CN111381042B - 肝细胞癌中大血管侵犯的预测方法、试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明发现具有不同程度血管侵犯的HCC患者特异性的蛋白质标志物，进而提供一种用于预测肝细胞癌(HCC)患者大血管侵犯的方法。本发明还开发了肝细胞癌(HCC)患者大血管侵犯的检测试剂盒，可用于免疫印迹和免疫组织化学分析，通过试剂盒检测可以在HCC发生早期进行血管侵犯情况的诊断和分级，并为其治疗建议优化的治疗方案，从而降低HCC大血管侵犯的发生和提高HCC的预后和生存率。

Description

肝细胞癌中大血管侵犯的预测方法、试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及一种肝细胞癌中大血管侵犯的预测方法。
背景技术
肝细胞癌(HCC)是全球癌症相关死亡的第三大常见原因，每年导致约600,000例死亡。治疗性肝切除术现在被广泛认为是具有良好肝功能储备的HCC的首选治疗方法，特别是早期HCC。不幸的是，大约70％的HCC患者在根治性肝切除术后的5年内复发。而血管侵犯通常被认为是肝切除术后HCC患者预后的重要危险因素。肝细胞癌的血管侵犯可进一步分为微血管和大血管侵犯。微血管侵犯(MVI)定义为肿瘤迁移到内皮包围的血管空间内、仅在显微镜下可识别，而大血管侵犯(MAV)是指大量肿瘤侵入门静脉或肝静脉的主干或分支。MVI和MAV可能代表了血管侵犯的逐步过程，最终导致肝内传播和HCC的远端转移。多项研究显示，包括MVI和MAV在内的血管侵犯与HCC患者的生存呈负相关。MVI患者可以从解剖肝切除术，经导管治疗和放疗中获益。尽管最近的诊断和治疗方案有所改善，但大血管侵犯HCC的预后仍然令人沮丧。据报道，在支持治疗的情况下，患有MAV的HCC患者的中位生存期仅为2-6个月。MAV传统上被认为是手术切除的禁忌症，尽管有一些不一致的研究报道HCC与MAV的存活率通过根治性手术程序得到改善。包括巴塞罗那临床肝癌系统，欧洲肝病研究协会和亚太肝脏研究协会在内的国际指南建议将索拉非尼作为晚期HCC与MAV的唯一选择。然而，索拉非尼只能轻微改善生存期1-3个月。在诊断时，大约10-40％的HCC患者存在肝和/或门静脉的MAV。当早期诊断出HCC时报告的MAV发生率较低，而终末期HCC患者中发现MAV的发生率高达44％。研究表明，MAV与HCC的恶性程度和死亡率呈正相关。因此，在早期阶段找到更有希望的分子标志物用以诊断HCC的血管侵犯情况是迫切和必要的。同时，目前关于MAV发生的分子机制研究相当有限，阐明MAV在HCC中的潜在发生机制具有重要意义，这可能会引导治疗方法的创新，从而改善这种致命疾病的预后。氮(Nitrogen)是人体所有蛋白质、RNA和DNA的基本组成部分。尿素循环是肝脏中氮代谢的必需途径，由5种代谢酶类CPS1、OTC、ASS1、ARG1和ASL组成，用于氨的解毒，将高毒性氨转化为尿素排泄到体外。有多项研究表明在很多癌变肿瘤中，尿素循环中的关键酶类会处于下调或失活状态，从而增加废物氨的重新利用，再次转化为氨基酸，甚至被用来合成嘧啶进而支持癌细胞RNA和DNA的合成，最终帮助肿瘤的生长和增殖。然而，尽管尿素循环被报道与包括HCC在内的多种癌症的发生相关，其在具有大血管侵犯的HCC中的确切功能仍不清楚。
近年来，基于多组学技术的精准医学获得了长足发展。基因组学的基因测序和转录组学、蛋白质组学以及代谢组学技术广泛应用于临床诊断和疾病发病机理的阐明。其中，蛋白质组学由于其研究对象蛋白质，不仅是生命活动的主要执行者，也是各种治疗方式的主要靶点，引起了极大的关注。通过蛋白质组学手段结合深入的生物信息学分析，从大队列临床病人样本中发现和确认疾病相关的标志物蛋白、信号通路和代谢途径，已经成为目前基础医学和临床研究的热点和重要手段。
发明内容
肝细胞癌(HCC)是世界上最致命的癌症之一。血管侵犯反映了HCC的侵袭性，被认为是肿瘤复发的关键危险因素。在本发明中，为了更好地了解HCC病人大血管侵犯和转移的分子机制并发现血管侵犯特异性的蛋白质标志物，我们进行了基于iTRAQ技术的高通量蛋白质组学研究，以确定MVI(-)，MVI(+)和MAV的HCC患者癌组织中显著失调的蛋白质。在具有MAV的HCC患者中，我们发现了47种蛋白质在其肿瘤组织中显著下调；而其中的30种蛋白在MVI(-)和MVI(+)的HCC患者肿瘤组织中是没有变化的。这些蛋白尤其是尿素循环中的关键酶类作为大血管侵犯HCC患者中特异的临床相关的蛋白质组学特征，可以用于MAV的精准诊断，并且为MAV的治疗提供潜在的治疗靶标。
为实现上述目的，本发明提供一种用于预测肝细胞癌(HCC)患者大血管侵犯的方法，当一或多种特异性的蛋白质标志物失调时，预测肝细胞癌(HCC)患者发生大血管侵犯，所述特异性的蛋白质标志物是基于高通量蛋白质组学研究在具有MAV的HCC患者中发现失调的蛋白质，所述失调是指表达水平上调或下调。
在一个实施例中，所述上调是指变化倍数大于1.2倍，所述下调是指变化倍数小于0.8倍。
在一个实施例中，所述特异性的蛋白质标志物失调是指Uniprot数据库中编号为P25325、P05062、P00167、P52758、Q93099、P04424、P11586、Q13228、P08319、P30084、P34913、Q6UX53、Q9UI17、P16930、P00966、P05089、P22033、A6NLP5、P55084、P42765、P31327、O75891、P05091、P09467、Q16822、Q53FZ2、Q9UBR1、Q93088、P00505、P54868、P36871、P35573、P80404、Q3LXA3、P06737、Q9Y2P5、Q16851、P33121、P50225、P08133、P23141、O95954、P45954、Q7Z4W1、P07108、Q9UBQ7、Q06278的47种蛋白中的一或多种的表达水平出现下调。
在一个实施例中，所述特异性蛋白质标志物的表达水平失调是指CPS1、ASS1、ASL、ARG1、BHMT、DMGDH、Annexin A6和CES1中的一或多种的表达水平出现下调。
在一个实施例中，所述特异性蛋白质标志物失调是指CKAP4的表达水平出现上调。
在一个实施例中，所述特异性蛋白质标志物失调是指尿素循环的5个关键酶CPS1、OTC、ASS1、ARG1和ASL中的一或多种的表达水平出现下调。
在一个实施例中，所述特异性蛋白质标志物失调是指尿素循环的5个代谢酶类BHMT、BHMT2、DMGDH、SARDH和GLDC一或多种的表达水平出现下调。
在一个实施例中，当所述患者出现与尿素循环的5个关键酶CPS1、OTC、ASS1、ARG1或ASL的表达水平出现下调或尿素循环上游的5个代谢酶类BHMT、BHMT2、DMGDH、SARDH或GLDC的表达水平出现下调相关的尿素循环紊乱时，预测肝细胞癌(HCC)患者发生大血管侵犯。
在一个实施例中，所述特异性蛋白质标志物通过如下步骤确定：
(1)通过手术或活检穿刺获得发生血管侵犯的肝细胞癌病人癌组织和相应癌旁组织；
(2)将不同病人组织采用Bioruptor非接触式超声破碎高效提取总蛋白；
(3)将获得的蛋白进行还原烷基化，并上样于超滤管进行胰蛋白酶酶解
(4)对从不同病人组织获取的酶解肽段按照优化后流程进行iTRAQ试剂的标记，混合并真空抽干后进行样品的HPLC预分级；
(5)将HPLC分级获得的肽段提交到在线二维液相色谱质谱联用系统(2D-LC-MS/MS)进行全蛋白质组学定量分析；
(6)通过强大的后期生物信息学分析，高通量高准确度的筛选和确认发生大血管侵犯的肝细胞癌病人特异性的蛋白质标志物；
(7)采用蛋白质免疫印迹和免疫组化技术手段，对蛋白质组学筛选获得的大血管侵犯特异性蛋白标志物在大队列的肝细胞癌病人中进行确证。
在一个实施例中，所述用于肝细胞癌(HCC)患者血管侵犯分级的方法包括如下步骤：
(1)通过活检穿刺获得发生血管侵犯的肝细胞癌患者癌组织和相应癌旁组织；
(2)将所获得组织石蜡包埋后进行连续切片，并将此切片用于特异性蛋白质标志物蛋白水平的免疫组化检测；
(3)根据检测结果对切片的染色情况进行打分；
(4)结合患者的临床信息，对患者的血管侵犯情况进行分级，并对患者的大血管侵犯进行预测。
本发明还提供一种用于肝细胞癌(HCC)患者血管侵犯分级的方法，其包括如下步骤：
(1)通过活检穿刺获得发生血管侵犯的肝细胞癌患者癌组织和相应癌旁组织；
(2)将所获得组织石蜡包埋后进行连续切片，并将此切片用于特异性蛋白质标志物蛋白水平的免疫组化检测；
(3)根据检测结果对切片的染色情况进行打分；
(4)结合患者的临床信息，对患者的血管侵犯情况，根据打分对患者的大血管侵犯进行分级。
本发明还提供一种肝细胞癌(HCC)患者大血管侵犯的检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含基于蛋白质组学研究在具有MAV的HCC患者中发现失调的蛋白质。
在一个实施例中，所述失调的蛋白质可为Uniprot数据库中编号为P25325、P05062、P00167、P52758、Q93099、P04424、P11586、Q13228、P08319、P30084、P34913、Q6UX53、Q9UI17、P16930、P00966、P05089、P22033、A6NLP5、P55084、P42765、P31327、O75891、P05091、P09467、Q16822、Q53FZ2、Q9UBR1、Q93088、P00505、P54868、P36871、P35573、P80404、Q3LXA3、P06737、Q9Y2P5、Q16851、P33121、P50225、P08133、P23141、O95954、P45954、Q7Z4W1、P07108、Q9UBQ7或Q06278的47种蛋白质中的一或多种。
在一个实施例中，所述失调的蛋白可为CPS1、ASS1、ASL、ARG1、BHMT、DMGDH、Annexin A6或CES1中的一或多种。
在一个实施例中，所述失调的蛋白可为CPS1、ASL、BHMT、Annexin A6或CES1中的一或多种。
本发明还提供上述检测试剂盒用于预测肝细胞癌(HCC)患者大血管侵犯的应用。
本发明需要解决的问题是发现和确认具有不同程度血管侵犯的HCC患者特异性的蛋白质标志物，进而阐明HCC大血管侵犯发生的分子机制，并应用于HCC大血管侵犯的临床预测、诊断和治疗。本发明开发了检测试剂盒，可用于免疫印迹和免疫组织化学分析，提供了一种对发生不同程度血管侵犯的HCC进行分子分型的方法。通过该试剂盒检测本发明发现的蛋白标志物的水平可以在HCC发生早期进行血管侵犯情况的诊断和分级，并为其治疗建议优化的治疗方案，从而降低HCC大血管侵犯的发生和提高HCC的预后和生存率。
附图简要说明
图1.大血管侵犯HCC患者MAV特异性蛋白质标志物高通量筛选的工作流程。
图2.iTRAQ实验所得的血管侵犯HCC患者肝癌组织中的蛋白质鉴定和定量。
图3.生物信息学分析筛选大血管侵犯HCC患者MAV特异性的差异蛋白。
图4.GO和KEGG分析揭示尿素循环在具有大血管侵犯的HCC患者癌组织中显著下调。
图5.通过Western印迹验证潜在的MAV特异性蛋白标志物。
图6.通过IHC染色进一步验证潜在的MAV特异性蛋白标志物。
图7.Western印迹和IHC染色表明CPS1是MAV特异性蛋白标志物，而CES1的表达水平与血管侵犯的进程相关。
图8.尿素循环的显著下调是具有大血管侵犯的HCC患者癌组织中特异的临床相关的蛋白质组学特征。
具体实施例方式
本发明的目的可以通过以下措施来达到：1.通过手术获得共61例发生不同程度血管侵犯(包括无血管侵犯23例、微血管侵犯23例和大血管侵犯15例)的肝癌病人癌组织和相应癌旁组织。2.从中挑选无血管侵犯2例、微血管侵犯2例和大血管侵犯4例，将不同病人癌组织和相应癌旁组织采用Bioruptor非接触式超声破碎高效提取总蛋白。将获得的蛋白进行还原烷基化，并上样于超滤管进行胰蛋白酶酶解。3.对从不同病人组织获取的酶解肽段按照优化后流程进行iTRAQ试剂的标记，混合并真空抽干后进行样品的HPLC预分级。4.将HPLC分级获得的肽段提交到在线二维液相色谱质谱联用系统(2D-LC-MS/MS)进行全蛋白质组学定量分析。5.通过强大的后期生物信息学分析，如PCA分析、Heatmap、火山图、维恩图，以及GO分析、KEGG分析和TCGA肝癌数据库分析等，高通量高准确度的筛选和确认发生大血管侵犯的肝细胞癌病人中特异性的蛋白质标志物。6.用包含蛋白质标志物的检测试剂盒，采用蛋白质免疫印迹(Western印迹)和免疫组化(IHC)等技术手段，对蛋白质组学筛选获得的大血管侵犯特异性标志物在53例大队列的肝细胞癌病人中进行确证。
本发明提供了一条稳定、高效的基于疾病蛋白质组学从不同程度血管侵犯的肝癌病人中筛选和确认大血管侵犯特异性蛋白质标志物的技术路线(图1)。在具有大血管侵犯(MAV)的患者中，我们发现47种蛋白质在HCC肿瘤组织中显著下调，如图2和图3所示。图2中，A.显示两次iTRAQ实验鉴定和定量到的蛋白数量；B.iTRAQ实验1中四个病人癌和癌旁样本的主成分分析；C.iTRAQ实验2中四个病人癌和癌旁样本的主成分分析；D.iTRAQ实验1中四个病人癌和癌旁样本的Heatmap；E.iTRAQ实验2中四个病人癌和癌旁样本的Heatmap。更重要的是，其中有30个蛋白在没有MAV的HCC病人中未发生变化(图3)。图3中，A-D.分别是病人A-D的火山图分析，左边绿色为下调蛋白，右边红色为上调蛋白；E.在病人A-D癌组织中上调和下调蛋白概览；F.在病人A-D癌组织中上调蛋白的韦恩图分析；G.在病人A-D癌组织中下调蛋白的韦恩图分析；H.在病人A-D癌组织中表达发生显著变化蛋白的Heatmap；I-J.在八个病人A-H中都稳定上调蛋白(I)和都稳定下调蛋白(J)的韦恩图分析。对这47种显著下调蛋白质进行GO分析发现，富集程度最高的生物学过程是尿素循环，表明尿素循环的下调和HCC的大血管侵犯有紧密的联系(图4)。图4中，A.在MAV病人癌组织中稳定下调蛋白的KEGG分析；B.在MAV病人癌组织中稳定下调蛋白的生物学过程分析；C.尿素循环在MAV病人癌组织中稳定下调；D.在MAV病人癌组织中稳定下调的尿素循环关键酶之间的相互作用网络。
为进一步验证蛋白组学结果，本发明开发了一种包含9种蛋白(CPS1，ASS1，ASL，ARG1，BHMT，DMGDH，Annexin A6，CES1和CKAP4)的检测试剂盒，该试剂盒包含上述9种蛋白各100μl。通过Western印迹方法验证了这9种候选蛋白在大血管侵犯的HCC患者(11例)中显著失调(p<0.01)，包括8种蛋白(CPS1，ASS1，ASL，ARG1，BHMT，DMGDH，Annexin A6和CES1)下调和1种蛋白(CKAP4)上调(图5)。图5中，A-B.在MAV病人癌组织中发生稳定变化蛋白的Western印迹验证；C-K.在11例MAV病人癌组织中对A和B中变化蛋白Western印迹结果的定量。由图5数据得出，蛋白CPS1，ASS1，ASL，ARG1，BHMT，DMGDH，Annexin A6和CES1下调的平均变化倍数大于1.2倍，蛋白CKAP4上调的变化倍数小于0.8倍。此外，进一步使用免疫组织化学染色进行验证，CPS1，ASL和ARG1(参与尿素循环的关键酶)以及Annexin A6和CES1(调节胆固醇体内平衡和脂肪酸酯代谢的主要蛋白质)在大血管侵犯患者(11例)中的显著下调(图6)。图6中，A.在MAV病人癌组织中稳定下调蛋白的免疫组织化学验证；B.对11例MAV病人癌组织中稳定下调蛋白免疫组织化学结果的打分和统计。同时，本发明在53例HCC患者中(包括无血管侵犯21例、微血管侵犯21例和大血管侵犯11例)确证了CPS1只在大血管侵犯HCC患者中下调(p<0.01)，而CES1会随着HCC患者血管侵犯严重程度的增加逐渐降低(p<0.01)，从而可以根据CPS1和CES1的蛋白表达水平实现HCC血管侵犯的分级(图7)。图7中，A-B.CPS1和CES1蛋白表达水平在不同血管侵犯HCC病人组织中的免疫组织化学验证(A)和Western印迹验证(B)；C.对于B图的统计结果。最后，在蛋白组学结果中观察到了整个尿素循环所有5个关键酶(CPS1、OTC、ASS1、ARG1和ASL)及其上游的5个代谢酶类(BHMT、BHMT2、DMGDH、SARDH和GLDC)在具有MAV的HCC病人肿瘤组织中显著下调(p<0.05)；并进一步利用TCGA肝癌数据库大队列分析,发现这些尿素循环相关酶类(CPS1、OTC、ALDH7A1、BHMT、BHMT2、DMGDH和SARDH)的mRNA水平的下调显著降低了HCC病人(182例)的整体生存率(p<0.05)(图8)。图8中，A.iTRAQ蛋白组学结果揭示尿素循环关键酶及其上游通路蛋白在MAV病人癌组织中稳定下调；B-C.TCGA肝癌数据库大队列分析发现尿素循环相关酶类(CPS1、OTC、ALDH7A1、BHMT、BHMT2、DMGDH和SARDH)的mRNA水平的下调显著降低了HCC病人(182例)的整体生存率(p<0.05)。因此，本发明揭示了尿素循环紊乱可能通过导致大血管侵犯和肿瘤迁移降低HCC病人生存率的分子机制；尿素循环的显著下调是具有大血管侵袭的HCC患者中特异的临床相关的蛋白质组学特征，可以用于MAV的精准诊断，并且为MAV的治疗提供潜在的治疗靶标。
1.方法
HCC患者组织样本的获取
本研究经南京大学医学院附属鼓楼医院伦理委员会批准。HCC患者的所有组织均来自南京大学医学院附属鼓楼医院肝胆外科。所有参与患者的一般和临床信息都有详细记录和存档。所有患者都知情并同意将他们的组织样本用于本研究。HCC患者肝脏组织样本获得以后，将肝组织在液氮中快速冷冻并储存在-80℃下用于进一步分析。对于iTRAQ实验，基于HCC病人的临床分类选择具有MAV(4名患者A-D)，MVI(+)(2名患者E，F)和MVI(-)(2名患者G，H)的HCC患者，同时收集来自同一患者的经病理学证实的肝癌组织和相邻的癌旁肝组织。
肝脏蛋白质的提取、酶解和iTRAQ标记
将来自HCC患者的100mg肝癌组织或邻近的癌旁组织用于蛋白质提取。简言之，首先将组织在RIPA裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，0.5％NP-40,0.25％脱氧胆酸钠，1mM EDTA和1％蛋白酶抑制剂混合物III和V，1mM PMSF，1mM NaVO3，1mM NaF，pH7.4)中均质化。在冰上孵育30分钟，然后使用Bioruptor Plus超声装置(Diagenode，Belgium)在4℃下进行非接触式超声裂解。收集上清液，通过12000rpm离心30分钟除去细胞碎片。用BCA蛋白质测定试剂盒测定蛋白质浓度，并通过考马斯亮蓝染色进一步确认。
对提取蛋白进行超滤管酶解，将100μg总蛋白用0.5M TEAB稀释至100μl，用5mMTCEP在55℃下还原1小时，随后用6.25mM MMTS室温在黑暗中烷基化30分钟。然后将获得的蛋白质转移至10K超滤管(Vivacon，USA)，以12000rpm离心30分钟除去溶剂，并通过重复离心用100μl的0.5M TEAB洗涤3次。最后，将胰蛋白酶(Promega，USA)以1:50胰蛋白酶与蛋白质的质量比加入到超滤管滤膜上，第一次酶解过夜，并且加入与蛋白质的质量比1：100的胰蛋白酶在37℃下进行第二次4小时的酶解。
表1：iTRAQ实验病人和不同样品标记信息
Figure BDA0001931177100000081
Figure BDA0001931177100000091
收集所得肽段，根据制造商的说明用iTRAQ Reagent-8plex Multiplex试剂盒(ABSciex，U.K.Limited)进行肽段标记。样品标记情况如表1中所示：在iTRAQ实验1中，来自患者A-D的4个HCC癌旁样品(P)用iTRAQ标签113,115,117或119标记；来自患者A-D的4个HCC肿瘤样品(T)用iTRAQ标签114,116,118或121标记。在iTRAQ实验2中，来自患者E-H的4个HCC癌旁样品(P)用iTRAQ标签113,115,117或119标记。来自患者E-H的4个HCC肿瘤样品(T)用iTRAQ标签114,116,118或121标记。对于每个iTRAQ实验，将所有8种标记的肽混合在一起，快速干燥，并使用高效液相色谱(HPLC，SHIMADZU)系统和Durashell C18色谱柱(5μm，
Figure BDA0001931177100000092
4.6×250mm)分级成48个样品。最后，将48个样品合并成16个样品，经脱盐和Speedvac干燥后，16个样品重新悬浮于3％(v/v)甲酸2％(v/v)乙腈，用于LC-MS/MS分析。
LC-MS/MS分析
用NanoLC.2D(Eksigent Technologies)和TripleTOF 5600系统(AB SCIEX，Concord，ON)进行MS数据采集。使用90分钟梯度从2-80％(流动相A:0.1％(v/v)甲酸，2％(v/v)乙腈；流动相B:0.1％(v/v)甲酸，98％(v/v)乙腈)对样品进行色谱分离。在样品上样到NanoLC柱3C18-CL，75μm×15cm(Eksigent Technologies)后，肽段的洗脱梯度包括在60分钟内溶剂B浓度从2％增加到22％，接着在18分钟内由22％B上升到35％B，然后在6分钟内爬升到80％B，在最后6分钟内保持在80％B，所有操作保持300nL/min的恒定流速。在350-1,500m/z的范围内收集MS 250ms。选择电荷状态为2-5的50种信号最强的前体离子用于片段化，并且在100-2,000m/z的范围内收集MS/MS100ms；前体离子被排除在重选之外15秒。
数据库搜索
将原始MS数据提交到ProteinPilot软件(版本4.5，AB Sciex)进行数据分析。在UniProt数据库(2016年4月9日，包含160,566个序列，http：//www.uniprot.org/proteomes/UP000005640)中针对Human Sapiens搜索MS/MS数据。使用以下搜索参数：仪器是TripleTOF 5600，iTRAQ定量，用MMTS修饰的半胱氨酸，选择生物学修饰作为蛋白质鉴定的重点，定量，胰蛋白酶酶解，偏差校正和背景校正检查蛋白质定量和标准化。对于错误发现率(FDR)计算，使用自动诱饵数据库搜索策略来使用PSPEP(蛋白质组学系统性能评估管道软件)算法来估计FDR。仅选择具有有效p值的蛋白质用于进一步分析。为了鉴定癌/癌旁中显著差异表达的蛋白质，当蛋白质倍数变化>1.2倍，p值<0.05时，认为是显著上调；当倍数变化<0.8倍，p值<0.05时，认为是显著下调。
生物信息学分析
通过对所有定量到蛋白质的PCA分析和热图以确定来自同一iTRAQ实验中4名患者的所有肿瘤和癌旁组织的相似性或异质性。使用R语言包中的“ggplot2”绘制的火山图分析每个患者的肿瘤和癌旁组织之间蛋白质表达水平的总体动态变化(T/P)。通过R语言包“VennDiagram”分析每个患者组中潜在的差异表达蛋白质的重现性。对肿瘤和癌旁组织中稳定差异表达的蛋白质通过热图(R语言包“pheatmap”)进行了演示，并使用DAVID在线工具(http：//david.abcc.ncifcrf.gov)通过Gene Ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia ofGenes and Genomes(KEGG通路)注释进行分类。对于每个类别，使用双尾Fisher精确检验来测试差异表达的蛋白质对所有鉴定的蛋白质的富集。具有校正的p值<0.05的GO和KEGG通路被认为是显著富集的。KEGG数据库用于在相关代谢途径上绘制差异表达的蛋白质(https://www.kegg.jp)。蛋白质-蛋白质相互作用网络分析通过STRING在线工具(http://string-db.org)进行，并手动重组。
蛋白质印迹分析
本发明开发了一种试剂盒，其包含基于蛋白质组学研究在具有MAV的HCC患者中发现失调的蛋白质。所述失调的蛋白质可为Uniprot数据库中编号为P25325、P05062、P00167、P52758、Q93099、P04424、P11586、Q13228、P08319、P30084、P34913、Q6UX53、Q9UI17、P16930、P00966、P05089、P22033、A6NLP5、P55084、P42765、P31327、O75891、P05091、P09467、Q16822、Q53FZ2、Q9UBR1、Q93088、P00505、P54868、P36871、P35573、P80404、Q3LXA3、P06737、Q9Y2P5、Q16851、P33121、P50225、P08133、P23141、O95954、P45954、Q7Z4W1、P07108、Q9UBQ7或Q06278的47种蛋白质中的一或多种。所述失调的蛋白还可为CPS1，ASS1，ASL，ARG1，BHMT，DMGDH，Annexin A6，CES1和CKAP4中的一或多种。本发明以包含9种蛋白质(含有CPS1，ASS1，ASL，ARG1，BHMT，DMGDH，Annexin A6，CES1和CKAP4抗体各100μl)的检测试剂盒通过蛋白质印迹分析检测和验证这9种蛋白在大血管侵犯HCC患者中的表达。根据临床信息选取11例大血管侵犯HCC患者，将其癌组织和邻近的癌旁组织在含有0.5％SDS的蛋白酶抑制剂混合物(Roche Applied Science)中匀浆。通过12％SDS-PAGE凝胶分离来自每个样品的100μg蛋白质，并转移至PVDF膜(Merck Millipore，Darmstadt，Germany)。用TBST配制的5％脱脂牛奶对膜进行封闭，并在4℃下与一抗一起孵育过夜。所使用的一抗如下：氨基甲酰磷酸合成酶1(CPS1,1：2500,18703-1-AP，Proteintech)，精氨琥珀酸合成酶1(ASS1,1：5000,16210-1-AP，Proteintech)，精氨琥珀酸裂合酶(ASL，1：800,16645-1-AP，Proteintech)，精氨酸酶1(ARG1,1：2500,16001-1-AP，Proteintech)，甜菜碱-高半胱氨酸甲基转移酶(BHMT，1：2000,15965-1-AP，Proteintech)，二甲基甘氨酸脱氢酶(DMGDH，1：5000,24813-1-AP，Proteintech)，羧酸酯酶(CES1,1：2500,14587-1-AP，Proteintech)，膜联蛋白A6(AnnexinA6,1：1000,12542-1-AP，Proteintech)和细胞骨架相关蛋白4(CKAP4,1：8000,16686-1-AP，Proteintech)。用TBST洗涤后，将膜与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗在室温下孵育1小时，并使用化学发光HRP底物(Merck Millipore，Darmstadt，Germany)进行曝光。结果表明CPS1，ASS1，ASL，ARG1，BHMT，DMGDH，Annexin A6和CES1在大血管侵犯HCC癌组织中显著降低(p<0.01)，而CKAP4则显著上升(p<0.01)。
免疫组织化学染色
为了将上述实验中验证的大血管侵犯相关蛋白质标志物用于肝细胞癌患者血管侵犯情况的分级和大血管侵犯的预测，我们应用本发明试剂盒通过免疫组织化学染色。对来自53例HCC患者(包括11例MAV患者，21例MVI(+)患者和21例MVI(-)患者)的肝癌及癌旁组织进行检测。试剂盒使用方式如下：将福尔马林固定、石蜡包埋的来自HCC患者肝癌及癌旁组织进行连续切片(5μm厚)，并使用CPS1(1:50)，ASL(1：250)，BHMT(1：100)，Annexin A6(1：250)和CES1(1:40)的特异性抗体进行IHC染色。用洗涤缓冲液冲洗后，将载玻片与合适的HRP偶联的二抗一起孵育。染色完成后对切片上蛋白的表达水平按照染色强度评分为阴性(0)，弱(1+)，中度(2+)和强(3+)。结果表明CPS1、ASL、BHMT1、Annexin A6和CES1的表达水平在大血管侵犯HCC癌组织中显著降低(0或1+)；同时，CPS1只在大血管侵犯HCC患者中下调(0或1+)，而CES1会随着HCC患者血管侵犯严重程度的增加逐渐降低(大血管侵犯是为0或1+，微血管侵犯时为2+，无血管侵犯时为3+)，从而可以根据CPS1和CES1的蛋白表达水平实现HCC血管侵犯的分级。具体分级标准如下：1.当CPS1，ASL，BHMT1，Annexin A6和CES1的染色强度评分均为0或1+时，推荐分级为大血管侵犯；2.当CPS1，ASL，BHMT1和Annexin A6的染色强度评分均为2+或3+同时CES1染色强度评分2+时，推荐分级为微血管侵犯；3.当CPS1，ASL，BHMT1，Annexin A6和CES1的染色强度评分均为3+时，推荐分级为无血管侵犯。
在临床上，目前检测和诊断HCC患者大血管侵犯的常规手段均为影像学手段，它们的缺点在于只有当肝癌的大血管侵犯已经发生时才能形成明确影像，从而做出诊断。而本发明的试剂盒的优点在于，可以对HCC患者的血管侵犯情况在分子水平进行分级并直接对患者是否可能发生大血管侵犯进行预测。即使HCC患者还处于无血管侵犯或微血管侵犯阶段，本发明试剂盒仍可通过特异性蛋白标志物的检测来预测肝癌大血管侵犯发生的可能，进而进行尽早干预，预防大血管侵犯的发生，对提高肝癌病人的生存率和预后具有极为重要的意义。
统计分析
所有数据均使用SPSS12.0(SPSS Inc.，Chicago，IL)处理，实验数据显示为平均值±标准偏差(S.D.)，p<0.05被认为具有统计学意义。使用配对T检验比较配对癌和癌旁组织之间的蛋白质水平差异是否显著。

Claims (4)

1.蛋白质组合作为标志物在用于制备预测肝细胞癌(HCC)患者大血管侵犯的试剂盒中的用途，其特征在于所述蛋白质组合为CPS1、ASS1、ASL、ARG1、BHMT、DMGDH、Annexin A6、CES1和CKAP4，当所述CPS1，ASS1，ASL，ARG1，BHMT，DMGDH，Annexin A6和CES1表达水平下调且CKAP4的表达水平上调时，预测肝细胞癌患者存在大血管侵犯。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于当CPS1，ASL，BHMT1，Annexin A6和CES1免疫组织化学染色中的染色强度评分均为阴性(0)或弱(1+)时，预测肝细胞癌患者存在大血管侵犯。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，包括如下使用步骤：
(1)通过活检穿刺获得肝细胞癌患者癌组织和相应癌旁组织；
(2)将所获得组织石蜡包埋后进行连续切片，试剂盒对此切片进行免疫组化检测；
(3)根据检测结果对切片的染色情况进行打分；
(4)根据打分判断患者是否存在大血管侵犯。
4.一种根据权利要求1或2所述的用途中所使用的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括含有如下蛋白质组合的检测试剂：CPS1、ASS1、ASL、ARG1、BHMT、DMGDH、Annexin A6、CES1和CKAP4。
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