JP5856048B2 - N結合型糖鎖を利用した消化器癌の検査方法 - Google Patents
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Description
しかしながら、腫瘍マーカーは、進行した悪性腫瘍の動態を把握するために使用されているのが現状であり、腫瘍マーカーを利用した癌の検出・診断方法として、早期診断に使用できるものは確立されていない。特に膵臓癌は、早期診断が困難であり、治療成績も不良なため、スクリーニングに応用できる方法の開発が急務である。
[1] 消化器癌の検査方法であって、
(a)被検者より採取された血液中の糖タンパクから糖鎖を遊離させる工程、
(b)遊離させた糖鎖を精製する工程、および
(c)精製した糖鎖において、下記(i)および(ii)の特性を示す糖鎖を検出する工程、を含む方法。
(ii) MALDI−TOF−MS型分析機による質量分析を行った場合、ピークの質量電荷比(m/z)が、2521、2216、2054、2681、3108、および2695のいずれかを示す
[2] 消化器癌の検査方法であって、
(a)被検者より採取された血液中の糖タンパクから糖鎖を遊離させる工程、
(b)遊離させた糖鎖を精製する工程、および
(c)精製した糖鎖において、下記の少なくともいずれか1つの糖鎖を検出する工程、を含む方法。
(ii) MALDI−TOF−MS型分析機による質量分析を行った場合におけるピークの質量電荷比(m/z)が、2521、2216、2054、2681、3108、2695、1326、1892、2172、2257、2334、2375、2639、2703、2725、2827、および3030のいずれかを示す。
(1)血液の採取
インフォームド・コンセントの得られた、膵臓癌患者17例、食道癌患者34例、胃癌患者22例の患者、および対照として健常者11例より血液を採取し、血漿を遠心分離した。得られた検体(血漿)は連結可能匿名化を行った後、−80℃で凍結保存した。
(2)血液サンプルの作製
タンパク質と修飾糖鎖を遊離させる目的で、血漿をN−グリコシダーゼF及びトリプシンにより処理した。具体的には、100μLの血漿に、純水(165μL)、1M重炭酸アンモニウム(25μL)、及び120mM ジチオスレイトール(25μL)を加え、60℃で30分間静置した後、123mM ヨードアセトアミド(50μL)を加え、室温、遮光下で1時間静置した。続いて、トリプシン(2000unit、25μL)を加え、37℃で1時間静置した後、80℃で15分間加熱することによりトリプシンを変性させた。室温まで冷却させた後に、N−グリコシダーゼF(10unit、10μL)を加え、37℃でオーバーナイト静置した。80℃で15分間加熱することにより、酵素を変性させ、最終量400μLの酵素処理血漿サンプルを得た。また、内部標準グルコースオリゴマー(1−20)(生化学工業 #800111)を10mg/mLとなるように純水に溶解し、内部標準糖鎖溶液を作製した。上記酵素処理血漿サンプル95μLに対し、内部標準糖鎖溶液5μL(=50μg相当)を添加し、全量100μLの溶液を調製した。このうち、20μLを糖鎖補足ビーズ(BlotGlyco(登録商標)for MALDI(住友ベークライト株式会社製))により処理し、遊離した糖鎖の捕捉、及びラベル化を行った。
(3)糖鎖分析の結果解析
ビーズに捕捉された糖鎖を精製・分離し、マトリックス(2,5-dihydroxybenzoic acid)溶液と混合して、MALDI−TOF−MS測定に供した。質量分析器としては、Autoflex III smartbeam TOF/TOF(Bruker Daltonics社製)を用いた。また、データの収集・解析には該機器附属のソフトウェア (例えば、flexControl, flexAnalysis)を用いた。また、レーザーイオン化は、通常ポジティブイオンモードで行い、リフレクターモードで検出した。
(1)血液の採取
インフォームド・コンセントの得られた、膵臓癌患者17例、および対照として健常者11例より血液を採取し、血漿を遠心分離した。得られた検体(血漿)は連結可能匿名化を行った後、−80℃で凍結保存した。
(2)血液サンプルの作製
タンパク質と修飾糖鎖を遊離させる目的で、血漿をN−グリコシダーゼF及びトリプシンにより処理した。具体的には、100μLの血漿に、純水(165μL)、1M重炭酸アンモニウム(25μL)、及び120mM ジチオスレイトール(25μL)を加え、60℃で30分間静置した後、123mM ヨードアセトアミド(50μL)を加え、室温、遮光下で1時間静置した。続いて、トリプシン(2000unit、25μL)を加え、37℃で1時間静置した後、80℃で15分間加熱することによりトリプシンを変性させた。室温まで冷却させた後に、N−グリコシダーゼF(10unit、10μL)を加え、37℃でオーバーナイト静置した。80℃で15分間加熱することにより、酵素を変性させ、最終量400μLの酵素処理血漿サンプルを得た。また、内部標準グルコースオリゴマー(1−20)(生化学工業 #800111)を10mg/mLとなるように純水に溶解し、内部標準糖鎖溶液を作製した。上記酵素処理血漿サンプル95μLに対し、内部標準糖鎖溶液5μL(=50μg相当)を添加し、全量100μLの溶液を調製した。このうち、20μLを糖鎖補足ビーズ(BlotGlyco(登録商標)for MALDI(住友ベークライト株式会社製))により処理し、遊離した糖鎖の捕捉、及びラベル化を行った。
(3)糖鎖分析の結果解析
ビーズに捕捉された糖鎖を精製・分離し、マトリックス(2,5-dihydroxybenzoic acid)溶液と混合して、MALDI−TOF−MS測定に供した。質量分析器としては、Autoflex III smartbeam TOF/TOF(Bruker Daltonics社製)を用いた。また、データの収集・解析には該機器附属のソフトウェア (例えば、flexControl, flexAnalysis)を用いた。また、レーザーイオン化は、通常ポジティブイオンモードで行い、リフレクターモードで検出した。
δmass = [測定値 m/z]-[理論値 m/z]
+:「+」の右側に示された構造が基本構造であり、左側に示された構造が付加構造である。
Hex: hexose(mannose)
HexNAc: N-acetylhexosamine(N-acetylglucosamine)
Deoxyhexose: fucose
Man: mannose
GlcNAc: N-acetylglycosamine
NeuAc: N-acetylneuraminic acid
Claims (3)
- 消化器癌の検査方法であって、
(a)被検者より採取された血液中の糖タンパクから糖鎖を遊離させる工程、
(b)遊離させた糖鎖を精製する工程、および
(c)精製した糖鎖において、下記(i)および(ii)の特性を示す糖鎖を検出する工程、を含む方法。
(i) N結合型糖鎖である
(ii) MALDI−TOF−MS型分析機による質量分析を行った場合、ピークの質量電荷比(m/z)が、2521、2216、2054、2681、3108、および2695のいずれかを示す - 消化器癌の検査方法であって、
(a)被検者より採取された血液中の糖タンパクから糖鎖を遊離させる工程、
(b)遊離させた糖鎖を精製する工程、および
(c)精製した糖鎖において、下記の少なくともいずれか1つの糖鎖を検出する工程、を含む方法。
- 消化器癌が、膵臓癌、食道癌、または胃癌である、請求項1または2に記載の方法。
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US20100055710A1 (en) * | 2005-07-11 | 2010-03-04 | Suomen Punainen Risti, Veripalvelu | Novel Carbohydrate Profile Compositions From Human Cells and Methods for Analysis and Modification Thereof |
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Title |
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JPN6011024201; Jia Zhao et al.: 'N-linked Glycosylation Profiling of Pancreatic Cancer Serum Using Capillary Liquid Phase Separation' Journal of Proteome Research Vol. 6, No. 3, 20070302, p. 1126-1138 * |
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US8932866B2 (en) | 2015-01-13 |
US20130109043A1 (en) | 2013-05-02 |
WO2011126053A1 (ja) | 2011-10-13 |
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