとしては、食生活の欧米化による動物性脂肪やタンパク質、アルコールなどの過剰摂取、或いは喫煙などがあると考えられている。さらに、慢性膵炎、膵石症、糖尿病、急性膵炎の既往のある人も、膵臓癌を発生する危険性の高い高危険群に属すると考えられている。
　膵臓癌は、外分泌の働きを持つ細胞、特に膵液が流れる膵管の細胞から発生するタイプの癌である。膵臓癌の９０％以上がこのタイプの癌に分類される。膵臓癌は非常に悪性度が高く、早期の段階で他臓器への転移をきたすことから、早期発見が一つの課題である。
　しかし、膵臓は、胃や十二指腸、脾臓、小腸、大腸、肝臓、胆嚢など多くの臓器に囲まれ、後腹膜に存在する。そのため、各種の画像診断を用いても初期段階の癌を発見することがきわめて困難である。したがって、膵臓癌は進行癌として発見される場合が多いのが現状である。
　また、胃癌の発生頻度が高い地域には、日本と東南アジアがある。これらの地域における癌での死亡率は世界第２位を占めている。胃癌の予後は、診断技術や治療法の発達により改善している。しかしながら、進行胃癌の予後は未だ良好とはいえない。特に、胃漿膜にまで浸潤した胃癌の予後の５年生存率は３５％と低い。
　腹膜播種は、進行癌の治癒的切除の後に起こる再発の主原因の一つである。化学療法の進歩により腹膜播種の再発に対する治療効果もみられてきている。しかしながら、未だに腹膜播種を再発した症例の５年生存率は低い。胃癌の腹膜播種の機序には、多くのステップと多くの遺伝子が関与していることが知られている。胃癌の腹膜播種には、接着分子関連遺伝子、アポトーシス関連遺伝子や他の遺伝子が深く関与しているという報告がある。胃癌の腹膜播種を始めとする胃癌の転移のメカニズムの解明に関しても、さらなる研究が必要である。
　さらに、食道癌は、約半数が胸部中部食道に発生する。本邦の食道癌は９０％以上が扁平上皮癌である。食道癌の罹患率、死亡率ともに男性のほうが女性より高く、女性の５倍以上である。食道癌の発生に関しては、飲酒や喫煙の関与が以前より報告されている。また、近年、食道癌の発生に関してＡＬＤＨ２の関与も報告されている。食道癌は、その手術において高度侵襲を伴い、予後不良な疾患である。
　近年、早期癌として発見される症例が増加しており、これに伴い内視鏡的治療で根治できる症例も増加してきている。さらに早期癌に対しては、化学放射線療法の効果もみられてきており、治療成績の向上がみられている。しかし、切除不能な進行癌の予後は依然不良である。したがって、今後も早期癌発見の新しいスクリーニング体系の確立と化学療法の進歩が望まれるところである。
　ところで、これまでに開発された癌の検査・診断方法としては、腫瘍マーカーの測定が挙げられる。
　膵臓癌を診断するための血中腫瘍マーカーとしては、例えば、ＣＡ１９－９（非特許文献１参照。）、Ｄｕｐａｎ－２（非特許文献２参照。）、ＣＡ－５０（非特許文献３参照。）、Ｓｐａｎ－１（非特許文献４参照。）等が既に開発されている。また、腫瘍細胞に特異的に発現している遺伝子をマーカーとして用いることにより、膵臓癌の検査や診断を行う方法がいくつかの特許公報で開示されている。
　現在までに、ＰＡＮＣＩＡおよびＰＡＮＣＩＢ（特許文献１参照。）や、ＫＣＣＲ１３Ｌ（特許文献２参照。）が膵臓癌マーカー遺伝子として開示されている。また、膵臓癌の細胞では、その染色体の特異的な部位にＤＮＡの増幅や欠失があることから、該膵癌に特異的な染色体部位の増幅や欠失を検出することによって、膵臓癌を診断する方法も提案されている。
　また、胃癌に関しては、既知のＩ型コラーゲンのＣ端非３重鎖テロペプチド（ＩＣＴＰ）の発現量の変動をマーカーにすることを特徴とする方法がある。また、進行胃癌、特にスキルス胃癌の適切な診断マーカー（特許文献３参照。）や、癌部または非癌部組織検体より得られたＤＮＡ繰り返し配列中に存在する脱メチル化ＤＮＡ数を測定し、その割合に基づいて胃癌をはじめ、種々の癌疾患の予後が良好か否かを判断する方法が提案されている（例えば、特許文献４参照。）。
　さらに、転移性結腸直腸癌、原発性あるいは転移性の胃癌または食道癌に関しては、ＳＩ、ＣＤＸ１、またはＣＤＸ２の発現を指標として、スクリーニングする方法が提案されている（特許文献５参照。）。
　しかしながら、腫瘍マーカーは、進行した悪性腫瘍の動態を把握するために使用されているのが現状であり、腫瘍マーカーを利用した癌の検査・診断方法として、早期診断に使用できるものは確立されていない。
　特に、膵臓癌は、早期診断が困難であり、治療成績も不良である。そのため、膵臓癌のスクリーニングに応用できる方法の開発が急務である。
特表２０００－５０２９０２号公報 特願２００３－０４１８４３号公報 特開２００１－３３４６０号公報 特開２００２－１１２７９９号公報 特表２００３－５３２３８９号公報
Somatic　Cell　Genet.,　5,　957-972,　1979 Cancer　Res.,　42,　601,　1982 Int.　Arch.　Allergy　Appl.　Immunol.,　71,　178-181,　1983 日外誌,　87,　236,　1986
　本発明の目的は、消化器癌を早期かつ簡便に検査する検査方法に用いることができる消化器癌診断用マーカー、および消化器癌を早期かつ簡便に検査し得る消化器癌の検査方法を提供することにある。
　このような目的は、下記（１）～（１２）に記載の本発明により達成される。 
  （１）　消化器癌の罹患の有無を識別するために用いられる消化器癌診断用マーカーであって、
　該消化器癌診断用マーカーは、血液中に含まれる糖タンパク質から遊離されるＮ結合型糖鎖を含み、
　該Ｎ結合型糖鎖は、下記式（１）～下記式（６）で表されるもののうち少なくとも１種であることを特徴とする消化器癌診断用マーカー。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　（２）　前記式（１）で表されるＮ結合型糖鎖の、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ型分析機を用いた質量分析により得られるマススペクトルは、質量電荷比が２５２１ｍ／ｚであるピークを含む上記（１）に記載の消化器癌診断用マーカー。
　（３）　前記式（２）で表されるＮ結合型糖鎖の、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ型分析機を用いた質量分析により得られるマススペクトルは、質量電荷比が２２１６ｍ／ｚであるピークを含む上記（１）に記載の消化器癌診断用マーカー。
　（４）　前記式（３）で表されるＮ結合型糖鎖の、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ型分析機を用いた質量分析により得られるマススペクトルは、質量電荷比が２２１６ｍ／ｚであるピークを含む上記（１）に記載の消化器癌診断用マーカー。
　（５）　前記式（４）で表されるＮ結合型糖鎖の、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ型分析機を用いた質量分析により得られるマススペクトルは、質量電荷比が２０５４ｍ／ｚであるピークを含む上記（１）に記載の消化器癌診断用マーカー。
　（６）　前記式（５）で表されるＮ結合型糖鎖の、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ型分析機を用いた質量分析により得られるマススペクトルは、質量電荷比が２６８１ｍ／ｚであるピークを含む上記（１）に記載の消化器癌診断用マーカー。
　（７）　前記式（６）で表されるＮ結合型糖鎖の、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ型分析機を用いた質量分析により得られるマススペクトルは、質量電荷比が３１０８ｍ／ｚであるピークを含む上記（１）に記載の消化器癌診断用マーカー。
　（８）　前記消化器癌が、膵臓癌、食道癌または胃癌である上記（１）に記載の消化器癌診断用マーカー。
　（９）　上記（１）に記載の消化器癌診断用マーカーを用いて消化器癌の罹患の有無を識別する消化器癌の検査方法であって、
　前記糖タンパク質から遊離される、前記式（１）～前記式（６）で表されるＮ結合型糖鎖を検出する検出工程と、
　前記検出工程の検出結果に基づいて、前記消化器癌の罹患の有無を識別する識別工程とを有することを特徴とする消化器癌の検査方法。
　（１０）　前記検出工程において、前記式（１）～前記式（６）で表されるＮ結合型糖鎖の検出は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ型分析機によるその質量分析により得られるマススペクトのピークを同定することにより行われる上記（９）に記載の消化器癌の検査方法。
　（１１）　質量電荷比［ｍ／ｚ］が２５２１であるピーク、質量電荷比［ｍ／ｚ］が２２１６であるピークおよび質量電荷比［ｍ／ｚ］が２０５４であるピークのうちの少なくとも１つのピークの検出値が、健常人の検出値よりも低い場合に、前記消化器癌の罹患が疑われると識別する上記（１０）に記載の消化器癌の検査方法。
　（１２）　質量電荷比［ｍ／ｚ］が２６８１であるピークおよび質量電荷比［ｍ／ｚ］が３１０８であるピークのうちの少なくとも１つのピークの検出値が、健常人の検出値よりも高い場合に、前記消化器癌の罹患が疑われると識別する請求項１０に記載の消化器癌の検査方法。
　本発明の消化器癌診断用マーカー、すなわち特定のＮ結合型糖鎖を、被検者から採取された血液から検出することで、早期の段階での消化器癌の検査を簡便に行うことが可能となる。
　したがって、かかる消化器癌診断用マーカーを用いた消化器癌の検査方法により、早期の段階での消化器癌の検査を簡便に行うことができ、早期での消化器癌の治療を行うことができる。
図１は、健常者と膵臓癌患者の２群間に対して行ったＴ－ｔｅｓｔにより、有意差があると判定された糖鎖について、各検体中での存在量を定量した結果を示すグラフである。（糖鎖の存在量の補正については実施例の記載を参照） 図２は、健常者と食道癌患者の２群間に対して行ったＴ－ｔｅｓｔにより、有意差があると判定された糖鎖について、各検体中での存在量を定量した結果を示すグラフである。（糖鎖の存在量の補正については実施例の記載を参照） 図３は、健常者と胃癌患者の２群間に対して行ったＴ－ｔｅｓｔにより、有意差があると判定された糖鎖について、各検体中での存在量を定量した結果を示すグラフである。（糖鎖の存在量の補正については実施例の記載を参照） 図４は、膵臓癌患者および健常者の検体を質量分析した結果得られたマススペクトルの各ピークについて、その面積を多変量解析し、２群（患者群、健常者群）に分離できるピークの組み合わせを同定した結果を示す図である。
　以下、本発明の消化器癌診断用マーカー、および消化器癌の検査方法について、好適実施形態に基づいて詳細に説明する。
＜消化器癌診断用マーカー＞
　糖鎖とは、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、シアル酸等の単糖およびこれらの誘導体がグリコシド結合によって鎖状に複数結合した分子の総称である。
　糖鎖は、非常に多様性に富んでおり、天然に存在する生物が有する様々な機能に関与する物質である。糖鎖は生体内でタンパク質や脂質等に結合した複合糖質として存在することが多く、生体内の重要な構成成分の一つである。生体内の糖鎖は細胞間情報伝達、タンパク質の機能や相互作用の調整等に深く関わっていることが明らかになりつつある。
　糖鎖を有する生体高分子としては、例えば、細胞の安定化に寄与する植物細胞の細胞壁のプロテオグリカン、細胞の分化、細胞の増殖、細胞の接着、細胞の移動等に影響を与える糖脂質、および細胞間相互作用や細胞認識に関与している糖タンパク質等が挙げられる。これらの高分子の糖鎖が、互いに機能を代行、補助、増幅、調節、あるいは阻害し合いながら、高度で精密な生体反応を制御する機構が次第に明らかにされつつある。
　さらに、このような糖鎖と細胞の分化増殖、細胞接着、免疫、および細胞の癌化との関係が明確にされれば、この糖鎖工学と、医学、細胞工学、あるいは臓器工学とを密接に関連させて新たな展開を図ることが期待されている。
　特に、細胞表面に存在する糖鎖は、様々な生体反応の足場として重要な役割をしている事が明らかとなってきた。例えば、糖鎖は、レセプターとの相互作用異常による疾病の発生、あるいはエイズウイルスやインフルエンザウイルス等の感染、病原性大腸菌Ｏ１５７の毒素やコレラ毒素の細胞への侵入に関わるとされている。
　さらに、ある種の癌細胞では特異的な糖鎖が細胞表面に現れる。このように、細胞表面の糖鎖は、細胞に個性をあたえる重要な分子と考えられている。
　以上のような糖鎖（糖タンパク質）のうち、「Ｎ結合型糖鎖」とは、タンパク質のアスパラギン残基が持つ側鎖のアミド基の窒素原子に結合している糖鎖であり、Ｎ型糖鎖やアスパラギン結合型糖鎖とも称される。
　本発明者は、このようなＮ結合型糖鎖、特に、消化器癌患者の血液サンプルに含まれるＮ結合型糖鎖に着目し、消化器癌診断用マーカー、および消化器癌の検査方法の開発を試みた。
　具体的には、同意が得られた膵臓癌患者１７例、食道癌患者３４例および胃癌患者２２例を被検者とし、各被検者より血液を採取し、血漿中のＮ結合型糖鎖に関して質量分析を行った。その結果、被検者（癌患者）の血液サンプルにおいて、健常者と比較して、有意に存在量が変化しているＮ結合型糖鎖（以下、単に「糖鎖」と言うこともある。）を同定することに成功し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、同定されたＮ結合型糖鎖は、消化器癌の罹患の有無を識別するための消化器癌診断用マーカーとして用いることができる。このＮ結合型糖鎖、血液中に含まれる糖タンパク質から遊離されるものであり、下記式（１）～下記式（６）で表されるもののうち少なくとも１種であることを特徴とする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　このような糖鎖は、例えば、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ型分析機を用いた質量分析法により同定することができる。各Ｎ結合型糖鎖は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ型分析機を用いた、その質量分析により得られるマススペクトルが、次のような特徴的なピークを含んでいる。
　具体的には、前記式（１）で表されるＮ結合型糖鎖のマススペクトルは、質量電荷比（ｍ／ｚ）が２５２１であるピークを含み、前記式（２）で表されるＮ結合型糖鎖のマススペクトルは、質量電荷比（ｍ／ｚ）が２２１６であるピークを含み、前記式（３）で表されるＮ結合型糖鎖のマススペクトルは、質量電荷比（ｍ／ｚ）が２２１６であるピークを含み、前記式（４）で表されるＮ結合型糖鎖のマススペクトルは、質量電荷比（ｍ／ｚ）が２０５４であるピークを含む。
　また、前記式（５）で表されるＮ結合型糖鎖のマススペクトルは、質量電荷比（ｍ／ｚ）が２６８１であるピークを含み、前記式（６）で表されるＮ結合型糖鎖のマススペクトルは、質量電荷比（ｍ／ｚ）が３１０８であるピークを含む。
　なお、被検者の血液サンプルから調製された糖鎖を、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ型分析機を用いて質量分析すると、得られるマススペクトルは、さらに、質量電荷比（ｍ／ｚ）が２６９５であるピークを含んでいる。そのため、このピークの起源となるＮ結合型糖鎖を同定できれば、このＮ結合型糖鎖も同様に、消化器癌の罹患の有無を識別するための消化器癌診断用マーカーとして用いることができる。
　また、「ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ」とは、ＭＡＬＤＩ法を利用して飛行時間を基に質量を測定する方法である。具体的には、ＭＡＬＤＩ法は、試料をプレート上にスポットした後、マトリクス溶液（2,5-Dihydroxybenzoic　acid）を添加、乾固して結晶状態にし、その後、パルスレーザー照射により大きなエネルギーをマトリクス上に与え、（Ｍ＋Ｈ）＋、（Ｍ＋Ｎａ）＋などの試料由来イオンとマトリクス由来イオンとを脱離させる方法である。イオンが一定の加速電圧Ｖで加速される場合、イオンの質量をｍ、イオンの速度をｖ、イオンの電荷数をｚ、電気素量をｅ、イオンの飛行時間をｔとしたとき、イオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）は、『ｍ／ｚ＝２ｅＶｔ２／Ｌ２』で表すことができる。
　以上のような、被検者（癌患者）の血液サンプルにおいて、健常者の血液サンプルと比較して、有意に存在量が変化している糖鎖（消化器癌診断用マーカー）を用いて、以下のような、本発明の消化器癌の検査方法により、消化器癌を検査することができる。
＜消化器癌の検査方法＞
　本発明の消化器癌の検査方法は、血液中に含まれる糖タンパク質から遊離される、前記式（１）～前記式（６）で表されるＮ結合型糖鎖を検出する検出工程と、検出工程の検出結果に基づいて、消化器癌の罹患の有無を識別する識別工程とを有する。
　［１］まず、血液中に含まれる糖タンパク質から遊離される、前記式（１）～前記式（６）で表されるＮ結合型糖鎖を検出する（検出工程）。
　［１－１］まず、被験者より血液をサンプルとして採取する。
　この「被検者より採取された血液（サンプル）」としては、血液成分を全て含む全血であっても、血液から分離された血清や血漿等であってもよい。中でも、サンプルとしては血清や血漿が良く、特に血漿が好ましい。これにより、優れた検出感度でサンプル中からＮ結合型糖鎖を検出することができる。
　［１－２］次いで、血液中の糖タンパクから糖鎖を遊離させる。
　かかる遊離方法としては、特に制限されるものではないが、例えば、Ｎ－グリコシダーゼＦ（グリコペプチダーゼ、ＰＮ　Ｇａｓｅ、グリカナーゼ、グリコアミダーゼなどとも称される）やグリコペプチダーゼＡ等を用いた酵素法や、ヒドラジン分解法を挙げることができる。なかでも、遊離方法には、Ｎ－グリコシダーゼＦによる酵素法を好適に用いることができる。これにより、糖タンパク質に連結する糖鎖のうち、Ｎ結合型糖鎖を選択的に遊離させることができる。
  なお、前記酵素法を用いた場合、トリプシン等のプロテアーゼを併用することもできる。
　［１－３］次いで、血液中において遊離させた糖鎖を精製する。
　かかる精製方法としては、サンプル中の混合物から糖鎖を選択的に捕捉して精製する方法であれば特に制限されない。この精製方法としては、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳや高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）での高感度測定用に最適化された糖鎖補足ビーズ（捕捉担体）であるＢｌｏｔＧｌｙｃｏ（登録商標）（住友ベークライト社製）を用いた方法が特に好適である。これにより、優れた精製率で糖鎖をサンプル中から精製することができる。
　［１－４］次いで、精製された糖鎖から、前記式（１）～前記式（６）で表されるＮ結合型糖鎖を検出する。
  なお、このような前記式（１）～前記式（６）で表されるＮ結合型糖鎖の検出は、前述したような、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ型分析機を用いた質量分析法により、優れた精度で行うことができる。
　［２］次に、検出工程の検出結果に基づいて、前記消化器癌の罹患の有無を識別する（識別工程）。
  ここで、前述した膵臓癌患者１７例、食道癌患者３４例および胃癌患者２２例の血漿中のＮ結合型糖鎖を質量分析したところ、質量電荷比（ｍ／ｚ）が２５２１、２２１６および２０５４であるピークのうちの少なくとも１つのピークの検出値が、健常者の検出値よりも、有意に低い結果となっていた。
  一方、質量電荷比（ｍ／ｚ）が２６８１および３１０８であるピークのうちの少なくとも１つの検出値が、健常者の検出値よりも、有意に高い結果となっていた。
　したがって、被検者において、質量電荷比［ｍ／ｚ］が２５２１、２２１６および２０５４であるピークのうちの少なくとも１つのピークの検出値が、健常者の検出値よりも低い場合、この被検者を、消化器癌の罹患が疑われると識別することができる。
  また、質量電荷比［ｍ／ｚ］が２６８１および３１０８であるピークのうちの少なくとも１つのピークの検出値が、健常者の検出値よりも高い場合、この被検者を、消化器癌の罹患が疑われると識別することができる。
　なお、構造が特定されていない糖鎖を起源とする質量電荷比（ｍ／ｚ）が２６９５であるピークの検出値については、健常者の検出値よりも、有意に高い結果となっていた。そのため、この検出値が、健常者の検出値よりも高い場合、この被検者を、消化器癌の罹患が疑われると識別することも可能である。
　以上のように、下記式（１）～下記式（６）で表されるＮ結合型糖鎖を、血液中から検出するという単純な作業で、早期の段階での消化器癌の検査を簡便に行うことができ、早期での消化器癌の治療を行うことができるようになる。
　なお、このような消化器癌の検査方法において、上記糖鎖のうち、複数の糖鎖の検出結果を組み合わせて、消化器癌の検査を行うことにより、その精度を高めることも可能である。さらに、本発明における癌の検査方法を、他の検査方法と組み合わせることにより、消化器癌の検査の精度を高めることも可能である。
　例えば、本発明者の検討により、以下のような結果が得られている。
  すなわち、膵臓癌患者および健常者の２群に分けて、採取した血液中に含まれる糖タンパク質から遊離されるＮ結合型糖鎖を、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ型分析機を用いた質量分析し、得られるマススペクトルに含まれるピークの同定を行った。そして、膵臓癌患者群において得られるマススペクトルで共通するピークを集め、膵臓癌患者および健常者の各ピークの面積を、多変量解析して、２群（患者群、健常者群）に分離できるピークの組み合わせを求めた。そうしたところ、質量電荷比（ｍ／ｚ）が１３２６、１８９２、２０５４、２１７２、２２１６、２２５７、２３３４、２３７５、２５２１、２６３９、２６８１、２６９５、２７０３、２７２５、２８２７，３０３０および３１０８であるピークの検出値に基づいて、２群を分離し得ることが判った。
　したがって、質量電荷比（ｍ／ｚ）が２５２１、２２１６、２０５４、２６８１、３１０８および２６９５であるピークの検出値以外に、これらのピークと質量電荷比（ｍ／ｚ）が異なる値（１３２６、１８９２、２１７２、２２５７、２３３４、２３７５、２６３９、２７０３、２７２５、２８２７および３０３０）であるピークのうちの少なくとも１つのピークの検出値が、健常者の検出値からズレが生じている場合、この被検者は、消化器癌の罹患がさらに疑われると識別することで、消化器癌の検査の精度を高めることができる。
　なお、質量電荷比（ｍ／ｚ）が１３２６であるピークの起源となる糖鎖の構造式は、(Hex)2(HexNAc)2(Deoxyhexose)1と推定される（表１）。
  質量電荷比（ｍ／ｚ）が１８９２であるピークの起源となる糖鎖の構造式は、(HexNAc)2(Deoxyhexose)1+(Man)3(GlcNAc)2と推定される（表１）。
  質量電荷比（ｍ／ｚ）が２１７２であるピークの起源となる糖鎖の構造式は、(Hex)2(HexNAc)1(NeuAc)1+(Man)3(GlcNAc)2と推定される（表１）。
　質量電荷比（ｍ／ｚ）が２２５７であるピークの起源となる糖鎖の構造式は、(Hex)1(HexNAc)3(Deoxyhexose)1+(Man)3(GlcNAc)2と推定される（表１）。
  質量電荷比（ｍ／ｚ）が２３３４であるピークの起源となる糖鎖の構造式は、(Hex)3(HexNAc)1(NeuAc)1+(Man)3(GlcNAc)2と推定される（表１）。
  質量電荷比（ｍ／ｚ）が２３７５であるピークの起源となる糖鎖の構造式は、(Hex)2(HexNAc)2(NeuAc)1+(Man)3(GlcNAc)2と推定される（表１）。
　質量電荷比（ｍ／ｚ）が２６３９であるピークの起源となる糖鎖の構造式は、(Hex)3(HexNAc)4+(Man)3(GlcNAc)2と推定される（表１）。
  質量電荷比（ｍ／ｚ）が２７０３であるピークの起源となる糖鎖の構造は、上記質量電荷比（ｍ／ｚ）が２６８１ｍ／ｚであるピークの起源となる糖鎖のＮａ付加体と推定される（表１）。
　質量電荷比（ｍ／ｚ）が２７２５であるピークの起源となる糖鎖の構造式は、(Hex)2(HexNAc)3(Deoxyhexose)1(NeuAc)1+(Man)3(GlcNAc)2と推定される（表１）。
  質量電荷比（ｍ／ｚ）が２８２７であるピークの起源となる糖鎖の構造式は、(Hex)2(HexNAc)2(Deoxyhexose)1(NeuAc)2+(Man)3(GlcNAc)2と推定される（表１）。
  質量電荷比（ｍ／ｚ）が３０３０であるピークの起源となる糖鎖の構造式は、(Hex)2(HexNAc)3(Deoxyhexose)1(NeuAc)2+(Man)3(GlcNAc)2と推定される（表１）。
　以上、本発明の消化器癌診断用マーカー、および消化器癌の検査方法を実施形態に基づいて説明したが、本発明はこれらに限定されるものではない。
  例えば、本発明の消化器癌の検査方法には、必要に応じて任意の工程が追加されてもよい。
　また、本発明の消化器癌の検査方法を適用する「消化器癌」としては、特に制限されるものではない。ただし、本発明は、難治性の癌である膵臓癌や食道癌、および発生頻度の高い癌である胃癌において特に有用である。
　さらに、上記糖鎖を検出する限り、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ型分析機以外の分析機を使用することもできる。イオン源として、例えば、電子イオン化法、化学イオン化法、電界離脱法、高速原子衝突法、エレクトロスプレーイオン化法、大気圧化学イオン化法等を用いることができる。また、分析法としては、例えば、磁場偏向型、四重極型、イオントラップ型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型などの方法を用いることができる。
　また、本発明においては、上記糖鎖を検出する限り、高速液体クロマトグラフィーを用いることもでき、上記質量分析と高速液体クロマトグラフィーとを組み合わせて用いることもできる。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。なお、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　[実施例１]
（１）血液の採取
　インフォームド・コンセントの得られた、膵臓癌患者１７例、食道癌患者３４例および胃癌患者２２例の患者、および対照として健常者１１例を含む被験者より血液を採取し、血漿を遠心分離した。得られた検体（血漿）は連結可能匿名化を行った後、－８０℃で凍結保存した。
（２）酵素処理済血漿サンプルの作製
　タンパク質から修飾糖鎖を遊離させる目的で、被検者毎の血漿をＮ－グリコシダーゼＦおよびトリプシンにより処理した。具体的には、１００μＬの血漿に、純水（１６５μＬ）、１Ｍ重炭酸アンモニウム（２５μＬ）、および１２０ｍＭジチオスレイトール（２５μＬ）を加え、６０℃で３０分間静置した後、１２３ｍＭヨードアセトアミド（５０μＬ）を加え、室温、遮光下で１時間静置した。続いて、これにトリプシン（２０００ｕｎｉｔ、２５μＬ）を加え、３７℃で１時間静置した後、８０℃で１５分間加熱することによりトリプシンを変性させた。その後、これを室温まで冷却させた後に、Ｎ－グリコシダーゼＦ（１０ｕｎｉｔ、１０μＬ）を加え、３７℃でオーバーナイト静置した。さらに、これを８０℃で１５分間加熱することにより、酵素を変性させ、最終量４００μＬの酵素処理済血漿サンプルを得た。
　また、内部標準グルコースオリゴマー（１－２０）（生化学工業　＃８００１１１）を１０ｍｇ／ｍＬとなるように純水に溶解し、内部標準糖鎖溶液を作製した。
  次いで、上記酵素処理済血漿サンプル９５μＬに対し、内部標準糖鎖溶液５μＬ（＝５０μｇ相当）を添加し、全量１００μＬの溶液を調製した。このうち、２０μＬを糖鎖補足ビーズ（BlotGlyco（登録商標）for　MALDI（住友ベークライト社製））により処理し、遊離した糖鎖を捕捉した。その後、捕捉した糖鎖のラベル化を行った。
（３）糖鎖分析の結果解析
　糖鎖補足ビーズに捕捉された糖鎖を精製・分離し、マトリックス(2,5-dihydroxybenzoic　acid)溶液と混合して、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ測定に供した。質量分析器としては、Autoflex　III　smartbeam　TOF/TOF（Bruker　Daltonics社製）を用いた。
　また、データの収集・解析には該機器附属のソフトウェア(例えば、flexControl,　flexAnalysis)を用いた。また、レーザーイオン化は、通常ポジティブイオンモードで行い、リフレクターモードで検出した。
　得られたマススペクトルから２０～１００のピークを同定した。
　このうち、膵臓癌、胃癌、膵臓癌について、それぞれ、内部標準糖鎖などを除外した６種類の糖鎖を解析対象とし、内部標準糖鎖と比較することにより各糖鎖の定量化を行った。さらに、各糖鎖毎に、それに由来する全てのピーク（シグナル）の面積を合計して、得られた値の比率を用いて、各定量化した糖鎖の量（存在量）を補正した。
　さらに、健常者と膵臓癌患者、健常者と食道癌患者、健常者と胃癌患者のそれぞれ２群間に対してＴ－ｔｅｓｔを行い、有意差を示す糖鎖の特定を試みた。
  その結果、膵臓癌および食道癌については、質量電荷比（ｍ／ｚ）が２５２１、２２１６、２０５４、２６８１、３１０８および２６９５であるピークの起源となる糖鎖が特定された。また、胃癌については、質量電荷比（ｍ／ｚ）が２５２１、２２１６および２０５４であるピークの起源となる糖鎖が特定された（図１～３参照。）。
　なお、ピーク面積／ピーク総面積（％）は、質量電荷比（ｍ／ｚ）が２５２１、２２１６または２０５４であるピークの起源となる糖鎖では、癌患者において有意に低かった。一方、質量電荷比（ｍ／ｚ）が２６８１、３１０８または２６９５であるピークの起源となる糖鎖では、癌患者において有意に高かった。
　また、質量電荷比（ｍ／ｚ）が２５２１および２２１６であるピークの起源となる糖鎖を用いた場合の正答率を、６つの分類器（Compound　Covariate　Predictor、Diagonal　Linear　Discriminant　Analysis、1-Nearest　Neighbor　Predictor、3-Nearest　Neighbor　Predictor、Nearest　Centroid　Predictor、Support　Vector　Machine　Predictor）により算出した。その結果、膵臓癌については、平均８８％程度の正答率が得られた。
　また、質量分析の結果得られたマススペクトルのピーク（シグナル）から糖鎖の構造式を予測した。その結果、質量電荷比（ｍ／ｚ）が２５２１であるピークの起源となる糖鎖は、構造が、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 と予想され、質量電荷比（ｍ／ｚ）が２２１６であるピークの起源となる糖鎖は、構造が、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 または、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 と予想され、質量電荷比（ｍ／ｚ）が２０５４であるピークの起源となる糖鎖は、構造が、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
 と予想され、質量電荷比（ｍ／ｚ）が２６８１であるピークの起源となる糖鎖は、構造が、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
 と予想され、質量電荷比（ｍ／ｚ）が３１０８であるピークの起源となる糖鎖は、構造が、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
 と予想された。
  なお、質量電荷比（ｍ／ｚ）が２６９５であるピークの起源となる糖鎖は、その構造を予測することができなかった。
　[実施例２]
（１）血液の採取
　インフォームド・コンセントの得られた、膵臓癌患者１７例、および対照として健常者１１例を含む被験者より血液を採取し、血漿を遠心分離した。得られた検体（血漿）は連結可能匿名化を行った後、－８０℃で凍結保存した。
（２）酵素処理済血漿サンプルの作製
　タンパク質から修飾糖鎖を遊離させる目的で、被験者毎の血漿をＮ－グリコシダーゼＦおよびトリプシンにより処理した。具体的には、１００μＬの血漿に、純水（１６５μＬ）、１Ｍ重炭酸アンモニウム（２５μＬ）、および１２０ｍＭジチオスレイトール（２５μＬ）を加え、６０℃で３０分間静置した後、１２３ｍＭヨードアセトアミド（５０μＬ）を加え、室温、遮光下で１時間静置した。続いて、これにトリプシン（２０００ｕｎｉｔ、２５μＬ）を加え、３７℃で１時間静置した後、８０℃で１５分間加熱することによりトリプシンを変性させた。その後、これを室温まで冷却させた後に、Ｎ－グリコシダーゼＦ（１０ｕｎｉｔ、１０μＬ）を加え、３７℃でオーバーナイト静置した。さらに、これを８０℃で１５分間加熱することにより、酵素を変性させ、最終量４００μＬの酵素処理済血漿サンプルを得た。
　また、内部標準グルコースオリゴマー（１－２０）（生化学工業　＃８００１１１）を１０ｍｇ／ｍＬとなるように純水に溶解し、内部標準糖鎖溶液を作製した。
  次いで、上記酵素処理済血漿サンプル９５μＬに対し、内部標準糖鎖溶液５μＬ（＝５０μｇ相当）を添加し、全量１００μＬの溶液を調製した。このうち、２０μＬを糖鎖補足ビーズ（BlotGlyco（登録商標）for　MALDI（住友ベークライト社製））により処理し、遊離した糖鎖を捕捉した。その後、捕捉した糖鎖のラベル化を行った。
（３）糖鎖分析の結果解析
　糖鎖補足ビーズに捕捉された糖鎖を精製・分離し、マトリックス(2,5-dihydroxybenzoic　acid)溶液と混合して、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ測定に供した。質量分析器としては、Autoflex　III　smartbeam　TOF/TOF（Bruker　Daltonics社製）を用いた。
　また、データの収集・解析には該機器附属のソフトウェア　(例えば、flexControl,　flexAnalysis)を用いた。また、レーザーイオン化は、通常ポジティブイオンモードで行い、リフレクターモードで検出した。
　得られたマススペクトルから２０～１００のピークを同定した。膵臓癌患者に共通するピークを集め、膵臓癌患者および健常者の各ピークの面積を、多変量解析ソフトＳＩＭＣＡ－Ｐ／Ｐ＋（ＵＭＥＴＲＩＣＳ社製）を用いて解析し、２群（患者群、健常者群）に分離できるピークの組み合わせを求めた。
　その結果、上記２群を分離し得るピークとして、質量電荷比（ｍ／ｚ）が１３２６、１８９２、２０５４、２１７２、２２１６、２２５７、２３３４、２３７５、２５２１、２６３９、２６８１、２７０３、２７２５、２８２７，３０３０および３１０８であるピークが検出された（図４、表１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
　なお、表１中の記号の意味は、下記の通りである。
　δmass　=　[測定値　m/z]-[理論値　m/z]
　＋：「＋」の右側に示された構造が基本構造であり、左側に示された構造が付加構造である。
　Hex:　hexose(mannose)
　HexNAc:　N-acetylhexosamine(N-acetylglucosamine)
　Deoxyhexose:　fucose
　Man:　mannose
　GlcNAc:　N-acetylglycosamine
　NeuAc:　N-acetylneuraminic　acid
　なお、図１～４および表１に示した質量電荷比（ｍ／ｚ）の値は、±１以内の測定誤差が生じうることを理解されたい。
　本発明は、消化器癌の罹患の有無を識別するために用いられる消化器癌診断用マーカーとして、血液中に含まれる糖タンパク質から遊離される特定のＮ結合型糖鎖を用いる。これにより、早期の段階での消化器癌の検査を簡便に行うことが可能となる。したがって、本発明は、産業上の利用可能性を有する。

Claims (12)

  1. 　消化器癌の罹患の有無を識別するために用いられる消化器癌診断用マーカーであって、
    　該消化器癌診断用マーカーは、血液中に含まれる糖タンパク質から遊離されるＮ結合型糖鎖を含み、
    　該Ｎ結合型糖鎖は、下記式（１）～下記式（６）で表されるもののうち少なくとも１種であることを特徴とする消化器癌診断用マーカー。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
  2. 　前記式（１）で表されるＮ結合型糖鎖の、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ型分析機を用いた質量分析により得られるマススペクトルは、質量電荷比が２５２１ｍ／ｚであるピークを含む請求項１に記載の消化器癌診断用マーカー。
  3. 　前記式（２）で表されるＮ結合型糖鎖の、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ型分析機を用いた質量分析により得られるマススペクトルは、質量電荷比が２２１６ｍ／ｚであるピークを含む請求項１に記載の消化器癌診断用マーカー。
  4. 　前記式（３）で表されるＮ結合型糖鎖の、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ型分析機を用いた質量分析により得られるマススペクトルは、質量電荷比が２２１６ｍ／ｚであるピークを含む請求項１に記載の消化器癌診断用マーカー。
  5. 　前記式（４）で表されるＮ結合型糖鎖の、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ型分析機を用いた質量分析により得られるマススペクトルは、質量電荷比が２０５４ｍ／ｚであるピークを含む請求項１に記載の消化器癌診断用マーカー。
  6. 　前記式（５）で表されるＮ結合型糖鎖の、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ型分析機を用いた質量分析により得られるマススペクトルは、質量電荷比が２６８１ｍ／ｚであるピークを含む請求項１に記載の消化器癌診断用マーカー。
  7. 　前記式（６）で表されるＮ結合型糖鎖の、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ型分析機を用いた質量分析により得られるマススペクトルは、質量電荷比が３１０８ｍ／ｚであるピークを含む請求項１に記載の消化器癌診断用マーカー。
  8. 　前記消化器癌が、膵臓癌、食道癌または胃癌である請求項１に記載の消化器癌診断用マーカー。
  9. 　請求項１に記載の消化器癌診断用マーカーを用いて消化器癌の罹患の有無を識別する消化器癌の検査方法であって、
    　前記糖タンパク質から遊離される、前記式（１）～前記式（６）で表されるＮ結合型糖鎖を検出する検出工程と、
    　前記検出工程の検出結果に基づいて、前記消化器癌の罹患の有無を識別する識別工程とを有することを特徴とする消化器癌の検査方法。
  10. 　前記検出工程において、前記式（１）～前記式（６）で表されるＮ結合型糖鎖の検出は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ型分析機によるその質量分析により得られるマススペクトのピークを同定することにより行われる請求項９に記載の消化器癌の検査方法。
  11. 　質量電荷比［ｍ／ｚ］が２５２１であるピーク、質量電荷比［ｍ／ｚ］が２２１６であるピークおよび質量電荷比［ｍ／ｚ］が２０５４であるピークのうちの少なくとも１つのピークの検出値が、健常人の検出値よりも低い場合に、前記消化器癌の罹患が疑われると識別する請求項１０に記載の消化器癌の検査方法。
  12. 　質量電荷比［ｍ／ｚ］が２６８１であるピークおよび質量電荷比［ｍ／ｚ］が３１０８であるピークのうちの少なくとも１つのピークの検出値が、健常人の検出値よりも高い場合に、前記消化器癌の罹患が疑われると識別する請求項１０に記載の消化器癌の検査方法。
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