JP2020514689A - 膵管腺癌の検出および処置のための方法 - Google Patents

膵管腺癌の検出および処置のための方法 Download PDF

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Abstract

提供されるのは、早期膵管腺癌の検出のための方法および関連するキットである。同様に提供されるのは、膵管腺癌に対して感受性である患者または膵管腺癌に対して感受性の疑いがある患者を処置する方法である。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2016年12月15日に出願された米国仮特許出願第62/435,024号明細書および米国仮特許出願第62/435,020号明細書の利益を主張するものであり、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、National Institutes of Healthにより与えられた助成金番号R03 CA123546の下で政府の支援により行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
膵管腺癌(PDAC)は、5年生存率がわずか8%であり、かつ死亡率が罹患率に密接に近づいている最も致死型の癌の1つである。切除可能なPDACは、より良好な生存と関連しているが、PDAC患者の15〜20%のみで局所性疾患を呈する。PDACが疑われている対象またはこの疾患のリスクが高い対象の精密検査で現在使用されているのは、画像診断法であり、特に内視鏡超音波検査および磁気共鳴胆管膵管造影である。しかしながら、既知の危険因子は、PDAC発生率にわずかな影響のみを及ぼす。
癌抗原19−9(CA19−9)は、現在、PDACバイオマーカーとして臨床で使用されている。CA19−9は、前臨床および早期のPDACの両方の診断バイオマーカーとしての可能性を示している(Riker et al.,Surgical Oncology 6:157−69,1998)。しかしながら、CA19−9単独では、早期疾患のバイオマーカーとしての性能が限定されおり、膵癌患者の75%未満がCA19−9の上昇を示し、多くの良性障害によりCA19−9レベルが上昇する可能性がある。さらに、CA19−9は、フコシルトランスフェラーゼ欠乏症でありLewis血液型の抗原を合成不能な患者の5〜10%で検出不能である。そのため、PDACを有すると誤って特定された個人の割合およびPDACを有しないと誤って特定された個人の割合は、診断ツールとしてのCA19−9のみへの依存を許容できないほど高い。
診断の遅れ、発生率の増加および処置の手段の制限に起因して、PDACは、癌関連死の主要な原因となり始めている。この疾患は、概して、多くの患者で進行期に診断され、独立型バイオマーカーとしてのCA19−9の使用が明らかに不適切であることを考慮すると、早期での膵癌の検出のための試験を開発する必要性がある。
本開示は、膵がんの早期検出のための方法およびキットを提供する。この方法およびキットは、対象から得られた生体サンプルに含まれるバイオマーカーの多重アッセイを使用する。下記の少なくとも3種のバイオマーカー:炭水化物抗原19−9(CA19−9)、TIMPメタロペプチダーゼインヒビター1(TIMP1)およびロイシンリッチのアルファ−2−糖タンパク質1(LRG1)の複合分析は、状態が既知であるコホートに対してスクリーニングされた場合、PDACの高精度診断をもたらす。
いくつかの実施形態では、バイオマーカーCA19−9、TIMP1およびLRG1の分析は、さらなるバイオマーカーの分析と組み合わされ得る。いくつかの実施形態では、このさらなるバイオマーカーは、タンパク質バイオマーカーであり得る。いくつかの実施形態では、このさらなるタンパク質バイオマーカーは、ALCAM、CHI3L1、COL18A1、IGFBP2、LCN2、LYZ、PARK7、REG3A、SLPI、THBS1、TNFRSF1A、WFDC2およびこれらの任意の組合せからなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、このさらなるバイオマーカーは、非タンパク質バイオマーカーであり得る。いくつかの実施形態では、この非タンパク質バイオマーカーは、循環腫瘍DNA(ctDNA)であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書で説明される方法は、この生体サンプル中の(N1/N8)−アセチルスペルミジン(AcSperm)のレベルを測定すること、この生体サンプル中のジアセチルスペルミン(DAS)のレベルを測定すること、この生体サンプル中のリゾホスファチジルコリン(LPC)(18:0)のレベルを測定すること、この生体サンプル中のリゾホスファチジルコリン(LPC)(20:3)のレベルを測定すること、およびこの生体サンプル中のインドール誘導体のレベルを測定することをさらに含み得、(N1/N8)−アセチルスペルミジン(AcSperm)、ジアセチルスペルミン(DAS)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(18:0)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(20:3)およびインドール誘導体の量は、この患者を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないと分類する。
対象からの生体サンプルで見出されるCA19−9、TIMP1およびLRG1のレベルに基づいて、この対象のPDAC状態を予測し得る回帰モデルが明らかにされた。
いくつかの実施形態では、患者から採取された血液サンプル中のバイオマーカーが測定される。いくつかの実施形態では、生体サンプル中でのバイオマーカーの存否が決定され得る。いくつかの実施形態では、生体サンプル中のバイオマーカーのレベルが定量され得る。
いくつかの実施形態では、生体サンプルを分析するために表面が提供される。いくつかの実施形態では、この表面上には、目的のバイオマーカーが非特異的に吸着する。いくつかの実施形態では、この表面上には、目的のバイオマーカーに特異的なレセプターが組み込まれている。
いくつかの実施形態では、この表面は、粒子(例えば、ビーズ)と会合している。いくつかの実施形態では、この表面は、同時測定を容易にするためにマルチウェルプレートに含まれている。
いくつかの実施形態では、バイオマーカーの並行評価のために複数の表面が提供される。いくつかの実施形態では、この複数の表面は、単一のデバイスに設けられ、例えば96ウェルプレートに設けられる。いくつかの実施形態では、この複数の表面は、バイオマーカーの同時測定を可能にする。いくつかの実施形態では、単一の生体サンプルが複数の表面に順次適用され得る。いくつかの実施形態では、複数の表面への同時適用のために生体サンプルが分割される。
いくつかの実施形態では、本バイオマーカーは、特定のレセプター分子に結合し、バイオマーカー−レセプター複合体の存否を決定し得る。いくつかの実施形態では、バイオマーカー−レセプター複合体の量が定量され得る。いくつかの実施形態では、このレセプター分子は、酵素に連結されており、検出および定量を容易にする。
いくつかの実施形態では、本バイオマーカーは、特定のリレー分子(relay molecule)に結合し、バイオマーカー−リレー分子複合体は、次にレセプター分子に結合する。いくつかの実施形態では、このバイオマーカー−リレー−レセプター複合体の存否が決定され得る。いくつかの実施形態では、バイオマーカー−リレー−レセプター複合体の量が定量され得る。いくつかの実施形態では、このレセプター分子は、酵素に連結されており、検出および定量を容易にする。いくつかの実施形態では、この酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼである。
いくつかの実施形態では、生体サンプルは、個々のバイオマーカーに関して順次分析される。いくつかの実施形態では、生体サンプルは、別々の部分に分割され、複数のバイオマーカーに関する同時分析を可能にする。いくつかの実施形態では、生体サンプルは、複数のバイオマーカーについての単一のプロセスで分析される。
いくつかの実施形態では、バイオマーカーの存否が目視検査によって決定され得る。いくつかの実施形態では、バイオマーカーの量が分光学的技術の使用によって決定され得る。いくつかの実施形態では、この分光学的技術は、質量分析である。いくつかの実施形態では、この分光学的技術は、UV/Vis分光法である。いくつかの実施形態では、この分光学的技術は、蛍光分光法等の励起/発光技術である。
いくつかの実施形態では、生体サンプルの分析のためのキットが提供される。いくつかの実施形態では、このキットは、この分析を実施するのに必要な化学物質および試薬を含み得る。いくつかの実施形態では、このキットは、避けられない操作者の介入を最小限に抑えるために生体サンプルを扱う手段を含む。
別の態様では、本開示は、膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、この患者から生体サンプルを得ること、この生体サンプル中の(N1/N8)−アセチルスペルミジン(AcSperm)のレベルを測定すること、この生体サンプル中のジアセチルスペルミン(DAS)のレベルを測定すること、この生体サンプル中のリゾホスファチジルコリン(LPC)(18:0)のレベルを測定すること、この生体サンプル中のリゾホスファチジルコリン(LPC)(20:3)のレベルを測定すること、およびこの生体サンプル中のインドール誘導体のレベルを測定することを含み、(N1/N8)−アセチルスペルミジン(AcSperm)、ジアセチルスペルミン(DAS)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(18:0)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(20:3)およびインドール誘導体の量は、この患者を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないと分類する、方法を提供する。
別の態様では、本開示は、血漿由来バイオマーカーパネルおよびタンパク質マーカーパネルを含む、膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、この血漿由来バイオマーカーパネルは、(N1/N8)−アセチルスペルミジン(AcSperm)、ジアセチルスペルミン(DAS)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(18:0)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(20:3)およびインドール誘導体を含み、このタンパク質バイオマーカーパネルは、CA19−9、LRG1およびTIMP1を含み、この方法は、この患者から生体サンプルを得ること、この生体サンプル中の血漿由来バイオマーカーおよびタンパク質バイオマーカーのレベルを測定することを含み、血漿由来バイオマーカーおよびタンパク質バイオマーカーの量は、この患者を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないと分類する、方法を提供する。
別の態様では、本開示は、1つまたは複数のタンパク質バイオマーカーおよび1つまたは複数の代謝産物マーカーのレベルを決定することを含む、膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、この患者から生体サンプルを得ること、このサンプルを、CA19−9抗原に結合する第1のレポーター分子と接触させること、このサンプルを、TIMP1抗原に結合する第2のレポーター分子と接触させること、このサンプルを、LRG1抗原に結合する第3のレポーター分子と接触させること、およびこの1つまたは複数のバイオマーカーのレベルを決定することを含み、この1つまたは複数のバイオマーカーは、(N1/N8)−アセチルスペルミジン(AcSperm)、ジアセチルスペルミン(DAS)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(18:0)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(20:3)およびインドール誘導体からなる群から選択され、この第1のレポーター分子、第2のレポーター分子、第3のレポーター分子およびこの1つまたは複数のバイオマーカーの量は、この患者を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないと分類する、方法を提供する。
別の態様では、本開示は、膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、この患者から生体サンプルを得ること、この生体サンプル中のCA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原のレベルを測定すること、この生体サンプル中の、(N1/N8)−アセチルスペルミジン(AcSperm)、ジアセチルスペルミン(DAS)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(18:0)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(20:3)およびインドール誘導体からなる群から選択される1つまたは複数の代謝産物マーカーのレベルを測定すること、この生体サンプル中のCA19−9抗原、TIMP1抗原、LRG1抗原、(N1/N8)−アセチルスペルミジン(AcSperm)、ジアセチルスペルミン(DAS)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(18:0)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(20:3)およびインドール誘導体のレベルの統計的分析によって決定されるように、この患者の状態を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないと割り当てることを含む方法を提供する。
別の態様では、本開示は、膵管腺癌に対して感受性の疑いがある患者を処置する方法であって、この患者を、請求項38〜41のいずれか一項に記載の方法により、膵管腺癌に対する感受性に関して分析すること、この腺癌に対して治療上有効な量の処置を施すことを含む方法を提供する。一実施形態では、この処置は、外科手術、化学療法、放射線療法、標的療法またはこれらの組合せである。
一実施形態では、本明細書で説明される方法は、CA19−9、TIMP1およびLRG1からなる群から選択される抗原に選択的に結合する少なくとも1つのセレプター分子を含む。
一実施形態では、CA19−9、TIMP1、LRG、(N1/N8)−アセチルスペルミジン(AcSperm)、ジアセチルスペルミン(DAS)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(18:0)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(20:3)またはインドール誘導体の量の検出は、固体粒子の使用を含む。別の実施形態では、この固体粒子は、ビーズである。
一実施形態では、本レポーター分子の少なくとも1つは、酵素に連結されている。
一実施形態では、本タンパク質マーカーまたは本代謝産物マーカーの少なくとも1つは、検出可能なシグナルを生成する。別の実施形態では、この検出可能なシグナルは、分光測定法によって検出可能である。別の実施形態では、この分光測定法は、質量分析法である。
一実施形態では、本明細書で説明される方法は、膵管腺癌を有するか、または膵管腺癌を有しないという割り当てへの患者の病歴情報の包含を含む。
一実施形態では、本明細書で説明される方法は、膵管腺癌を有すると割り当てられた患者に少なくとも1つの代替診断試験を施すことを含む。別の実施形態では、この少なくとも1つの代替診断試験は、少なくとも1つのctDNAのアッセイまたは配列決定を含む。
別の態様では、本開示は、本明細書で説明される方法のためのキットであって、CA19−9抗原の検出のための第1の溶質、LRG1抗原の検出のための第2の溶質、TIMP1抗原の検出のための第3の溶質、(N1/N8)−アセチルスペルミジン(AcSperm)の検出のための第4の溶質、ジアセチルスペルミン(DAS)の検出のための第5の溶質、リゾホスファチジルコリン(LPC)(18:0)の検出のための第6の溶質、リゾホスファチジルコリン(LPC)(20:3)の検出のための第7の溶質およびインドール誘導体の検出のための第8の溶質を含む試薬溶液を含むキットを提供する。
一実施形態では、そのようなキットは、CA19−9抗原の検出のための第1の溶質を含む第1の試薬溶液、LRG1抗原の検出のための第2の溶質を含む第2の試薬溶液、TIMP1抗原の検出のための第3の溶質を含む第3の試薬溶液、(N1/N8)−アセチルスペルミジン(AcSperm)の検出のための第4の溶質を含む第4の試薬溶液、ジアセチルスペルミン(DAS)の検出のための第5の溶質を含む第5の試薬溶液、リゾホスファチジルコリン(LPC)(18:0)の検出のための第6の溶質を含む第6の試薬溶液、リゾホスファチジルコリン(LPC)(20:3)の検出のための第7の溶質を含む第7の試薬溶液およびインドール誘導体の検出のための第8の溶質を含む第8の試薬溶液を含み得る。
一実施形態では、本明細書で説明されるキットは、この試薬溶液を生体サンプルと接触させるためのデバイスを含み得る。別の実施形態では、そのようなキットは、少なくとも1つの抗原に結合するための手段を有する少なくとも1つの表面を含み得る。別の実施形態では、この少なくとも1つの抗原は、CA19−9、LRG1およびTIMP1からなる群から選択される。別の実施形態では、この少なくとも1つの表面は、ctDNAに結合するための手段を含む。
別の態様では、本開示は、本明細書で説明されるような方法であって、本生体サンプル中の(N1/N8)−アセチルスペルミジン(AcSperm)のレベルを測定すること、この生体サンプル中のジアセチルスペルミン(DAS)のレベルを測定すること、この生体サンプル中のリゾホスファチジルコリン(LPC)(18:0)のレベルを測定すること、この生体サンプル中のリゾホスファチジルコリン(LPC)(20:3)のレベルを測定すること、およびこの生体サンプル中のインドール誘導体のレベルを測定することを含み、(N1/N8)−アセチルスペルミジン(AcSperm)、ジアセチルスペルミン(DAS)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(18:0)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(20:3)およびインドール誘導体の量は、本患者を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないと分類する、方法を提供する。
別の態様では、本開示は、膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、この患者から生体サンプルを得ること、この生体サンプル中の(N1/N8)−アセチルスペルミジン(AcSperm)のレベルを測定すること、この生体サンプル中のジアセチルスペルミン(DAS)のレベルを測定すること、この生体サンプル中のリゾホスファチジルコリン(LPC)(18:0)のレベルを測定すること、この生体サンプル中のリゾホスファチジルコリン(LPC)(20:3)のレベルを測定すること、およびこの生体サンプル中のインドール誘導体のレベルを測定することを含み、(N1/N8)−アセチルスペルミジン(AcSperm)、ジアセチルスペルミン(DAS)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(18:0)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(20:3)およびインドール誘導体の量は、この患者を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないと分類する、方法を提供する。
別の態様では、本開示は、血漿由来バイオマーカーパネルおよびタンパク質マーカーパネルを含む、膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、この血漿由来バイオマーカーパネルは、(N1/N8)−アセチルスペルミジン(AcSperm)、ジアセチルスペルミン(DAS)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(18:0)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(20:3)およびインドール誘導体を含み、このタンパク質バイオマーカーパネルは、CA19−9、LRG1およびTIMP1を含み、この方法は、この患者から生体サンプルを得ること、この生体サンプル中の血漿由来バイオマーカーおよびタンパク質バイオマーカーのレベルを測定することを含み、血漿由来バイオマーカーおよびタンパク質バイオマーカーの量は、この患者を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないと分類する、方法を提供する。
別の態様では、本開示は、1つまたは複数のタンパク質バイオマーカーおよび1つまたは複数の代謝産物マーカーのレベルを決定することを含む、膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、この患者から生体サンプルを得ること、このサンプルを、CA19−9抗原に結合する第1のレポーター分子と接触させること、このサンプルを、TIMP1抗原に結合する第2のレポーター分子と接触させること、このサンプルを、LRG1抗原に結合する第3のレポーター分子と接触させること、およびこの1つまたは複数のバイオマーカーのレベルを決定することであって、この1つまたは複数のバイオマーカーは、(N1/N8)−アセチルスペルミジン(AcSperm)、ジアセチルスペルミン(DAS)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(18:0)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(20:3)およびインドール誘導体からなる群から選択される、決定することを含み、第1のレポーター分子、第2のレポーター分子、第3のレポーター分子および1つまたは複数のバイオマーカーの量は、この患者を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないと分類する、方法を提供する。
別の態様では、本開示は、膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、この患者から生体サンプルを得ること、この生体サンプル中のCA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原のレベルを測定すること、およびこの生体サンプル中の、(N1/N8)−アセチルスペルミジン(AcSperm)、ジアセチルスペルミン(DAS)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(18:0)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(20:3)およびインドール誘導体からなる群から選択される1つまたは複数の代謝産物マーカーのレベルを測定すること、この生体サンプル中のCA19−9抗原、TIMP1抗原、LRG1抗原、(N1/N8)−アセチルスペルミジン(AcSperm)、ジアセチルスペルミン(DAS)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(18:0)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(20:3)およびインドール誘導体のレベルの統計的分析によって決定されるように、この患者の状態を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないかのいずれかに割り当てることを含む方法を提供する。
別の態様では、本開示は、膵管腺癌に対して感受性の疑いがある患者を処置する方法であって、この患者を、請求項36〜39のいずれか一項に記載の方法により、膵管腺癌に対する感受性に関して分析すること、この腺癌に対して治療上有効な量の処置を施すことを含む方法を提供する。一実施形態では、この処置は、外科手術、化学療法、放射線療法、標的療法またはこれらの組合せである。別の実施形態では、そのような方法は、CA19−9、TIMP1およびLRG1からなる群から選択される抗原に選択的に結合する少なくとも1つのセレプター分子を含む。別の実施形態では、CA19−9、TIMP1、LRG、(N1/N8)−アセチルスペルミジン(AcSperm)、ジアセチルスペルミン(DAS)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(18:0)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(20:3)またはインドール誘導体の量の検出は、固体粒子の使用を含む。別の実施形態では、この固体粒子は、ビーズである。別の実施形態では、本レポーター分子の少なくとも1つは、酵素に連結されている。別の実施形態では、本タンパク質マーカーまたは本代謝産物マーカーの少なくとも1つは、検出可能なシグナルを生成する。別の実施形態では、この検出可能なシグナルは、分光測定法によって検出可能である。別の実施形態では、この分光測定法は、質量分析法である。別の実施形態では、そのような方法は、膵管腺癌を有するか、または膵管腺癌を有しないという割り当てへの患者の病歴情報の包含を含む。別の実施形態では、そのような方法は、膵管腺癌を有すると割り当てられた患者に少なくとも1つの代替診断試験を施すことを含む。別の実施形態では、この少なくとも1つの代替診断試験は、少なくとも1つのctDNAのアッセイまたは配列決定を含む。
別の態様では、本開示は、請求項36〜40のいずれか一項に記載の方法のためのキットであって、CA19−9抗原の検出のための第1の溶質、LRG1抗原の検出のための第2の溶質、TIMP1抗原の検出のための第3の溶質、(N1/N8)−アセチルスペルミジン(AcSperm)の検出のための第4の溶質、ジアセチルスペルミン(DAS)の検出のための第5の溶質、リゾホスファチジルコリン(LPC)(18:0)の検出のための第6の溶質、リゾホスファチジルコリン(LPC)(20:3)の検出のための第7の溶質およびインドール誘導体の検出のための第8の溶質を含む試薬溶液を含むキットを提供する。別の実施形態では、本明細書で開示されたキットは、CA19−9抗原の検出のための第1の溶質を含む第1の試薬溶液、LRG1抗原の検出のための第2の溶質を含む第2の試薬溶液、TIMP1抗原の検出のための第3の溶質を含む第3の試薬溶液、(N1/N8)−アセチルスペルミジン(AcSperm)の検出のための第4の溶質を含む第4の試薬溶液、ジアセチルスペルミン(DAS)の検出のための第5の溶質を含む第5の試薬溶液、リゾホスファチジルコリン(LPC)(18:0)の検出のための第6の溶質を含む第6の試薬溶液、リゾホスファチジルコリン(LPC)(20:3)の検出のための第7の溶質を含む第7の試薬溶液およびインドール誘導体の検出のための第8の溶質を含む第8の試薬溶液を含む。一実施形態では、そのようなキットは、この試薬溶液を生体サンプルと接触させるためのデバイスを含む。別の実施形態では、そのようなキットは、少なくとも1つの抗原に結合するための手段を有する少なくとも1つの表面を含む。別の実施形態では、この少なくとも1つの抗原は、CA19−9、LRG1およびTIMP1からなる群から選択される。別の実施形態では、この少なくとも1つの表面は、ctDNAに結合するための手段を含む。
別の態様では、本開示は、患者の膵管腺癌(PDAC)の処置またはその悪化の予防の方法であって、CA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原のレベルは、この患者を、PDACを有するか、またはPDACに対して感受性であると分類し、この方法は、PDACを有する患者に化学療法剤を投与すること、PDACを有する患者に治療放射線を投与すること、およびPDACを有する患者の癌性組織の部分的または完全な外科的切除のための外科手術の1つまたは複数を含む、方法を提供する。一実施形態では、CA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原のレベルは、上昇している。別の実施形態では、CA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原のレベルは、PDACを有しない参照患者または参照群でのCA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原のレベルと比較して上昇している。別の実施形態では、この参照患者または参照群は、健康である。別の実施形態では、AUC(95%CI)は、少なくとも0.850である。別の実施形態では、AUC(95%CI)は、少なくとも0.900である。別の実施形態では、患者のPDACを有するとの分類は、それぞれ95%および99%の特異度で0.849および0.658の感度を有する。別の実施形態では、CA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原のレベルは、慢性膵炎を有する参照患者または参照群でのCA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原のレベルと比較して上昇している。別の実施形態では、CA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原のレベルは、良性の膵疾患を有する参照患者または参照群でのCA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原のレベルと比較して上昇している。別の実施形態では、AUC(95%CI)は、少なくとも0.850である。別の実施形態では、AUC(95%CI)は、少なくとも0.900である。別の実施形態では、患者のPDACを有するとの分類は、それぞれ95%および99%の特異度で0.849および0.658の感度を有する。別の実施形態では、PDACは、切除可能境界病期(borderline resectable stage)においてまたはその前に診断されている。別の実施形態では、PDACは、切除可能病期で診断されている。
別の態様では、本開示は、患者の膵管腺癌(PDAC)の処置またはその悪化の予防の方法であって、CA19−9抗原、TIMP1抗原、LRG1、N1/N8)−アセチルスペルミジン(AcSperm)、ジアセチルスペルミン(DAS)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(18:0)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(20:3)およびインドール誘導体のレベルは、この患者を、PDACを有するか、またはPDACに対して感受性であると分類し、この方法は、PDACを有する患者に化学療法剤を投与すること、PDACを有する患者に治療放射線を投与すること、およびPDACを有する患者の癌性組織の部分的または完全な外科的切除のための外科手術の1つまたは複数を含む、方法を提供する。別の実施形態では、CA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原のレベルは、上昇している。別の実施形態では、CA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原のレベルは、PDACを有しない参照患者または参照群でのCA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原のレベルと比較して上昇している。別の実施形態では、この参照患者または参照群は、健康である。別の実施形態では、CA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原のレベルは、慢性膵炎を有する参照患者または参照群でのCA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原のレベルと比較して上昇している。別の実施形態では、CA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原のレベルは、良性の膵疾患を有する参照患者または参照群でのCA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原のレベルと比較して上昇している。別の実施形態では、この患者は、PDACのリスクが高い。別の実施形態では、この患者は、真性糖尿病を新たに発症した50歳超であるか、慢性膵炎を有するか、膵臓のムチン分泌嚢胞と偶然に診断されているか、またはこれらの高リスク群の1つの無症候性家系である。
別の態様では、本開示は、膵管腺癌に対する感受性の疑いがある患者を処置する方法であって、この患者を、本明細書で説明される方法により、膵管腺癌に対する感受性に関して分析すること、この腺癌に対して治療上有効な量の処置を施すことを含む。別の実施形態では、この処置は、外科手術、化学療法、放射線療法、標的療法またはこれらの組合せである。
検証済のバイオマーカーモデルを発見するためのフローチャートを示す。 トリアージセットにおいて健康コントロールと比べてPDACのレベルが有意に高いバオマーカー候補を示す。トリアーゼセットにおける(図2A)PDAC(n=75)対健康コントロール(n=27)の比較および(図2B)PDAC対慢性膵炎患者(n=19)の比較でのバイオマーカー候補の性能。バーは、AUC(95%CI)を示す。は、逆順が使用されたことを示す。AUC、曲線下面積。 組み合わせた検証セットにおける、TIMP1+LRG1+CA19−9に基づくバイオマーカーパネルの性能を示す。(図3A)PDAC対健康コントロールおよび(図3B)PDAC対良性の膵疾患(「OR」規則の組合せ)のために開発されたバイオマーカーパネルのROC分析。上方の線は、モデルを示し、下方の線は、CA19−9を示す。AUC、曲線下面積。 検証セット#2における、バイオマーカーパネル(TIMP1、LRG1およびCA19−9)ベースのスコアと腫瘍サイズ値との間の相関分析を示す。基礎となる線形回帰モデルは、切片および傾きがそれぞれ3.7329および−0.2646である(傾き95%CI=−0.745〜0.216;Waldベースの両側p値=0.27)。腫瘍サイズは、CT/MRI/EUSにより評価した2つの測定値の大きい方を指す。 試験セットにおける、TIMP1+LRG1+CA19−9に基づくバイオマーカーモデルの性能を示す。PDAC対健康コントロールのための、組み合わされた検証セットで開発された固定係数を有する組合せモデルのROC分析。上方の線は、モデルを示し、下方の線は、CA19−9を示す。AUC、曲線下面積。 研究デザインおよびフィルタリング戦略の概略を示す。 発見コホートにおけるリゾホスファチジルコリン、スフィンゴミエリンおよびセラミドの検出に関する個々のAUCを示す。略語:LPC:リゾホスファチジルコリン;SM:スフィンゴミエリン。 インドール誘導体に関するMSMSスペクトルを示し、対応するフラグメントは、約118、約148および約188m/zで生じる。 訓練セットにおける個々の代謝産物および5−マーカー代謝産物パネルのAUC曲線を示す。組み合わされた発見および「確認」コホートに基づく性能。(図9A)健康な対象(n=10)からのPDAC(n=29)の識別のための個々の代謝産物および5−マーカー代謝産物パネルに関する受信者動作特性(ROC)曲線。(図9B)良性の膵疾患(慢性膵炎(n=10)および低悪性度嚢胞(n=50))と診断された対象に対してPDAC(n=29)を比較する、個々の代謝産物および5−マーカー代謝産物パネルに関するROC曲線。 試験セットにおける個々の代謝産物および5−マーカー代謝産物パネルの検証を示す。(図10A)健康な対象(n=82)からの切除可能なPDAC(n=39)の識別のための個々の代謝産物および5−マーカー代謝産物パネルに関する受信者動作特性(ROC)曲線(試験セット#1)。(図10B)良性の膵疾患(低悪性度嚢胞(n=102))と診断された対象に対して切除可能なPDAC(n=20)を比較する、個々の代謝産物および5−マーカー代謝産物パネルに関するROC曲線(試験セット#2)。 代謝産物パネルおよびタンパク質パネルからなるハイパーパネルは、タンパク質パネルのみと比較して分類を改善することを示す。(図11Aおよび図11B)訓練セット(29例のPDAC対10例の健康対象)および独立した検証コホート(試験セット#1;39例のPDAC対82例の健康対象)におけるハイパーパネルおよびタンパク質パネルのみのROC曲線。 膵管腺癌は、細胞外リゾリン脂質を異化することを示す。(図12A)24、48および72時間の培養後のPANC1細胞株およびSU8686 PDAC細胞株におけるリゾホスファチジルコリン(18:0)、リゾホスファチジルコリン(20:3)およびグリセロホスホコリンの血清含有培地組成の変化率(%)。(図12B)ホスファチジルコリンおよびリゾホスファチジルコリンの異化に関与する酵素の概要を示す。(図12C)PDACおよび隣接コントロール組織でのPLA2G10、LYPLA1およびENPP2のmRNA発現+/−SEM。統計的優位性を対応のあるt検定により決定した(p:**<0.01、****<0.001)。mRNA発現データをOncomineから得ており、Badeaデータセットに基づく。 馴化培地中の脂質種の組成を示す。培地ブランクと比較した、PDAC細胞株PANC−1およびSU8686に由来の24、48および72時間の馴化の血清含有培地中の脂質種の組成の変化%を示すヒートマップ。略語:PC:ホスファチジルコリン;PE:ホスファチジルエタノールアミン;LPC:リゾホスファチジコリン;LPE:リゾホスファチジルエタノールアミン;Plas:プラスマロゲン。 膵管腺癌は、ポリアミンの異化の上昇を示すことを示す。(図14A)5種のPDAC細胞株(CFPAC−1、MiaPaCa、SU8686、PANC03−27およびSW1990)の細胞溶解物中におけるN1/N8−アセチルスペルミジンまたはジアセチルスペルミンの存在量(単位面積±stDev)。(図14B)5種のPDAC細胞株(CFPAC−1、MiaPaCa、SU8686、PANC03−27およびSW1990)からの馴化の1、2、4および6時間後に回収した血清フリー培地中におけるN1/N8−アセチルスペルミジンまたはジアセチルスペルミンの存在量(単位面積±stdev)。(図14C)ポリアミンおよびそのアセチル化誘導体の生合成に関与する酵素を表示するネットワーク。ノードの陰影(淡灰色=減少;濃灰色=増加)および大きさは、PDACと隣接コントロール組織との間のそれぞれの酵素のmRNA発現における変化の方向および大きさを示す。太いノード境界は、統計的有意性(対応のあるt検定<0.05)を示す。箱ひげ図は、PDACと隣接コントロール組織との間のそれぞれの酵素のmRNA発現の分布を示す。mRNA発現データをOncomineから得ており、Badeaデータセットに基づく。
提供されるのは、ヒト対象において膵癌を同定する方法であって、
(a)この対象から得られた血液サンプルを少なくとも3種のバイオマーカー:CA19−9、TIMP1およびLRG1の分析のためのアッセイに適用すること、
(b)この血液サンプル中に存在する少なくとも3種のバイオマーカーの量を定量すること、
(c)存在するバイオマーカーの量に基づく統計的分析を適用して、対応する膵癌に関するバイオマーカースコアを決定し、それにより対象を膵癌に関して陽性または陰性のいずれかに分類すること
を概して含む方法である。
本明細書の方法は、高リスク対象のスクリーニングを可能にし、例えば膵癌の家族歴を有するものまたは他の危険因子(例えば、慢性膵炎、肥満、重度の喫煙および場合により糖尿病)を有する患者のスクリーニングを可能にする。本明細書で提供されたロジスティック回帰モデルは、これらの因子を分類方法に組み込み得る。
PDAC陽性と分類された対象のためにPDAC状態を明らかにするためのさらなる方法が提供され得る。PDAC陽性との分類後、コンピュータ断層撮影(CT)、内視鏡超音波検査(EUS)または内視鏡的逆行性膵胆管造影(ERCP)が挙げられるが、これらに限定されない方法が続き得る。
CA19−9の検出を、配列Neu5Acα2,3Galβ1,3(Fucα1,4)GlcNAcを有するシアリル−Lewis A(血液型抗原のLewisファミリの一部)と呼ばれる炭水化物構造であるCA19−9抗原との接触により達成し得る。シアリル−Lewis Aは、N連結グリカンおよびO連結グリカンの両方に単糖前駆体を逐次連結させるグリコシルトランスフェラーゼにより合成される。シアリル−Lewis Aは、多くの異なるタンパク質(例えば、ムチン、癌胎児性抗原および血中循環アポリポタンパク質(circulating apolipoprotein))に付着している。標準的なCA19−9臨床アッセイでは、モノクローナル抗体がサンドイッチELISAフォーマットでCA19−9抗原を捕捉して検出し、このサンドイッチELISAフォーマットは、多くの異なるキャリアタンパク質上でCA19−9抗原を測定する(Partyka et al.,Proteomics 12(13):2213−20,2012)。
TIMP1(配列番号1;UniProtKB:P01033)の検出を、TIMP1に特異的に結合するレポーター分子との接触により達成し得る。
LRG1(配列番号2;UniProtKB:P02750)の検出を、LRG1に特異的に結合するレポーター分子との接触により達成し得る。
少なくとも3種のバイオマーカーCA19−9、TIMP1およびLRG1の組合せにより、これまでにない信頼性の高いPDAC予測力を得ることができる。39例の切除可能なPDAC症例および82例の対応する健康コントロールからの血漿サンプルで構成された盲検試験セットに適応された場合、本明細書で説明される方法により、健康コントールと比べた早期PDACの識別において、95%の特異度で感度が0.667である0.887(0.817〜0.957)のAUC(95%CI)が得られる。このバイオマーカーパネルの性能は、早期膵癌の高精度検出と、CA19−9単独と比較して統計的に有意な改善(p=0.008、試験セット)とを示した。
本明細書で詳述されたバイオマーカーの検出に関して、本開示は、本明細書で報告された特定のバイオマーカーに限定されない。いくつかの実施形態では、本開示のバイオマーカーの検出および分析のために他の生体分子が選択され得、この生体分子として、タンパク質、抗体、核酸、アプタマーおよび合成有機化合物に基づく生体分子が挙げられるが、これに限定されない。他の分子は、感度、効率、アッセイ速度、費用、安全性または製造もしくは貯蔵の容易さの観点で利点を示し得る。これに関して、本明細書で開示されたバイオマーカーの予測力および診断力は、このバイオマーカーのタンパク質形態のみならず、さらにはこのバイオマーカーの他の表現(例えば、核酸)の分析まで及び得ることを当業者は認識するであろう。さらに、本明細書で開示されたバイオマーカーの予測力および診断力も、PDACと関連する他のバイオマーカーの分析と組み合わせて使用され得ることを当業者は認識するであろう。いくつかの実施形態では、PDACと関連する他のバイオマーカーは、タンパク質ベースのバイオマーカーであり得る。いくつかの実施形態では、PDACと関連する他のバイオマーカーは、非タンパク質ベースのバイオマーカー(例えば、ctDNA)であり得る。
TIMP1およびLRG1は、本明細書で開示されている検証研究においてCA19−9の性能を補完する。遺伝子発現および/またはTIMP1の分泌の増加がPDACで既に観察されており、腫瘍細胞増殖を誘導することが分かっている。血中循環TIMP1レベルの上昇は、PDACと関連しているが、レベルの上昇は、他の上皮腫瘍タイプでも見出されている。LRG1の役割は、TGF−β経路の活性化を介した血管新生の促進で示唆されている。PDAC以外に、LRG1血漿レベルの増加が他の癌タイプでも見出されている。
3種のマーカーパネルの性能は、早期PDACの対応する健康対象または良性の膵疾患コントロールからの識別において、CA19−9単独を超える統計的に有意な改善を示した。この3種のマーカーパネルは、リスクが平均的な無症候性対象のスクリーニングとは対照的に、リスクが高い対象(即ち家族歴、嚢胞性病変、慢性膵炎を有する対象)または成人発症II型糖尿病を呈する対象間でのPDACの評価を可能にする。
本明細書で開示されているのは、切除可能なPDAC患者および対応するコントロールからのサンプルの複数の独立したセットにおいて、同定されたバイオマーカー候補の逐次検証を実行するために、ヒト診断前およびマウスの両方の早期PDAC血漿サンプルを使用して実行される最初のプロテオミクスベースの研究である。
いくつかの実施形態では、生体サンプル中のCA19−9、TIMP1およびLRG1のレベルを測定する。いくつかの実施形態では、CA19−9、TIMP1およびLRG1をレポーター分子と接触させ、それぞれのレポーター分子のレベルを測定する。いくつかの実施形態では、それぞれCA19−9、TIMP1およびLRG1に特異的に結合する3種のレポーター分子が提供される。レポーター分子の使用により、アッセイの利便性および感度が増大し得る。
いくつかの実施形態では、CA19−9、TIMP1およびLRG1は、キットに備えられた表面上に吸着される。いくつかの実施形態では、レポーター分子は、表面に吸着されたCA19−9、TIMP1およびLRG1に結合する。バイオマーカーの吸着は、非選択的または選択的であり得る。いくつかの実施形態では、この表面は、1つまたは複数のバイオマーカーの吸着に対する選択性を増加させるためのレセプター官能基を含む。
いくつかの実施形態では、CA19−9、TIMP1およびLRG1は、これらのバイオマーカーの1つまたは複数に対して選択的な3種の表面上に吸着される。次いで、あるレポーター分子または複数のレポーター分子が、表面に吸着されたバイオマーカーに結合し得、特定の表面と会合しているレポーター分子のレベルは、この表面上に存在する特定のバイオマーカーの容易な定量を可能にし得る。
いくつかの実施形態では、CA19−9、TIMP1およびLRG1は、キットに備えられた表面上に吸着され、これらのバイオマーカーの1つまたは複数に対して特異的なリレー分子が、表面に吸着されたバイオマーカーに結合し得、1つまたは複数のリレー分子に特異的なレセプター分子がリレー分子に結合し得る。リレー分子は、特定のバイオマーカーに対する特異性を付与し得、レセプター分子は、検出を可能にし得る。
いくつかの実施形態では、CA19−9、それぞれTIMP1およびLRG1に特異的に結合する3種のリレー分子が用意される。これらのリレー分子は、バイオマーカーに対して特異的に設計され得るか、またはこれらの結合特性に起因して候補のプールから選択され得る。これらのリレー分子は、これらのバイオマーカーに結合するように生成された抗体であり得る。
いくつかの実施形態では、CA19−9、TIMP1およびLRG1は、キットに備えられた3種の別々の表面上に吸着され、これらのバイオマーカーの1つまたは複数に特異的なリレー分子が、表面に吸着されたバイオマーカーに結合し得、レセプター分子がリレー分子に結合し得る。これらの表面の分析を段階的にまたは同時に達成し得る。
いくつかの実施形態では、本レポーター分子は、酵素に連結されており、このレポーター分子の定量は、容易である。いくつかの実施形態では、定量は、望ましい分光特性を有する物質の触媒産生により達成され得る。
いくつかの実施形態では、バイオマーカーの量を、分光法を使用して決定する。いくつかの実施形態では、この分光法は、UV/可視分光法である。いくつかの実施形態では、バイオマーカーの量を、質量分析法を使用して決定する。
特定のアッセイで見出されたバイオマーカーの量は、オペレータに直接報告され得るか、あるいはデジタル的に保存されて数学的処理に容易に利用され得る。数学的分析を実施するためにシステムが設けられ得、PDAC陽性またはPDAC陰性としての分類がオペレータにさらに報告され得る。
いくつかの実施形態では、当業者に既知のさらなるアッセイが本開示の範囲内で機能し得る。他のアッセイの例として、下記を利用するアッセイが挙げられるが、これらに限定されない:質量分析法、免疫親和性LC−MS/MS、表面プラズモン共鳴、クロマトグラフィー、電気化学、音波、免疫組織化学およびアレイ技術。
同様に本明細書で提供されるのは、PDAC陽性と分類された対象の処置方法である。PDAC陽性患者の処置として、外科手術、化学療法、放射線療法、標的療法またはこれらの組合せを挙げ得るがこれらに限定されない。
上記は、詳細な説明がよりよく理解され得るように本開示の特徴および技術的利益をやや広く概説している。開示された具体的な実施形態は、本開示の同一の目的を実行するための他の構造またはプロセスの改変または設計の基礎として容易に利用され得ることを当業者は認識すべきである。本開示は、説明される特定の実施形態に限定されないことを理解すべきであり、なぜなら、この特定の実施形態の変更形態がなされ得、かつ添付された特許請求の範囲内に依然として含まれるからである。
定義
本明細書で使用される場合、用語「膵癌」は、細胞の異常な増殖を特徴とする膵臓の悪性新生物を意味し、この細胞の増殖は、この細胞の周囲の正常な組織の増殖を上回りかつこの正常な細胞の増殖と調和していない。
本明細書で使用される場合、用語「PDAC」は、膵管腺癌を指し、この膵管腺癌は、膵臓の管に生じる可能性がある膵癌である。
本明細書で使用される場合、用語「PDAC陽性」は、PDACを有するとの対象の分類を指す。
本明細書で使用される場合、用語「PDAC陰性」は、PDACを有しないとの対象の分類を指す。
本明細書で使用される場合、用語「膵炎」は、膵臓の炎症を指す。膵炎は、概して癌には分類されないが、膵癌に進行する場合がある。
本明細書で使用される場合、用語「対象」または「患者」は、本明細書で使用される場合、PDAC陽性またはPDAC陰性としての分類が望まれており、かつさらなる処置が施され得る哺乳動物(好ましくはヒト)を指す。
本明細書で使用される場合、「参照患者」または「参照群」は、PDACを有するか、またはPDACに対して感受性であるとの疑いがある患者からの試験サンプルが比較され得る患者または対象の群を指す。いくつかの実施形態では、そのような比較は、試験対象がPDACを有するかどうかを決定するために使用され得る。参照患者または参照群は、試験または診断の目的のためのコントロールとして役立ち得る。本明細書で説明される場合、参照患者または参照群は、単一の患者から得られたサンプルであり得、またはサンプル群(例えば、プールされたサンプル群)を表し得る。
本明細書で使用される場合、「健康な」は、健康な膵臓を有する個体を指し、即ち正常で損なわれていない膵臓機能を有する個体を指す。健康な患者または対象は、PDACまたは他の膵疾患の症状を有しない。いくつかの実施形態では、健康な患者または対象は、ある患者または患者の群でのPDACの決定のための罹患サンプルまたは罹患が疑われるサンプルとの比較のための参照患者として使用され得る。
用語「処置」または「処置すること」は、本明細書で使用される場合、対象または患者が患っている場合の虚弱、または病気、または状態、または事象の発症または再発の予防(prophylaxis)(予防(prevention))、あるいはこの発症または再発の程度または可能性の治癒または低減のための、この対象に関する医薬の投与または医療処置の実施を指す。本開示に関連して、この用語は、薬理学的物質もしくは製剤の投与または非薬理学的方法(例えば、限定されないが、放射線療法および外科手術)の実施も意味し得る。本明細書で使用される薬理学的物質として、下記が挙げられ得るが、これらに限定されない:当技術分野で確立されている化学療法剤、例えばゲムシタビン(GEMZAR)、5−フルオロウラシル(5−FU)、イリノテカン(CAMPTOSAR)、オキサリプラチン(ELOXATIN)、アルブミン結合パクリタキセル(ABRAXANE)、カペシタビン(XELODA)、シスプラチン、パクリタキセル(TAXOL)、ドセタキセル(TAXOTERE)およびイリノテカンリポソーム(ONIVYDE)。薬理学的物質は、免疫療法で使用される物質(例えば、チェックポイント阻害剤)を含み得る。処置は、多様な薬理学的物質または多様な処置方法(例えば、限定されないが、外科手術および化学療法)を含み得る。
本明細書で使用される場合、用語「ELISA」は、酵素結合免疫吸着アッセイを指す。このアッセイは、概して、タンパク質の蛍光タグ付きサンプルを、そのタンパク質に対して特異的親和性を有する抗体と接触させることを含む。このタンパク質の検出は、レーザー蛍光定量法が挙げられるが、これに限定されない様々な手段により達成され得る。
本明細書で使用される場合、用語「回帰」は、サンプルの観察可能な形質(または観察可能な形質のセット)に基づいて、前記サンプルの基本的な特性についての予測値を割り当て得る統計的方法を指す。いくつかの実施形態では、この特性は、直接観察可能ではない。例えば、本明細書で使用される回帰方法は、特定の対象に関する特定のバイオマーカー試験またはバイオマーカー試験のセットの定性的または定量的な結果を、前記対象がPDAC陽性であるという可能性に関連付け得る。
本明細書で使用される場合、用語「ロジスティック回帰」は、モデルからの予測の割り当てがいくつかの許容離散値の1つを有し得る回帰方法を指す。例えば、本明細書で使用されるロジスティック回帰モデルは、特定の対象に関してPDAC陽性またはPDAC陰性のいずれかの予測を割り当て得る。
本明細書で使用される場合、用語「バイオマーカースコア」は、特定の対象に関する特定のバイオマーカーレベルを統計的方法に入力することにより算出される、前記対象に関する数値スコアを指す。
本明細書で使用される場合、用語「カットオフポイント」は、対象のバイオマーカースコアに基づいて前記対象にPDAC陽性またはPDAC陰性の分類を割り当てるために使用され得る具体的な統計的方法と関連する数学的値を指す。
本明細書で使用される場合、用語「分類」は、対象に関して得られたバイオマーカースコアの結果に基づく、PDAC陽性またはPDAC陰性のいずれかとしての前記対象の割り当てを指す。
本明細書で使用される場合、用語「PDAC陽性」は、本開示の方法の転帰の結果に基づいて対象がPDACに対して感受性と予測される指標を指す。
本明細書で使用される場合、用語「PDAC陰性」は、本開示の方法の転帰の結果に基づいて対象がPDACに対して感受性ではないと予測される指標を指す。
本明細書で使用される場合、用語「Wilcoxon順位和検定」(Mann−Whitney U検定、Mann−Whitney−Wilcoxon検定またはWilcoxon−Mann−Whitney検定としても既知である)は、2つの集団の比較に使用される特定の統計的方法を指す。例えば、本明細書では、この検定を使用して、観察可能な形質(特にバイオマーカーレベル)を特定の集団の対象でのPDACの有無に関連付け得る。
本明細書で使用される場合、用語「真陽性率」は、特定の方法により陽性と分類された所与の対象が真に陽性である確率を指す。
本明細書で使用される場合、用語「偽陽性率」は、特定の方法により陽性と分類された所与の対象が真には陰性である確率を指す。
本明細書で使用される場合、用語「ROC」は、様々なカットオフポイントでの特定の診断方法の性能を評価するために本明細書で使用されるグラフィカルプロットである受信者動作特性を指す。ROCプロットを様々なカットオフポイントでの真陽性および偽陽性の割合から構築し得る。
本明細書で使用される場合、用語「AUC」は、ROCプロットの曲線下面積を指す。AUCを使用して特定の診断試験の予測力を推定し得る。一般に、より大きいAUCは、予測誤差の頻度の減少と共に予測力の増加に対応する。AUCの可能な値は、0.5〜1.0の範囲であり、後者の値は、誤差のない予測方法の特性である。
本明細書で使用される場合、用語「p値」または「p」は、陽性PDACの対象および非陽性PDACの対象に関するバイオマーカースコアの分布がWilcoxon順位和検定との関連で同一である確率を指す。一般に、ゼロに近いp値は、特定の統計的方法が対象の分類で高い予測力を有するであろうことを示す。
本明細書で使用される場合、用語「CI」は、信頼区間(即ち特定の値が特定の信頼レベルにあると予測され得る区間)を指す。本明細書で使用される場合、用語「95%CI」は、特定の値が95%の信頼レベルにあると予測され得る区間を指す。
本明細書で使用される場合、用語「感度」は、様々な生化学アッセイとの関連で、疾患を有するものを正確に同定するアッセイの能力(即ち真陽性率)を指す。比較すると、本明細書で使用される場合、用語「特異度」は、様々な生化学アッセイとの関連で、疾患を有しないものを正確に同定するアッセイの能力(即ち真陰性率)を指す。感度および特異度は、二値分類検定の能力(即ち分類関数)の統計的尺度である。感度は、偽陰性の回避を定量化し、特異度は、偽陽性に監視で同じことをする。
本明細書で使用される場合、用語「ALCAM」は、活性化白血球細胞接着分子を指す。
本明細書で使用される場合、用語「CHI3L1」は、キチナーゼ−3様−1を指す。
本明細書で使用される場合、用語「COL18A1」は、XVIII型コラーゲンアルファ1を指す。
本明細書で使用される場合、用語「IGBFP2」は、インスリン様成長因子結合タンパク質2を指す。
本明細書で使用される場合、用語「LCN2」は、リポカリン2を指す。
本明細書で使用される場合、用語「LRG1」は、ロイシンリッチアルファ−2−糖タンパク質1を指す。
本明細書で使用される場合、用語「LYZ」は、リゾチーム2を指す。
本明細書で使用される場合、用語「PARK7」は、プロテインデグリカーゼ(protein deglycase)DJ−1を指す。
本明細書で使用される場合、用語「REG3A」は、再生ファミリメンバー3アルファ(regenerating family member 3 alpha)を指す。
本明細書で使用される場合、用語「SLPI」は、アンチロイコプロテイナーゼ(antileukoproteinase)としても当技術分野で既知である分泌型白血球プロテアーゼインヒビターを指す。
本明細書で使用される場合、用語「プロ−CTSS」は、プロカテプシンSを指す。
本明細書で使用される場合、用語「総−CTSS」は、総カテプシンSを指す。
本明細書で使用される場合、用語「THBS1」は、トロンボスポンジン1を指す。
本明細書で使用される場合、用語「TIMP1」は、メタロプロテイナーゼインヒビター1としても当技術分野で既知であるTIMPメタロペプチダーゼインヒビター1を指す。
本明細書で使用される場合、用語「TNFRSF1A」は、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリメンバー1Aを指す。
本明細書で使用される場合、用語「WFDC2」は、WAP 4−ジスルフィドコアドメイン2を指す。
本明細書で使用される場合、用語「CA19−9」は、炭水化物抗原19−9を指し、癌抗原19−9およびシアリル化Lewis抗原としても当技術分野で既知である。
本明細書で使用される場合、用語「ctDNA」は、無細胞DNAまたは血中循環腫瘍DNAを指す。ctDNAは、癌患者の血液中を自由に循環していることが分かっている腫瘍DNAである。理論に制限されることなく、ctDNAは、死滅しかけている腫瘍細胞から生じると考えられ、様々なレベルおよび変異対立遺伝子画分ではあるが、広範囲の癌で存在し得る。一般に、ctDNAは、元々の腫瘍細胞中で形成され、かつ宿主の健康な細胞中で見出されない特有の体細胞変異を持つ。従って、このctDNA体細胞変異は、癌に特異的なバイオマーカーとして作用し得る。
本明細書で使用される場合、「代謝産物」は、細胞代謝の中間体および/または産物である小分子を指す。代謝産物は、細胞中で様々な機能を発揮し得、例えば酵素に対する構造的な、シグナル伝達の、刺激性のおよび/または阻害性の効果を発揮し得る。いくつかの実施形態では、代謝産物は、非タンパク質の血漿由来代謝産物マーカーであり得、このマーカーとして、例えばアセチルスペルミジン、ジアセチルスペルミン、リゾホスファチジルコリン(18:0)、リゾホスファチジルコリン(20:3)およびインドール誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「インドール誘導体」は、インドールに由来する化合物を指す。インドールは、式CNの芳香族複素環有機化合物である。インドールは、二環式構造を有し、5員の窒素含有ピロール環に縮合した6員のベンゼン環からなる。本明細書で説明されるインドール誘導体は、インドールのあらゆる誘導体であり得る。代表例として、下記が挙げられるが、これらに限定されない:トリプトファン、インドール−3−エタノール、10,11−メチレンジオキシ−20(S)−CPT、9−メチル−20(S)−CPT、9−アミノ−10,11−メチレンジオキシ−20(S)−CPT、9−クロロ−10,11−メチレンジオキシ−20(S)−CPT、9−クロロ−20(S)−CPT、10−ヒドロキシ−20(S)−CPT、9−アミノ−20(S)−CPT、10−アミノ−20(S)−CPT、10−クロロ−20(S)−CPT、10−ニトロ−20(S)−CPT、20(S)−CPT、9−ヒドロキシ−20(S)−CPT、(SR)−インドリン−2−カルボン酸、IAA、IAA−L−Ile、IAA−L−Leu、IBA、ICA−OEt、ICA、インドール−3−アクリル酸、インドール−3−カルボン酸メチルエステル、インドール−3−カルボン酸、インドール−4−カルボン酸メチルエステル、Boc−L−Igl−OH。
膵癌の診断、病期分類および処置。
膵癌を分類するための最も一般的な方法は、膵癌を外科手術により切除し得るかどうか、および膵癌が広がっている場所に基づいて膵癌を下記の4つのカテゴリに分類することである:切除可能、切除可能境界、局所進行性または転移性。切除可能な膵癌を外科手術により切除し得る。この腫瘍は、膵臓のみに存在し得るかまたは膵臓を超えて広がり得るが、この腫瘍は、この領域の重要な動脈または静脈まで増殖していない。この腫瘍が膵臓外の領域に広がっているという証拠はない。今日の医療業界で一般的な標準的方法を使用すると、この病期で診断されるのは、患者のわずか約10%〜15%である。切除可能境界は、最初に診断された場合、外科手術により切除することが困難な場合または不可能な場合であるが、化学療法および/または放射線療法により最初に腫瘍を小さくし得、その後に切除縁陰性で切除し得る腫瘍を説明する。切除縁陰性は、視認できるがん細胞が取り残されていないことを意味する。局所進行性の膵癌は、膵臓周辺の領域にのみ依然として存在するが、近くの動脈もしくは静脈までまたは近くの臓器まで増殖していることから、外科手術により切除され得ない。しかしながら、局所進行性の膵癌が身体の任意の遠い部位まで広がっているという徴候はない。今日の医学業界で一般的な標準的方法を使用すると、この病期で診断されるのは、患者の約35%〜40%である。転移性は、癌が膵臓の領域を超えて他の臓器(例えば、肝臓または腹部の遠い領域)まで広がっていることを意味する。今日の医学業界で一般的な標準的方法を使用すると、この病期で診断されるのは、患者の約45%〜55%である。あるいは、他の癌で一般的に使用されているTNM病気分類システムを使用し得る(しかしながら、膵癌では一般的ではない)。このシステムは、腫瘍サイズ(T)、リンパ節への広がり(N)および転移(M)に基づく。
膵癌の処置の選択肢として、癌性組織の部分的または完全な外科的切除のための外科手術(例えば、ウィップル法、膵体尾部切除術または膵全摘術)、1つまたは複数の化学療法剤の投与および罹患した組織への治療用放射線(例えば、従来の/標準的な定位部分的放射線療法(SBRT))の投与が挙げられる。膵癌の処置のために承認されている化学療法剤として、下記が挙げられるが、これらに限定されない:カペシタビン(Xeloda)、エルロチニブ(Tarceva)、フルオロウラシル(5−FU)、ゲムシタビン(Gemzar)、イリノテカン(Camptosar)、ロイコボリン(Wellcovorin)、nab−パクリタキセル(Abraxane)、ナノリポソーム型イリノテカン(nanoliposomal irinotecan)(Onivyde)およびオキサリプラチン(Eloxatin)。
膵癌は、早期に診断された場合、好ましくは切除可能境界病期においてまたはその前に診断された場合、より好ましくは切除可能病期で診断された場合に最も効果的に処置される。
下記の実施例は、本開示の実施形態を実証するために含まれる。下記の実施例は、例証としてのみかつ本開示を使用する当業者を補助するために示される。実施例は、本開示の範囲を別途限定することを決して意図しない。当業者は、本開示に照らして、開示された具体的な実施形態に対する多くの変更形態がなされ得、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく同様のまたは類似の結果が依然として得られることを認識すべきである。
実施例1:質量分析法。
ヒト血漿サンプルの定量的質量分析(MS)分析を、既に説明されている(Faca et al.,PLoS Med.5(6):e123,2008)ように行った。症状の発症および診断前に血液を採取した膵臓の症例からなる1つのプールを重1,2,3−13C−アクリルアミド同位体で標識し、コントロールプールをこれらのプールの混合前に軽アクリルアミドで標識した。タンパク質を、Workstation Class−VP 7.4(Shimadzu Corporation)により制御される自動化オンライン2D−HPLCシステムで分離した。分離は、陰イオン交換クロマトグラフィーと、それに続く逆相クロマトグラフィーとからなった。各画分を凍結乾燥させ、溶液中で消化し、NanoLC−1D(Eksigent)と共にLTQ−Orbitrap(Thermo)質量分析計を使用するMSにより分析した。
得られたLC−MS/MSデータをComputational Proteomics Analysis System(CPAS)パイプライン(Rauch et al.,J.Proteome Res.5(1):112−21, 2006)で処理した。カスタムスコアリングプラグインCometを有するX!TandemをヒトInternational Protein Index(IPI)バージョン3.13.のデータベースに対する検索エンジンとして使用した。検索アルゴリズムパラメータをトリプシン特異度および最大で2つの開裂欠損について設定した。質量許容度は、前駆体イオンの場合には1.5Daであり、断片トイオンの場合には0.5Daであった。[12C]アクリルアミドによるシステインアルキル化(+71.03657)を固定改変として設定し、[13C]アクリルアミド(+3.01006)とメチオニンの酸化(+15.99491)とを可変改変として設定した。同定したペプチドをPeptideProphet(Keller et al.,Anal.Chem.74(20):5383−92,2002)によりさらに検証し、タンパク質をProteinProphet(Nesvizhskii et al.,Anal.Chem.75(17):4646−58,2003)により推測した。タンパク質同定をProteinProphet評価に基づいて5%のエラー率でフィルタリングした。指定されたツールQ3によりタンパク質の定量的情報を抽出して、MS/MSにより同定されたシステイン残基を含む各対のペプチドを定量した(Faca et al.,J.Proteome Res.5(8):2009−18,2006)。最小で0.75のPeptideProphetスコアおよび最大で20ppmの分数デルタ質量を有するペプチドのみを定量に選択した。[13C]アクリルアミド標識ペプチド対[12C]アクリルアミド標識ペプチドの比をヒストグラム(logスケール)上でプロットし、分布の中央値の中心をゼロに置いた。特定のタンパク質に関する全ての正規化ペプチド比を平均化して、全体のタンパク質比を算出した。
この分析により、5%未満のエラー率で0.8以上のProteinProphetスコアを使用して1,732種のタンパク質を同定した。結果は、下流の分析に使用される少なくとも2種の定量したペプチドによる395種のタンパク質の定量も含んだ。
実施例2:ELISA法。
全てのELISA実験に関して、各サンプルを二重にアッセイし、吸光度または化学発光をSpectraMax M5マイクロプレートリーダー(Molecular Devicesで測定した。内部コントロールサンプルを全てのプレートで実行し、プレート間のばらつきを補正するために、サンプルの各値を同一のプレート中の内部コントロールの平均値で除算した。
NPC2
組換えNPC2(aa 20〜151;配列番号3;UniProtKB:P61916)に対するマウスモノクローナル抗体(#635および#675)を作製し、サンドインチELISAで使用した。
96ウェルポリスチレンプレート(Corning,Canton,NY,USA)を捕捉抗体としての1μg/mLの抗NPC2マウスモノクローナル抗体(#635)でコーティングし、それに続いてReagent Diluent(R&D Systems)でブロックした。血漿サンプルを1:200に希釈し、組換えタンパク質の段階希釈を適用して標準曲線を作成した。1:4000希釈でのビオチン化抗NPC2マウスモノクローナル抗体(#675)を検出に使用した。洗浄後、各ウェルをストレプトアビジン−HRPと共にインキュベートし、それに続いて発色試薬および停止溶液(R&D Systems)と共にインキュベートした。
実施例3:血液サンプルセット。
独立した複数の血液サンプルコホートを、PDAC症例(n=187)、良性の膵疾患(n=93)および健康コントロール(n=169)からなるプールから得た。全てのヒト血液サンプルをInstitutional Review Board(University of Michigan Comprehensive Cancer Center,Evanston Hospital,University of Utah,University of Texas MD Anderson Cancer Center and International Agency for Research on Cancer)の承認およびインフォームドコンセント後に得た。
初期発見セット
綿密な定量的MSを使用する研究のために、6例の診断前PDAC症例(性別、男性;年齢中央値、66.5歳;範囲、62〜76歳)および6例の対応するコントロール(性別、男性;年齢中央値、67.0歳、範囲:61〜76歳)から血漿プールを構成した。これらのサンプルを、Carotene and Retinol Efficacy Trialの一部としてのサンプル収集から平均9.3ヶ月(範囲、8〜12ヶ月)後に病期IA(N=1)、IB(N=2)およびIIB(N=3)PDACと後に診断した対象から、ならびに年齢、性別および喫煙歴が一致しかつ4年間のフォローアップ期間をかけて癌と診断されていない同一のコホートからの6つのコホートから収集した。
トリアージセット
75例のPDAC症例、27例の健康コントロールおよび19例の慢性膵炎症例からなる、Early Detection Research Networkの後援の下でUniversity of Michigan Comprehensive Cancer Centerから得た血漿サンプルを初期検証およびバイオマーカー選択(トリアージセット)に使用した。
検証セット
73例の早期PDACを有する患者、60例の健康コントロール、60例の慢性膵炎を有する患者および14例の良性の膵嚢胞を有する患者からの血漿サンプルのさらなるセットをバイオマーカーの連続検証およびパネル開発に使用した。全ての慢性膵炎サンプルを、急性の再燃がない状態で診療所での選択的な設定で採取した。
Evanston Hospitalの検証セット#1は、病期IB〜IIBのPDAC症例(n=10)、健康コントロール(n=10)および慢性膵炎症例(n=10)からなり、検証セット#2(University of Utah)は、早期(IA〜IIA)PDAC症例(n=42)、健康コントロール(n=50)および慢性膵炎症例(n=50)からなり、検証セット#3(University of Texas MD Anderson Cancer Center)は、切除可能なPDAC症例(n=21)、および良性の膵嚢胞症例(n=14)からなった。
これらの3種の検証セットの人口統計を表1に表す。
試験セット
39例の早期PDACおよび82例の健康コントロールからなる、組み合わされたバイオマーカーパネルを試験するためのさらなる独立した血漿サンプルセットをInternational Agency for Research on Cancerから得た。この試験セットの人口統計を表2に表す。
実施例4:統計的方法
各アッセイに関して最低の検出値を補完した後、生アッセイデータを検出限界未満の値にlog2変換した。片側Wilcoxon順位和検定を使用し、PDAC症例と、健康コントロール、慢性膵炎症例および膵嚢胞症例とを比較してp値を算出した。適用した検定は、対立仮説AUC>0.50に対してAUC=0.50の帰無仮説を検定することを目的とした片側であった。受信者動作特性(ROC)曲線分析を実施して、PDAC症例の健康コントロール、慢性膵炎症例および膵嚢胞症例からの識別でのバイオマーカーの性能を評価した。各セットの小さいサンプルサイズのために、検証セット#1、#2および#3を、健康コントールの場合に平均が0でありかつ標準偏差が1であるようにデータを標準化することによるモデル開発のために組み合わせた。検証セット#3は、健康コントロールを含まなかったことから、良性の膵嚢胞サンプルが慢性膵炎サンプルと同一の平均および標準偏差を有するように結果を標準化した。MATLAB R2014bおよびSASバージョン9.3を使用して統計的分析を実施した。p<0.05を全ての分析において統計的に有意であるとみなした。
7種の検証されたバイオマーカー候補の全ての可能な組合せを調査し、Akaike情報量規準(AIC)に基づいて、健康コントロール、慢性膵炎および膵嚢胞から膵癌を識別するためにロジスティック回帰モデルを選択した。合計で127個のロジスティック回帰モデルをフィットさせた。係数の変動性を考慮して、標準誤差、信頼区間およびp値を1000倍ブートストラップにより得た。バイオマーカーパネルおよびCA19−9単独を比較するためのp値は、1000倍ブートストラップにより算出され、AUC(パネル)=AUC(CA19−9)対代替AUC(パネル)>AUC(CA19−9)の帰無仮説を参照する。尤度比検定も適用して、バイオマーカーパネルの適合度をCA19−9単独と比較した。LeaveMOut交差検証技術を適用して、得られたロジスティック回帰モデルを検証した。データをトレーニングセットおよび試験セットに分割し、これらのセットは、それぞれ元のデータの2/3および1/3に対応する。そのような分割スキームを1000回繰り返し、試験セットから得られた1000個のAUCを平均化することにより、モデルを検証した。改変された計画共変量行列を適用して、慢性膵炎および良性の膵嚢胞の患者から膵癌を識別し得るOR規則を有するロジスティック回帰モデルを構築した:[I(Ca19−9>=a)Ca19−9I(Ca19−9>=a)I(Ca19−9<a)TIMP1I(Ca19−9<a)LRG1I(Ca19−9<a)CA19−9I(Ca19−9<a)]。CA19−9閾値「a」の全ての可能な値をスキャンして、1000倍ブートストラップにより可能な限り高いAUCを達成した。ブートストラップにより最初に選択されなかった測定値を使用して予測スコアを作成し、AUCを評価した。この手順を1000回繰り返し、得られた1000個のAUCに対して両側p値を算出した。最も高いAUCを「a」=1.6で得た。
3種のバイオマーカーTIMP1、LRG1、CA19−9と一緒に共変量(求人センター、性別、年齢、喫煙状況および飲酒により表される)を含むロジスティック回帰モデルの試験セットでの開発の過剰フィッティングを避けるために二段階戦略に従った。最初に、共変量のみを含むロジスティック回帰モデルをフィッティングすることにより共変量ベースのスコアを作成し、次いでこの共変量ベースのスコアを単一の共変量としての3種のバイオマーカーロジスティック回帰モデルに追加した。
実施例5:バイオマーカーパネル候補の選択。
上記で説明したNPC2アッセイをこの研究に利用した。少なくとも17種のさらなるバイオマーカーパネル候補を表3に列挙する。
実施例6:バイオマーカーパネル組成の発見。
トリアージ
この研究のためのフロー図を図1に示す。簡潔に言うと、18種のバイオマーカー候補のプールをトリアーゼセットに対するスクリーニングによりトリミングした。12種のバイオマーカーのレベルは、健康コントロールと比較して、PDACにおいて統計的に有意な程度まで高く、それぞれ曲線下面積(AUC)>0.60およびp<0.05(Wilcoxon順位和検定)であった(図2A)。これらのバイオマーカーの7種(IGFBP2、LRG1、CA19−9、REG3A、COL18A1、TIMP1およびTNFRSF1A)のレベルも、慢性膵炎症例と比較しPDAC症例で統計的に有意な程度まで高く(p<0.05、Wilcoxon順位和検定)、>0.60のAUCであった(図2B)。これらの7種のバイオマーカー候補を検証セット#1、#2および#3に対するさらなる評価のためにトリアーゼパネルとして選択した。
検証
次いで、トリアージパネル中のこれらの7種のバイオマーカー候補を、上記で説明される3種の検証セットによる分析にかけた。トリアージセットで選択された7種の全てのバイオマーカーのAUC値は、検証セット#1、#2および#3の対応するコントロールと比較して、血漿レベルがPDAC患者で一貫して上昇したことを示す(表4、表5および表6)。検証セット#2におけるPDAC対慢性膵炎症例の比較でのこれらの7種のマーカー(IGFBP2を除く)のAUCは、両方の検証セット#1および#2における健康コントロールおよび慢性膵炎症例からのPDAC症例の識別で>0.60であった。加えて、4種のバイオマーカー(CA19−9、TIMP1、LRG1およびIGFBP2)も、検証セット#3において良性の膵嚢胞症例と比較して、PDAC症例からの血漿サンプル中で<0.60のAUCを生じた(表6)。
パネル構築
早期PDACのためのバイオマーカーパネルを開発するために、検証セット#1、#2および#3の結果を標準化して組み合わせた。組み合わせた検証セットでは、PDAC症例における7種の全てのバイオマーカーのレベルは、健康コントロールおよび良性の膵疾患症例(慢性膵炎症例と良性の膵嚢胞症例との組合せ)の場合と比べて統計的に有意な程度(AUC>0.60;p<0.05、Wilcoxon順位和検定)まで高かった(表7)。次に、ロジスティック回帰モデルに基づく早期PDACのためのバイオマーカーパネルを開発した。
得られた回帰モデルは、
logit(p)=−1.97+1.7005×logTIMP1+0.93856×logLRG1+0.60639×logCA19.9
であり得、ここで、pは、所与のサンプル中に症例が存在する可能性を示す。このモデルは、ロジットリンク関数を使用する正規ロジスティック回帰モデルである。二値疾患状態(binary disease status)は、反応の役割を果たしており、マーカーは、共変量の役割を果たす。そのような回帰モデルをフィットさせるためのアルゴリズムは、標準的なものであり、一般化線形モデルの標準的なテキストで詳細に説明されている反復再加重手順に基づく(McCullogh et al.,Generalized Linear and Mixed Models(2008);Wiley Series in Probability and Statistics,John Wiley&Sons,Inc.,Hoboken,New Jersey)。しかしながら、この標準的なアプローチは、モデルフィッティングに適用されるにもかかわらず、基礎となるAUCに推論を提供し得ない。AUCを参照するp値および信頼区間を提供するために、推定される係数の変動性を考慮に入れ得るために各ブートストラップサンプル内で係数の再推定(合計で1000回)が行われるブートストラップスキームを採用した。
LeaveMOut交差検証技術を適用して、得られたロジスティック回帰モデルを検証した。PDAC症例と健康コントロールとの比較では、得られたパネルは、0.949(0.917〜0.981)のAUC(95%CI)および0.936の交差検証関連平均AUCを生じるTIMP1、LRG1およびCA19−9からなり、これは、CA19−9単独のAUC(AUC(95%CI)=0.882(0.809〜0.956))と比べて統計的に有意な程度まで大きかった(p=0.003、ブートストラップ;p<0.001、尤度比検定;表8および図3A)。このパネルは、それぞれ95%および99%の特異度で0.849および0.658の感度を生じたが、CA19−9単独の場合の95%および99%の特異度での感度は、それぞれ0.726および0.411であった。同一のバイオマーカー組合せ(TIMP1、LRG1およびCA19−9)に基づくモデルを検証セット#2で訓練し、検証セット#1において固定係数で試験した(p=0.04、訓練セットでのブートストラップ;p=0.02、試験セットでのブートストラップ;(表9))場合、PDAC症例と健康コントロールとの比較においてCA19−9単独を超える有意な改善も観察した。この結果は、腫瘍サイズが利用可能であった検証セット#2では、パネルベースのバイオマーカースコアが腫瘍サイズに対する統計的有意性と相関しなかったことも示す。理論に制限されることなく、これは、バイオマーカーの組合せの、寸法が小さい腫瘍を検出する能力を示唆する(図4)。
同一のバイオマーカー組合せ(TIMP1、LRG1およびCA19−9)に基づくロジスティック回帰モデルを開発し、PDACを良性の膵疾患症例から識別した(AUC(95%CI)=0.846(0.781〜0.911)および交差検証関連平均AUC=0.830、表8)。「OR」規則に基づく線形回帰モデルが、CA19−9単独または3種の全てのマーカーの組合せのいずれかにより、PDACと良性の膵疾患症例との間の識別を可能にすることがあるかどうかも調査した。TIMP1、LRG1およびCA19−9の「OR」規則の組合せは、0.890(0.802〜0.978)のAUC(95%CI)を生じ、これは、CA19−9単独の場合(AUC(95%CI)=0.831(0.754〜0.907)と比べて統計的に有意な程度まで大きかった(p<0.001 ブートストラップ;p<0.001、尤度比検定;表8および図3B)。
良性の膵疾患からのPDACの識別のための回帰モデルは、
logit(p)=−1.2497+0.50306×logTIMP1+0.25355×logLRG1+0.51564×logCA19.9
であり得、ここで、logは、2を底とする対数を指す。これは、ロジットリンク関数を利用し、かつ応答として二値疾患状態および共変量としてマーカーを使用することにより、正規ロジスティック回帰モデルをフィットさせることによって得られた。そのような回帰モデルをフィットさせるためのアルゴリズムは、標準的なものであり、一般化線形モデルの標準的なテキスト(McCullogh et al.,上記を参照されたい)で詳細に説明されている反復再加重手順に基づく。CA19−9単独と3種のマーカーパネルとの間のトレードオフを、グリッド検索によって変動した決定値に基づいて検討して、OR規則をさらに検討した。即ち、CA19−9のみまたは3種の全てのマーカーを通して計画行列が寄与している正規ロジスティック回帰モデルを検討した。この寄与を決定することになる閾値の点の細かいグリッドに基づいて、グリッドの全ての点に関して全てのモデルを繰り返しフィットさせた後に導き出し得る例示的なAUCを抽出した。
このパネルは、95%特異度で0.452の感度を生じ、これは、CA19−9単独の場合の95%特異度での0.288の感度を超える改善を表す。TIMP1、LRG1およびCA19−9の「OR」規則の組合せは、0.955(0.890〜1)のAUC(95%CI)を生じる、PDAC患者と健康コントロ−ルとの比較に適用した場合に高い診断制度をもたらす(p対CA19−9:p<0.001 ブートストラップ;p<0.001、尤度比検定;表8)。
Youden指数ベースの最適カットオフポイントでのオッズ比を推定した。早期PDAC症例対健康コントロールに関するモデルの場合、log(オッズ比)は、感度が0.849であり、特異度が0.950であるカットオフポイントで4.67(95%CI=3.29〜6.05)であった。早期PDAC症例対良性の膵疾患症例に関するモデルの場合、log(オッズ比)は、感度が0.863であり、特異度が0.757であるカットオフポイントで2.98(95%CI=2.04〜3.91)であった。
実施例7:バイオマーカーパネルの評価。
試験セットを使用して、3種のバイオマーカーTIMP1、LRG1およびCA19−9のパネルのさらなる盲検検証を実施した。3種の全てのバイオマーカーのレベルは、健康コントロールの場合と比べてPDAC症例において有意に高く、AUC(95%CI)は、CA19−9に関して0.821(0.736〜0.906)であり、TIMP1に関して0.730(0.626〜0.834)であり、LRG1に関して0.832(0.755〜0.909)であった(表10)。これらの3種のマーカーの線形結合により、AUC(95%CI)は0.903(0.838〜0.967)となり、これは、CA19−9単独のAUCと比べて統計的に有意な程度まで大きかった(p=0.001、ブートストラップ;p<0.001、尤度比検定;表11)。さらに、TIMP1、LRG1、CA19−9および共変量(求人センター、性別、年齢、喫煙状況およびアルコール消費で表される)の線形結合により、AUC(95%CI)は、0.929(0.878〜0.980)となり、これは、CA19−9および共変量の組合せのみ(AUC(95%CI)=0.848(0.778〜0.920)を超える統計的に有意な改善を示す(p=0.01、ブートストラップ;p<0.001、尤度比検定;表11)。共変量の包含により、3種のバイオマーカーパネルのみと比較して、性能が統計的に有意に改善された(p=0.03、ブートストラップ;p=0.004、尤度比検定;表11)。
注目すべきことに、PDAC対健康コントロールのための組み合わされた検証セットで開発された固定係数を有するCA19−9、TIMP1およびLRG1のロジスティック回帰モデルは、0.887のAUCを生じ、同様にCA19−9単独と比較して性能が統計的に有意に改善された(p=0.008、尤度比検定;表10および図5)。このモデルは、それぞれ95%および99%の特異度で0.667および0.410の感度を生じたが、CA19−9単独に関する95%および99%の特異度での感度は、それぞれ0.538および0.462であった。Youden指数ベースの最適カットオフポイントでの対数変換オッズ比は、感度が0.872であり、特異度が0.780であるカットオフポイントで3.19(95%CI=2.11〜4.26)であった。
実施例8:回帰モデルの診断スコアの範囲における特異度および感度。
様々な試薬を使用することを含み得る、バイオマーカーの検出、定量および分析の様々な方法またはアッセイは、この回帰モデルの改変を必要とする場合がある様々な結果を生じることを当業者は認識するであろう。具体的には、様々なアッセイは、例えば、様々な単位で表される結果を生じ得る。さらに、同一サンプルの二重アッセイにおける二重反応も異なる生結果を生じ得る。しかしながら、少なくとも3種のバイオマーカーTIMP1、LRG1およびCA19−9の組み合わされた検出、定量および分析は、本明細書で開示された回帰モデルに組み込まれた場合にPDACの決定的な診断をもたらす。
3種のバイオマーカーの検出、定量および分析に使用される特定の各アッセイに関して報告される結果の範囲は、感度または特異度の程度に部分的に依存する、得られたPDAC予測スコアの範囲を有する(表12;Youden Indexに基づく好ましいカットオフは、特異度が0.95であり、感度が0.8493である0.8805である)。PDAC予測スコアを生成するために使用される回帰モデルは、マーカーを試験するために利用される特定のアッセイに依存する可能性がある。当業者に理解されるように、様々なアッセイは、3種のバイオマーカーの異なるエピトープを標的とし得るか、または異なる親和性および感度を有し得る。従って、PDAC予測スコアを生成するために使用される回帰モデルアルゴリズムは、これらのアッセイ変動を考慮するために改変され得る。
実施例9:サンプルのアッセイおよびPDAC患者の診断。
一例では、本明細書で開示された3種のバイオマーカーパネルに基づいてPDACに関してスクリーニングされた患者から血液サンプル(または他の流体生検もしくは組織生検)を採取し、ELISA(または他のアッセイ)で評価して、この患者中でのTIMP1、LRG1およびCA19−9のレベルを定量した。使用される特定のアッセイ(例えば、ELISA;表3)を考慮する少なくともこれらのバイオマーカーの正規化値は、例えば、TIMP1=0.6528ng/mL;LRG1=2.0498ng/mL;およびCA19−9=1.8160U/mLであり得た。次いで、生アッセイデータをlog変換し、各コホートにおける健康サンプルに関する平均および標準偏差を算出する。次いで、健康サンプルが0の平均および1の標準偏差を有するようにデータを標準化し(Read−meanhealthy)/(stdhealthy)、ここで、jは、j番目のサンプルである。
下記の回帰モデル:
logit(p)=−1.97+1.7005×logTIMP1+0.93856×logLRG1+0.60639×logCA19.9
を使用して分析された場合、上記の患者は、2.1653の組み合わされたスコアを有することになる。特異度および感度の両方の考慮のための好ましいカットオフを考慮すると(表12)、そのような組み合わされたスコアを有する患者は、ほぼ確実にPDACを有するはずであり、その結果として、本明細書で論じたおよび当業者に既知の他のモダリティを使用するPDACの追跡試験および処置に向けられる。本明細書で説明される回帰モデルを使用すると、組み合わされたPDAC予測スコアがプラスであるほど、患者は、より確実にPDACを有する。逆に、組み合わされたPDAC予測スコアがマイナスであるほど、患者は、より確実にPDACを有しない。
対照的に、別の例では、使用される特定のアッセイを考慮するバイオマーカーTIMP1、LRG1およびCA19−9の正規化値は、例えば、TIMP1=−2.0370ng/mL;LRG1=−1.5792ng/mL;およびCA19−9=1.0712U/mLであり得た。上記と同一の回帰モデルを使用して分析した場合、そのような患者は、−6.2666の組み合わされたスコアを有することになる。特異度および感度の両方の考慮のための好ましいカットオフを考慮すると(表12)、そのような組み合わされたスコアを有する患者は、ほぼ確実にPDACを有しないはずであり、従って、続いて任意の他の臨床条件の強さに基づくさらなる試験を行っても行わなくてもよい。
実施例10:早期膵癌の検出のための血漿代謝産物マーカーおよびタンパク質マーカーを組み合わせたパネル
非標的メタボロミクスアプローチを使用して、切除可能な膵管腺癌(PDAC)のために血漿由来代謝産物バイオマーカーパネルを開発した。液体クロマトグラフィー/質量分析を使用するマルチアッセイメタボロミクスアプローチを、20例(10例の早期および10例の後期)のPDAC症例ならびに20例の対応するコントロール(10例の健康対象;10例の慢性膵炎を有する対象)から採取した血漿に適用して、PDACのための候補代謝産物マーカーを同定し、候補マーカーを、9例のPDACおよび50例の良性の膵疾患(BPD)を有する対象からなる別の「確認」コホートに基づいて絞り込んだ。39例の切除可能なPDAC症例および82例の対応するコントロールからなる独立したコホートで盲検化検証を実施した。PDACのための候補バイオマーカーマーカーとして、下記を含む5種の代謝産物:アセチルスペルミジン、ジアセチルスペルミン、リゾホスファチジルコリン(18:0)、リゾホスファチジルコリン(20:3)およびインドール誘導体を発見コホートおよび「確認」コホートで同定した。ロジスティック回帰モデルに基づいて代謝産物パネルを開発し、組み合わされた発見コホートおよび「確認」コホートにおいて、この代謝産物パネルの、健康コントロールからPDACを識別する能力に関して評価した。得られたパネルは、0.90(95%C.I.:0.818〜0.989)の曲線下面積(AUC)を生じた。この代謝産物パネルの盲検化検証では、独立した検証コホートにおいて0.89(95%C.I.:0.828〜0.956)のAUCが生じた。この代謝産物マーカーと、本発明者らが既に同定したタンパク質マーカー(CA19−9、TIMP1およびLRG1)との組合せの重要な評価では、検証コホートにおいて0.92のAUCが生じ、これは、このタンパク質パネルのみ(AUC=0.86;p−値:0.024)と比べて統計的に有意に大きく、これは、3種タンパク質マーカーパネルと組み合わせた場合のこの代謝産物パネルの相補的性質を強調する。
膵管腺癌(PDAC)は、米国において男女の両方での癌関連死亡率の3番目に主要な原因であり、全体の5年生存率、わずか約8%である。残念ながら、早期でのPDACの診断は、一般的ではなく、通常、患者の大部分(約85%)は、局所的に進行した疾患また転移性疾患を呈する偶発的なものである。
現在、無症候性個体において早期PDACに望ましい性能特性を示す臨床マーカーは存在しない。スクリーニングバイオマーカーとしてのCA19−9の現在の使用は、このCA19−9の変わりやすい精度、疾患の診断前病期での性能の低下およびフコシルトランスフェラーゼ欠乏症を有する対象の約10%で検出され得ないことにより制限される。その結果、無症候性個体での少量のPDACの確実な検出のために、より高い感度および特異度をまとめて示すさらなるマーカーが非常に必要とされている。これに関連して、血液ベースのバイオマーカーは、理想的であり、かつ早期での疾患の検出のための比較的非侵襲で費用対効果が高い方法を表す。
近年では、CA19−9を補完し得る、早期PDACの検出のためのタンパク質ベースのバイオマーカーパネルの開発およびその後の検証が実施された。分類性能は、CA19−9のみと比べて改善されたが、改善の余地が残っていた。そのため、この困難な用途に最適なバイオマーカー組合せモデルの開発を可能にするために、代謝産物等の様々な種類のバイオマーカーの相対的寄与を試験する必要がある。
本研究では、非標的メタボロミクスアプローチを適用して、PDACのための血漿由来代謝産物バイオマーカーパネルを開発した。固定されたバイオマーカーパネルを、その後、既に同定したタンパク質パネルに対する比較に加えて、39例の切除可能なPDAC症例および82例の対応する健康コントロールからなる独立した試験コホートで盲検的に検証した。この代謝産物パネルの、良性の膵嚢胞と診断された対象からPDAC症例を識別する性能をさらに試験した。
研究対象集団
全てのヒト血液サンプルをInstitutional Review Boardの承認およびインフォームドコンセント後に得た。初期の代謝産物発見研究のために、20例のPDACを有する患者(10例の早期PDACおよび10例の後期PDACを含む)、10例の健康コントロールならびに10例の慢性膵炎を有する患者からの血漿サンプルをEvanston Hospitalから得た(発見セット)。全ての慢性膵炎サンプルを、急性の再燃がない状態で診療所での選択的な設定で採取した。50例の低形成異常グレードの膵嚢胞を有する患者および9例の浸潤性IPMN(5例の早期腺癌および4例の後期腺癌)を有する患者からなる、Indiana University School of Medicineから得られた血漿サンプルをバイオマーカーの順次選択および初期検証(確認セット)に使用した。全ての患者は、嚢胞性病変の外科的切除を受け、外科手術前に血漿サンプルを採取した。形成異常グレードを外科的切除後に組織病理学的に確認し、WHO基準に従って決定した。39例の早期PDACおよび82例の健康コントロールからなる、組み合わされたバイオマーカーパネルを試験するためのさらなる独立した血漿サンプルをInternational Agency for Research on Cancerから得た(試験セット#1)。102例の低形成異常グレードの膵嚢胞を有する患者、12例の切除可能な浸潤性IPMNを有する患者およびIPMNを有する切除可能な8例のPDAC患者からなる、Indiana University School of Medicineからの別のサンプルセットを試験セット#2として適用した。この検証セットおよび試験セットにおける研究の流れ図および患者の臨床的特徴を図6ならびに表13および表14に表す。
細胞株のメタボロミック実験
PDAC細胞株(CFPAC、MiaPaCa、SU8686、BxPC3、CAPAN2、PANC03.27およびSW1990)を、10%FBSを含むRPMI−1640中で増殖させた。各細胞株の同一性を、PowerPlex 1.2キット(Promega)を使用して、mRNAおよび全タンパク質の溶解物の調製時に短いタンデム反復によるDNAフィンガープリンティングにより確認した。フィンガープリンティングの結果を、細胞株の一次供給源により維持されている参照フィンガープリントと比較した。細胞を6cmディッシュ(Thermo Scientific)に播種し、この細胞は、最初の播種から24時間後に70%(50〜80%)培養密度に達した。24時間後、細胞溶解物を、予め冷却した0.9%NaClで2回洗浄し、続いて予め冷却した抽出緩衝液(3:1イソプロパノール:超純水)1mLを添加してクエンチし、細胞培地を除去した。次いで、細胞を、抽出溶媒中で25cmセルスクレーパ(Sarstedt)を使用して掻き取り、1.5mLのエッペンドルフチューブに移した。短時間にわたりボルテックスした後、抽出された細胞溶解物を2,000×gで10分にわたり4℃において遠心分離した。その後、抽出された代謝産物を含む上清1mLを1.5mLのエッペンドルフチューブに移し、メタボロミック分析に必要とされるまで−20℃で貯蔵した。
エクソメタボローム(Exometabolome)実験
細胞を12ウェルディッシュ(Costar)中においてRPMI 1640+10%FBS 1ml中で増殖させ、この細胞は、最初の播種の24時間後に70%(50〜80%)培養密度に達した。実験当日、この細胞を、5mMグルコースおよび0.5mMグルタミンを含む血清フリーRPMI(Fisher Scientific)500μLで2回洗浄した。次いで、5mMグルコースおよび0.5mMグルタミンを含む血清フリーRPMI(300μL)を各ウェルに添加し、細胞をインキュベートした。所定のインキュベーション期間(1、2、4および6時間)後に馴化培地250μLを回収した。ベースライン(T0)のために、培地を300μL添加した直後に250μL回収した。全ての時点を三重または四重に実施した。培地のみを含むブランクサンプルを含め、T0およびT6で回収した。6時間サンプルを使用して、データ正規化のために細胞数を計数した。全ての培地サンプルを回収した時点で、チューブを10分にわたり2000×gで遠心分離して残留細片を除去し、上清を1.5mLのエッペンドルフチューブに移し、メタボロミクス分析に使用するまで−80℃で貯蔵した。
一次代謝産物および生体アミン
96ウェルマイクロプレート(Eppendorf)中において、LCMSグレードのメタノール(ThermoFisher)30μLにより、予め分注したEDTA血漿(10μL)から血清代謝産物を抽出した。プレートを加熱密封し、750rpmで5分にわたりボルテックスし、室温で10分にわたり2000×gにおいて遠心分離した。上清(10μL)を96ウェルプレートに慎重に移し、沈殿したタンパク質を残した。この上清を100mMギ酸アンモニウム(pH3)10μLでさらに希釈した。親水性相互作用液体クロマトグラフィー(HILIC)分析のために、このサンプルをLCMSグレードのアセトニトリル(ThermoFisher)60μLで希釈し、C18分析のためのサンプルを水60μL(GenPure超純水システム、ThermoFisher)で希釈した。各サンプル溶液をLCMS分析のために384ウェルマイクロプレート(Eppendorf)に移した。
細胞溶解物のために、100μL(3:1イソプロパノール:超純水)を2枚の300μLの96ウェルプレート(Eppendorf)に分注し、真空下で蒸発乾固させた。次いで、このサンプルを下記の通りに再構築した:HILICアッセイのために、乾燥させたサンプルをACN(Fisher Scientific):100mMギ酸アンモニウム(pH3)(9:1)65μLに溶解させ、逆相C18アッセイのために、乾燥させたサンプルをHO:100mMギ酸アンモニウム(pH3)(9:1)65μLに溶解させた。次いで、このサンプルを遠沈させてあらゆる不溶性物質を除去し、LCMSを使用するハイスループット分析のために384ウェルプレートに移した。
凍結培地サンプルを氷上で解凍し、30μlを、100mMギ酸アンモニウム(pH3.0)30μLが入った96ウェルマイクロプレート(Eppendorf)に移した。このマイクロプレートを加熱密封し、750rpmで5分にわたりボルテックスし、室温で10分にわたり2000×gにおいて遠心分離した。親水性相互作用液体クロマトグラフィー(HILIC)分析のために、サンプル25μLを、アセトニトリル75μLが入った新たな96ウェルプレートに移し、C18分析のためのサンプルを、水75μL(GenPure超純水システム、ThermoFisher)が入った新たな96ウェルプレートに移した。各サンプル溶液をLCMS分析のために384ウェルマイクロプレート(Eppendorf)に移した。
各バッチに関して、サンプルを無作為化し、マトリックスに適合させた参照品質コントロールおよびバッチ特異的にプールした品質コントロールを含めた。
複雑な脂質
96ウェルマイクロプレート(Eppendorf)中において、LCMSグレードの2−プロパノール(ThermoFisher)30μLにより、予め分注したEDTA血漿サンプル(10μL)を抽出した。プレートを加熱密封し、750rpmで5分にわたりボルテックスし、室温で10分にわたり2000×gにおいて遠心分離した。上清(10μL)を96ウェルプレートに慎重に移し、沈殿したタンパク質を残した。この上清を1:3:2 100mMギ酸アンモニウム(pH3)(Fischer Scientific):アセトニトリル:2−プロパノール 90μLでさらに希釈し、LCMSを使用する液体分析のために384ウェルマイクロプレート(Eppendorf)に移した。
細胞溶解物のために、300μLの96ウェルプレート中において、抽出された細胞溶解物代謝産物の上清(3:1イソプロパノール:超純水)10μLを1:3:2 100mMギ酸アンモニウム(pH3):アセトニトリル:2−プロパノール(Fisher Scientific)90μLで希釈し、LCMSを使用する分析のために384ウェルマイクロプレート(Eppendorf)に移した。
各バッチに関して、サンプルを無作為化し、マトリックスに適合させた参照品質コントロールおよびバッチ特異的にプールした品質コントロールを含めた。
一次代謝産物および生体アミンの非標的分析
Xevo G2−XS四重極飛行時間(qTOF)質量分析計に連結された2Dカラム再生構成(IクラスおよびHクラス)を有するWaters Acquity(商標)UPLCシステムで非標的メタボロミクス分析を実行した。45℃でHILIC(Acquity(商標)UPLC BEHアミド、100Å、1.7μm 2.1×100mm、Waters Corporation、Milford,U.S.A)およびC18(Acquity(商標)UPLC HSS T3、100Å、1.8μm、2.1×100mm、Water Corporation,Milford,U.S.A)カラムを使用して、クロマトグラフィー分離を実施した。
四級溶媒系移動相は、(A)水中の0.1%ギ酸、(B)アセトニトリル中の0.1%ギ酸および(D)100mMギ酸アンモニウム(pH3)であった。サンプルを、下記の勾配プロファイルを使用して分離した:HILIC分離のために、95%Bおよび5%Dの出発勾配を0.4mL/分の流速で5分間かけて70%A、25%Bおよび5%Dへ直線的に増加させ、その後、0.4mL/分の流速で100%Aにおいて1分間の定組成勾配を続けた。C18分離の場合、クロマトグラフィー勾配は、下記の通りであった:開始条件、100%A、5%A、95%Bの最終条件までの直線的な増加、その後の1分にわたる95%B、5%Dでの定組成勾配。
カラムの再生および平衡化に二成分ポンプを使用した。溶媒系移動相は、(A1)100mMギ酸アンモニウム(pH3)、(A2)2−プロパノール中の0.1%ギ酸および(B1)アセトニトリル中の0.1%ギ酸であった。HILICカラムを、5分にわたり90%A2を使用してストリップし(strip)、その後、0.3mL/分の流速で100%B1を使用して2分にわたり平衡化した。2分にわたり95%A1、5%B1を使用して逆相C18カラム再生を実施し、その後、5分にわたり5%A1、95%B1を使用してカラムを平衡化した。
複雑な脂質の非標的分析
リピドミック(lipidomic)アッセイのために、Xevo G2−XS四重極飛行時間(qTOF)質量分析計に連結された2Dカラム再生構成(IクラスおよびHクラス)を有するWaters Acquity(商標)UPLCシステムで非標的メタボロミクス分析を実行した。55℃でC18(Acquity(商標)UPLC HSS T3、100Å、1.8μm、2.1×100mm、Water Corporation,Milford,U.S.A)カラムを使用して、クロマトグラフィー分離を実施した。移動相は、(A)水、(B)アセトニトリル、(C)2−プロパノールおよび(D)500mMギ酸アンモニウム(pH3)であった。20%A、30%B、49%Cおよび1%Dの出発溶出勾配を5.5分にわたり10%B、89%Cおよび1%Dへ直線的に増加させ、その後、1.5分にわたり10%B、89%Cおよび1%Dでの定組成溶出ならびに1分にわたる最初の条件によるカラム平衡化が続いた。
質量分析データの取得
質量分析データを、一次代謝産物の場合には50〜1200Da範囲内での、および複雑な脂質の場合には100〜2000Da内での感度、正および負のエレクエトロスプレーイオン化モードで取得した。エレクエトロスプレー取得のために、キャピラリー電圧を1.5kV(正)、3.0kV(負)に設定し、30Vのサンプルコーン電圧、120℃の供給源温度、50L/時のコーンガス流、および連続モードでの0.5秒のスキャン時間を有する800L/時の脱溶媒和ガス流速に設定した。ロックスプレー補正およびスキャンのためのロイシンエンケファリン;556.2771Da(正)および554.2615Da(負)を0.5分で実施した。別途指定しない限り、各サンプルの注入量は、3μLであった。サンプル取得期間にわたり装置感度を最適化するために装置の自動利得制御により取得を実行した。
プールされた品質コントロールサンプルを規定の数のサンプル後に分析して、複製精度を評価し、注入順序によるLOESS補正を可能にした。プールされた品質コントロールサンプルに関するMSe関数を使用して、さらなるデータを取得した。
データ処理
LC−MSおよびMSeのデータのピークピッキングおよび保持時間アラインメントを、Progenesis QI(Nonlinear,Waters)を使用して実施した。データ処理およびピークアノテーションを、インハウスの自動パイプラインを使用して実施した。信頼のおける標準から作成したカスタマイズライブラリを使用して正確な質量および保持時間を一致させることにより、かつ/またはNIST MSMS、LipidBlastもしくはHMDB v3理論的断片化に対する実験に基づくタンデム質量分析データを一致させることにより、アノテーションを決定した。注入順序のドリフトを補正するために、実行シーケンスを通じて10回の注入毎に収集した品質コントロールサンプルの反復注入からのデータを使用して各特徴を正規化した。既に説明されている(1)Locally Weighted Scatterplot Smoothing (LOESS)シグナル補正(QC−RLSC)により、測定データを平滑化した。品質コントロールサンプルにおいて30未満の相対標準偏差(RSD)を示す検出された特徴のみをさらなる統計分析のために考慮した。データマトリックスの複雑さを低減するために、複数の付加物または取得モードの反復を有する注釈付きの機能を1つの代表的な固有の機能に折りたたんだ。特徴を複製精度(RSD<30)、強度、および理論的同位体分布に一致する最良の同位体類似性に基づいて選択した。所与の分析物に関する分析バッチ毎に実行された過去の品質コントロール参照サンプルの中央値に対する比として値を報告する。
酵素結合免疫吸着アッセイ
CA19−9、LRG1およびTIMP1の血漿タンパク質濃度を、既に説明されているように決定した(Capello et al.,2017)。全てのELISA実験に関して、各サンプルを二重にアッセイし、吸光度または化学発光をSpectraMax M5マイクロプレートリーダー(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)で測定した。内部コントロールサンプルを全てのプレートで流し、サンプルの各値を同一プレート中の内部コントールの平均値で除算して、内挿変動性を補正した。
遺伝子発現のデータおよびネットワーク
Badeaデータセットに関する遺伝子発現をoncomineデータベースからダウンロードした。サイトスコープを使用してネットワークを可視化した。
統計分析
受信者動作特性(ROC)曲線分析を実施して、健康コントロールおよび良性の膵疾患(慢性膵炎または膵嚢胞)と診断された対象からのPDAC症例の識別でのバイオマーカーの性能を評価した。
全てのバイオマーカーの個々の性能に対応するAUCを、受信者動作特性曲線(ROC)の経験に基づく推定量下の面積を使用して推定する。各バイオマーカーの個々の性能に関して提示された標準誤差(S.E.)および対応する95%信頼区間は、コントロールおよび罹患した1000例のブートストラップサンプルに関する別々の置き換えにより再サンプリングを実施したブートストラップ手順に基づいていた。マーカーLPC(18:0)、LPC(20:3)およびインドール−3−ラクテートの場合、これらのマーカーは、癌関連サンプルに対応する測定値と比較してコントロールに関して高い測定値を示す傾向があることから、逆方向性を考慮することに留意した。モデル構築は、ロジットリンク関数を使用するロジスティック回帰モデルに基づいていた。このモデルに対応する線形結合の経験に基づく推定量を使用することにより、提案された代謝産物パネルの推定AUC(0.9034)を導き出した。AUC(0.8180〜0.9889)に基づく代謝産物パネルに関して報告された95%信頼区間は、基礎となるロジスティック回帰モデルの係数が推定されたという事実を考慮しており、そのため、1000回の反復でブートストラップを使用することにより、全てのブートストラップ反復で適切な推論を提供するためにモデルの係数が再推定される変動性を示す。ハイパーパネル(即ち2つの基礎となるパネル(タンパク質のためのパネルおよび代謝産物のためのパネル)の組合せを指すパネル)は、固定されたそれぞれの係数を考慮して、これらの2つのパネルを2種の複合マーカー(タンパク質のための1つの複合マーカーおよび代謝産物のための1つ)として使用して開発されている。このハイパーパネルを、本発明者らがロジットリンク関数を考慮したロジスティック回帰モデルを使用して、これらの2つの基礎となる複合マーカーを組み合わせることにより開発した。
結果
膵癌代謝産物バイオマーカーの同定
非標的メタボロミクス分析を、20例のPDAC症例(10例の早期および10例の後期)ならびに20例の対応するコントロール(10例の健康対象および10例の慢性膵炎(CP)を有する対象)からなる発見コホート(セット#1)で実行した(図6)。有意なROC AUC(両側Wilcoxon順位和検定<0.05)に基づいて候補バイオマーカーを最初に選択し、91種の代謝産物が得られた(表15)。候補リストをさらに絞り込むために、メタボロミック分析を、9例のPDAC(5例の早期および4例の後期)ならびに50例の良性の膵疾患(BPD)(良性の膵嚢胞)を有する対象からなる独立した「確認」コホート(セット#2)で実行した。91種の元々の特徴のうち、16種は、有意なAUCを保持し、セット1で観察されたのと同一の相対的な変化の方向(増加/減少)を維持した(表16)。候補代謝産物をさらに洗練させて、(1)早期PDACとCPを有する対象との間で類似のレベルを示した代謝産物(片側Mann−Whitney U検定p<0.1)、および(2)CPと健康コントロールとの間で異なる代謝産物(片側Mann−Whitney U検定p<0.1)を除外した(表16)。個々の脂質種の場合、食事パターン等の外的要因に起因する非特異性を軽減するために、脂質クラス全体の中で性能特性の均一性を示す脂質を強調した(即ち、所与の脂質クラスにおいて検出された個々の脂質の>80%は、コントロールを比較して症例の一致した増加/減少を示した)(図7)。上述の基準を満たす合計5例の代謝産物を選択した。これらの5種の代謝産物は、(N1/N8)−アセチルスペルミジン(AcSperm)、ジアセチルスペルミン(DAS)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(18:0)、LPC(20:3)およびインドール誘導体であった(図8および表17)。
次に、ロジスティック回帰モデルに基づいてPDACのためのバイオマーカーパネルを開発した。セット#1および#2からのPDAC症例(n=29)を組み合わせ、セット#1からの健康対象(n=10)に対して評価した(図7)。ロジットリンク関数を組み込むロジスティック回帰モデルにより得られた推定係数を表18に示す。組み合わされたデータセットに関する5−代謝産物マーカーの個々の性能を表17に示す。PDACと健康な対象との比較において、得られたAcSperm+DAS+LPC(18:0)+LPC(20:3)+インドール誘導体のパネルは、0.90(95%C.I.=0.818〜0.989)のAUCを生じ、99%の特異度で69%の感度を示す(図9A)。BPD(慢性膵炎および低悪性度嚢胞)からのPDACの識別のための代謝産物パネルの性能は、95%の特異度で41%の感度において0.69(95%C.I.=0.557〜0.819)のAUCを生じたが、達成された最大AUCは、インドール誘導体のみで得られた(AUC=0.833)(図9B)。
切除可能なPDAC血漿サンプルの2つの独立したセットにおける代謝産物バイオマーカーパネルの試験
5種の代謝産物の盲検検証を個々におよびパネルとして39例の切除可能なPDAC症例および82例の対応する健康コントロールからなる血漿サンプルの独立したセットで実施した(試験セット#1)。5種の全てのバイオマーカーは、0.73〜0.84の範囲の個々のAUCを有する健康コントロールと比較して、PDAC症例において有意に異なっていた(片側p<0.001)(表19)。5種の全ての代謝産物は、初期コホートで観察されたものと同一の変化の方法(増加/減少)を示した。5−代謝産物パネルに関するロジスティック回帰モデルは、0.89(95%C.I.=0.828〜0.956)のAUCを生じ、95%の特異度で6%の感度を示す(図10および表19)。
個々の代謝産物およびパネルの、BPD(低悪性度嚢胞)からPDACを識別する能力を、確認セット(セット#2)と同一の研究に由来するが、別々に分析した、20例の切除可能なPDACおよび102例のPBDと診断された対象からなる別のコホート(試験セット#2)で試験した。個々の分類性能は、0.60〜0.73の範囲であった(表2)。5−代謝産物パネルに関する固定されたロジスティック回帰モデルは、0.70(95%C.I.=0.573〜0.833)のAUCを生じ、95%の特異度で15%の感度を示した(図10Bおよび表19)。
代謝産物マーカーおよびタンパク質マーカーの組合わせは、分類性能を改善する
既に早期PDACのためのタンパク質由来バイオマーカーパネルを開発し、このパネルを、本明細書で説明される同一の独立コホート(試験セット#1)で検証した。従って、代謝産物パネルおよびタンパク質パネルからなるハイパーパネルは、タンパク質パネルのみと比較して分類性能を改善するかどうかを調べた。訓練セット(29例のPDAC対10例の健康コントロール)におけるハイパーパネルのAUCは、95%CIで0.97のAUC(0.9278〜1.000)を生じた。1%のFPR値に対する代謝産物パネルのみの感度は、0.6897であると推定される。訓練セットにおけるハイパーパネルを考慮する場合、この推定値は、0.8621まで統計的に有意に改善される(対応する片側p値=0.0390)。訓練セットにおける、AUCに関するタンパク質パネル(AUC=0.95)およびハイパーパネル(AUC=0.97)の比較により、0.1074のp値が得られる(図11A)。タンパク質パネルに関する盲検検証(試験セット#1)中の対応する推定値は、0.86のAUCを生じたが、ハイパーパネルは、0.0236に等しい比較のための対応する片側p値と共に0.92のAUCを生じた(図11B)。これは、タンパク質パネルと比較してハイパーパネルの性能の全体としての統計的に有意な改善を実証し、これは、代謝産物パネルおよびタンパク質パネルが相補的であることを示す。
PDACは、アセチル化ポリアミンを分泌する
血漿AcSpermおよびDASの上昇が病状と関連しているかどうかを決定するために、5種のPDAC細胞株(CFPAC−1、MiaPaCa、SU8686、PANC03−27およびSW1990)由来の細胞溶解物および血清フリー馴化培地を分析した。細胞溶解物のメタボロミック分析により、5種の全ての細胞株におけるAcSpermおよびDASの検出可能なレベルを明らかにした。馴化培地の分析は、5種の全ての細胞株における陽性率のAcSperm蓄積を示し、5種の細胞株の3種で陽性率のDAS蓄積を観察した(図12A)。Badeaデータセットにおけるポリアミン関連酵素のmRNAの発現の調査は、隣接コントロール組織と比較してスペルミンシンターゼ(SMS)およびスペルミジン/スペルミンアセチルトランスフェラーゼ(SAT1)の有意な(対応のあるT検定)PDAC関連上昇を示したが、スペルミジンシンターゼ(SRM)、ポリアミンオキシダーゼ(PAOX)およびスペルミンオキシダーゼ(SMOX)は、有意に減少し(図11B))、これは、これらの酸化よりもむしろポリアミンのアセチル化の増加およびその後の分泌をまとめて示唆する。
PDACは、細胞外リゾホスファチジルコリンを異化する
PDAC細胞が細胞外脂質を異化する/除去するかどうかを決定するために、PANC1細胞およびSu8686細胞に由来の血清含有培地の脂質組成を馴化から24、48および72時間後に調べた。この分析は、LPC(18:0)およびLPC(20:3)(図12A)を含むいくつかのリゾリン脂質(図13)の時間依存的な減少を示した。同時に、LPCの分解生成物であるグリセロホスホコリンは、馴化培地中で時間依存的増加を示し(図12B)、これは、細胞外LPCの活発な異化をまとめて示唆する。リン脂質およびリゾリン脂質の異化に関与する酵素のmRNA発現の評価(図12C)は、Badeaデータセットにおける隣接コントロール組織と比べて、可溶性ホスホリパーゼA2−X(PLA2G10)、オートタキシン(ENPP2)およびリゾホスホリパーゼLYPLA1の有意な(両側Mann−Whitney U検定)PDAC関連の上昇を示した(図12D)。
考察
本研究の主な目的は、切除可能なPDACに関する血漿代謝産物由来バイオマーカーパネルを同定して検証することであった。非標的メタボロミクスアプローチを使用して、検証コホート(試験セット#1)において0.89のAUCを生じる健康個体から切除可能なPDAC症例を識別し得る5−マーカー代謝産物バイオマーカーパネルを同定して検証した。代謝産物および既に同定したタンパク質パネルからなるハイパーパネルは、タンパク質パネルのみと比較して分類性能を有意に改善する(AUC:0.92対0.86;p:0.024;試験セット#1)ことが同様に実証され、これは、この代謝産物パネルの相補的性質を強調する。
PDACの低い有病率を考えると、マルチマーカーシグネチャは、平均リスク集団よりもむしろ高リスク対象を標的とするスクリーニングプログラムに最も適しているはずである。これらには、真性糖尿病を新たに発症した50歳超、高リスク家族の無症候性家系、慢性膵炎を有する対象および膵臓のムチン分泌嚢胞と偶発的に診断された患者が含まれる。代謝産物−バイオマーカーパネルは、2つの別々のサンプルセットにおいて低悪性度の膵嚢胞からPDACを有意に識別し得、それぞれ検証セットおよび試験セット#2において0.69および0.70に等しいAUCを生じた。
特に、これまでの発見とは対照的に、症例と、それぞれのコントロールとの間に血漿分枝鎖アミノ酸(BCAA)の差異を観察しなかった。しかしながら、診察時に採取されたサンプル中の血漿BCAAに差異がないという観察と一致して、BCAAの予測値は、診断から2〜5年前に最も顕著であり、診断の0〜2年前にレベルは、ベースラインに戻ることに注目すべきである。
ポリアミン代謝の変化は、腫瘍形成および過剰増殖性障害と長く関連しており、細胞周期の進行に密接に関与している。ポリアミン合成は、律速酵素ODC1およびAMD1により調節されるのに対して、それらの異化作用は、SAT1により調節される。これまでの発見は、組織学的に影響を受けない膵臓と比較して膵癌におけるプトレシンおよびAcSpermの存在量の増加を示した。反対に、健康コントロールと比較して、AcSpermを含む多くのポリアミンが症例の血清中で上昇していることが既に発見された。これらの発見は、Badeaデータセットにおける隣接コントロール組織と比較したPDAC中のSAT1のmRNA発現の上昇、ならびに細胞溶解物中でのAcSpermおよびDASの検出、ならびにそれらの馴化培地中での同時蓄積と一致している(図11)。本研究および他の研究で説明されている発見は、PDACを有する対象の血漿に反映されている概念であるポリアミン異化の増幅を示す。特に、DASの上昇は、膵癌にのみ起因するのではなく、これは、癌のスクリーニングマーカーとしてのより広い有用性におけるより一般的な役割を本質的に示唆する。
これまでの研究は、本研究の発見と一致して、血漿LPCが、健康コントロールまたは慢性膵炎を有する対象と比較してPDAC中で有意に低いことを示した。細胞株データは、PDAC細胞がBadeaデータセット中の遺伝子発現データにより支持される概念であるリゾリン脂質を異化し(図12)、それによりPDAC対象中での血漿LPCの観察された減少の妥当性がもたらされることを示した。それにもかかわらず、PDAC単独では、特に疾患の早期では、血漿LPCレベルの低下が完全には説明され得ない。脂質代謝を調節する重要な器官である肝臓への転移は、膵癌の早期で起こることが示されている。そのため、血漿LPCの減少は、癌性細胞による異化の増加と、疾患と同時に起こる肝機能の変化との両方を反映し得ることが有力であり、この概念は、現在の研究とは無関係にさらなる調査を必要とするであろう。
結論として、早期PDACのための代謝産物由来バイオマーカーパネルを開発し、既に同定されたタンパク質ベースのバイオマーカーパネルを補完することを検証した。
他の実施形態
上記の詳細な説明は、本開示の実施において当業者を補助するために提供される。しかしながら、本明細書で説明されかつ特許請求された開示は、本明細書で開示された具体的な実施形態により範囲が限定されるべきではなく、なぜなら、この実施形態は、本開示のいくつかの態様の例示として意図されているからである。あらゆる均等な実施形態が本開示の範囲内であることが意図されている。実際には、本開示の様々な改変形態は、本明細書で示されかつ説明されたものに加えて、本発明の発見の趣旨または範囲から逸脱しない上述の説明から当業者に明らかになるであろう。そのような改変形態も添付の特許請求の範囲に含まれることが意図されている。

Claims (81)

  1. 膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、
    前記患者から生体サンプルを得ること、
    前記生体サンプル中のCA19−9抗原のレベルを測定すること、
    前記生体サンプル中のTIMP1抗原のレベルを測定すること、
    前記生体サンプル中のLRG1抗原のレベルを測定すること
    を含み、
    CA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原の量は、前記患者を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないと分類する、方法。
  2. 膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、
    前記患者から生体サンプルを得ること、
    前記サンプルを、CA19−9抗原に結合する第1のレポーター分子と接触させること、
    前記サンプルを、TIMP1抗原に結合する第2のレポーター分子と接触させること、
    前記サンプルを、LRG1抗原に結合する第3のレポーター分子と接触させること
    を含み、
    前記第1のレポーター分子、前記第2のレポーター分子および前記第3のレポーター分子の量は、前記患者を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないと分類する、方法。
  3. 膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、
    前記患者から生体サンプルを得ること、
    CA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原に結合するための手段を有する表面を提供すること、
    前記生体サンプルと共に前記表面をインキュベートすること、
    前記表面を、CA19−9抗原に結合する第1のレポーター分子と接触させること、
    前記表面を、TIMP1抗原に結合する第2のレポーター分子と接触させること、
    前記表面を、LRG1抗原に結合する第3のレポーター分子と接触させること、
    前記表面と会合している前記第1のレポーター分子の量を測定すること、
    前記表面と会合している前記第2のレポーター分子の量を測定すること、
    前記表面と会合している前記第3のレポーター分子の量を測定すること
    を含み、
    前記第1のレポーター分子、前記第2のレポーター分子および前記第3のレポーター分子の前記量は、前記患者を膵管腺癌に対して感受性であるか、または疾患に対して感受性ではないと分類する、方法。
  4. 膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、
    前記患者から生体サンプルを得ること、
    CA19−9抗原に結合するための手段を有する第1の表面を提供すること、
    TIMP1抗原に結合するための手段を有する第2の表面を提供すること、
    LRG1抗原に結合するための手段を有する第3の表面を提供すること、
    前記生体サンプルと共に前記第1の表面をインキュベートすること、
    前記生体サンプルと共に前記第2の表面をインキュベートすること、
    前記生体サンプルと共に前記第3の表面をインキュベートすること、
    前記第1の表面を、CA19−9抗原に結合する第1のレポーター分子と接触させること、
    前記第2の表面を、TIMP1抗原に結合する第2のレポーター分子と接触させること、
    前記第3の表面を、LRG1抗原に結合する第3のレポーター分子と接触させること、
    前記第1の表面と会合している前記第1のレポーター分子の量を測定すること、
    前記第2の表面と会合している前記第2のレポーター分子の量を測定すること、
    前記第3の表面と会合している前記第3のレポーター分子の量を測定すること
    を含み、
    前記第1のレポーター分子、前記第2のレポーター分子および前記第3のレポーター分子の前記量は、前記患者を膵管腺癌に対して感受性であるか、または疾患に対して感受性ではないと分類する、方法。
  5. 膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、
    前記患者から生体サンプルを得ること、
    CA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原に結合するための手段を有する表面を提供すること、
    前記生体サンプルと共に前記表面をインキュベートすること、
    前記表面を、CA19−9抗原に結合する第1のリレー分子と接触させること、
    前記表面を、TIMP1抗原に結合する第2のリレー分子と接触させること、
    前記表面を、LRG1抗原に結合する第3のリレー分子と接触させること、
    前記表面を、前記第1のリレー分子に結合する第1のレポーター分子と接触させること、
    前記表面を、前記第2のリレー分子に結合する第2のレポーター分子と接触させること、
    前記表面を、前記第3のリレー分子に結合する第3のレポーター分子と接触させること、
    前記第1のリレー分子およびCA19−9抗原と会合している前記第1のレポーター分子の量を測定すること、
    前記第2のリレー分子およびTIMP1抗原と会合している前記第2のレポーター分子の量を測定すること、
    前記第3のリレー分子およびLRG1抗原と会合している前記第3のレポーター分子の量を測定すること
    を含み、
    前記第1のレポーター分子、前記第2のレポーター分子および前記第3のレポーター分子の前記量は、前記患者を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないと分類する、方法。
  6. 膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、
    前記患者から生体サンプルを得ること、
    CA19−9抗原に結合するための手段を有する第1の表面を提供すること、
    TIMP1抗原に結合するための手段を有する第2の表面を提供すること、
    LRG1抗原に結合するための手段を有する第3の表面を提供すること、
    前記生体サンプルと共に前記第1の表面をインキュベートすること、
    前記生体サンプルと共に前記第2の表面をインキュベートすること、
    前記生体サンプルと共に前記第3の表面をインキュベートすること、
    前記第1の表面を、CA19−9抗原に結合する第1のリレー分子と接触させること、
    前記第2の表面を、TIMP1抗原に結合する第2のリレー分子と接触させること、
    前記第3の表面を、LRG1抗原に結合する第3のリレー分子と接触させること、
    前記第1の表面を、前記第1のリレー分子に結合する第1のレポーター分子と接触させること、
    前記第2の表面を、前記第2のリレー分子に結合する第2のレポーター分子と接触させること、
    前記第3の表面を、前記第3のリレー分子に結合する第3のレポーター分子と接触させること、
    前記第1のリレー分子およびCA19−9抗原と会合している前記第1のレポーター分子の量を測定すること、
    前記第2のリレー分子およびTIMP1抗原と会合している前記第2のレポーター分子の量を測定すること、
    前記第3のリレー分子およびLRG1抗原と会合している前記第3のレポーター分子の量を測定すること
    を含み、
    前記第1のレポーター分子、前記第2のレポーター分子および前記第3のレポーター分子の前記量は、前記患者を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないと分類する、方法。
  7. 前記表面の少なくとも1つは、CA19−9、TIMP1およびLRG1からなる群から選択される抗原に選択的に結合する少なくとも1つのレセプター分子を含む、請求項3〜6のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記表面の少なくとも1つは、固体粒子の表面である、請求項3〜6のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記固体粒子は、ビーズである、請求項8に記載の方法。
  10. 前記レポーター分子の少なくとも1つは、酵素に連結されている、請求項2〜6のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記第1のレポーター分子の少なくとも1つは、検出可能なシグナルを生成する、請求項2〜6のいずれか一項に記載の方法。
  12. 検出可能なシグナルは、分光測定法によって検出可能である、請求項11に記載の方法。
  13. 前記分光測定法は、質量分析法である、請求項12に記載の方法。
  14. 前記第1のレポーター分子は、CA19−9抗原に選択的に結合する、請求項2〜4のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記第2のレポーター分子は、TIMP1抗原に選択的に結合する、請求項2〜4のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記第3のレポーター分子は、LRG1抗原に選択的に結合する、請求項2〜4のいずれか一項に記載の方法。
  17. 膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、
    前記患者から生体サンプルを得ること、
    前記生体サンプルをCA19−9抗体と接触させ、かつ前記抗原と前記抗体との間の結合を観察することにより、前記生体サンプル中のCA19−9抗原のレベルを測定すること、
    前記生体サンプルをTIMP1抗体と接触させ、かつ前記抗原と前記抗体との間の結合を観察することにより、前記生体サンプル中のTIMP1抗原のレベルを測定すること、
    前記生体サンプルをLRG1抗体と接触させ、かつ前記抗原と前記抗体との間の結合を観察することにより、前記生体サンプル中のLRG1抗原のレベルを測定すること、
    CA19−9、TIMP1およびLRG1レベルの測定値によって決定されるように、前記患者の状態を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないかのいずれかに割り当てること
    を含む方法。
  18. 膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、
    前記患者から生体サンプルを得ること、
    前記生体サンプル中のCA19−9抗原のレベルを測定すること、
    前記生体サンプル中のTIMP1抗原のレベルを測定すること、
    前記生体サンプル中のLRG1抗原のレベルを測定すること、
    第1の標準値と比較してCA19−9抗原のレベルを決定することであって、比は、膵管腺癌を予測する、決定すること、
    第2の標準値と比較してTIMP1抗原のレベルを決定することであって、比は、膵管腺癌を予測する、決定すること、
    第3の標準値と比較してLRG1抗原のレベルを決定することであって、比は、膵管腺癌を予測する、決定すること、および
    CA19−9、TIMP1およびLRG1レベルの前記比の統計分析によって決定されるように、前記患者の状態を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないかのいずれかに割り当てること
    を含む方法。
  19. 膵管腺癌に対する患者の感受性を予測する方法であって、
    前記患者から生体サンプルを得ること、
    前記生体サンプル中のCA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原のレベルを測定すること、および
    前記CA19−9、TIMP1およびLRG1レベルの統計分析によって決定されるように、予測因子を算出すること
    を含む方法。
  20. 膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、
    前記患者から生体サンプルを得ること、
    前記生体サンプル中のCA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原のレベルを測定すること、および
    前記生体サンプル中の前記CA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原のレベルの統計分析によって決定されるように、前記患者の状態を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないかのいずれかに割り当てること
    を含む方法。
  21. 患者から得られた生体サンプルを使用して、膵管腺癌に対する感受性を検出する方法であって、
    前記生体サンプル中に存在するCA19−9抗原のレベルに関して、前記CA19−9抗原に特異的な少なくとも1つの抗体または抗体画分を使用してアッセイすること、および
    前記生体サンプル中に存在するTIMP1抗原のレベルに関して、前記TIMP1抗原に特異的な少なくとも1つの抗体または抗体画分を使用してアッセイすること、および
    前記生体サンプル中に存在するLRG1抗原のレベルに関して、前記LRG1抗原に特異的な少なくとも1つの抗体または抗体画分を使用してアッセイすること、および
    前記CA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原の前記レベルが、膵管腺癌を有する前記患者の指標であるかどうかを決定すること
    を含む方法。
  22. 膵管腺癌に対する感受性を検出する方法であって、
    対象から生体サンプルを得ること、
    抗CA19−9抗体またはその抗原結合断片による前記サンプルへのイムノアッセイを実施すること、
    抗LRG1抗体またはその抗原結合断片による前記サンプルへのイムノアッセイを実施すること、
    抗TIMP1抗体またはその抗原結合断片による前記サンプルへのイムノアッセイを実施すること
    を含み、
    前記抗体の結合は、前記対象中での膵管腺癌の指標であり、かつ前記イムノアッセイは、早期膵管腺癌を検出し得る、方法。
  23. 膵管腺癌に対する感受性を検出する方法であって、
    個体から生体サンプルを得ること、
    抗CA19−9抗体またはその抗原結合断片によるイムノアッセイを実施すること、
    抗LRG1抗体またはその抗原結合断片によるイムノアッセイを実施すること、
    抗TIMP1抗体またはその抗原結合断片によるイムノアッセイを実施すること、
    CA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原のレベルが、膵管腺癌を有する患者の指標であるかどうかを決定すること
    を含む方法。
  24. CA19−9、LRG1およびTIMP1レベルの決定は、実質的に同時に行われる、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
  25. CA19−9、LRG1およびTIMP1レベルの決定は、段階的に行われる、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
  26. 膵管腺癌を有するか、または膵管腺癌を有しないという割り当てへの患者の病歴情報の包含を含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
  27. 膵管腺癌を有すると割り当てられた患者に少なくとも1つの代替診断試験を施すことを含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記少なくとも1つの代替診断試験は、少なくとも1つのctDNAのアッセイまたは配列決定を含む、請求項27に記載の方法。
  29. 請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法のためのキットであって、
    CA19−9抗原の検出のための第1の溶質、
    LRG1抗原の検出のための第2の溶質、および
    TIMP1抗原の検出のための第3の溶質
    を含む試薬溶液を含むキット。
  30. 請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法のためのキットであって、
    CA19−9抗原の検出のための第1の溶質を含む第1の試薬溶液、
    LRG1抗原の検出のための第2の溶質を含む第2の試薬溶液、および
    TIMP1抗原の検出のための第3の溶質を含む第3の試薬溶液
    を含むキット。
  31. 前記試薬溶液を生体サンプルと接触させるためのデバイスを含む、請求項29または30に記載のキット。
  32. 少なくとも1つの抗原に結合するための手段を有する少なくとも1つの表面を含む、請求項29または30に記載のキット。
  33. 前記少なくとも1つの抗原は、CA19−9、LRG1およびTIMP1からなる群から選択される、請求項32に記載のキット。
  34. 前記少なくとも1つの表面は、ctDNAに結合するための手段を含む、請求項33に記載のキット。
  35. 前記生体サンプル中の(N1/N8)−アセチルスペルミジン(AcSperm)のレベルを測定すること、
    前記生体サンプル中のジアセチルスペルミン(DAS)のレベルを測定すること、
    前記生体サンプル中のリゾホスファチジルコリン(LPC)(18:0)のレベルを測定すること、
    前記生体サンプル中のリゾホスファチジルコリン(LPC)(20:3)のレベルを測定すること、および
    前記生体サンプル中のインドール誘導体のレベルを測定すること
    をさらに含み、
    (N1/N8)−アセチルスペルミジン(AcSperm)、ジアセチルスペルミン(DAS)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(18:0)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(20:3)および前記インドール誘導体の量は、前記患者を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないと分類する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
  36. 膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、
    前記患者から生体サンプルを得ること、
    前記生体サンプル中の(N1/N8)−アセチルスペルミジン(AcSperm)のレベルを測定すること、
    前記生体サンプル中のジアセチルスペルミン(DAS)のレベルを測定すること、
    前記生体サンプル中のリゾホスファチジルコリン(LPC)(18:0)のレベルを測定すること、
    前記生体サンプル中のリゾホスファチジルコリン(LPC)(20:3)のレベルを測定すること、および
    前記生体サンプル中のインドール誘導体のレベルを測定すること
    を含み、
    (N1/N8)−アセチルスペルミジン(AcSperm)、ジアセチルスペルミン(DAS)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(18:0)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(20:3)および前記インドール誘導体の量は、前記患者を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないと分類する、方法。
  37. 血漿由来バイオマーカーパネルおよびタンパク質マーカーパネルを含む、膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、
    前記血漿由来バイオマーカーパネルは、(N1/N8)−アセチルスペルミジン(AcSperm)、ジアセチルスペルミン(DAS)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(18:0)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(20:3)およびインドール誘導体を含み、
    前記タンパク質バイオマーカーパネルは、CA19−9、LRG1およびTIMP1を含み、
    前記方法は、
    前記患者から生体サンプルを得ること、
    前記生体サンプル中の前記血漿由来バイオマーカーおよび前記タンパク質バイオマーカーのレベルを測定すること
    を含み、
    前記血漿由来バイオマーカーおよび前記タンパク質バイオマーカーの量は、前記患者を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないと分類する、方法。
  38. 1つまたは複数のタンパク質バイオマーカーおよび1つまたは複数の代謝産物マーカーのレベルを決定することを含む、膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、
    前記患者から生体サンプルを得ること、
    前記サンプルを、CA19−9抗原に結合する第1のレポーター分子と接触させること、
    前記サンプルを、TIMP1抗原に結合する第2のレポーター分子と接触させること、
    前記サンプルを、LRG1抗原に結合する第3のレポーター分子と接触させること、および
    前記1つまたは複数のバイオマーカーの前記レベルを決定することであって、前記1つまたは複数のバイオマーカーは、(N1/N8)−アセチルスペルミジン(AcSperm)、ジアセチルスペルミン(DAS)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(18:0)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(20:3)およびインドール誘導体からなる群から選択される、決定すること
    を含み、
    前記第1のレポーター分子、前記第2のレポーター分子、前記第3のレポーター分子および前記1つまたは複数のバイオマーカーの量は、前記患者を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないと分類する、方法。
  39. 膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、
    前記患者から生体サンプルを得ること、
    前記生体サンプル中のCA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原のレベルを測定すること、および
    前記生体サンプル中の、(N1/N8)−アセチルスペルミジン(AcSperm)、ジアセチルスペルミン(DAS)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(18:0)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(20:3)およびインドール誘導体からなる群から選択される1つまたは複数の代謝産物マーカーのレベルを測定すること、
    前記生体サンプル中のCA19−9抗原、TIMP1抗原、LRG1抗原、(N1/N8)−アセチルスペルミジン(AcSperm)、ジアセチルスペルミン(DAS)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(18:0)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(20:3)および前記インドール誘導体の前記レベルの統計的分析によって決定されるように、前記患者の状態を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないかのいずれかに割り当てること
    を含む方法。
  40. 膵管腺癌に対して感受性の疑いがある患者を処置する方法であって、
    前記患者を、請求項36〜39のいずれか一項に記載の方法により、膵管腺癌に対する感受性に関して分析すること、
    前記腺癌に対して治療上有効な量の処置を施すこと
    を含む方法。
  41. 前記処置は、外科手術、化学療法、放射線療法、標的療法またはこれらの組合せである、請求項40に記載の処置する方法。
  42. CA19−9、TIMP1およびLRG1からなる群から選択される抗原に選択的に結合する少なくとも1つのセレプター分子を含む、請求項36〜40のいずれか一項に記載の方法。
  43. CA19−9、TIMP1、LRG、(N1/N8)−アセチルスペルミジン(AcSperm)、ジアセチルスペルミン(DAS)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(18:0)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(20:3)または前記インドール誘導体の前記量の検出は、固体粒子の使用を含む、請求項36〜40のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記固体粒子は、ビーズである、請求項43に記載の方法。
  45. 前記レポーター分子の少なくとも1つは、酵素に連結されている、請求項36〜40のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記タンパク質マーカーまたは代謝産物マーカーの少なくとも1つは、検出可能なシグナルを生成する、請求項36〜40のいずれか一項に記載の方法。
  47. 検出可能なシグナルは、分光測定法によって検出可能である、請求項36〜40のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記分光測定法は、質量分析法である、請求項47に記載の方法。
  49. 膵管腺癌を有するか、または膵管腺癌を有しないという割り当てへの患者の病歴情報の包含を含む、請求項36〜40のいずれか一項に記載の方法。
  50. 膵管腺癌を有すると割り当てられた患者に少なくとも1つの代替診断試験を施すことを含む、請求項36〜40のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記少なくとも1つの代替診断試験は、少なくとも1つのctDNAのアッセイまたは配列決定を含む、請求項50に記載の方法。
  52. 請求項36〜40のいずれか一項に記載の方法のためのキットであって、
    CA19−9抗原の検出のための第1の溶質、
    LRG1抗原の検出のための第2の溶質、
    TIMP1抗原の検出のための第3の溶質、
    (N1/N8)−アセチルスペルミジン(AcSperm)の検出のための第4の溶質、
    ジアセチルスペルミン(DAS)の検出のための第5の溶質、
    リゾホスファチジルコリン(LPC)(18:0)の検出のための第6の溶質、
    リゾホスファチジルコリン(LPC)(20:3)の検出のための第7の溶質、および
    前記インドール誘導体の検出のための第8の溶質
    を含む試薬溶液を含むキット。
  53. 請求項36〜40のいずれか一項に記載の方法のためのキットであって、
    CA19−9抗原の検出のための第1の溶質を含む第1の試薬溶液、
    LRG1抗原の検出のための第2の溶質を含む第2の試薬溶液、
    TIMP1抗原の検出のための第3の溶質を含む第3の試薬溶液、
    (N1/N8)−アセチルスペルミジン(AcSperm)の検出のための第4の溶質を含む第4の試薬溶液、
    ジアセチルスペルミン(DAS)の検出のための第5の溶質を含む第5の試薬溶液、
    リゾホスファチジルコリン(LPC)(18:0)の検出のための第6の溶質を含む第6の試薬溶液、
    リゾホスファチジルコリン(LPC)(20:3)の検出のための第7の溶質を含む第7の試薬溶液、および
    前記インドール誘導体の検出のための第8の溶質を含む第8の試薬溶液
    を含むキット。
  54. 前記試薬溶液を生体サンプルと接触させるためのデバイスを含む、請求項52または53に記載のキット。
  55. 少なくとも1つの抗原に結合するための手段を有する少なくとも1つの表面を含む、請求項52または53に記載のキット。
  56. 前記少なくとも1つの抗原は、CA19−9、LRG1およびTIMP1からなる群から選択される、請求項55に記載のキット。
  57. 前記少なくとも1つの表面は、ctDNAに結合するための手段を含む、請求項55に記載のキット。
  58. 患者の膵管腺癌(PDAC)の処置またはその悪化の予防の方法であって、前記患者におけるCA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原のレベルは、前記患者を、PDACを有するか、またはPDACに対して感受性であると分類し、前記方法は、
    i.PDACを有する前記患者に化学療法剤を投与すること、
    ii.PDACを有する前記患者に治療放射線を投与すること、および
    iii.PDACを有する前記患者の癌性組織の部分的または完全な外科的切除のための外科手術
    の1つまたは複数を含む、方法。
  59. 前記CA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原のレベルは、上昇している、請求項58に記載の方法。
  60. 前記CA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原のレベルは、PDACを有しない参照患者または参照群でのCA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原のレベルと比較して上昇している、請求項58に記載の方法。
  61. 前記参照患者または参照群は、健康である、請求項60に記載の方法。
  62. AUC(95%CI)は、少なくとも0.850である、請求項58に記載の方法。
  63. AUC(95%CI)は、少なくとも0.900である、請求項58に記載の方法。
  64. 前記患者のPDACを有するとの分類は、それぞれ95%および99%の特異度で0.849および0.658の感度を有する、請求項58に記載の方法。
  65. 前記CA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原のレベルは、慢性膵炎を有する参照患者または参照群でのCA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原のレベルと比較して上昇している、請求項58に記載の方法。
  66. 前記CA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原のレベルは、良性の膵疾患を有する参照患者または参照群でのCA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原のレベルと比較して上昇している、請求項58に記載の方法。
  67. AUC(95%CI)は、少なくとも0.850である、請求項66に記載の方法。
  68. AUC(95%CI)は、少なくとも0.900である、請求項66に記載の方法。
  69. 前記患者のPDACを有するとの分類は、それぞれ95%および99%の特異度で0.849および0.658の感度を有する、請求項58に記載の方法。
  70. 前記PDACは、切除可能境界病期においてまたはその前に診断されている、請求項58に記載の方法。
  71. 前記PDACは、切除可能病期で診断されている、請求項58に記載の方法。
  72. 患者の膵管腺癌(PDAC)の処置またはその悪化の予防の方法であって、前記患者におけるCA19−9抗原、TIMP1抗原、LRG1、N1/N8)−アセチルスペルミジン(AcSperm)、ジアセチルスペルミン(DAS)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(18:0)、リゾホスファチジルコリン(LPC)(20:3)およびインドール誘導体のレベルは、前記患者を、PDACを有するか、またはPDACに対して感受性であると分類し、前記方法は、
    i)PDACを有する前記患者に化学療法剤を投与すること、
    ii)PDACを有する前記患者に治療放射線を投与すること、および
    iii)PDACを有する前記患者の癌性組織の部分的または完全な外科的切除のための外科手術
    の1つまたは複数を含む、方法。
  73. 前記CA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原のレベルは、上昇している、請求項72に記載の方法。
  74. 前記CA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原のレベルは、PDACを有しない参照患者または参照群でのCA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原のレベルと比較して上昇している、請求項72に記載の方法。
  75. 前記参照患者または参照群は、健康である、請求項72に記載の方法。
  76. 前記CA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原のレベルは、慢性膵炎を有する参照患者または参照群でのCA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原のレベルと比較して上昇している、請求項72に記載の方法。
  77. 前記CA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原のレベルは、良性の膵疾患を有する参照患者または参照群でのCA19−9抗原、TIMP1抗原およびLRG1抗原のレベルと比較して上昇している、請求項72に記載の方法。
  78. 前記患者は、PDACのリスクが高い、請求項72に記載の方法。
  79. 前記患者は、真性糖尿病が新たに発症した50歳超であるか、慢性膵炎を有するか、膵臓のムチン分泌嚢胞と偶然に診断されているか、または前記高リスク群の1つの無症候性家系である、請求項58〜78のいずれか一項に記載の方法。
  80. 膵管腺癌に対する感受性の疑いがある患者を処置する方法であって、
    前記患者を、請求項1〜79のいずれか一項に記載の方法により、膵管腺癌に対する感受性に関して分析すること、
    前記腺癌に対して治療上有効な量の処置を施すこと
    を含む方法。
  81. 前記処置は、外科手術、化学療法、放射線療法、標的療法またはこれらの組合せである、請求項80に記載の処置する方法。
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