WO2009136506A1 - N結合型糖鎖を利用した膵臓癌の診断方法 - Google Patents
N結合型糖鎖を利用した膵臓癌の診断方法 Download PDFInfo
- Publication number
- WO2009136506A1 WO2009136506A1 PCT/JP2009/002019 JP2009002019W WO2009136506A1 WO 2009136506 A1 WO2009136506 A1 WO 2009136506A1 JP 2009002019 W JP2009002019 W JP 2009002019W WO 2009136506 A1 WO2009136506 A1 WO 2009136506A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- pancreatic cancer
- sugar chains
- sugar chain
- mass
- maldi
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/24—Nuclear magnetic resonance, electron spin resonance or other spin effects or mass spectrometry
Definitions
- the present invention relates to a method for determining pancreatic cancer using a specific N-linked sugar chain as a marker for pancreatic cancer diagnosis.
- pancreas is an organ having a length of about 15 cm on the back side of the stomach.
- the main diseases include pancreatic cancer and pancreatitis.
- pancreatic cancer is known as one of the cancers whose Japanese mortality has been increasing in recent years.
- the cause of pancreatic cancer has not been fully clarified, but excessive intake of animal fat, protein, alcohol, etc. due to westernization of dietary habits or smoking are considered to be risk factors, and chronic pancreatitis People with a history of pancreatic stones, diabetes, and acute pancreatitis are also considered to be a high-risk group for pancreatic cancer.
- Pancreatic cancer is cancer that originates from cells that have an exocrine function, particularly cells of the pancreatic duct through which pancreatic juice flows, and more than 90% of pancreatic cancers are of this type. Since pancreatic cancer is very malignant and metastasis to other organs (especially liver etc.) occurs at an early stage, it is very important to detect it early. However, because the pancreas is surrounded by many organs such as the stomach, duodenum, spleen, small intestine, large intestine, liver, and gallbladder, it is extremely difficult to detect early-stage cancer, and in many cases, distant metastasis It is discovered at an advanced stage that has already passed the possibility of therapeutic resection.
- Examples of blood tumor markers for diagnosis of pancreatic cancer include, for example, CA19-9 (Non-patent Document 1), Don-2 (Non-patent Document 2), CA-50 (Non-patent Document 3), Span-1 (Non-patent Document 3).
- Patent Document 4) and the like have already been developed.
- these tumor markers are also positive in pancreatitis and benign diseases such as chronic pancreatitis, chronic hepatitis, cirrhosis, etc., and there are problems with their specificity, and they are negative for specific pancreatic cancer
- Patent Document 3 discloses methods for detecting and diagnosing pancreatic cancer by using a gene specifically expressed in tumor cells as a marker.
- PANCIA and PANCIB Patent Document 1
- KCCR13L Patent Document 2
- Patent Document 3 since there is amplification or deletion of DNA at a specific site of the chromosome of a pancreatic cancer cell, a method for diagnosing pancreatic cancer by detecting the amplification or deletion of a specific chromosome site of the pancreatic cancer ( Patent Document 3) has also been proposed.
- An object of the present invention is to provide a method for determining pancreatic cancer using a novel marker for detecting pancreatic cancer.
- the present inventors collected blood from a total of 78 patients, including 24 patients with benign pancreatobiliary disease (16 gallstones, 8 patients with pancreatitis) and 54 patients with pancreatic cancer, and the mass of N-linked sugar chains in the plasma was measured. Analysis was carried out. Of the 74 mass spectral peaks detected, 65 sugar chains were extracted from the results of PAM analysis, and pancreatic cancer or benign biliary tract benign disease was predicted using these 65 sugar chains. Answered correctly. Furthermore, T-test was performed between the two groups of pancreaticobiliary benign disease and pancreatic cancer, and as a sugar chain showing a significant difference (p ⁇ 0.05) and a difference in expression level more than twice.
- the present invention includes (1) a step of releasing an N-linked sugar chain from a glycoprotein in blood collected from a subject, a step of purifying the released sugar chain, and mass spectrometry of the purified sugar chain.
- mass-to-charge ratio (m / z) of the peaks by mass spectrometry using a MALDI-TOF-MS type analyzer are 3031, 2362, 1339, 3047, 2703, 2097, 1950, 1266, 3193, 4177.
- pancreatic cancer comprising: a step of determining pancreatic cancer using the detection intensity of at least one sugar chain as an index among the sugar chains corresponding to the above or a sugar chain corresponding to the sugar chain Pancreatic cancer according to (1) above, wherein (2) the mass-to-charge ratio (m / z) of the peak by mass spectrometry using a MALDI-TO
- the method for determining pancreatic cancer of the present invention includes (1) a step of releasing N-linked sugar chains from glycoproteins in blood collected from a subject; (2) a step of purifying the released sugar chains; (3) a step of performing mass spectrometry of the purified sugar chain; (4) mass-to-charge ratios (m / z) of peaks by mass spectrometry using a MALDI-TOF-MS type analyzer are 3031, 2362, 1339, 3047 , 2703, 2097, 1950, 1266, 3193, 4177, 2663, 2639, 2055, 2259, 2579, 1206, 2428, 1984, 2817, 1893, 2274, 2071, 2814, 2217, 2696, 1324, 2269, 2742, 2112 2011, 1175, 2563, 2128, 2420, 2214, 4015, 2313, 1381, 26 0, 1208, 1203, 3352, 2682, 3338, 2649, 2123, 2574, 2335, 2880, 1351, 2668, 27
- the sample used in the method for determining pancreatic cancer of the present invention is not particularly limited as long as it is a blood-derived sample collected from a subject, even whole blood containing all blood components, Serum and plasma separated from blood may be used, but serum and plasma are preferable, and plasma is particularly preferable.
- the N-linked sugar chain is a sugar chain bonded to the nitrogen atom of the amide group of the side chain of the asparagine residue of the protein among the sugar chains of the glycoprotein. Also referred to as asparagine-linked sugar chain.
- methods for releasing N-linked sugar chains from glycoproteins in blood include, for example, N-glycosidase F (also called glycopeptidase, PN Gase, glycanase, glycoamidase, etc.), glycopeptidase A, etc.
- Specific examples include an enzymatic method using hydrazine and a hydrazine decomposition method.
- the method for purifying the released sugar chain is not particularly limited as long as it is a method for selectively capturing and purifying a sugar chain from a mixture in a sample, but it is not limited in MALDI-TOF-MS.
- a specific example is a method using BlotGlyco (registered trademark) for MALDI (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.), which is a sugar chain supplemented bead optimized for sensitivity measurement.
- MALDI-TOF-MS is an abbreviation for Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time-of-Flight (Mass Spectrometer).
- a matrix solution (2,5-dihydroxybenzoic acid) is added, dried and crystallized, and a large amount of energy is given to the matrix by pulse laser irradiation.
- (M + H) + , (M + Na) + and other sample-derived ions and matrix-derived ions are desorbed, and MALDI-TOF-MS measures mass based on time of flight using the MALDI method.
- an analyzer other than the MALDI-TOF-MS type analyzer can be used.
- an ion source for example, an electron ionization method, a chemical ionization method, a field detachment method, a fast atom collision method, an electrospray ionization method.
- Methods atmospheric pressure chemical ionization method, and the like can be used, and as an analysis method, for example, a magnetic field deflection type, a quadrupole type, an ion trap type, a Fourier transform ion cyclotron resonance type, or the like can be used. . Further, the above analysis method and HPLC can be used in combination.
- a sugar chain having a mass-to-charge ratio (m / z) of a peak of 3031 by mass analysis using a MALDI-TOF-MS type analyzer is 3031 is a glycan of mass analysis using a MALDI-TOF-MS type analyzer.
- the sugar chain corresponding to the sugar chain is a mass spectrum of 3031 m / z when a MALDI-TOF-MS type analyzer is used when a mass spectrometer other than a MALDI-TOF-MS type analyzer is used. It means a sugar chain that is homologous to a sugar chain that exhibits a peak.
- a sugar chain having a mass-to-charge ratio (m / z) of a peak of 2362 by mass analysis using a MALDI-TOF-MS type analyzer is 2362 and is a mass spectrum obtained by a MALDI-TOF-MS type analyzer.
- it is a sugar chain exhibiting a mass spectral peak of 2362 m / z, and its predicted structural formula includes, for example, (HexNAc) 2 (NeuGc) 2+ (Man) 3 (GlcNAc) 2 and (Hex) 1 (HexNAc).
- the sugar chain corresponding to the sugar chain is a 2362 m / z mass spectrum when a MALDI-TOF-MS type analyzer is used when a mass spectrometer other than a MALDI-TOF-MS type analyzer is used. It means a sugar chain that is homologous to a sugar chain that exhibits a peak.
- Plasma was treated with N-glycosidase F and trypsin for the purpose of releasing proteins and modified sugar chains. Specifically, pure water (165 ⁇ L), 1M ammonium bicarbonate (25 ⁇ L), and 120 mM dithiothreitol (25 ⁇ L) were added to 100 ⁇ L of plasma, allowed to stand at 60 ° C. for 30 minutes, and then 123 mM iodoacetamide (50 ⁇ L). ) And left at room temperature for 1 hour under light shielding. Subsequently, trypsin (2000 units, 25 ⁇ L) was added and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour, followed by heating at 80 ° C.
- N-glycosidase F (10 units, 10 ⁇ L) was added and allowed to stand at 37 ° C. overnight. The enzyme was denatured by heating at 80 ° C. for 15 minutes to obtain a final amount of 400 ⁇ L of the enzyme-treated plasma sample.
- an internal standard sugar chain solution was prepared by dissolving the internal standard glucose oligomer (1-20) (Seikagaku Corporation # 800111) in pure water at 10 mg / mL.
- An internal standard sugar chain solution (5 ⁇ L) ( 50 ⁇ g) was added to 95 ⁇ L of the enzyme-treated plasma sample to prepare a total solution of 100 ⁇ L.
- sugar chain-supplemented beads BlotGlyco (registered trademark) for MALDI (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.)
- T-test was performed between the two groups of pancreaticobiliary benign disease and pancreatic cancer, and as a sugar chain showing a significant difference (p ⁇ 0.05) and a difference in expression level more than twice. , 3031 m / z sugar chain and 2362 m / z sugar chain. Table 3 shows the results of quantifying (%) the detected intensities of these two sugar chains with reference to the control (100%).
- pancreatic cancer with high specificity by analyzing a specific N-linked sugar chain in plasma without imposing a heavy burden on the subject.
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本発明は、新規の膵臓癌診断用マーカー、及び当該マーカーを利用した膵臓癌の判定方法等を提供する。本発明者らは、膵胆道良性疾患患者24例(胆石16例、膵炎8例)、膵臓癌患者54例の計78例の患者より血液を採取し、血漿中のN結合型糖鎖に関して質量分析を行った。検出された74のマススペクトルピークのうち、PAM解析の結果から65の糖鎖を抽出し、これらの65の糖鎖を用いて膵癌あるいは膵胆道良性疾患の予測を行ったところ、74%の診断に正答した。さらに、膵胆道良性疾患と膵臓癌との2群間に対してT-testを行い、有意差(p<0.05)を示し、且つ、発現量の差が2倍以上を示す糖鎖として、3031m/z及び2362m/zの2つの糖鎖を特定した。これらの糖鎖を用いた場合の正答率を、6つの分類器により算出した結果、いずれも70%程度の正答率が得られることを見い出した。
Description
本発明は、特定のN結合型糖鎖を膵臓癌診断用マーカーとして利用した膵臓癌の判定方法に関する。
膵臓は、胃の裏側にある長さ15cm程度の臓器である。その主な疾患としては膵臓癌と膵炎とがあり、特に膵臓癌は、近年日本人の死亡率が上昇してきている癌の一つとして知られている。膵臓癌の原因は完全には明らかにされていないが、食生活の欧米化による動物性脂肪やタンパク質、アルコールなどの過剰摂取、或いは喫煙などがリスクファクターであると考えられている他、慢性膵炎、膵石症、糖尿病、急性膵炎の既往のある人も膵臓癌の高危険群であると考えられている。膵臓癌は、外分泌の働きを持つ細胞、特に膵液が流れる膵管の細胞から発生する癌であり、膵臓癌の90%以上がこのタイプである。膵臓癌は非常に悪性であり、早い段階で他の臓器(特に、肝臓等)への転移が起きることから、早期に発見することが非常に重要である。しかし、膵臓は、胃や十二指腸、脾臓、小腸、大腸、肝臓、胆嚢など多くの臓器に囲まれているため、初期段階の癌を発見することがきわめて困難であり、多くの場合、遠隔転移を起こし、既に治療切除等の可能性を過ぎた進行期になって発見される。
膵臓癌診断のための血中腫瘍マーカーとしては、例えば、CA19-9(非特許文献1)、Dupan-2(非特許文献2)、CA-50(非特許文献3)、Span-1(非特許文献4)等が既に開発されている。しかし、これらの腫瘍マーカーは、慢性膵炎や、慢性肝炎、肝硬変などの膵・肝良性疾患でも陽性となり、その特異性の点で問題がある他、特定の膵臓癌に対しては陰性を示すことがあり、膵臓癌を特異的にかつ確実に検出する腫瘍マーカーとしては問題があった。したがって、従来の方法では、広範囲の膵臓癌に対して、早期に、確実に、癌の存在を検出/確認することは困難とされていた。
また、腫瘍細胞に特異的に発現している遺伝子をマーカーとしてを用いることにより、膵臓癌の検出や診断を行う方法がいくつかの特許公報で開示されている。現在までに、PANCIA及びPANCIB(特許文献1)や、KCCR13L(特許文献2)が膵臓癌マーカー遺伝子として開示されている。また、膵臓癌の細胞の染色体の特異的な部位にDNAの増幅や欠失があることから、該膵癌に特異的な染色体部位の増幅や欠失を検出することによって、膵癌を診断する方法(特許文献3)も提案されている。
Somatic Cell Genet., 5, 957-972、1979
Cancer Res., 42, 601, 1982
Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 71, 178-181, 1983
日外誌, 87, 236, 1986
本発明の課題は、新規の膵癌検出用マーカーを利用した膵臓癌の判定方法を提供することにある。
本発明者らは、膵胆道良性疾患患者24例(胆石16例、膵炎8例)、膵臓癌患者54例の計78例の患者より血液を採取し、血漿中のN結合型糖鎖に関して質量分析を行った。検出された74のマススペクトルピークのうち、PAM解析の結果から65の糖鎖を抽出し、これらの65の糖鎖を用いて膵癌あるいは膵胆道良性疾患の予測を行ったところ、74%の診断に正答した。さらに、膵胆道良性疾患と膵臓癌との2群間に対してT-testを行い、有意差(p<0.05)を示し、且つ、発現量の差が2倍以上を示す糖鎖として、3031m/z及び2362m/zの2つの糖鎖を特定した。これらの糖鎖を用いた場合の正答率を、6つの分類器により算出した結果、いずれも70%程度の正答率が得られることを見い出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、(1)被検者より採取された血液中の糖タンパクからN結合型糖鎖を遊離させる工程と、遊離させた糖鎖を精製する工程と、精製した糖鎖の質量分析を行う工程と、MALDI-TOF-MS型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比(m/z)が、3031、2362、1339、3047、2703、2097、1950、1266、3193、4177、2663、2639、2055、2259、2579、1206、2428、1984、2817、1893、2274、2071、2814、2217、2696、1324、2269、2742、2112、2011、2175、2563、2128、2420、2214、4015、2313、1381、2630、1208、1203、3352、2682、3338、2649、2123、2574、2335、2880、1351、2668、2728、4340、2417、1501、1989、2726、1674、1259、3320、1827、1619、1819、2723、及び2151のいずれかである糖鎖、又は上記糖鎖に相当する糖鎖のうち、少なくとも1つの糖鎖の検出強度を指標として、膵臓癌の判定を行う工程とを、順次備えたことを特徴とする膵臓癌の判定方法や、(2)MALDI-TOF-MS型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比(m/z)が、3031及び/又は2362である上記(1)に記載の膵臓癌の判定方法や、(3)トリプシン及びN-グリコシダーゼFを用いて、N結合型糖鎖を遊離させることを特徴とする上記(1)又は(2)に記載の膵臓癌の判定方法に関する。
本発明の膵臓癌の判定方法としては、(1)被検者より採取された血液中の糖タンパクからN結合型糖鎖を遊離させる工程;(2)遊離させた糖鎖を精製する工程;(3)精製した糖鎖の質量分析を行う工程;(4)MALDI-TOF-MS型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比(m/z)が、3031、2362、1339、3047、2703、2097、1950、1266、3193、4177、2663、2639、2055、2259、2579、1206、2428、1984、2817、1893、2274、2071、2814、2217、2696、1324、2269、2742、2112、2011、2175、2563、2128、2420、2214、4015、2313、1381、2630、1208、1203、3352、2682、3338、2649、2123、2574、2335、2880、1351、2668、2728、4340、2417、1501、1989、2726、1674、1259、3320、1827、1619、1819、2723、及び2151のいずれかである糖鎖、又は上記糖鎖に相当する糖鎖のうち、少なくとも1つの糖鎖の検出強度を指標として、膵臓癌の判定を行う工程;とを順次備えた方法であれば特に制限されるものではなく、なかでも、質量分析によるピークの質量電荷比(m/z)が、3031及び/又は2362である糖鎖の検出強度を指標として、膵臓癌の判定を行う方法が好ましい。また、本発明の膵臓癌の判定方法に用いるサンプルとしては、被検者より採取された血液由来のサンプルであれば特に制限されるものではなく、血液成分を全て含む全血であっても、血液から分離された血清や血漿等であってもよいが、血清や血漿が好ましく、なかでも、血漿が特に好ましい。
本発明において、N結合型糖鎖とは、糖タンパク質の糖鎖のうち、タンパク質のアスパラギン残基が持つ側鎖のアミド基の窒素原子に結合している糖鎖であり、N型糖鎖やアスパラギン結合型糖鎖とも称される。本発明において、血液中の糖タンパクからN結合型糖鎖を遊離させる方法としては、例えば、N-グリコシダーゼF(グリコペプチダーゼ、PN Gase、グリカナーゼ、グリコアミダーゼなどとも称される)やグリコペプチダーゼA等を用いた酵素法や、ヒドラジン分解法を具体的に例示することができるが、なかでも、N-グリコシダーゼFによる酵素法を好例として挙げることができる。その際、トリプシン等のプロテアーゼを併用することもできる。また、本発明において、遊離させた糖鎖を精製する方法としては、試料中の混合物から糖鎖を選択的に捕捉し精製する方法であれば特に制限されないが、MALDI-TOF-MSでの高感度測定用に最適化された糖鎖補足ビーズであるBlotGlyco(登録商標)for MALDI(住友ベークライト株式会社製)を用いた方法を好例として具体的に挙げることができる。
また、本明細書において、「MALDI-TOF-MS」とは、Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time-of-Flight(Mass Spectrometer)の略語である。MALDI法は、試料をプレート上にスポットした後、マトリクス溶液(2, 5-Dihydroxybenzoic acid)を添加、乾固し、結晶状態にし、パルスレーザー照射により大きなエネルギーをマトリクス上に与え、(M+H)+、(M+Na)+などの試料由来イオンとマトリクス由来イオンとを脱離させる方法で、MALDI-TOF-MSは、MALDI法を利用して飛行時間を元に質量を測定するものである。イオンが一定の加速電圧Vで加速される場合、イオンの質量をm、イオンの速度をv、イオンの電荷数をz、電気素量をe、イオンの飛行時間をtとしたとき、イオンのm/zは、『m/z=2eVt2/L2』で表すことができる。本発明においては、MALDI-TOF-MS型分析機以外の分析機を使用することもでき、イオン源として、例えば、電子イオン化法、化学イオン化法、電界離脱法、高速原子衝突法、エレクトロスプレーイオン化法、大気圧化学イオン化法等を用いることができ、また、分析法としては、例えば、磁場偏向型、四重極型、イオントラップ型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型などの方法を用いることができる。さらに、上記分析法と、HPLCとを組み合わせて用いることもできる。
本発明において、MALDI-TOF-MS型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比(m/z)が、3031である糖鎖とは、MALDI-TOF-MS型分析機よる質量分析の結果、3031m/zマススペクトルピークを呈する糖鎖であり、その予想される構造式としては、例えば、(Hex)1(HexNAc)6(NeuGc)1+(Man)3(GlcNAc)2や、(Hex)2(HexNAc)6(Deoxyhexose)1+(Man)3(GlcNAc)2や、(HexNAc)4(Deoxyhexose)6+(Man)3(GlcNAc)2や、(HexNAc)1(NeuAc)4(NeuGc)1+(Man)3(GlcNAc)2や、(HexNAc)1(Deoxyhexose)2(NeuAc)3(NeuGc)1+(Man)3(GlcNAc)2や、(Hex)1(HexNAc)1(Deoxyhexose)1(NeuAc)4+(Man)3(GlcNAc)2や、(Hex)1(HexNAc)3(NeuAc)1(NeuGc)2+(Man)3(GlcNAc)2や、(HexNAc)1(Deoxyhexose)4(NeuAc)2(NeuGc)1+(Man)3(GlcNAc)2や、(Hex)1(HexNAc)1(Deoxyhexose)3(NeuAc)3+(Man)3(GlcNAc)2や、(HexNAc)1(Deoxyhexose)2(NeuAc)4 +(Man)3(GlcNAc)2や、(Hex)1(HexNAc)3(NeuAc)2(NeuGc)1+(Man)3(GlcNAc)2や、(HexNAc)1(Deoxyhexose)4(NeuAc)3+(Man)3(GlcNAc)2や、(Hex)2(HexNAc)3(Deoxyhexose)1(NeuAc)2+(Man)3(GlcNAc)2等を具体的に挙げることができる。また、上記糖鎖に相当する糖鎖とは、MALDI-TOF-MS型分析機以外の質量分析機を用いた場合における、MALDI-TOF-MS型分析機を用いたときの3031m/zマススペクトルピークを呈する糖鎖と相同の糖鎖を意味する。
本発明において、MALDI-TOF-MS型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比(m/z)が、2362である糖鎖とは、MALDI-TOF-MS型分析機よる質量分析の結果、2362m/zマススペクトルピークを呈する糖鎖であり、その予想される構造式としては、例えば、(HexNAc)2(NeuGc)2+(Man)3(GlcNAc)2や、(Hex)1(HexNAc)2(Deoxyhexose)1(NeuGc)1+(Man)3(GlcNAc)2や、(HexNAc)2(NeuAc)1(NeuGc)1+(Man)3(GlcNAc)2や、(Hex)1(HexNAc)2(Deoxyhexose)1(NeuAc)1+(Man)3(GlcNAc)2等を具体的に挙げることができる。また、上記糖鎖に相当する糖鎖とは、MALDI-TOF-MS型分析機以外の質量分析機を用いた場合における、MALDI-TOF-MS型分析機を用いたときの2362m/zマススペクトルピークを呈する糖鎖と相同の糖鎖を意味する。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
[血液の採取]
インフォームド・コンセントの得られた、膵胆道良性疾患患者24例(胆石16例、膵炎8例)、膵臓癌患者54例の計78例の患者より血液を採取し、血漿を遠心分離した。得られた検体(血漿)は連結可能匿名化を行った後、-80℃で凍結保存した。
インフォームド・コンセントの得られた、膵胆道良性疾患患者24例(胆石16例、膵炎8例)、膵臓癌患者54例の計78例の患者より血液を採取し、血漿を遠心分離した。得られた検体(血漿)は連結可能匿名化を行った後、-80℃で凍結保存した。
[血液サンプルの作製]
タンパク質と修飾糖鎖を遊離させる目的で、血漿をN-グリコシダーゼF及びトリプシンにより処理した。具体的には、100μLの血漿に、純水(165μL)、1M重炭酸アンモニウム(25μL)、及び120mM ジチオスレイトール(25μL)を加え、60℃で30分間静置した後、123mM ヨードアセトアミド(50μL)を加え、室温、遮光下で1時間静置した。続いて、トリプシン(2000unit、25μL)を加え、37℃で1時間静置した後、80℃で15分間加熱することによりトリプシンを変性させた。室温まで冷却させた後に、N-グリコシダーゼF(10unit、10μL)を加え、37℃でオーバーナイト静置した。80℃で15分間加熱することにより、酵素を変性させ、最終量400μLの酵素処理血漿サンプルを得た。また、内部標準グルコースオリゴマー(1-20)(生化学工業 #800111)を10mg/mLとなるように純水に溶解し、内部標準糖鎖溶液を作製した。上記酵素処理血漿サンプル95μLに対し、内部標準糖鎖溶液5μL(=50μg相当)を添加し、全量100μLの溶液を調製した。このうち、20μLを糖鎖補足ビーズ(BlotGlyco(登録商標)for MALDI(住友ベークライト株式会社製))により処理し、遊離した糖鎖の捕捉、及びラベル化を行った。
タンパク質と修飾糖鎖を遊離させる目的で、血漿をN-グリコシダーゼF及びトリプシンにより処理した。具体的には、100μLの血漿に、純水(165μL)、1M重炭酸アンモニウム(25μL)、及び120mM ジチオスレイトール(25μL)を加え、60℃で30分間静置した後、123mM ヨードアセトアミド(50μL)を加え、室温、遮光下で1時間静置した。続いて、トリプシン(2000unit、25μL)を加え、37℃で1時間静置した後、80℃で15分間加熱することによりトリプシンを変性させた。室温まで冷却させた後に、N-グリコシダーゼF(10unit、10μL)を加え、37℃でオーバーナイト静置した。80℃で15分間加熱することにより、酵素を変性させ、最終量400μLの酵素処理血漿サンプルを得た。また、内部標準グルコースオリゴマー(1-20)(生化学工業 #800111)を10mg/mLとなるように純水に溶解し、内部標準糖鎖溶液を作製した。上記酵素処理血漿サンプル95μLに対し、内部標準糖鎖溶液5μL(=50μg相当)を添加し、全量100μLの溶液を調製した。このうち、20μLを糖鎖補足ビーズ(BlotGlyco(登録商標)for MALDI(住友ベークライト株式会社製))により処理し、遊離した糖鎖の捕捉、及びラベル化を行った。
[糖鎖分析の結果解析]
ビーズに捕捉された糖鎖を精製・分離し、MALDI-TOF-MS型分析機(Voyager-DETM STR Workstation;Applied Biosystems社製)により質量分析を行い、得られたマススペクトルから454のピークを同定した。このうち、25%の症例で確認された108糖鎖から、内部標準糖鎖などを除外した74糖鎖を解析対象とし、内部標準と比較することにより各糖鎖の定量化を行った。次に、PAM解析(Prediction Analysis for Microarrays)を行い、表1に示す65の糖鎖を抽出した。これらの65の糖鎖を用いて、クロスバリデーションを行った結果、78症例中58症例(74%)の診断に正答した(図1)。
ビーズに捕捉された糖鎖を精製・分離し、MALDI-TOF-MS型分析機(Voyager-DETM STR Workstation;Applied Biosystems社製)により質量分析を行い、得られたマススペクトルから454のピークを同定した。このうち、25%の症例で確認された108糖鎖から、内部標準糖鎖などを除外した74糖鎖を解析対象とし、内部標準と比較することにより各糖鎖の定量化を行った。次に、PAM解析(Prediction Analysis for Microarrays)を行い、表1に示す65の糖鎖を抽出した。これらの65の糖鎖を用いて、クロスバリデーションを行った結果、78症例中58症例(74%)の診断に正答した(図1)。
また、表2に示すように、65の糖鎖を用いたPAM解析の膵臓癌診断の感度は0.907、特異性は0.375であった。
さらに、膵胆道良性疾患と膵臓癌との2群間に対してT-testを行い、有意差(p<0.05)を示し、且つ、発現量の差が2倍以上を示す糖鎖として、3031m/z糖鎖、及び2362m/z糖鎖の2つの糖鎖を特定した。これら2つの糖鎖の検出強度を、コントロールを基準(100%)として数値化(%)した結果を表3に示す。
また、3031m/z糖鎖、及び2362m/z糖鎖を用いた場合の正答率を、6つの分類器により算出した結果、いずれも70%程度の正答率が得られた。下記に、用いた6つの分類器と算出されたそれぞれの正答率を示す。
Compound Covariate Predictor:73%
Diagonal Linear Discriminant Analysis:74%
1-Nearest Neighbor Predictor:67%
3-Nearest Neighbor Predictor:71%
Nearest Centroid Predictor:72%
Support Vector Machine Predictor:67%
また、質量分析の結果得られたシグナルから、GlycoSuite on line database(Proteome Systems)を用いて、糖鎖の構造式を予測した(図3及び4)。以上の結果から、血漿中の3031m/z及び2362m/z糖鎖を指標として、膵臓癌診断が可能であることが明らかとなった。
Compound Covariate Predictor:73%
Diagonal Linear Discriminant Analysis:74%
1-Nearest Neighbor Predictor:67%
3-Nearest Neighbor Predictor:71%
Nearest Centroid Predictor:72%
Support Vector Machine Predictor:67%
また、質量分析の結果得られたシグナルから、GlycoSuite on line database(Proteome Systems)を用いて、糖鎖の構造式を予測した(図3及び4)。以上の結果から、血漿中の3031m/z及び2362m/z糖鎖を指標として、膵臓癌診断が可能であることが明らかとなった。
本発明によると、血漿中の特定のN結合型糖鎖を解析することにより、被検者に大きな負担を掛けることなく、特異性の高い膵臓癌の判定を行うことが可能となる。
Claims (3)
- 以下の(1)~(4)の工程を順次備えたことを特徴とする膵臓癌の判定方法。
(1)被検者より採取された血液中の糖タンパクからN結合型糖鎖を遊離させる工程;
(2)遊離させた糖鎖を精製する工程;
(3)精製した糖鎖の質量分析を行う工程;
(4)MALDI-TOF-MS型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比(m/z)が、3031、2362、1339、3047、2703、2097、1950、1266、3193、4177、2663、2639、2055、2259、2579、1206、2428、1984、2817、1893、2274、2071、2814、2217、2696、1324、2269、2742、2112、2011、2175、2563、2128、2420、2214、4015、2313、1381、2630、1208、1203、3352、2682、3338、2649、2123、2574、2335、2880、1351、2668、2728、4340、2417、1501、1989、2726、1674、1259、3320、1827、1619、1819、2723、及び2151のいずれかである糖鎖、又は上記糖鎖に相当する糖鎖のうち、少なくとも1つの糖鎖の検出強度を指標として、膵臓癌の判定を行う工程; - MALDI-TOF-MS型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比(m/z)が、3031及び/又は2362である請求項1に記載の膵臓癌の判定方法。
- トリプシン及びN-グリコシダーゼFを用いて、N結合型糖鎖を遊離させることを特徴とする請求項1又は2に記載の膵臓癌の判定方法。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US12/991,340 US8372647B2 (en) | 2008-05-09 | 2009-05-08 | Method of diagnosing pancreatic cancer with the use of N-binding type sugar chains |
EP09742631A EP2275809A4 (en) | 2008-05-09 | 2009-05-08 | METHOD FOR DIAGNOSIS OF PANCREATIC CANCER USING N-BINDING SUGAR CHAINS |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008123391A JP5212893B2 (ja) | 2008-05-09 | 2008-05-09 | N結合型糖鎖を利用した膵臓癌の診断方法 |
JP2008-123391 | 2008-05-09 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
WO2009136506A1 true WO2009136506A1 (ja) | 2009-11-12 |
Family
ID=41264563
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PCT/JP2009/002019 WO2009136506A1 (ja) | 2008-05-09 | 2009-05-08 | N結合型糖鎖を利用した膵臓癌の診断方法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8372647B2 (ja) |
EP (1) | EP2275809A4 (ja) |
JP (1) | JP5212893B2 (ja) |
WO (1) | WO2009136506A1 (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013051710A1 (ja) * | 2011-10-06 | 2013-04-11 | 国立大学法人鹿児島大学 | 消化器癌診断用マーカー、および消化器癌の検査方法 |
US20130109043A1 (en) * | 2010-04-06 | 2013-05-02 | Kagoshima University | Method for inspecting gastroenterological cancer by utilizing n-linked sugar chain |
WO2020004244A1 (ja) * | 2018-06-26 | 2020-01-02 | 富士フイルム和光純薬株式会社 | 膵臓癌の判定用マーカー |
WO2022186318A1 (ja) * | 2021-03-03 | 2022-09-09 | 株式会社先端生命科学研究所 | がん検出方法、がん検査方法、及びこれらに用いるキット |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5392500B2 (ja) * | 2010-03-18 | 2014-01-22 | 住友ベークライト株式会社 | 質量分析による糖鎖の分析方法 |
KR101389382B1 (ko) * | 2013-05-20 | 2014-04-29 | 국립암센터 | 인지질을 이용한 암의 진단 방법 |
KR101452730B1 (ko) * | 2014-02-19 | 2014-10-23 | 한국과학기술원 | 신규한 위암 진단방법 |
KR101484969B1 (ko) * | 2014-03-26 | 2015-01-22 | 충남대학교산학협력단 | N-당쇄화된 당펩타이드를 이용한 암 진단방법 |
KR101530210B1 (ko) * | 2014-10-07 | 2015-06-22 | 충남대학교산학협력단 | N-당쇄화된 당펩타이드를 이용한 위암 진단용 마커 조성물 |
KR20160146102A (ko) * | 2015-06-11 | 2016-12-21 | 한국과학기술원 | N-당쇄 질량분석을 이용한 대장암 진단방법 |
CN113311056B (zh) * | 2021-05-10 | 2022-06-21 | 中国医学科学院北京协和医院 | 用于遗传性血管水肿的标志物及其应用 |
Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2000502902A (ja) | 1995-12-29 | 2000-03-14 | インサイト・ファーマスーティカルズ・インコーポレイテッド | 膵臓癌に関連する新規ポリヌクレオチドpanc1a及びpanc1b |
JP2001017169A (ja) | 1999-07-12 | 2001-01-23 | Sumitomo Electric Ind Ltd | 染色体異常の検出による膵臓癌の診断方法 |
WO2002008760A1 (en) | 2000-07-19 | 2002-01-31 | Biotron Limited | Method of identifying cancer markers and uses therefor in the diagnosis of cancer |
JP2003041843A (ja) | 2001-08-02 | 2003-02-13 | Kawamura Electric Inc | 蝶 番 |
JP2005515440A (ja) * | 2001-12-29 | 2005-05-26 | コリア リサーチ インスティテュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー | 癌発生及び転移に関与するタンパク質の糖鎖変化を測定して癌を診断する方法及びそれを利用した診断キット |
WO2006114659A1 (en) * | 2005-04-26 | 2006-11-02 | Dwek Raymond A | Glycosylation markers for cancer diagnosing and monitoring |
WO2007112082A2 (en) | 2006-03-24 | 2007-10-04 | The Regent Of The University Of Michigan | Methods and compositions for the identification of cancer markers |
WO2009044213A1 (en) * | 2007-10-05 | 2009-04-09 | National Institute For Bioprocessing Research And Training | Glycosylation markers for pancreatitis, sepsis and pancreatic cancer |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4194080B2 (ja) | 2003-02-19 | 2008-12-10 | 茂 森村 | 膵癌検出用マーカー |
-
2008
- 2008-05-09 JP JP2008123391A patent/JP5212893B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-05-08 EP EP09742631A patent/EP2275809A4/en not_active Ceased
- 2009-05-08 US US12/991,340 patent/US8372647B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2009-05-08 WO PCT/JP2009/002019 patent/WO2009136506A1/ja active Application Filing
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2000502902A (ja) | 1995-12-29 | 2000-03-14 | インサイト・ファーマスーティカルズ・インコーポレイテッド | 膵臓癌に関連する新規ポリヌクレオチドpanc1a及びpanc1b |
JP2001017169A (ja) | 1999-07-12 | 2001-01-23 | Sumitomo Electric Ind Ltd | 染色体異常の検出による膵臓癌の診断方法 |
WO2002008760A1 (en) | 2000-07-19 | 2002-01-31 | Biotron Limited | Method of identifying cancer markers and uses therefor in the diagnosis of cancer |
JP2003041843A (ja) | 2001-08-02 | 2003-02-13 | Kawamura Electric Inc | 蝶 番 |
JP2005515440A (ja) * | 2001-12-29 | 2005-05-26 | コリア リサーチ インスティテュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー | 癌発生及び転移に関与するタンパク質の糖鎖変化を測定して癌を診断する方法及びそれを利用した診断キット |
WO2006114659A1 (en) * | 2005-04-26 | 2006-11-02 | Dwek Raymond A | Glycosylation markers for cancer diagnosing and monitoring |
WO2007112082A2 (en) | 2006-03-24 | 2007-10-04 | The Regent Of The University Of Michigan | Methods and compositions for the identification of cancer markers |
WO2009044213A1 (en) * | 2007-10-05 | 2009-04-09 | National Institute For Bioprocessing Research And Training | Glycosylation markers for pancreatitis, sepsis and pancreatic cancer |
Non-Patent Citations (10)
Title |
---|
BARRABES ET AL., GLYCOBIOLOGY, vol. 17, 2007, pages 388 - 400 |
CANCER RES., vol. 42, 1982, pages 601 |
INT. ARCH. ALLERGY APPL. IMMUNOL., vol. 71, 1983, pages 178 - 181 |
JIA ZHAO ET AL.: "N-linked Glycosylation Profiling of Pancreatic Cancer Serum Using Capillary Liquid Phase Separation Coupled with Mass Spectrometric Analysis", JOURNAL OF PROTEOME RESEARCH, vol. 6, 2007, pages 1126 - 1138, XP008143476 * |
OKUYAMA ET AL., INT. J. CANCER, vol. 118, 2006, pages 2803 - 2808 |
OLGA GORNIK ET AL.: "Changes of serum glycans during sepsis and acute pancreatitis", GLYCOBIOLOGY, vol. 17, no. 12, 2007, pages 1321 - 1332, XP002513046 * |
SOMATIC CELL GENET., vol. 5, 1979, pages 957 - 972 |
THE JAPANESE JOURNAL OF SURGERY, vol. 87, 1986, pages 236 |
ZHAO ET AL., JOURNAL OF PROTEOME RESEARCH, vol. 5, 2006, pages 1792 - 1802 |
ZHAO ET AL., JOURNAL OF PROTEOME RESEARCH, vol. 6, 2007, pages 1126 - 1138 |
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20130109043A1 (en) * | 2010-04-06 | 2013-05-02 | Kagoshima University | Method for inspecting gastroenterological cancer by utilizing n-linked sugar chain |
US8932866B2 (en) * | 2010-04-06 | 2015-01-13 | Kagoshima University | Method for inspecting gastroenterological cancer by utilizing N-linked sugar chain |
WO2013051710A1 (ja) * | 2011-10-06 | 2013-04-11 | 国立大学法人鹿児島大学 | 消化器癌診断用マーカー、および消化器癌の検査方法 |
JP2013083490A (ja) * | 2011-10-06 | 2013-05-09 | Kagoshima Univ | 消化器癌診断用マーカー、および消化器癌の検査方法 |
WO2020004244A1 (ja) * | 2018-06-26 | 2020-01-02 | 富士フイルム和光純薬株式会社 | 膵臓癌の判定用マーカー |
KR20210024464A (ko) * | 2018-06-26 | 2021-03-05 | 후지필름 와코 준야쿠 가부시키가이샤 | 췌장암의 판정용 마커 |
JPWO2020004244A1 (ja) * | 2018-06-26 | 2021-08-12 | 富士フイルム和光純薬株式会社 | 膵臓癌の判定用マーカー |
JP7425447B2 (ja) | 2018-06-26 | 2024-01-31 | 富士フイルム株式会社 | 膵臓癌の判定用マーカー |
KR102665511B1 (ko) | 2018-06-26 | 2024-05-10 | 후지필름 가부시키가이샤 | 췌장암의 판정용 마커 |
WO2022186318A1 (ja) * | 2021-03-03 | 2022-09-09 | 株式会社先端生命科学研究所 | がん検出方法、がん検査方法、及びこれらに用いるキット |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2009270996A (ja) | 2009-11-19 |
US20110065141A1 (en) | 2011-03-17 |
US8372647B2 (en) | 2013-02-12 |
EP2275809A1 (en) | 2011-01-19 |
EP2275809A4 (en) | 2011-07-13 |
JP5212893B2 (ja) | 2013-06-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5212893B2 (ja) | N結合型糖鎖を利用した膵臓癌の診断方法 | |
Dallas et al. | Current peptidomics: applications, purification, identification, quantification, and functional analysis | |
Lankisch et al. | Bile proteomic profiles differentiate cholangiocarcinoma from primary sclerosing cholangitis and choledocholithiasis | |
WO2017054686A1 (zh) | 用于恶性肿瘤相关筛查及评估的产品、应用及方法 | |
Pelaia et al. | Application of proteomics and peptidomics to COPD | |
Hannivoort et al. | Genomics and proteomics in liver fibrosis and cirrhosis | |
EP2550371A1 (en) | Protein and gene biomarkers for rejection of organ transplants | |
EP2398918A2 (en) | Compositions and methods for diagnosis and prognosis of colorectal cancer | |
WO2010064683A1 (ja) | 前立腺癌の判定方法 | |
JPWO2019004430A1 (ja) | 大腸がんを検出するためのバイオマーカー | |
US20170299605A1 (en) | Srm methods in alzheimer's disease and neurological disease assays | |
Sinclair et al. | Metabolomics and biomarker discovery | |
Liu et al. | Down-regulated expression of complement factor I: a potential suppressive protein for gastric cancer identified by serum proteome analysis | |
EP3535587A1 (en) | Mass spectrometry-based methods for the detection of circulating histones h3 and h2b in plasma from sepsis or septic shock (ss) patients | |
JP2018179962A (ja) | N結合型糖鎖を利用した尿路上皮癌の診断方法 | |
WO2023240046A2 (en) | Multi-omics assessment | |
JP5856048B2 (ja) | N結合型糖鎖を利用した消化器癌の検査方法 | |
WO2013051710A1 (ja) | 消化器癌診断用マーカー、および消化器癌の検査方法 | |
Hood et al. | Development of High-Throughput Mass Spectrometry–Based Approaches for Cancer Biomarker Discovery and Implementation | |
US20150133342A1 (en) | Mrm-ms signature assay | |
김용인 | Studies on Lung Cancer Biomarkers by Proteogenomic Analysis | |
WO2022191244A1 (ja) | コロナウイルス感染を検出する方法 | |
Cova et al. | Salivary omics | |
JP5130999B2 (ja) | 抗癌剤の有効性予測方法 | |
CN117288954A (zh) | 一组肝细胞癌标志物及应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 09742631 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 12991340 Country of ref document: US Ref document number: 2009742631 Country of ref document: EP |
|
NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |