JP2001017169A - 染色体異常の検出による膵臓癌の診断方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 膵臓癌における染色体の特異的な構造変化を
検出し、膵臓癌を診断する方法を提供すること。 【解決手段】 膵臓癌の細胞の染色体には、特異的な部
位にＤＮＡの増幅や欠失があることを明らかにしたうえ
で、膵臓癌に特異的な染色体部位の増幅や欠失を検出す
ることによって膵臓癌を診断する方法を提供した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、膵臓癌の診断方法
に関する。より具体的には、本発明は、患者由来の染色
体の特定部位における増幅と欠失を検出することによっ
て膵臓癌を診断する方法を提供する。

【０００２】

【従来の技術】癌は、細胞の一部が異常増殖しながら周
囲の正常組織を浸潤し、正常な機能を破壊する疾患であ
る。１９８１年以来、癌は我国の死因の第１位を占めて
おり、その効果的な診断法と治療法を確立することが社
会的な急務とされている。今日までに、癌を対象とした
さまざまな遺伝子レベルの研究がなされてきた。その結
果、染色体の一部の欠失または増幅が癌の発生に関係し
ていることが明らかにされた。たとえば、網膜芽細胞腫
ではヒト１３番染色体のＲｂ遺伝子が常に欠失している
ことが確認されており、多くの癌ではヒト１７番染色体
短腕のｐ５３遺伝子が欠失していることが見出されてい
る。これらの遺伝子は癌抑制遺伝子であり、その欠失が
癌化を引き起こすものと考えられている。また、ある種
の癌では染色体の特定の部位が増幅することが確認され
ている。最近では、ゲノム中の１つの遺伝子ではなく、
複数の遺伝子が欠失や増幅を起こして多段階変異するこ
とによって癌が発生するという考え方も提唱されてい
る。

【０００３】このように、癌の発生と染色体異常の関係
について活発な研究活動が繰り広げられているが、両者
の関係についてはいまだ解明すべき点が多く、癌発生の
メカニズムは明らかにされていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明は、膵
臓癌における染色体の特異的な構造変化を明らかにする
ことを解決すべき課題とした。また、本発明は、膵臓癌
における染色体の特異的な構造変化を検出することによ
って、膵臓癌を診断する方法を提供することを課題とし
た。さらに、本発明は、この診断を１回の操作で簡便に
行うことができる方法を提供することも課題とした。

【０００５】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、本発明者らは膵臓癌の癌細胞のＤＮＡをＣＧＨ（コ
ンパラティブゲノミックハイブリダイゼーション）法を
利用して分析した。その結果、癌細胞の染色体には癌に
特異的な部位にＤＮＡの増幅や欠失があることが判明
し、染色体の構造変化と癌の発生とを具体的に相関付け
ることができることが明らかになった。本発明者らは、
この事実に基づいて、癌に特異的な増幅や欠失を検出す
ることによって膵臓癌を診断する方法を開発し、本発明
を提供するに至った。

【０００６】本発明によれば、患者由来の癌細胞の染色
体において、ヒト１番染色体長腕２３−長腕２５、ヒト
５番染色体短腕１４−短腕ｔｅｒ、ヒト５番染色体長腕
１４−長腕２３、ヒト１番染色体長腕、ヒト１３番染色
体長腕、ヒト３番染色体長腕２２−長腕２５、ヒト７番
染色体短腕１２−短腕１５、ヒト８番染色体長腕１１−
長腕１３、ヒト８番染色体長腕２３−長腕ｔｅｒ、ヒト
１２番染色体短腕１１−短腕１２、ヒト１２番染色体長
腕１３−長腕１４、ヒト１９番染色体長腕、ヒト４番染
色体長腕２１−長腕２５、ヒト７番染色体長腕３１−３
２、ヒト１１番染色体短腕、ヒト１１番染色体長腕１４
−長腕２２、ヒト１５番染色体長腕２３−長腕ｔｅｒ、
ヒト１７番染色体長腕２１−長腕２２、ヒト１８番染色
体短腕、ヒトＸ染色体長腕２５−長腕ｔｅｒ、ヒト２０
番染色体長腕、ヒト４番染色体短腕もしくはヒト２０番
染色体短腕１２−短腕ｔｅｒの増幅、または、ヒト３番
染色体短腕２１−短腕ｔｅｒ、ヒト８番染色体短腕１１
−短腕２２、ヒト９番染色体短腕２１−短腕ｔｅｒ、ヒ
ト６番染色体長腕、ヒト１７番染色体短腕、ヒト１９番
染色体短腕、ヒト１９番染色体長腕、ヒト４番染色体長
腕２３−長腕３２、ヒト５番染色体長腕１３−長腕１
４、ヒトＸ染色体長腕、ヒト１８番染色体長腕２１、ヒ
ト５番染色体長腕１５−長腕２２、ヒト２１番染色体長
腕２２−長腕ｔｅｒ、ヒト２２番染色体長腕１２−長腕
ｔｅｒヒト１番染色体短腕、ヒト１２番染色体長腕２２
−長腕ｔｅｒ、ヒト４番染色体短腕、ヒト６番染色体短
腕、ヒト９番染色体長腕もしくはヒトＸ染色体短腕の欠
失を検出することを含む膵臓癌の診断方法が提供され
る。

【０００７】また、本発明によれば、患者由来の癌細胞
の染色体において、ヒト１番染色体長腕２３−長腕２
５、ヒト５番染色体短腕１４−短腕ｔｅｒ、ヒト５番染
色体長腕１４−長腕２３、ヒト３番染色体長腕２２−長
腕２５、ヒト７番染色体短腕１２−短腕１５、ヒト８番
染色体長腕１１−長腕１３、ヒト８番染色体長腕２３−
長腕ｔｅｒ、ヒト１２番染色体短腕１１−短腕１２、ヒ
ト１２番染色体長腕１３−長腕１４、ヒト１９番染色体
長腕もしくはヒト２０番染色体長腕の増幅、または、ヒ
ト３番染色体短腕２１−短腕ｔｅｒ、ヒト８番染色体短
腕１１−短腕２２、ヒト９番染色体短腕２１−短腕ｔｅ
ｒ、ヒト６番染色体長腕、ヒト１７番染色体短腕、ヒト
１９番染色体短腕、ヒト１９番染色体長腕、ヒト１８番
染色体長腕２１、ヒト１番染色体短腕もしくはヒト１２
番染色体長腕２２−長腕ｔｅｒの欠失を検出することを
含む膵臓癌の診断方法が提供される。

【０００８】また、本発明によれば、患者由来の癌細胞
の染色体において、ヒト１番染色体長腕２３−長腕２
５、ヒト５番染色体短腕１４−短腕ｔｅｒ、ヒト５番染
色体長腕１４−長腕２３、ヒト１番染色体長腕もしくは
ヒト１３番染色体長腕の増幅、または、ヒト３番染色体
短腕２１−短腕ｔｅｒ、ヒト８番染色体短腕１１−短腕
２２、ヒト９番染色体短腕２１−短腕ｔｅｒ、ヒト６番
染色体長腕、ヒト１７番染色体短腕、ヒト１９番染色体
短腕、ヒト１９番染色体長腕、ヒト４番染色体長腕２３
−長腕３２、ヒト５番染色体長腕１３−長腕１４もしく
はヒトＸ染色体長腕の欠失を検出することを含むステー
ジＩまたはＩＩの膵臓癌の診断方法が提供される。

【０００９】また、本発明によれば、患者由来の癌細胞
の染色体において、ヒト１番染色体長腕２３−長腕２
５、ヒト５番染色体短腕１４−短腕ｔｅｒもしくはヒト
５番染色体長腕１４−長腕２３の増幅、または、ヒト３
番染色体短腕２１−短腕ｔｅｒ、ヒト８番染色体短腕１
１−短腕２２、ヒト９番染色体短腕２１−短腕ｔｅｒ、
ヒト６番染色体長腕、ヒト１７番染色体短腕、ヒト１９
番染色体短腕もしくはヒト１９番染色体長腕の欠失を検
出することを含むステージＩまたはＩＩの膵臓癌の診断
方法が提供される。

【００１０】また、本発明によれば、患者由来の癌細胞
の染色体において、ヒト３番染色体長腕２２−長腕２
５、ヒト７番染色体短腕１２−短腕１５、ヒト８番染色
体長腕１１−長腕１３、ヒト８番染色体長腕２３−長腕
ｔｅｒ、ヒト１２番染色体短腕１１−短腕１２、ヒト１
２番染色体長腕１３−長腕１４、ヒト１９番染色体長
腕、ヒト４番染色体長腕２１−長腕２５、ヒト７番染色
体長腕３１−３２、ヒト１１番染色体短腕、ヒト１１番
染色体長腕１４−長腕２２、ヒト１３番染色体長腕、ヒ
ト１５番染色体長腕２３−長腕ｔｅｒ、ヒト１７番染色
体長腕２１−長腕２２、ヒト１８番染色体短腕もしくは
ヒトＸ染色体長腕２５−長腕ｔｅｒの増幅、または、ヒ
ト３番染色体短腕２１−短腕ｔｅｒ、ヒト１８番染色体
長腕２１、ヒト５番染色体長腕１５−長腕２２、ヒト２
１番染色体長腕２２−長腕ｔｅｒもしくはヒト２２番染
色体長腕１２−長腕ｔｅｒの欠失を検出することを含む
ステージＩＩＩの膵臓癌の診断方法が提供される。

【００１１】また、本発明によれば、患者由来の癌細胞
の染色体において、ヒト３番染色体長腕２２−長腕２
５、ヒト７番染色体短腕１２−短腕１５、ヒト８番染色
体長腕１１−長腕１３、ヒト８番染色体長腕２３−長腕
ｔｅｒ、ヒト１２番染色体短腕１１−短腕１２、ヒト１
２番染色体長腕１３−長腕１４もしくはヒト１９番染色
体長腕の増幅、または、ヒト３番染色体短腕２１−短腕
ｔｅｒもしくはヒト１８番染色体長腕２１の欠失を検出
することを含むステージＩＩＩの膵臓癌の診断方法が提
供される。

【００１２】また、本発明によれば、患者由来の癌細胞
の染色体において、ヒト２０番染色体長腕、ヒト４番染
色体短腕もしくはヒト２０番染色体短腕１２−短腕ｔｅ
ｒの増幅、または、ヒト１番染色体短腕、ヒト１２番染
色体長腕２２−長腕ｔｅｒ、ヒト４番染色体短腕、ヒト
６番染色体短腕、ヒト９番染色体長腕、ヒトＸ染色体短
腕の欠失を検出することを含むステージＩＶの膵臓癌の
診断方法が提供される。

【００１３】また、本発明によれば、患者由来の癌細胞
の染色体において、ヒト２０番染色体長腕の増幅、また
は、ヒト１番染色体短腕もしくはヒト１２番染色体長腕
２２−長腕ｔｅｒの欠失を検出することを含むステージ
ＩＶの膵臓癌の診断方法が提供される。

【００１４】本発明により提供される診断方法を実施す
るための一態様として、正常細胞の染色体に、第１標識
で標識化した患者由来の癌細胞のＤＮＡと、第２標識で
標識化した正常細胞のＤＮＡとを競合的にハイブリダイ
ズさせ、癌細胞のＤＮＡがハイブリダイズした染色体部
位が第１標識によって観察され、正常細胞のＤＮＡがハ
イブリダイズした染色体部位が第２標識によって観察さ
れ、両者がハイブリダイズした染色体部位が第１標識と
第２標識が混合して観察されるようにして、それぞれの
部位の標識を識別することによって、前記増幅または前
記欠失を検出する診断方法が提供される。

【００１５】本発明により提供される診断方法を実施す
るための別の一態様として、正常細胞の染色体に、第１
の色として検出できるように標識化した患者由来の癌細
胞のＤＮＡと、第２の色として検出できるように標識化
した正常細胞のＤＮＡとを競合的にハイブリダイズさ
せ、癌細胞のＤＮＡがハイブリダイズした染色体部位が
第１の色として観察され、正常細胞のＤＮＡがハイブリ
ダイズした染色体部位が第２の色として観察され、両者
がハイブリダイズした染色体部位が第１の色と第２の色
とが混ざってなる第３の色として観察されるようにし
て、それぞれの部位の色を識別することによって、前記
増幅または前記欠失を検出する診断方法が提供される。
この態様では、第１の色と第２の色の強度比を染色体各
部位において測定することによって、増幅または欠失を
検出することができる。

【００１６】

【発明の実施の形態】以下、本発明を実施するための方
法を具体的に説明する。本発明の膵臓癌の診断方法は、
膵臓癌に特異的な染色体部位の異常を検出することを特
徴とするものである。したがって、本発明の診断は、異
常を検出しようとしている染色体部位の変化を確認する
ことができる手段であればいかなる手段を利用して行っ
てもよい。たとえば、患者由来の癌細胞の染色体におい
て、ヒト１番染色体長腕２３−長腕２５、ヒト５番染色
体短腕１４−短腕ｔｅｒ、ヒト５番染色体長腕１４−長
腕２３、ヒト１番染色体長腕、ヒト１３番染色体長腕、
ヒト３番染色体長腕２２−長腕２５、ヒト７番染色体短
腕１２−短腕１５、ヒト８番染色体長腕１１−長腕１
３、ヒト８番染色体長腕２３−長腕ｔｅｒ、ヒト１２番
染色体短腕１１−短腕１２、ヒト１２番染色体長腕１３
−長腕１４、ヒト１９番染色体長腕、ヒト４番染色体長
腕２１−長腕２５、ヒト７番染色体長腕３１−３２、ヒ
ト１１番染色体短腕、ヒト１１番染色体長腕１４−長腕
２２、ヒト１５番染色体長腕２３−長腕ｔｅｒ、ヒト１
７番染色体長腕２１−長腕２２、ヒト１８番染色体短
腕、ヒトＸ染色体長腕２５−長腕ｔｅｒ、ヒト２０番染
色体長腕、ヒト４番染色体短腕もしくはヒト２０番染色
体短腕１２−短腕ｔｅｒの増幅、または、ヒト３番染色
体短腕２１−短腕ｔｅｒ、ヒト８番染色体短腕１１−短
腕２２、ヒト９番染色体短腕２１−短腕ｔｅｒ、ヒト６
番染色体長腕、ヒト１７番染色体短腕、ヒト１９番染色
体短腕、ヒト１９番染色体長腕、ヒト４番染色体長腕２
３−長腕３２、ヒト５番染色体長腕１３−長腕１４、ヒ
トＸ染色体長腕、ヒト１８番染色体長腕２１、ヒト５番
染色体長腕１５−長腕２２、ヒト２１番染色体長腕２２
−長腕ｔｅｒ、ヒト２２番染色体長腕１２−長腕ｔｅｒ
ヒト１番染色体短腕、ヒト１２番染色体長腕２２−長腕
ｔｅｒ、ヒト４番染色体短腕、ヒト６番染色体短腕、ヒ
ト９番染色体長腕もしくはヒトＸ染色体短腕の欠失を検
出することができる手段であればいかなる方法を利用し
てもよい。

【００１７】このような染色体異常を検出する方法とし
て、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を利用す
ることができる。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーショ
ン法は、標識化した核酸プローブを染色体にＤＮＡ−Ｄ
ＮＡハイブリダイズまたはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイ
ズさせ、その後に標識を検出することによって核酸プロ
ーブがハイブリダイゼーションした染色体部位を明らか
にする方法である。この方法を利用すれば、患者の癌部
組織の細胞から調製したゲノムＤＮＡを標識化して調製
したプローブを正常細胞の染色体にハイブリダイズさせ
ることができる。このとき、プローブがハイブリダイズ
しなかった正常細胞の染色体部位は、癌細胞の染色体で
は欠失していることを示している。また、正常細胞から
調製したゲノムＤＮＡを標識化して調製したプローブを
患者の癌部組織から調製した染色体にハイブリダイズさ
せることもできる。このとき、プローブがハイブリダイ
ズしなかった癌細胞の染色体部位は、癌細胞の染色体が
増幅した部位を示す。このように、癌細胞の染色体の欠
失か増幅のいずれか一方を検出する場合には、ｉｎ ｓ
ｉｔｕハイブリダイゼーション法を効果的に応用するこ
とができる。

【００１８】一方、癌細胞の染色体の欠失と増幅を一度
の操作で同時に検出する必要があるときには、ＣＧＨ法
を利用するのが好ましい。ＣＧＨ法は、第１標識で標識
化したＤＮＡと第２標識で標識化した別のＤＮＡを同時
に染色体上にハイブリダイズさせて、２つの標識をそれ
ぞれ検出することによって各ＤＮＡがハイブリダイズし
た染色体部位を明らかにする方法である（Du Manoir, S
他、Hum.Genet., 90; 590-610, 1993）。本発明の診断
方法では、第１標識で標識化した患者由来の癌細胞のＤ
ＮＡより作製したＤＮＡプローブと第２標識で標識化し
た正常細胞のＤＮＡより調製したＤＮＡプローブとを正
常細胞の染色体上に同時にハイブリダイズさせる。染色
体のうち、癌細胞において増幅されている部位は癌細胞
のＤＮＡが主としてハイブリダイズするために第１標識
が観察される。また、癌細胞において欠失している部位
は正常細胞のＤＮＡのみがハイブリダイズするために第
２標識が観察される。さらに、正常細胞でも癌細胞でも
変化せず共通している部位には、両者が競合的にハイブ
リダイズするために第１標識と第２標識が混合して観察
される。こうして、癌による染色体の欠失と増幅を１回
の操作で検出することができる。以下において、本発明
の好ましい実施態様であるＣＧＨ法を用いた本発明の診
断方法を具体的に順を追って説明する。

【００１９】本発明の診断方法で使用する癌細胞のＤＮ
Ａは、膵臓癌の疑いがある患者の癌部組織から細胞を採
取して調製する。本明細書でいう患者の「癌細胞」や
「癌部組織」は、すでに癌化した細胞や組織のみなら
ず、将来癌化するかも知れない細胞や組織も含む概念で
ある。また、本発明の診断方法で使用する正常細胞のＤ
ＮＡは、癌を有しない健常人に由来する細胞のＤＮＡで
ある。取得する組織や細胞の種類は特に限定されない。
用意すべき癌細胞のＤＮＡと正常細胞のＤＮＡには、欠
失や増幅を検出したい染色体部位に対応する部分が含ま
れていれば本発明の診断方法の実施に際して支障はな
い。しかし、特定の染色体部位のＤＮＡを選択する煩雑
さを回避するために、通常はゲノムＤＮＡを使用する。
ゲノムＤＮＡは、全長のゲノムを使用できるが、採取し
た細胞から当業者に既知の方法にしたがって適切な制限
酵素を用いて調製したＤＮＡを使用することができる。
ゲノムから調製するＤＮＡは１０〜１０００ｋｂの範囲
内の大きさにするのが好ましい。ハイブリダイゼーショ
ンにプローブとして使用する各ＤＮＡの長さは、２００
〜１０００ｂｐであることが好ましい。しかし、この範
囲外の長さのＤＮＡを用いることもできる。

【００２０】前記に拘わらず、用意すべき癌細胞のＤＮ
Ａと正常細胞のＤＮＡには、増幅を検出したい染色体部
位に対応する部分が含まれていれば本発明の診断方法の
実施に際して支障はない。実際には、プローブとするＤ
ＮＡを選択することは煩雑であるので、プローブをハイ
ブリダイズさせる正常細胞由来の染色体（以下標的ＤＮ
Ａという）を選択する方が実用的である。例えば、ヒト
１番染色体長腕２３−長腕２５の増幅を検出するために
は、染色体のそれらの部位を標的ＤＮＡとして使用すれ
ばよい。標的ＤＮＡを限定する方が、全染色体を標的Ｄ
ＮＡとするよりも、プローブの標識を測定する時にバッ
クグラウンドの影響が少なくなるので、精度のよい測定
が行える。

【００２１】標的ＤＮＡには、正常細胞の染色体または
その一部の部位が組み込まれたＹＡＣベクターやＢＡＣ
ベクター等に各プローブをハイブリダイズさせ、あるい
は、前記ＹＡＣベクターやＢＡＣベクターから切り出し
た染色体またはその一部の部位に各プローブをハイブリ
ダイズさせ、増幅または欠失の程度を検出する方法もあ
る。ＹＡＣベクターやＢＡＣベクターはヒトの染色体が
組み込まれたものが市販されているので、それを使用で
きる。ただし、所望する染色体部位全体が一つのＹＡＣ
ベクター等に組み込まれているとは限らないので、所望
する染色体部位全体が得られるように複数のＹＡＣベク
ター等を選択して使用する。

【００２２】癌細胞のＤＮＡと正常細胞のＤＮＡは、ハ
イブリダイズさせる前に、それぞれ異なる標識（第１の
標識と第２の標識）によって標識化しておく。標識の種
類は、ハイブリダイゼーション後に互いに区別して検出
しうるものであれば特に制限されない。したがって、分
光学的、生化学的、化学的、免疫学的に検出しうる標識
を広く用いることができる。例えば、蛍光色素、電子密
度試薬、酵素、ビオチン、ジゴキシゲニンなどを使用す
ることが可能である。好ましい標識は、発色するために
視覚的に認識することが可能な標識である。中でも、第
１の標識の色と第２の標識の色が混合することによっ
て、これら２色と区別しうる第３の色になるように標識
を組み合わせて選択することが特に好ましい。例えば、
第１の標識として緑色に発色する標識を選択し、第２の
標識として赤色に発色する標識を選択することによっ
て、混合したときに黄色にすることができる。このよう
に互いに区別しうる３色が形成されるように標識を選択
したうえでハイブリダイズさせることによって、癌で欠
損する部位、癌で増幅する部位および癌によって変化し
ない部位を視覚的に容易に区別することができる。本発
明で使用することができる緑色の蛍光色素として、ＦＩ
ＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）を例示する
ことができる。また、赤色の蛍光色素として、ＴＲＩＴ
Ｃ（テトラメチルローダミンイソチオシアネート）、ロ
ーダミン、テキサスレッドを例示することができる。

【００２３】癌細胞のＤＮＡと正常細胞のＤＮＡを染色
体にハイブリダイズさせる条件は、特に制限されない。
癌細胞のＤＮＡと正常細胞のＤＮＡをハイブリダイズさ
せる染色体には、例えばリンパ球などの細胞から作製し
た染色体標本を用いることができる。ただし、固定化し
ていない染色体を用いてハイブリダイゼーションを行
い、その後にスライドガラス等に滴下して固定化するこ
ともできる。

【００２４】ハイブリダイゼーション後の分析方法は、
標識の種類に応じて適宜決定する。標識として蛍光色素
を用いた場合は、分解能が高い蛍光顕微鏡等を用いて視
覚的に観察しながら分析することができる。また、蛍光
顕微鏡で観察された画像を、カラーイメージスキャナで
読み込み、各点における色を３色に分解して、各点がど
ちらにより多く染められているかを定量化すること（即
ち、各点の標識化物質比を求めること）もできる。

【００２５】このように、本発明を利用して患者に由来
する組織の染色体における欠失と増幅を検出することに
よって、該組織が膵臓癌であるか否かを容易に診断する
ことができる。これによって、早期の癌診断や癌治療の
途が開かれるものと期待される。また、本発明を利用し
て、膵臓癌の進行度を診断することができる。これによ
って、癌の進行度に応じたより適正な処置を行うことが
できる。

【００２６】

【実施例】以下に実施例を記載して本発明をさらに具体
的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によっ
て限定的に解釈されるものではない。 ＜実施例１＞ （１）染色体標本の作製 正常染色体を有する細胞（正常人の血液細胞）から、以
下の手順にしたがって染色体標本を作製した。各人から
１０ｍｌの血液を採取し、培養液（ＲＰＭＩ１６４０、
１０％ＦＣＳ、ＰＨＡ（２０μｌ／ｍｌ））で約１．５
倍に希釈した。この希釈血液をチューブ（Ficol Paque;
ファルマシア社製）に静かに流し込み、２，０００ｒ
ｐｍで２０分間遠心した。白血球の層を取り出し、上記
培養液を用いて１，２００ｒｐｍで５分間遠心する操作
を２回繰り返した。さらに上記培養液を加えて十分に攪
拌した後、２枚の１０ｃｍシャーレに１５ｍｌずつ入れ
て培養を開始した。

【００２７】培養を開始してから４８時間後にチミジン
（シグマ社製）を最終濃度３００μｇ／ｍｌになるよう
に添加した。さらに１８時間培養後に、上記培養液を用
いて１，２００ｒｐｍで５分間遠心する洗浄操作を３回
繰り返した。さらに、６時間培養後、コルセミド（ギブ
コ社製）を最終濃度０．０５μｇ／ｍｌになるように添
加した。１時間後、細胞に上記培養液を添加して１，２
００ｒｐｍで５分間遠心して洗浄し、０．０７５Ｍ Ｋ
Ｃｌを３〜５ｍｌ添加して室温で３０分間低張処理し
た。その後、赤血球の色が消えるまで数回に分けてカル
ノア固定液（メタノール：酢酸＝３：１）を加え、細胞
を固定した。固定した細胞をスライドに滴下して、使用
するまで−８０℃で保存した。

【００２８】（２）癌部組織由来ゲノムＤＮＡの調製 膵臓癌患者（２５症例）の癌部組織から、以下の手順に
したがってゲノムＤＮＡを調製した。５ｍｍ角以上の固
形腫瘍組織をＰＢＳで少し湿らせ、眼科用はさみで細切
した。細胞懸濁液を注射器（１ｍｌ）に吸入して排出す
る操作を数回繰り返した後、ナイロンメッシュで濾過し
た。細胞懸濁液を遠沈チューブに入れ、０．２％のＮａ
Ｃｌを添加して数分間静置した。２，０００ｒｐｍで５
分間遠心した後、上清を捨て、微量のＰＢＳ中に再懸濁
した。この細胞懸濁液をマイクロチューブに入れ、２，
０００ｒｐｍで５分間遠心した後、上清を捨てた。以
下、核酸抽出剤セパジーン（登録商標、三光純薬（株）
製）を使用して、その使用説明書に従ってＤＮＡを調製
した。

【００２９】また、以下の手順にしたがって、健常人の
血液のリンパ球から正常細胞のＤＮＡとして使用するた
めのゲノムＤＮＡを調製した。健常人から２０ｍｌの血
液を採取し、ヘパリンで抗凝固してＰＢＳで２倍に希釈
した。この希釈血液を、３０ｍｌのフィコール液を入れ
た遠心管に静かに重層し、そのまま１０分間静置した。
その後、２，０００ｒｐｍで２０分間遠心すると、淡黄
色の層の下に乳白色のリンパ球の層が形成した。その乳
白色の層を、３０ｍｌのフィコール液を入れた別の遠心
管に採取してＰＢＳを添加した。２，０００ｒｐｍで５
分間遠心し、アスピレーターで上清を除去した。０．２
％のＮａＣｌを３ｍｌ添加して溶血させた後、２，００
０ｒｐｍで５分間遠心し、アスピレーターで上清を除去
した。以下、核酸抽出剤セパジーン（登録商標、三光純
薬（株）製）を使用して、その使用説明書に従ってＤＮ
Ａを調製した。

【００３０】（３）標識化ＤＮＡの作製 膵臓癌組織のＤＮＡを緑色の蛍光を発するＦＩＴＣで標
識し、正常細胞のＤＮＡを赤色の蛍光を発するＴＲＩＴ
Ｃで標識した。ＤＮＡの標識は、ニックトランスレーシ
ョンキット（Ｖｙｓｉｓ社製）の使用説明書にしたがっ
て、ｄＴＴＰ、ｄＮＴＰ混合物、標識化ｄ−ＵＴＰ、鋳
型ＤＮＡ、ニックトランスレーション緩衝液、ニックト
ランスレーション酵素、水を混合して適当な時間インキ
ュベートすることにより行った。

【００３１】（４）ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ
法） （Ａ）ＤＮＡブローブの一本鎖化 ヒトＣＯＴ−１ＤＮＡ（２０μｌ）、ＴＲＩＴＣで標識
化した正常細胞のＤＮＡ（１０μｌ）、ＦＩＴＣで標識
化した膵臓癌組織のＤＮＡ（１０μｌ）、酢酸ナトリウ
ム（４μｌ）および１００％エタノール（１ｍｌ）を混
合し、４℃にて１４，０００ｒｐｍで３０分間遠心し
た。デカンテーションによって上清を捨て、遮光して十
分に乾燥させた。その後、マスターミックス＃１を１０
μｌ添加して、十分にピペッティングした。次いで７５
℃で５分間処理することによって一本鎖化した。

【００３２】（Ｂ）染色体標本の一本鎖化 染色体標本のＤＮＡを、７０％ホルムアミド／２×ＳＳ
Ｃ（ｐＨ７．０）を用いて７５℃で２．５分間処理する
ことによって一本鎖化した。次いで、７０％エタノー
ル、８５％エタノール、１００％エタノールで順次２分
間ずつ処理して脱水し、標本を風乾した。染色体上に現
れるバンドの位置および数により、該染色体が正常染色
体であることを確認した。

【００３３】（Ｃ）ハイブリダイゼーション 染色体標本のスライドグラスに一本鎖化したプローブミ
ックスを９．５μｌずつ載せた。１８×１８の大きさの
カバーグラスをかけ、ペーパーボンドで周りを貼り付け
た。約１０分間ホットプレート上に置き、３７℃のＣＯ
₂ インキュベーターにて２〜３日間ハイブリダイゼーシ
ョンを行った。ハイブリダイゼーション後、５０％ホル
ムアミド／２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）を用いて４５℃で
１２分間洗浄する操作を３回繰り返した。次いで、２×
ＳＳＣを用いて４５℃で１０分間洗浄し、ＰＮ緩衝液を
用いて室温で１０分間洗浄する操作を２回繰り返し、蒸
留水を用いて室温で５分間洗浄する操作を２回繰り返し
た。その後、０．１〜０．２ｍｇ／ｍｌのＤＡＰＩ−ａ
ｎｔｉｆａｄｅを８μｌ載せて、１８×１８のカバーグ
ラスで封入した。

【００３４】（５）蛍光顕微鏡観察 このスライドグラスを蛍光顕微鏡で観察し、蛍光顕微鏡
写真（カラー写真）を撮影した。各染色体において、緑
色が観察されて、膵臓癌に特異的なＤＮＡの増幅が認め
られた部位、および各染色体において、赤色が観察され
て、膵臓癌に特異的なＤＮＡ欠失が認められた部位を表
１および表２に示す。

【００３５】２０％を越える症例に認められた部位を表
１に示す。また、２０％以下の症例に認められた部位を
表２に示す。表１および表２において、数字は染色体の
番号を表し、ｐは短腕、ｑは長腕を示す。例えば、１ｐ
はヒト１番染色体の短腕を表す。各染色体部位の右横に
は、遺伝子の変化が見られた頻度を百分率で表示した。

【００３６】

【表１】

【００３７】

【表２】

【００３８】癌の進行度と癌特異的に増幅または欠失す
る染色体部位との相関を調べた。癌の進行度は、ステー
ジＩ及びＩＩ、ステージＩＩＩ、ステージＩＶの３群に
分け、各群で観察された膵臓癌特異的に増幅または欠失
する染色体部位をまとめた。

【００３９】ステージＩおよびＩＩで、２０％を越える
症例に認められた膵臓癌特異的に増幅する染色体部位を
以下に挙げる。ヒト１番染色体長腕２３−長腕２５、ヒ
ト５番染色体短腕１４−短腕ｔｅｒもしくはヒト５番染
色体長腕１４−長腕２３。

【００４０】ステージＩおよびＩＩで、２０％を越える
症例に認められた膵臓癌特異的に欠失する染色体部位を
以下に挙げる。ヒト３番染色体短腕２１−短腕ｔｅｒ、
ヒト８番染色体短腕１１−短腕２２、ヒト９番染色体短
腕２１−短腕ｔｅｒ、ヒト６番染色体長腕、ヒト１７番
染色体短腕、ヒト１９番染色体短腕またはヒト１９番染
色体長腕。

【００４１】ステージＩＩＩで、２０％を越える症例に
認められた膵臓癌特異的に増幅する染色体部位を以下に
挙げる。ヒト３番染色体長腕２２−長腕２５、ヒト７番
染色体短腕１２−短腕１５、ヒト８番染色体長腕１１−
長腕１３、ヒト８番染色体長腕２３−長腕ｔｅｒ、ヒト
１２番染色体短腕１１−短腕１２、ヒト１２番染色体長
腕１３−長腕１４もしくはヒト１９番染色体長腕。これ
らの染色体部位の少なくとも一つが増幅している患者は
ステージＩＩＩの膵臓癌であると判定される。

【００４２】ステージＩＩＩで、２０％を越える症例に
認められた膵臓癌特異的に欠失する染色体部位を以下に
挙げる。ヒト３番染色体短腕２１−短腕ｔｅｒまたはヒ
ト１８番染色体長腕２１。これらの染色体部位の少なく
とも一つが欠失している患者はステージＩＩＩの膵臓癌
であると判定される。

【００４３】ステージＩＶで、２０％を越える症例に認
められた膵臓癌特異的に増幅する染色体部位を以下に挙
げる。ヒト２０番染色体長腕。この染色体部位が増幅し
ている患者はステージＩＩＩの膵臓癌であると判定され
る。

【００４４】ステージＩＶで、２０％を越える症例に認
められた膵臓癌特異的に欠失する染色体部位を以下に挙
げる。ヒト１番染色体短腕またはヒト１２番染色体長腕
２２−長腕ｔｅｒ。これらの染色体部位の少なくとも一
つが欠失している患者はステージＩＩＩの膵臓癌である
と判定される。

【００４５】膵臓癌の進行につれて各ステージで特異的
に増幅または欠失する染色体部位を図１に示す。

【００４６】診断に用いる染色体の特異的な部位として
は、より限定された部位（ローカス）であることが好ま
しい。例えば、３番染色体長腕の増幅を診断に用いるよ
りは、３番染色体２６の増幅を診断に用いる方が、バッ
クグラウンドの影響がより少なく、結果としてより確度
の高い診断を行うことが可能である。また、染色体上の
ローカスを限定することにより、ＹＡＣベクター等を利
用して、当該ローカスのＤＮＡを効率的に増幅すること
が可能となる。すなわち、染色体上のローカスを限定す
ることは、染色体の短腕、長腕のいずれかを指定するの
とは質的な違いがあるといえる。したがって、本発明で
は、表１または表２に示した各ローカスの増幅または欠
失を膵臓癌の診断に用いることが好ましい。

【００４７】

【発明の効果】以上の試験によって、膵臓癌細胞の染色
体には特異的な部位にＤＮＡの増幅や欠失があることが
明らかにされた。このような染色体の構造変化と癌の発
生との関係を応用した本発明を利用すれば、患者が膵臓
癌に罹患しているかどうか的確に診断することができ
る。これによって、早期の癌診断や癌治療の途が開かれ
るものと期待される。

【００４８】また、本発明によれば膵臓癌の進行度を客
観的に推測することができるために、それぞれの患者に
対して最適と考えられる治療を選択することが可能とな
る。このことは、癌患者のＱＯＬを高めるばかりではな
く、医療経済学の上からも大きな利益をもたらすもので
ある。

【図面の簡単な説明】

【図１】膵臓癌の進行につれて各ステージで特異的に増
幅または欠失する染色体部位を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/566 33/58 33/58 Ａ (72)発明者 岸本 利彦 神奈川県横浜市栄区田谷町１番地 住友電 気工業株式会社横浜製作所内 (72)発明者 佐々木 功典 山口県宇部市南小串１丁目１番１号 山口 大学医学部病理学教室第二講座内 Ｆターム(参考） 2G045 AA24 AA26 AA35 CB02 DA13 FB02 FB07 GC12 JA06 4B024 AA11 CA01 CA09 HA13 HA14 4B063 QA17 QA19 QQ08 QQ20 QQ43 QR56 QS34 QX01 QX10

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 患者由来の癌細胞の染色体において、ヒ
   ト１番染色体長腕２３−長腕２５、ヒト５番染色体短腕
   １４−短腕ｔｅｒ、ヒト５番染色体長腕１４−長腕２
   ３、ヒト１番染色体長腕、ヒト１３番染色体長腕、ヒト
   ３番染色体長腕２２−長腕２５、ヒト７番染色体短腕１
   ２−短腕１５、ヒト８番染色体長腕１１−長腕１３、ヒ
   ト８番染色体長腕２３−長腕ｔｅｒ、ヒト１２番染色体
   短腕１１−短腕１２、ヒト１２番染色体長腕１３−長腕
   １４、ヒト１９番染色体長腕、ヒト４番染色体長腕２１
   −長腕２５、ヒト７番染色体長腕３１−３２、ヒト１１
   番染色体短腕、ヒト１１番染色体長腕１４−長腕２２、
   ヒト１５番染色体長腕２３−長腕ｔｅｒ、ヒト１７番染
   色体長腕２１−長腕２２、ヒト１８番染色体短腕、ヒト
   Ｘ染色体長腕２５−長腕ｔｅｒ、ヒト２０番染色体長
   腕、ヒト４番染色体短腕もしくはヒト２０番染色体短腕
   １２−短腕ｔｅｒの増幅、または、ヒト３番染色体短腕
   ２１−短腕ｔｅｒ、ヒト８番染色体短腕１１−短腕２
   ２、ヒト９番染色体短腕２１−短腕ｔｅｒ、ヒト６番染
   色体長腕、ヒト１７番染色体短腕、ヒト１９番染色体短
   腕、ヒト１９番染色体長腕、ヒト４番染色体長腕２３−
   長腕３２、ヒト５番染色体長腕１３−長腕１４、ヒトＸ
   染色体長腕、ヒト１８番染色体長腕２１、ヒト５番染色
   体長腕１５−長腕２２、ヒト２１番染色体長腕２２−長
   腕ｔｅｒ、ヒト２２番染色体長腕１２−長腕ｔｅｒヒト
   １番染色体短腕、ヒト１２番染色体長腕２２−長腕ｔｅ
   ｒ、ヒト４番染色体短腕、ヒト６番染色体短腕、ヒト９
   番染色体長腕もしくはヒトＸ染色体短腕の欠失を検出す
   ることを含む膵臓癌の診断方法。
2. 【請求項２】 患者由来の癌細胞の染色体において、ヒ
   ト１番染色体長腕２３−長腕２５、ヒト５番染色体短腕
   １４−短腕ｔｅｒ、ヒト５番染色体長腕１４−長腕２
   ３、ヒト３番染色体長腕２２−長腕２５、ヒト７番染色
   体短腕１２−短腕１５、ヒト８番染色体長腕１１−長腕
   １３、ヒト８番染色体長腕２３−長腕ｔｅｒ、ヒト１２
   番染色体短腕１１−短腕１２、ヒト１２番染色体長腕１
   ３−長腕１４、ヒト１９番染色体長腕もしくはヒト２０
   番染色体長腕の増幅、または、ヒト３番染色体短腕２１
   −短腕ｔｅｒ、ヒト８番染色体短腕１１−短腕２２、ヒ
   ト９番染色体短腕２１−短腕ｔｅｒ、ヒト６番染色体長
   腕、ヒト１７番染色体短腕、ヒト１９番染色体短腕、ヒ
   ト１９番染色体長腕、ヒト１８番染色体長腕２１、ヒト
   １番染色体短腕もしくはヒト１２番染色体長腕２２−長
   腕ｔｅｒの欠失を検出することを含む膵臓癌の診断方
   法。
3. 【請求項３】 患者由来の癌細胞の染色体において、ヒ
   ト１番染色体長腕２３−長腕２５、ヒト５番染色体短腕
   １４−短腕ｔｅｒ、ヒト５番染色体長腕１４−長腕２
   ３、ヒト１番染色体長腕もしくはヒト１３番染色体長腕
   の増幅、または、ヒト３番染色体短腕２１−短腕ｔｅ
   ｒ、ヒト８番染色体短腕１１−短腕２２、ヒト９番染色
   体短腕２１−短腕ｔｅｒ、ヒト６番染色体長腕、ヒト１
   ７番染色体短腕、ヒト１９番染色体短腕、ヒト１９番染
   色体長腕、ヒト４番染色体長腕２３−長腕３２、ヒト５
   番染色体長腕１３−長腕１４もしくはヒトＸ染色体長腕
   の欠失を検出することを含むステージＩまたはＩＩの膵
   臓癌の診断方法。
4. 【請求項４】 患者由来の癌細胞の染色体において、ヒ
   ト１番染色体長腕２３−長腕２５、ヒト５番染色体短腕
   １４−短腕ｔｅｒもしくはヒト５番染色体長腕１４−長
   腕２３の増幅、または、ヒト３番染色体短腕２１−短腕
   ｔｅｒ、ヒト８番染色体短腕１１−短腕２２、ヒト９番
   染色体短腕２１−短腕ｔｅｒ、ヒト６番染色体長腕、ヒ
   ト１７番染色体短腕、ヒト１９番染色体短腕もしくはヒ
   ト１９番染色体長腕の欠失を検出することを含むステー
   ジＩまたはＩＩの膵臓癌の診断方法。
5. 【請求項５】 患者由来の癌細胞の染色体において、ヒ
   ト３番染色体長腕２２−長腕２５、ヒト７番染色体短腕
   １２−短腕１５、ヒト８番染色体長腕１１−長腕１３、
   ヒト８番染色体長腕２３−長腕ｔｅｒ、ヒト１２番染色
   体短腕１１−短腕１２、ヒト１２番染色体長腕１３−長
   腕１４、ヒト１９番染色体長腕、ヒト４番染色体長腕２
   １−長腕２５、ヒト７番染色体長腕３１−３２、ヒト１
   １番染色体短腕、ヒト１１番染色体長腕１４−長腕２
   ２、ヒト１３番染色体長腕、ヒト１５番染色体長腕２３
   −長腕ｔｅｒ、ヒト１７番染色体長腕２１−長腕２２、
   ヒト１８番染色体短腕もしくはヒトＸ染色体長腕２５−
   長腕ｔｅｒの増幅、または、ヒト３番染色体短腕２１−
   短腕ｔｅｒ、ヒト１８番染色体長腕２１、ヒト５番染色
   体長腕１５−長腕２２、ヒト２１番染色体長腕２２−長
   腕ｔｅｒもしくはヒト２２番染色体長腕１２−長腕ｔｅ
   ｒの欠失を検出することを含むステージＩＩＩの膵臓癌
   の診断方法。
6. 【請求項６】 患者由来の癌細胞の染色体において、ヒ
   ト３番染色体長腕２２−長腕２５、ヒト７番染色体短腕
   １２−短腕１５、ヒト８番染色体長腕１１−長腕１３、
   ヒト８番染色体長腕２３−長腕ｔｅｒ、ヒト１２番染色
   体短腕１１−短腕１２、ヒト１２番染色体長腕１３−長
   腕１４もしくはヒト１９番染色体長腕の増幅、または、
   ヒト３番染色体短腕２１−短腕ｔｅｒもしくはヒト１８
   番染色体長腕２１の欠失を検出することを含むステージ
   ＩＩＩの膵臓癌の診断方法。
7. 【請求項７】 患者由来の癌細胞の染色体において、ヒ
   ト２０番染色体長腕、ヒト４番染色体短腕もしくはヒト
   ２０番染色体短腕１２−短腕ｔｅｒの増幅、または、ヒ
   ト１番染色体短腕、ヒト１２番染色体長腕２２−長腕ｔ
   ｅｒ、ヒト４番染色体短腕、ヒト６番染色体短腕、ヒト
   ９番染色体長腕、ヒトＸ染色体短腕の欠失を検出するこ
   とを含むステージＩＶの膵臓癌の診断方法。
8. 【請求項８】 患者由来の癌細胞の染色体において、ヒ
   ト２０番染色体長腕の増幅、または、ヒト１番染色体短
   腕もしくはヒト１２番染色体長腕２２−長腕ｔｅｒの欠
   失を検出することを含むステージＩＶの膵臓癌の診断方
   法。
9. 【請求項９】 正常細胞の染色体に、第１標識で標識化
   した患者由来の癌細胞のＤＮＡと、第２標識で標識化し
   た正常細胞のＤＮＡとを競合的にハイブリダイズさせ、 癌細胞のＤＮＡがハイブリダイズした染色体部位が第１
   標識によって観察され、正常細胞のＤＮＡがハイブリダ
   イズした染色体部位が第２標識によって観察され、両者
   がハイブリダイズした染色体部位が第１標識と第２標識
   が混合して観察されるようにして、それぞれの部位の標
   識を識別することによって、前記増幅または前記欠失を
   検出する請求項１ないし９のいずれか一項に記載の診断
   方法。
10. 【請求項１０】 請求項９において、前記第１標識で標
    識化した患者由来の癌細胞のＤＮＡを第１の色として検
    出できるように標識化した患者由来の癌細胞のＤＮＡと
    し、前記第２標識で標識化した正常細胞のＤＮＡを第２
    の色として検出できるように標識化した正常細胞のＤＮ
    Ａとし、前記癌細胞のＤＮＡがハイブリダイズした染色
    体部位が第１の色として観察され、前記正常細胞のＤＮ
    Ａがハイブリダイズした染色体部位が第２の色として観
    察され、両者がハイブリダイズした染色体部位が第１の
    色と第２の色とが混ざってなる第３の色として観察され
    るようにして、それぞれの部位の色を識別することによ
    って、前記増幅または前記欠失を検出する請求項９に記
    載の診断方法。
11. 【請求項１１】 第１の色と第２の色の強度比を染色体
    各部位において測定することによって、前記増幅または
    前記欠失を検出する請求項１０の診断方法。