KR20190101395A - 췌관 선암종의 검출 및 치료를 위한 방법 - Google Patents

췌관 선암종의 검출 및 치료를 위한 방법 Download PDF

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Abstract

초기 병기의 췌관 선암종의 검출을 위한 방법 및 관련 키트를 제공한다. 또한 췌관 선암종에 감수성이거나, 또는 감수성으로 의심되는 환자를 치료하기 위한 방법이 제공된다.

Description

췌관 선암종의 검출 및 치료를 위한 방법
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 미국 가출원 제62/435,024호, 및 미국 가출원 제62/435,020호의 이득을 청구하고, 이들 2개 출원은 모두 2016년 12월 15일 출원되었고, 이의 개시 내용은 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입된다.
연방 정부 지원 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명은 미국 국립 보건원이 수여하는 보조금 번호 R03 CA123546 하의 정부 지원으로 수행되었다. 정부는 본 발명의 일정 권리를 갖는다.
췌관 선암종 (PDAC)은 5년 생존율이 단지 8%에 불과하고 사망률이 발병률에 가까이 접근하는 가장 치명적인 유형의 암 중 하나이다. 절제가능한 PDAC는 더 양호한 생존율과 관련되지만, PDAC 환자의 오직 15 내지 20%만이 국부 질환으로 존재한다. 영상화 형태, 특히 내시경 초음파 및 자기 공명 자기 공명 췌담도조영술이 PDAC가 의심되거나 또는 이 질환에 대한 높은 위험성이 의심되는 대상체의 워크업에서 현재 사용된다. 그러나, 공지된 위험 인자는 PDAC 발병에 대해 오직 미미한 효과를 갖는다.
암 항원 (Cancer Antigen) 19-9 (CA19-9)는 PDAC 바이오마커로서 현재 임상적으로 사용되고 있다. CA19-9는 전임상 및 초기 단계 PDAC에 대한 진단 바이오마커로서 잠재성을 보여주었다 (Riker et al., Surgical Oncology 6:157-69, 1998). 그러나, CA19-9 단독은 초기 단계 질환에 대한 바이오마커로서 제한된 성능을 갖는다: 췌장암 환자의 75% 미만은 상승된 CA19-9를 갖고, 많은 양성 질병은 상승된 CA19-9 수준을 야기할 수 있다. 게다가, CA19-9는 루이스식 혈액형의 항원을 합성하는 푸코실트랜스퍼라제 결핍 및 불능인 환자의 5 내지 10%에서는 검출불가능하다. 이와 같이, PDAC를 갖는 것으로 부정확하게 확인된 개체를 비롯하여, PDAC를 갖지 않는 것으로 부정확하게 확인된 개체의 비율은 진단 도구로서 CA19-9 단독에 대한 의존성때문에 허용불가하게 높다.
늦은 진단, 증가하는 발병률 및 제한된 치료 수단에 기인하여, PDAC는 암-관련 사망의 주요 원인이 되고 있다. 이 질환이 일반적으로 대부분의 환자에서 후기 단계에 진단되고, 자립형 바이오마커로서 CA19-9의 사용이 명확하게 부적절하다는 것을 고려하여, 초기 단계에 췌장암의 검출을 위한 검사를 개발하려는 요구가 존재한다.
본 개시 내용은 췌장암의 조기 검출을 위한 방법 및 키트를 제공한다. 이 방법 및 키트는 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 내에 함유된 바이오마커의 다수 어세이를 사용한다. 적어도 3종 바이오마커: 탄수화물 항원 19-9 (CA19-9), TIMP 메탈로펩티다제 억제제 1 (TIMP1), 및 류신-풍부 알파-2-당단백질 1 (LRG1)의 조합 분석은 기지 상태를 갖는 코호트에 대한 스크리닝시 PDAC의 고정밀 진단을 제공한다.
일부 실시형태에서, 바이오마커 CA19-9, TIMP1, 및 LRG1의 분석은 추가의 바이오마커의 분석과 조합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 추가의 바이오마커는 단백질 바이오마커일 수 있다. 일부 실시형태에서, 추가의 단백질 바이오마커는 ALCAM, CHI3L1, COL18A1, IGFBP2, LCN2, LYZ, PARK7, REG3A, SLPI, THBS1, TNFRSF1A, WFDC2, 및 이의 임의의 조합으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 추가의 바이오마커는 비-단백질 바이오마커일 수 있다. 일부 실시형태에서, 비-단백질 바이오마커는 순환성 종양 DNA (ctDNA)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법은 생물학적 샘플 중 (N1/N8)-아세틸스퍼미딘 (AcSperm)의 수준을 측정하는 단계; 생물학적 샘플 중 디아세틸스퍼민 (DAS)의 수준을 측정하는 단계; 생물학적 샘플 중 리소포스파티딜콜린 (LPC) (18:0)의 수준을 측정하는 단계; 생물학적 샘플 중 리소포스파티딜콜린 (LPC) (20:3)의 수준을 측정하는 단계; 및 생물학적 샘플 중 인돌-유사체의 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있고; (N1/N8)-아세틸스퍼미딘 (AcSperm), 디아세틸스퍼민 (DAS), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (18:0), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (20:3), 및 인돌-유사체의 양은 환자를 췌관 선암종에 감수성이거나 또는 췌장 선암종에 감수성이 아닌 것으로 분류한다.
회귀 모델은 대상체 유래 생물학적 샘플에 존재하는 CA19-9, TIMP1, 및 LRG1의 수준을 기반으로 대상체에 대한 PDAC 상태를 예측할 수 있는 것으로 확인되었다.
일부 실시형태에서, 바이오마커는 환자로부터 추출된 혈액 샘플에서 측정된다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플 중 바이오마커의 존재 또는 부재를 결정할 수 있다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플 중 바이오마커의 수준을 정량할 수 있다.
일부 실시형태에서, 표면이 생물학적 샘플을 분석하기 위해 제공된다. 일부 실시형태에서, 관심 바이오마커는 표면 상에 비특이적으로 흡착된다. 일부 실시형태에서, 관심 바이오마커에 특이적인 수용체가 표면 상에 도입된다.
일부 실시형태에서, 표면은 입자, 예를 들어 비드와 회합된다. 일부 실시형태에서, 표면은 동시 측정을 촉진하도록 다중-웰 플레이트에 함유된다.
일부 실시형태에서, 다수 표면이 바이오마커의 동시 평가를 위해 제공된다. 일부 실시형태에서, 다수 표면은 단일 장치, 예를 들어 96웰 플레이트 상에 제공된다. 일부 실시형태에서, 다수 표면은 바이오마커의 동시 측정을 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 단일 생물학적 샘플이 복수개의 표면에 순차적으로 적용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 복수개의 표면에 동시 적용을 위해 분배된다.
일부 실시형태에서, 바이오마커는 특정한 수용체 분자에 결합하고, 바이오마커-수용체 복합체의 존재 또는 부재를 결정할 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오마커-수용체 복합체의 양을 정량할 수 있다. 일부 실시형태에서, 수용체 분자는 검출 및 정량을 촉진하기 위해 효소에 연결된다.
일부 실시형태에서, 바이오마커는 특정한 릴레이 분자에 결합하고, 이후에 바이오마커-릴레이 분자 복합체는 수용체 분자에 결합한다. 일부 실시형태에서, 바이오마커-릴레이-수용체 복합체의 존재 또는 부재를 결정할 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오마커-릴레이-수용체 복합체의 양을 정량할 수 있다. 일부 실시형태에서, 수용체 분자는 검출 및 정량을 촉진하기 위해 효소에 연결된다. 일부 실시형태에서, 효소는 홀스래디쉬 퍼옥시다제 또는 알칼리 포스파타제이다.
일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 개별 바이오마커에 대해서 순차적으로 분석된다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 다수의 바이오마커에 대한 동시적 분석이 가능하도록 개별 부분으로 나뉜다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 다수의 바이오마커를 위해 단일 프로세스로 분석된다.
일부 실시형태에서, 바이오마커의 존재 또는 부재는 육안 검사로 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오마커의 분량은 분광학적 기술의 사용으로 결정할 수 있다. 일부 실시형태에서, 분광학적 기술은 질량 분광법이다. 일부 실시형태에서, 분광학적 기술은 UV/Vis 분광광도법이다. 일부 실시형태에서, 분광학적 기술은 여기/발광 기술 예컨대 형광 분광광도법이다.
일부 실시형태에서, 키트가 생물학적 샘플의 분석을 위해 제공된다. 일부 실시형태에서, 키트는 분석을 수행하는데 필요한 화학물 및 시약을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 키트는 필요한 작동자 개입을 최소화하기 위해서 생물학적 샘플을 조작하기 위한 수단을 함유한다.
다른 양상에서, 본 개시 내용은 췌관 선암종에 대한 환자의 감수성을 결정하는 방법을 제공하고, 이 방법은 환자로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 생물학적 샘플 중 (N1/N8)-아세틸스퍼미딘 (AcSperm)의 수준을 측정하는 단계; 생물학적 샘플 중 디아세틸스퍼민 (DAS)의 수준을 측정하는 단계; 생물학적 샘플 중 리소포스파티딜콜린 (LPC) (18:0)의 수준을 측정하는 단계; 생물학적 샘플 중 리소포스파티딜콜린 (LPC) (20:3)의 수준을 측정하는 단계; 및 생물학적 샘플 중 인돌-유사체의 수준을 측정하는 단계를 포함하고; (N1/N8)-아세틸스퍼미딘 (AcSperm), 디아세틸스퍼민 (DAS), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (18:0), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (20:3), 및 인돌-유사체의 양은 환자를 췌관 선암종에 감수성이거나 또는 췌관 선암종에 감수성이 아닌 것으로 분류한다.
다른 양상에서, 본 개시 내용은 췌관 선암종에 대한 환자의 감수성을 결정하는 방법을 제공하고, 이 방법은 혈장-유래 바이오마커 패널 및 단백질 마커 패널을 포함하고: 혈장-유래 바이오마커 패널은 (N1/N8)-아세틸스퍼미딘 (AcSperm), 디아세틸스퍼민 (DAS), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (18:0), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (20:3), 및 인돌-유사체를 포함하고; 단백질 바이오마커 패널은 CA19-9, LRG1, 및 TIMP1을 포함하며; 이 방법은 환자로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 생물학적 샘플 중 혈장-유래 바이오마커 및 단백질 바이오마커의 수준을 측정하는 단계를 포함하고; 혈장-유래 바이오마커 및 단백질 바이오마커의 양은 환자를 췌관 선암종에 대해 감수성이거나 또는 췌관 선암종에 대해 감수성이 아닌 것으로 분류한다.
다른 양상에서, 본 개시 내용은 하나 이상의 단백질 바이오마커 및 하나 이상의 대사산물 마커의 수준을 결정하는 단계를 포함하는, 췌관 선암종에 대한 환자의 감수성을 결정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 환자로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 샘플을 CA19-9 항원에 결합하는 제1 리포터 분자와 접촉시키는 단계; 샘플을 TIMP1 항원에 결합하는 제2 리포터 분자와 접촉시키는 단계; 샘플을 LRG1 항원에 결합하는 제3 리포터 분자와 접촉시키는 단계; 및 하나 이상의 바이오마커의 수준을 결정하는 단계를 포함하고, 하나 이상의 바이오마커는 (N1/N8)-아세틸스퍼미딘 (AcSperm), 디아세틸스퍼민 (DAS), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (18:0), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (20:3), 및 인돌-유사체로 이루어진 군으로부터 선택되고; 제1 리포터 분자, 제2 리포터 분자, 제3 리포터 분자, 및 하나 이상의 바이오마커의 양은 환자를 췌관 선암종에 감수성이거나 또는 췌관 선암종에 감수성이 아닌 것으로 분류한다.
다른 양상에서, 본 개시 내용은 췌관 선암종에 대한 환자의 감수성을 결정하는 방법을 제공하고, 이 방법은 환자로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 생물학적 샘플 중 CA19-9, TIMP1, 및 LRG1 항원의 수준을 측정하는 단계; 및 생물학적 샘플 중 (N1/N8)-아세틸스퍼미딘 (AcSperm), 디아세틸스퍼민 (DAS), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (18:0), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (20:3), 및 인돌-유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 대사산물 마커의 수준을 측정하는 단계; 생물학적 샘플 중 CA19-9 항원, TIMP1 항원, LRG1 항원, (N1/N8)-아세틸스퍼미딘 (AcSperm), 디아세틸스퍼민 (DAS), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (18:0), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (20:3), 및 인돌-유사체의 수준의 통계적 분석에 의한 결정에 따라, 환자의 병태를 췌관 선암종에 감수성이거나 또는 췌관 선암종에 감수성이 아닌 것으로 지정하는 단계를 포함한다.
다른 양상에서, 본 개시 내용은 췌관 선암종에 대한 감수성이 의심되는 환자를 치료하는 방법을 제공하고, 이 방법은 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에서 언급된 바와 같은 방법으로 췌관 선암종에 대한 감수성에 대해 환자를 분석하는 단계; 선암종에 대한 치료의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 치료는 수술, 화학요법, 방사선 요법, 표적 요법, 또는 이의 조합이다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법은 CA19-9, TIMP1, 및 LRG1로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원에 선택적으로 결합하는 적어도 하나의 수용체 분자를 포함한다.
일 실시형태에서, CA19-9, TIMP1, LRG, (N1/N8)-아세틸스퍼미딘 (AcSperm), 디아세틸스퍼민 (DAS), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (18:0), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (20:3), 또는 인돌-유사체의 양의 검출은 고체 입자의 사용을 포함한다. 다른 실시형태에서, 고체 입자는 비드이다.
일 실시형태에서, 리포터 분자 중 적어도 하나는 효소에 연결된다.
일 실시형태에서, 단백질 또는 대사산물 마커 중 적어도 하나는 검출가능한 신호를 발생시킨다. 다른 실시형태에서, 검출가능한 신호는 분광분석 방법에 의해 검출가능하다. 다른 실시형태에서, 분광분석 방법은 질량 분광법이다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법은 췌관 선암종을 갖거나 또는 췌관 선암종을 갖지 않는 것으로의 지정에 환자 이력 정보의 포함 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법은 췌관 선암종으로 갖는다고 지정된 환자에 대한 적어도 하나의 대체 진단 검사를 투여하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 적어도 하나의 대체 진단 검사는 적어도 하나의 ctDNA의 어세이 또는 시퀀싱을 포함한다.
다른 양상에서, 본 개시 내용은 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법을 위한 키트를 제공하고, 키트는 CA19-9 항원의 검출을 위한 제1 용질; LRG1 항원의 검출을 위한 제2 용질; TIMP1 항원의 검출을 위한 제3 용질; (N1/N8)-아세틸스퍼미딘 (AcSperm)의 검출을 위한 제4 용질; 디아세틸스퍼민 (DAS)의 검출을 위한 제5 용질; 리소포스파티딜콜린 (LPC) (18:0)의 검출을 위한 제6 용질; 리소포스파티딜콜린 (LPC) (20:3)의 검출을 위한 제7 용질; 및 인돌-유사체의 검출을 위한 제8 용질을 포함하는 시약 용액을 포함한다.
일 실시형태에서, 이러한 키트는 CA19-9 항원의 검출을 위한 제1 용질을 포함하는 제1 시약 용액; LRG1 항원의 검출을 위한 제2 용질을 포함하는 제2 시약 용액; TIMP1 항원의 검출을 위한 제3 용질을 포함하는 제3 시약 용액; (N1/N8)-아세틸스퍼미딘 (AcSperm)의 검출을 위한 제4 용질을 포함하는 제4 시약 용액; 디아세틸스퍼민 (DAS)의 검출을 위한 제5 용질을 포함하는 제5 시약 용액; 리소포스파티딜콜린 (LPC) (18:0)의 검출을 위한 제6 용질을 포함하는 제6 시약 용액; 리소포스파티딜콜린 (LPC) (20:3)의 검출을 위한 제7 용질을 포함하는 제7 시약 용액; 및 인돌-유사체의 검출을 위한 제8 용질을 포함하는 제8 시약 용액을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 키트는 시약 용액과 생물학적 샘플을 접촉시키기 위한 장치를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 이러한 키트는 적어도 하나의 항원을 결합시키기 위한 수단을 갖는 적어도 하나의 표면을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 적어도 하나의 항원은 CA19-9, LRG1, 및 TIMP1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 적어도 하나의 표면은 ctDNA를 결합시키기 위한 수단을 포함한다.
다른 양상에서, 본 개시 내용은 본 명세서에 기술된 바와 같은 이러한 방법을 제공하고 이 방법은 생물학적 샘플 중 (N1/N8)-아세틸스퍼미딘 (AcSperm)의 수준을 측정하는 단계; 생물학적 샘플 중 디아세틸스퍼민 (DAS)의 수준을 측정하는 단계; 생물학적 샘플 중 리소포스파티딜콜린 (LPC) (18:0)의 수준을 측정하는 단계; 생물학적 샘플 중 리소포스파티딜콜린 (LPC) (20:3)의 수준을 측정하는 단계; 및 생물학적 샘플 중 인돌-유사체의 수준을 측정하는 단계를 더 포함하고; (N1/N8)-아세틸스퍼미딘 (AcSperm), 디아세틸스퍼민 (DAS), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (18:0), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (20:3), 및 인돌-유사체의 양은 환자를 췌관 선암종에 감수성이거나 또는 췌관 선암종에 감수성이 아닌 것으로 분류한다.
다른 양상에서, 췌관 선암종에 대한 환자의 감수성을 결정하는 방법을 제공하고, 이 방법은 환자로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 생물학적 샘플 중 (N1/N8)-아세틸스퍼미딘 (AcSperm)의 수준을 측정하는 단계; 생물학적 샘플 중 디아세틸스퍼민 (DAS)의 수준을 측정하는 단계; 생물학적 샘플 중 리소포스파티딜콜린 (LPC) (18:0)의 수준을 측정하는 단계; 생물학적 샘플 중 리소포스파티딜콜린 (LPC) (20:3)의 수준을 측정하는 단계; 및 생물학적 샘플 중 인돌-유사체의 수준을 측정하는 단계를 포함하고; (N1/N8)-아세틸스퍼미딘 (AcSperm), 디아세틸스퍼민 (DAS), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (18:0), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (20:3), 및 인돌-유사체의 양은 환자를 췌관 선암종에 감수성이거나 또는 췌관 선암종에 감수성이 아닌 것으로 분류한다.
다른 양상에서, 본 개시 내용은 혈장-유래 바이오마커 패널 및 단백질 마커 패널을 포함하는, 췌관 선암종에 대한 환자의 감수성을 결정하는 방법을 제공하고, 혈장-유래 바이오마커 패널은 (N1/N8)-아세틸스퍼미딘 (AcSperm), 디아세틸스퍼민 (DAS), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (18:0), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (20:3), 및 인돌-유사체를 포함하고; 단백질 바이오마커 패널은 CA19-9, LRG1, 및 TIMP1을 포함하고; 이 방법은 환자로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 생물학적 샘플 중 혈장-유래 바이오마커 및 단백질 바이오마커의 수준을 측정하는 단계를 포함하고; 혈장-유래 바이오마커 및 단백질 바이오마커의 양은 환자를 췌관 선암종에 감수성이거나 또는 췌관 선암종에 감수성이 아닌 것으로 분류한다.
다른 양상에서, 본 개시 내용은 하나 이상의 단백질 바이오마커 및 하나 이상의 대사산물 마커의 수준을 결정하는 단계를 포함하는, 췌관 선암종에 대한 환자의 감수성을 결정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 환자로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 샘플을 CA19-9 항원에 결합하는 제1 리포터 분자와 접촉시키는 단계; 샘플을 TIMP1 항원에 결합하는 제2 리포터 분자와 접촉시키는 단계; 샘플을 LRG1 항원에 결합하는 제3 리포터 분자와 접촉시키는 단계; 및 하나 이상의 바이오마커의 수준을 결정하는 단계를 포함하고, 하나 이상의 바이오마커는 (N1/N8)-아세틸스퍼미딘 (AcSperm), 디아세틸스퍼민 (DAS), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (18:0), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (20:3), 및 인돌-유사체로 이루어진 군으로부터 선택되고; 제1 리포터 분자, 제2 리포터 분자, 제3 리포터 분자, 및 하나 이상의 바이오마커의 양은 환자를 췌관 선암종에 감수성이거나 또는 췌관 선암종에 감수성이 아닌 것으로 분류한다.
다른 양상에서, 개시 내용은 췌관 선암종에 대한 환자의 감수성을 결정하는 방법을 제공하고, 이 방법은 환자로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 생물학적 샘플 중 CA19-9, TIMP1, 및 LRG1 항원의 수준을 측정하는 단계; 및 생물학적 샘플 중 (N1/N8)-아세틸스퍼미딘 (AcSperm), 디아세틸스퍼민 (DAS), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (18:0), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (20:3), 및 인돌-유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 대사산물 마커의 수준을 측정하는 단계; 생물학적 샘플 중 CA19-9 항원, TIMP1 항원, LRG1 항원, (N1/N8)-아세틸스퍼미딘 (AcSperm), 디아세틸스퍼민 (DAS), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (18:0), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (20:3), 및 인돌-유사체의 수준의 통계 분석에 의한 결정에 따라, 환자의 병태가 췌관 선암종에 감수성이거나 또는 췌관 선암종에 대해 감수성이 아닌 것으로 지정하는 단계를 포함한다.
다른 양상에서, 개시 내용은 췌관 선암종에 대한 감수성이 의심되는 환자를 치료하는 방법을 제공하고, 이 방법은 제36항 내지 제39항 중 어느 하나에 언급된 방법으로 췌관 선암종에 대한 감수성에 대해 환자를 분석하는 단계; 선암종에 대한 치료의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 치료는 수술, 화학요법, 방사선 요법, 표적 요법, 또는 이의 조합이다. 다른 실시형태에서, 이러한 방법은 CA19-9, TIMP1, 및 LRG1로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원에 선택적으로 결합하는 적어도 하나의 수용체 분자를 포함한다. 다른 실시형태에서, CA19-9, TIMP1, LRG, (N1/N8)-아세틸스퍼미딘 (AcSperm), 디아세틸스퍼민 (DAS), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (18:0), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (20:3), 또는 인돌-유사체의 양의 검출은 고체 입자의 사용을 포함한다. 다른 실시형태에서, 고체 입자는 비드이다. 다른 실시형태에서, 리포터 분자 중 적어도 하나는 효소에 연결된다. 다른 실시형태에서, 단백질 또는 대사산물 마커의 적어도 하나는 검출가능한 신호를 발생시킨다. 다른 실시형태에서, 검출가능한 신호는 분광분석 방법에 의해 검출가능하다. 다른 실시형태에서, 분광분석 방법은 질량 분광법이다. 다른 실시형태에서, 이러한 방법은 췌관 선암종을 갖거나 또는 췌관 선암종을 갖지 않는 것으로의 지정에 환자 이력 정보의 포함 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 이러한 방법은 췌관 선암종을 갖는 것으로 지정된 환자에 대한 적어도 하나의 대체 진단 검사를 투여하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 적어도 하나의 대체 진단 검사는 적어도 하나의 ctDNA의 어세이 또는 시퀀싱을 포함한다.
다른 양상에서, 본 개시 내용은 36항 내지 제40항 중 어느 하나에 언급된 바와 같은 방법을 위한 키트를 제공하고, 이 키트는 CA19-9 항원의 검출을 위한 제1 용질; LRG1 항원의 검출을 위한 제2 용질; TIMP1 항원의 검출을 위한 제3 용질; (N1/N8)-아세틸스퍼미딘 (AcSperm)의 검출을 위한 제4 용질; 디아세틸스퍼민 (DAS)의 검출을 위한 제5 용질; 리소포스파티딜콜린 (LPC) (18:0)의 검출을 위한 제6 용질; 리소포스파티딜콜린 (LPC) (20:3)의 검출을 위한 제7 용질; 및 인돌-유사체의 검출을 위한 제8 용질을 포함하는 시약 용액을 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 키트는 CA19-9 항원의 검출을 위한 제1 용질을 포함하는 제1 시약 용액; LRG1 항원의 검출을 위한 제2 용질을 포함하는 제2 시약 용액; TIMP1 항원의 검출을 위한 제3 용질을 포함하는 제3 시약 용액; (N1/N8)-아세틸스퍼미딘 (AcSperm)의 검출을 위한 제4 용질을 포함하는 제4 시약 용액; 디아세틸스퍼민 (DAS)의 검출을 위한 제5 용질을 포함하는 제5 시약 용액; 리소포스파티딜콜린 (LPC) (18:0)의 검출을 위한 제6 용질을 포함하는 제6 시약 용액; 리소포스파티딜콜린 (LPC) (20:3)의 검출을 위한 제7 용질을 포함하는 제7 시약 용액; 및 인돌-유사체의 검출을 위한 제8 용질을 포함하는 제8 시약 용액을 포함한다. 일 실시형태에서, 이러한 키트는 시약 용액과 생물학적 샘플을 접촉시키기 위한 장치를 포함한다. 다른 실시형태에서, 이러한 키트는 적어도 하나의 항원에 결합하기 위한 수단을 갖는 적어도 하나의 표면을 포함한다. 다른 실시형태에서, 적어도 하나의 항원은 CA19-9, LRG1, 및 TIMP1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 적어도 하나의 표면은 ctDNA에 결합하기 위한 수단을 포함한다.
다른 양상에서, 본 개시 내용은 하기의 단계 중 하나 이상을 포함하는, CA19-9 항원, TIMP1 항원, 및 LRG1 항원의 수준이 환자를 PDAC를 갖거나 또는 PDAC에 대해 감수성인 것으로 분류시킨 환자에서 췌관 선암종 (PDAC)의 진행의 치료 또는 예방 방법을 제공한다: PDAC를 갖는 환자에게 치료적 방사선을 투여하는 단계; 및 PDAC를 갖는 환자에서 암성 조직의 부분 또는 완전 외과적 제거를 위한 수술 단계. 일 실시형태에서, CA19-9 항원, TIMP1 항원, 및 LRG1 항원의 수준은 상승된다. 다른 실시형태에서, CA19-9 항원, TIMP1 항원, 및 LRG1 항원의 수준은 PDAC를 갖지 않는 기준 환자 또는 그룹 중 CA19-9 항원, TIMP1 항원, 및 LRG1 항원의 수준과 비교하여 상승된다. 다른 실시형태에서, 기준 환자 또는 그룹은 건강하다. 다른 실시형태에서, AUC (95% CI)는 적어도 0.850이다. 다른 실시형태에서, AUC (95% CI)는 적어도 0.900이다. 다른 실시형태에서, PDAC를 갖는 것으로 환자의 분류는 각각 95% 및 99% 특이도에서 0.849 및 0.658의 감도를 갖는다. 다른 실시형태에서, CA19-9 항원, TIMP1 항원, 및 LRG1 항원의 수준은 만성 췌장염을 갖는 기준 환자 또는 그룹 중 CA19-9 항원, TIMP1 항원, 및 LRG1 항원의 수준과 비교하여 상승된다. 다른 실시형태에서, CA19-9 항원, TIMP1 항원, 및 LRG1 항원의 수준은 양성 췌장 질환을 갖는 기준 환자 또는 그룹 중 CA19-9 항원, TIMP1 항원, 및 LRG1 항원의 수준과 비교하여 상승된다. 다른 실시형태에서, AUC (95% CI)는 적어도 0.850이다. 다른 실시형태에서, AUC (95% CI)는 적어도 0.900이다. 다른 실시형태에서, PDAC를 갖는 것으로 환자의 분류는 각각 95% 및 99% 특이도에서 0.849 및 0.658의 감도를 갖는다. 다른 실시형태에서, PDAC는 경계선 절제가능 병기 시에 또는 그 이전에 진단된다. 다른 실시형태에서, PDAC는 절제가능 병기에 진단된다.
다른 양상에서, 개시 내용은 하기 단계 중 하나 이상을 포함하는, CA19-9 항원, TIMP1 항원, LRG1, (N1/N8)-아세틸스퍼미딘 (AcSperm), 디아세틸스퍼민 (DAS), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (18:0), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (20:3), 및 인돌-유사체의 수준이 PDAC를 갖거나 또는 PDAC에 대해 감수성인 것으로 환자를 분류시킨 환자에서 췌관 선암종 (PDAC)의 진행의 치료 또는 예방 방법을 제공한다: PDAC를 갖는 환자에게 화학요법 약물을 투여하는 단계; PDAC를 갖는 환자에게 치료적 방사선을 투여하는 단계; 및 PDAC를 갖는 환자에서 암성 조직의 부분 또는 완전 외과적 제거를 위한 수술 단계. 다른 실시형태에서, CA19-9 항원, TIMP1 항원, 및 LRG1 항원의 수준은 상승된다. 다른 실시형태에서, CA19-9 항원, TIMP1 항원, 및 LRG1 항원의 수준은 PDAC를 갖지 않는 기준 환자 또는 그룹 중 CA19-9 항원, TIMP1 항원, 및 LRG1 항원의 수준과 비교하여 상승된다. 다른 실시형태에서, 기준 환자 또는 그룹은 건강하다. 다른 실시형태에서, CA19-9 항원, TIMP1 항원, 및 LRG1 항원의 수준은 만성 췌장염을 갖는 기준 환자 또는 그룹 중 CA19-9 항원, TIMP1 항원, 및 LRG1 항원의 수준과 비교하여 상승된다. 다른 실시형태에서, CA19-9 항원, TIMP1 항원, 및 LRG1 항원의 수준은 양성 췌장 질환을 갖는 기준 환자 또는 그룹 중 CA19-9 항원, TIMP1 항원, 및 LRG1 항원의 수준과 비교하여 상승된다. 다른 실시형태에서, 환자는 PDAC에 고위험성이다. 다른 실시형태에서, 환자는 50세 이상이며 신규 발병 진성 당뇨병을 갖거나, 만성 췌장염을 갖거나, 췌장의 뮤신-분비 낭종으로 우연히 진단받았거나, 또는 이들 고위험 그룹 중 하나의 무증상성 동류이다.
다른 양상에서, 개시 내용은 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법으로 췌관 선암종에 대한 감수성에 대해 환자를 분석하는 단계; 선암종에 대한 치료의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 췌관 선암종에 대한 감수성이 의심되는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 다른 실시형태에서, 치료는 수술, 화학요법, 방사선 요법, 표적 요법, 또는 이의 조합이다.
도 1은 검증된 바이오마커 모델의 발굴을 위한 흐름도를 도시한다.
도 2A 및 도 2B는 환자분류 세트에서 건강한 대조군보다 PDAC에서 유의하게 더 높은 수준인 바이오마커 후보들을 도시한다. 환자분류 세트에서 (도 2A) PDAC (n = 75) 대 건강한 대조군 (n = 27) 및 (도 2B) PDAC 대 만성 췌장염 환자 (n = 19)의 비교에서 바이오마커 후보들의 효율. 막대는 AUC (95%CI)를 의미한다. *는 역순이 사용되었음을 의미한다. AUC, 곡선하 면적.
도 3A 및 도 3B는 복합 검증 세트에서 TIMP1+LRG1+CA19-9를 기반으로 바이오마커 패널의 효율을 도시한다. (도 3A) PDAC 대 건강한 대조군 및 (도 3B) PDAC 대 양성 췌장 질환 ("OR" 규칙 조합)에 대해 개발된 바이오마커 패널의 ROC 분석. 윗쪽선은 모델을 나타내고, 아랫쪽선은 CA19-9를 나타낸다. AUC, 곡선하 면적.
도 4는 검증 세트 #2에서 바이오마커 패널 (TIMP1, LRG1, 및 CA19-9) 기반 지수 및 종양 크기 값 사이의 상관성 분석을 도시한다. 기초적인 선형 회귀 모델은 각각 3.7329 및 -0.2646의 절편 및 기울기를 산출한다 (기울기 95% CI = -0.745-0.216; Wald-기반 양측 p-값 = 0.27). 종양 크기는 CT/MRI/EUS에 의해 평가된 2회 측정 중 더 큰 것을 의미한다.
도 5는 시험 세트에서 TIMP1+LRG1+CA19-9를 기반으로 하는 바이오마커 모델의 효율을 도시한다. PDAC 대 건강한 대조군에 대해, 복합 검증 세트에서 개발된, 고정 계수를 갖는 조합 모델의 ROC 분석. 윗쪽선은 모델을 나타내고, 아랫쪽선은 CA19-9를 나타낸다. AUC, 곡선하 면적.
도 6은 실험 디자인 및 여과 전략의 개략도를 도시한다.
도 7은 발굴 코호트에서 검출된 리소포스파티딜콜린, 스핑고미엘린 및 세라마이드에 대한 개별 AUC를 도시한다. 약어: LPC: 리소포스파티디콜린; SM: 스핑고미엘린.
도 8은 인돌-유사체에 대한 MSMS 스펙트럼을 도시하고, 일치되는 단편은 약 118, 약 148, 및 약 188 m/z에서 발생된다.
도 9A 및 도 9B는 시험 세트에서 개별 대사산물 및 5-마커 대사산물 패널의 AUC 그래프를 도시한다. 효율은 복합 발굴 및 '확증' 코호트를 기반으로 한다. (도 9A) PDAC (n=29)를 건강한 대상체 (n=10)와 구별하기 위한 개별 대사산물 및 5-마커 대사산물 패널에 대한 ROC (Receiver operating characteristic) 그래프. (도 9B) PDAC (n=29)를 양성 췌장 질환 (만성 췌장염 (n=10) 및 저등급 낭종 (n=50))으로 진단된 대상체에 대해 비교한 개별 대사산물 및 5-마커 대사산물 패널에 대한 ROC 그래프.
도 10A 및 도 10B는 시험 세트에서 개별 대사산물 및 5-마커 대사산물 패널의 검증을 도시한다. (도 10A) 절제성 PDAC (n=39)를 건강한 대상체 (n=82)와 비교하기 위한 개별 대사산물 및 5-마커 대사산물 패널에 대한 ROC (Receiver operating characteristic) 그래프 (시험 세트 #1). (도 10B) 절제성 PDAC (n=20)를 양성 췌장 질환 (저등급 낭종 (n=102)) (시험 세트 #2)으로 진단받은 대상체에 대해 비교하는 개별 대사산물 및 5-마커 대사산물 패널에 대한 ROC 그래프.
도 11A 및 도 11B는 대사산물-패널 및 단백질-패널로 이루어진 하이퍼-패널이 단백질-패널 단독과 비교하여 분류를 개선시킨다는 것을 도시한다. (도 11A-B) 훈련 세트 (9 PDAC vs 10 건강한 대상체) 및 독립적인 검증 코호트 (시험 세트 #1; 39 PDAC vs 82 건강한 대상체)에서 하이퍼-패널 및 단백질-패널 단독에 대한 ROC 그래프.
도 12A - 도 12C는 췌관 선암종이 세포외 리소인지질을 이화시키는 것을 도시한다. (도 12A) 24시간, 48시간 및 72시간의 배양 이후에 PANC1 및 SU8686 PDAC 세포주에서 리소포스파티딜콜린 (18:0), 리소포스파티딜콜린 (20:3), 및 글리세로포스포콜린의 혈청-함유 배지 조성물 중 변화율 (%). (도 12B) 포스파티딜콜린 및 리소포스파티딜콜린의 이화작용에 관여되는 효소들을 예시하는 개략도. (도 12C) PDAC 및 인접한 대조군 조직 중에서 PLA2G10, LYPLA1, 및 ENPP2 의 mRNA 발현도 +/- SEM. 통계적 유의도는 쌍별 t-검정으로 결정하였다 (p: **<0.01, ****<0.001). mRNA 발현 데이타는 Oncomine으로부터 수득하였고 Badea 데이타세트를 기반으로 한다.
도 13은 조건화 배지 중 지질종의 조성을 도시한다. 배지 블랭크와 비교하여 PDAC 세포주 PANC-1 및 SU8686 유래의 24시간, 48시간 및 72시간 조건화 혈청-함유 배지 중 지질종의 조성의 변화율 (%)을 도시하는 히트맵. 약어: PC: 포스파티딜콜린; PE: 포스파티딜에탄올아민; LPC: 리소포스파티디콜린; LPE: 리소포스파티딜에탄올아민; Plas: 플라스마로겐.
도 14A - 도 14C는 췌관 선암종이 폴리아민의 상승된 이화작용을 나타냄을 도시한다. (도 14A) 5종 PDAC 세포주 (CFPAC-1, MiaPaCa, SU8686, PANC03-27, 및 SW1990)의 세포 용해물 중 N1/N8-아세틸스퍼미딘 또는 디아세틸스퍼민의 존재비 (면적 유닛 +/- stdev). (도 14B) 5종 PDAC 세포주 (CFPAC-1, MiaPaCa, SU8686, PANC03-27, 및 SW1990) 유래의 조건화 후 1시간, 2시간, 4시간 및 6시간에 수집된 무혈청 배지 중 N1/N8-아세틸스퍼미딘 또는 디아세틸스퍼민의 존재비 (면적 유닛 +/- stdev). (도 14C) 폴리아민 및 그들의 아세틸화된 유도체의 생합성에 관여되는 효소를 표시하는 네트워크. 노드 음영 (연회색 = 감소; 진회색 = 증가) 및 크기는 PDAC 및 인접한 대조군 조직 간 개별 효소의 mRNA 발현의 변화 규모 및 방향을 도시한다. 진한 노드 경계는 통계적 유의성 (쌍별 t-검정 <0.05)을 예시한다. 상자 수염도는 PDAC 및 인접한 대조군 조직 간 개별 효소에 대한 mRNA 발현의 분포를 예시한다. mRNA 발현 데이타는 Oncomine으로부터 수득하였고 Badea 데이타세트를 기반으로 한다.
인간 대상체에서 췌장암을 식별하기 위한 방법을 제공
하고, 이 방법은 일반적으로
(a) 대상체로부터 수득된 혈액 샘플을 적어도 3종의 바이오마커: CA19-9, TIMP1, 및 LRG1의 분석을 위한 어세이에 적용하는 단계;
(b) 혈액 샘플에 존재하는 적어도 3종의 바이오마커의 양을 정량하는 단계; 및
(c) 존재하는 바이오마커의 양을 기반으로 통계 분석을 적용하여 상응하는 췌장암에 대해 바이오마커 지수를 결정하고, 그리하여 대상체를 췌장암에 대해 양성 또는 음성으로 분류하는 단계
를 포함한다.
본 명세서의 방법은 고위험 대상체, 예를 들어, 췌장암의 가족력을 갖는 대상체, 또는 다른 위험 인자 예컨대 만성 췌장염, 비만, 과도한 흡연, 및 가능하게는 당뇨병을 갖는 환자의 스크리닝을 가능하게 한다. 본 명세서에서 제공하는 로지스틱 회귀 모델은 이들 인자들을 분류 방법에 통합시킬 수 있다.
PDAC-양성으로 분류된 대상체의 경우에, PDAC 상태를 명확하게 하기 위해서 추가 방법이 제공될 수 있다. PDAC-양성으로서 분류는 제한없이, 컴퓨터 단층촬영술 (CT), 내시경 초음파 (EUS), 또는 내시경 역행 췌담관 조영술 (ERCP)을 포함한 방법이 후속될 수 있다.
CA19-9의 검출은 Neu5Acα2,3Galβ1,3(Fucα1,4)GlcNAc의 서열을 갖는 시알릴-루이스 A (혈액형 항원의 루이스 패밀리의 일부)라고 불리는 탄수화물 구조인, CA19-9 항원과의 접촉에 의해 수행될 수 있다. 시알릴-루이스 A는 N-연결 및 O-연결 글리칸 상에 모노사카라이드 전구체를 순차적으로 연결하여 글리코실트랜스퍼라제에 의해 합성된다. 이것은 뮤신, 암배 항원, 및 순환성 아포리포단백질을 포함하는, 많은 상이한 단백질에 부착된다. 표준 CA19-9 임상 어세이에서, 단일클론 항체는 많은 상이한 캐리어 단백질 상에서 CA19-9 항원을 측정하는, 샌드위치 ELISA 형태에서 CA19-9 항원을 포획하고 검출한다 (Partyka et al., Proteomics 12(13):2213-20, 2012).
TIMP1 (SEQ ID NO:1; UniProtKB: P01033)의 검출은 TIMP1에 특이적으로 결합하는 리포터 분자와의 접촉에 의해 수행될 수 있다.
Figure pct00001
LRG1 (SEQ ID NO:2; UniProtKB: P02750)의 검출은 LRG1에 특이적으로 결합하는 리포터 분자와의 접촉에 의해 수행될 수 있다.
Figure pct00002
적어도 3종의 바이오마커 CA19-9, TIMP1, 및 LRG1의 조합은 이전에 보지 못한, 고도로 신뢰할만한 PDAC 예측력을 제공할 수 있다. 39명의 절제성 PDAC 사례 및 82명의 부합되는 건강한 대조군 유래의 혈장 샘플로 구성된 맹검 시험 세트에 적용했을 때, 본 명세서에 기술된 방법은 건강한 대조군에 비해 초기-병기 PDAC를 구별하는데 있어 95% 특이도에서 0.667의 감도로 0.887 (0.817-0.957)의 AUC (95% CI)를 산출하였다. 바이오마커 패널의 효율은 CA19-9 단독과 비교하여 통계적으로 유의한 개선 및 초기 병기 췌장암의 고정밀 검출을 입증하였다 (p = 0.008, 시험 세트).
본 명세서에 상술하는 바이오마커의 검출과 관련하여, 개시 내용은 본 명세서에 보고되는 특별한 생물분자에 국한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 제한없이 단백질, 항체, 핵산, 압타머 및 합성 유기 화합물 기반의 생물분자를 포함하여 개시된 바이오마커의 검출 및 분석을 위해 다른 생물분자들이 선택될 수 있다. 다른 분자는 어세이의 감도, 효율성, 속도, 제조 또는 저장의 비용, 안전성 또는 용이함의 관점에서 장점을 입증할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 당업자는 본 명세서에 개시된 바이오마커의 예측력 및 진단력을 단지 이들 바이오마커의 단백질 형태만이 아니라 역시 바이오마커의 다른 표상 (예를 들어, 핵산)의 분석으로 확대할 수 있다는 것을 이해하게 될 것이다. 더 나아가서, 당업자는 본 명세서에 개시된 바이오마커의 예측력 및 진단력이 또한 PDAC와 연관된 다른 바이오마커의 분석과 조합하여 사용될 수도 있다는 것을 이해하게 될 것이다. 일부 실시형태에서, PDAC와 연관된 다른 바이오마커는 단백질-기반 바이오마커일 수 있다. 일부 실시형태에서, PDAC와 연관된 다른 바이오마커는 비단백질-기반 바이오마커, 예컨대, 예를 들어 ctDNA일 수 있다.
TIMP1 및 LRG1은 본 명세서에 개시된 검증 실험에서 CA19-9 효율을 보완한다. TIMP1의 증가된 유전자 발현 및/또는 분비는 PDAC에서 이전에 관찰되었고 종양 세포 증식을 유도하는 것으로 확인되었다. 상승된 순환성 TIMP1 수준이 PDAC와 연관되어있지만, 증가된 수준이 또한 다른 상피 종양 유형에서도 확인되었다. LRG1에 대한 역할은 TGF-β 경로의 활성화를 통해서 혈관생성을 촉진하는데서 제안되었다. PDAC 이외에도, 증가된 LRG1 혈장 수준이 또한 다른 암 유형에서도 확인되었다.
3종 마커 패널의 효율은 부합되는 건강한 대상체 또는 양성 췌장 질환 대조군과 초기-병기 PDAC를 구별하는데서 CA19-9 단독보다 통계적으로 유의한 개선이 입증되었다. 3종의 마커 패널은 평균 위험성의 무증상 대상체의 스크리닝과는 대조적으로, 높은 위험성의 대상체들, 즉 가족력, 낭종 병변, 만성 췌장염을 갖는 대상체 또는 성인-발병 제II형 당뇨병이 존재하는 대상체 중에서 PDAC의 평가를 가능하게 한다.
본 명세서는 절제성 PDAC 환자 및 부합되는 대조군 유래의 복수의 독립적인 샘플 세트에서 동정된 바이오마커 후보물의 순차적 검증을 수행하기 위해서, 인간 진단전 및 마우스 초기-병기 PDAC 혈장 샘플 둘 모두를 사용해 수행된, 최초의 단백질체-기반 연구를 개시한다.
일부 실시형태에서, 생물학적 샘플 중 CA19-9, TIMP1, 및 LRG1의 수준이 측정된다. 일부 실시형태에서, CA19-9, TIMP1, 및 LRG1은 리포터 분자와 접촉되고, 개별 리포터 분자의 수준이 측정된다. 일부 실시형태에서, 각각 CA19-9, TIMP1, 및 LRG1에 특이적으로 결합하는 3종의 리포터 분자가 제공된다. 리포터 분자의 사용은 어세이에 대한 편리함 및 감도에 이득을 제공할 수 있다.
일부 실시형태에서, CA19-9, TIMP1, 및 LRG1는 키트에 제공된 표면 상에 흡착된다. 일부 실시형태에서, 리포터 분자는 표면-흡착된 CA19-9, TIMP1, 및 LRG1에 결합된다. 바이오마커의 흡착은 비선택적일 수 있거나 또는 선택적일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표면은 하나 이상의 바이오마커의 흡착에 대한 선택도를 증가시키기 위해 수용체 작용성을 포함한다.
일부 실시형태에서, CA19-9, TIMP1, 및 LRG1은 바이오마커 중 하나 이상에 대해 선택적인 3개 표면 상에 흡착된다. 그 다음으로 하나의 리포터 분자 또는 복수개의 리포터 분자가 표면-흡착된 바이오마커에 결합될 수 있고, 특정한 표면과 회합된 리포터 분자(들)의 수준은 그 표면 상에 존재하는 특정한 바이오마커의 쉬운 정량을 가능하게 할 수 있다.
일부 실시형태에서, CA19-9, TIMP1, 및 LRG1은 키트에 제공되는 표면 상에 흡착되고; 이들 바이오마커 중 하나 이상에 특이적인 릴레이 분자가 표면-흡착된 바이오마커에 결합될 수 있으며; 하나 이상의 릴레이 분자에 특이적인 수용체 분자는 릴레이 분자에 결합될 수 있다. 릴레이 분자는 일정한 바이오마커에 대한 특이성을 제공할 수 있고, 수용체 분자가 검출을 할 수 있게 한다.
일부 실시형태에서, 3종의 릴레이 분자는 각각 CA19-9, TIMP1, 및 LRG1에 특이적으로 결합하는 것이 제공된다. 릴레이 분자는 바이오마커에 대한 특이성에 대해 디자인될 수 있거나, 또는 그들의 결합 특성에 기인하여 후보물 풀로부터 선택될 수 있다. 릴레이 분자는 바이오마커에 결합하도록 생성된 항체일 수 있다.
일부 실시형태에서, CA19-9, TIMP1, 및 LRG1은 키트에 제공된 3개의 개별 표면 상에 흡착되고; 이들 바이오마커 중 하나 이상에 특이적인 릴레이는 표면-흡착된 바이오마커에 결합될 수 있으며; 수용체 분자는 릴레이 분자에 결합할 수 있다. 표면의 분석은 단계식으로 또는 동시발생적 방식으로 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 리포터 분자는 리포터 분자의 정량을 용이하게 하는 효소에 연결된다. 일부 실시형태에서, 정량은 바람직한 분광 특성을 갖는 물질의 촉매적 생성에 의해 획득될 수 있다.
일부 실시형태에서, 바이오마커의 양은 분광학을 사용해 결정된다. 일부 실시형태에서, 분광학은 UV/가시광 분광학이다. 일부 실시형태에서, 바이오마커의 양은 질량 분광법을 사용해 결정된다.
특정한 어세이에서 확인되는 바이오마커(들)의 분량은 조작자에게 직접 보고될 수 있거나, 또는 대안적으로 디지탈로 저장될 수 있고 쉽게 수학적 프로세싱에 이용가능할 수 있다. 시스템은 수학적 분석을 수행하기 위해 제공될 수 있고, 조작자에게 PDAC-양성 또는 PDAC-음성으로서의 분류를 더욱 보고할 수 있다.
일부 실시형태에서, 당업자에게 공지된 추가의 어세이는 본 개시 내용의 범주 내에서 기능할 수 있다. 다른 어세이의 예는 제한없이, 질량-분광광도법, 면역친화성 LC-MS/MS, 표면 플라스몬 공명, 크로마토그래피, 전기화학법, 음파, 면역조직화학, 및 어레이 기술을 활용하는 어세이를 포함한다.
본 명세서는 또한 PDAC-양성으로서 분류된 대상체를 위한 치료 방법을 제공한다. PDAC-양성 환자를 위한 치료는 제한없이, 수술, 화학요법, 방사선 요법, 표적 요법, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
전술한 내용은 상세한 설명을 더욱 잘 이해할 수 있기 위해서 개시 내용의 특성 및 기술적 이득을 다소 광범위하게 약술하였다. 개시된 특별한 실시형태는 개시 내용의 동일 목적을 수행하기 위해서 다른 구조 또는 방법을 변형시키거나 또는 디자인하기 위한 기초로서 쉽게 활용될 수 있다는 것을 당업자가 이해해야 한다. 본 개시 내용은 특정한 실시형태의 변이가 이루어질 수 있고 여전히 첨부된 청구항의 범주 내에 속하므로, 기술된 특정한 실시형태에 국한되지 않는다는 것을 이해해야 한다.
정의
본 명세서에서 사용시, 용어 "췌장암"은 세포의 비정상적인 증식을 특징으로 하는 췌장의 악성 신생물을 의미하는데, 세포의 성장이 초과되어서 그 주변의 정상 조직과 조화되지 않는다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "PDAC"는 췌장관에서 기원할 수 있는 췌장암인 췌관 선암종을 의미한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "PDAC-양성"은 PDAC를 갖는 것으로서 대상체의 분류를 의미한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "PDAC-음성"은 PDAC를 갖지 않는 것으로서 대상체의 분류를 의미한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "췌장염"은 췌장의 염증을 의미한다. 췌장염은 췌장암으로 진행될 수 있지만, 일반적으로 암으로서 분류되지 않는다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "대상체" 또는 "환자"는 PDAC-양성 또는 PDAC-음성으로서 분류가 바람직하고, 본 명세서에서 사용시 추가 치료가 제공될 수 있는, 포유동물, 바람직하게 인간을 의미한다.
본 명세서에서 사용시, "기준 환자" 또는 "기준 그룹"은 PDAC를 갖거나 또는 PDAC에 감수성인 것으로 의심되는 환자 유래의 시험 샘플을 비교할 수 있는 대상체 또는 환자의 그룹을 의미한다. 일부 실시형태에서, 이러한 비교는 시험 대상체가 PDAC를 갖는지 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 기준 환자 또는 그룹은 시험 또는 진단 목적을 위한 대조군으로서 제공될 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 기준 환자 또는 그룹은 단일 환자로부터 수득된 샘플일 수 있거나, 샘플 그룹, 예컨대 샘플의 풀링 그룹을 대표할 수도 있다.
본 명세서에서 사용시, "건강한"은 건강한 췌장, 또는 정상의 비약화된 췌장 기능을 갖는 개체를 의미한다. 건강한 환자 또는 대상체는 PDAC 또는 다른 췌장 질환의 증상을 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, 건강한 환자 또는 대상체는 환자 또는 환자의 그룹에서 PDAC의 결정을 위해 질환 또는 의심되는 질환 샘플과의 비교를 위한 기준 환자로서 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 대상체 또는 환자가 영향받는 예에서 병약 또는 병폐 또는 병태 또는 이벤트의 발생 또는 재발의 정도 또는 공산을 감소시키거나 또는 치유하거나 또는 예방적 처치 (예방)를 위한, 대상체에 대한 의학적 절차의 수행 또는 약물의 투여를 의미한다. 본 개시 내용과 관련되어 이 용어는 또한 제한없이, 방사선 요법 및 수술을 포함하는 비약학적 방법의 수행 또는 약학적 물질 또는 제제의 투여를 의미할 수도 있다. 본 명세서에서 사용되는 약학 물질은 제한없이, 당분야에서 확립된 화학요법제, 예컨대 젬시타빈 (Gemzar), 5-플루오로우라실 (5-FU), 이리노테칸 (Camptosar), 옥살리플라틴 (Eloxatin), 알부민-결합 파클리탁셀 (Abraxane), 카페시타빈 (Xeloda), 시스플라틴, 파클리탁셀 (Taxol), 도세탁셀 (Taxotere), 및 이리노테칸 리포솜 (Onivyde)을 포함할 수 있다. 약학 물질은 면역요법에서 사용되는 물질, 예컨대 체크포인트 억제제를 포함할 수 있다. 치료는 다수의 약학 물질, 또는 제한없이, 수술 및 화학요법을 포함하는 다수의 치료 방법을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "ELISA"는 효소-연결 면역흡착 어세이를 의미한다. 이러한 어세이는 일반적으로 형광적으로 태그화된 단백질 샘플을 그들 단백질에 대한 특이적 친화성을 갖는 항체와 접촉시키는 것을 포함한다. 이들 단백질의 검출은 제한없이 레이저 형광측정법을 포함하는 다양한 수단에 의해 수행될 수 있다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "회귀"는 샘플의 기초적인 특징에 대한 예측 값을 상기 샘플의 관찰가능한 특성 (또는 관찰가능한 특성의 세트)를 기반으로 지정할 수 있는 통계 방법을 의미한다. 일부 실시형태에서, 특징은 직접적으로 관찰가능하지 않을 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 사용하는 회귀 방법은 일정한 대상체에서, 특정한 바이오마커 세트, 또는 바이오마커 시험의 세트의 정성적 또는 정량적 결과를 상기 대상체가 PDAC-양성일 확률과 연결시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "로지스틱 회귀"는 모델로부터 예측의 지정이 몇몇 허용되는 개별 값 중 하나를 가질 수 있는 회귀 방법을 의미한다. 예를 들어, 본 명세서에서 사용되는 로지스틱 회귀 모델은 일정한 대상체의 경우에, PDAC-양성 또는 PDAC-음성의 예측을 지정할 수 있다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "바이오마커 지수"는 특정 대상체에 대한 수치적 지수를 의미하는 것으로서, 통계 방법에 상기 대상체에 대한 특정한 바이오마커 수준을 입력하여 계산된다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "컷오프 지점"은 PDAC-양성 또는 PDAC-음성의 분류를 대상체에 대해 지정하는데 사용될 수 있는 특별한 통계 방법과 연관된 수학값을 의미하는 것으로서, 상기 대상체의 바이오마커 지수를 기반으로 한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "분류"는 PDAC-양성 또는 PDAC-음성으로서 대상체의 지정을 의미하는 것으로서, 상기 대상체에 대해 수득된 바이오마커 지수의 결과를 기반으로 한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "PDAC-양성"은 본 개시 내용의 방법의 결과의 결말을 기반으로, 대상체가 PDAC에 감수성으로 예측된다는 지표이다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "PDAC-음성"은 본 개시 내용의 방법의 결과의 결말을 기반으로, 대상체가 PDAC에 감수성이 아닌 것으로 예측된다는 지표이다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "윌콕슨 순위합 검정 (Wilcoxon rank sum test)"은 또한 만-위트니 U 검정 (Mann-Whitney U test), 만-위트니-윌콕슨 검정 (Mann-Whitney-Wilcoxon test), 또는 윌콕슨-만-위트니 검정(Wilcoxon-Mann-Whitney test)으로도 알려져 있으며, 2개 개체군의 비교를 위해 사용되는 특별한 통계 방법을 의미한다. 예를 들어, 이 검정은 관찰가능한 특성, 특히 바이오마커 수준을 일정 개체군의 대상체에서 PDAC의 존재 또는 부재와 연결시키는데 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "참 양성율"은 일정 방법에 의해 양성으로 분류되는 소정 대상체가 정확하게 양성일 확률을 의미한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "거짓 양성율"은 일정 방법에 의해 양성으로 분류된 소정 대상체가 정확하게 음성일 확률을 의미한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "ROC"는 다양한 컷오프 지점에서 일정 진단 방법의 효율을 추산하기 위해 본 명세서에서 사용되는 도표인, 수신자 조작 특성 (receiver operating characteristic)을 의미한다. ROC 그래프는 다양한 컷오프 지점에서 참 양성 및 거짓 양성의 분율로 구성될 수 있다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "AUC"는 ROC 그래프의 곡선하 면적을 의미한다. AUC는 일정 진단 검사의 예측력을 추정하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 더 큰 AUC는 증가된 예측력에 상응하고, 예측 오류 빈도는 감소된다. AUC의 가능한 값은 0.5 내지 1.0 범위이고, 후자의 값은 무오류 예측 방법의 특징이다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "p-값" 또는 "p"는 양성-PDAC 및 비-양성-PDAC 대상체에 대한 바이오마커 지수의 분포가 윌콕슨 순위합 검정의 경우에 동일할 확률을 의미한다. 일반적으로, 0에 가까운 p-값은 특정한 통계 방법이 대상체를 분류하는 높은 예측력을 가지게 될 것임을 의미한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "CI"는 신뢰 구간, 즉 일정 값이 일정 수준의 신뢰도로 거짓으로 예측될 수 있는 구간을 의미한다. 본 명세서에서 사용시, 용어 "95% CI"는 일정 값이 95%의 신뢰도로 거짓으로 예측될 수 있는 간격을 의미한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "감도"는 다양한 생화학적 어세이 상황에서, 질환을 갖는 대상체를 정확하게 식별하는 어세이의 능력을 의미한다 (즉, 참 양성율). 그에 비해, 본 명세서에서 사용시, 용어 "특이도"는 다양한 생화학적 어세이의 상황에서, 질환이 없는 대상체를 정확하게 식별하는 어세이의 능력을 의미한다 (즉, 참 음성율). 감도 및 특이도는 이원 분류 시험의 효율에 대한 통계적 척도이다 (즉, 분류 함수). 감도는 거짓 음성의 방지를 정량하고, 특이도는 거짓 양성에 대해 동일하다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "ALCAM"은 활성화된 백혈구 세포 부착 분자를 의미한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "CHI3L1"은 키티나제-3-유사-1을 의미한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "COL18A1"은 콜라겐 제XVIII형 알파 1을 의미한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "IGBFP2"는 인슐린-유사성장 인자 결합 단백질 2를 의미한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "LCN2"는 리포칼린 2를 의미한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "LRG1"은 류신-풍부 알파-2-당단백질 1을 의미한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "LYZ"는 리소자임 2를 의미한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "PARK7"은 단백질 디글리카제 DJ-1을 의미한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "REG3A"는 재생 패밀리 구성원 3 알파를 의미한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "SLPI"는 분비성 백혈구 프로테아제 억제제를 의미하고, 이것은 당분야에서 또한 안티류코프로테이나제로서 알려져 있다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "프로-CTSS"는 프로-카텝신 S를 의미한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "총-CTSS"는 전체 카텝신 S를 의미한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "THBS1"은 트롬보스폰딘 1을 의미한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "TIMP1"은 TIMP 메탈로펩티다제 억제제 1을 의미하고, 또한 당분야에서 메탈로프로테이나제 억제제 1로도 알려져 있다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "TNFRSF1A"는 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 1A를 의미한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "WFDC2"는 WAP 4-디술파이드 코어 도메인 2를 의미한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "CA19-9"는 탄수화물 항원 19-9를 의미하고, 또한 당분야에서 암 항원 19-9 및 시알릴화 루이스a 항원으로도 알려져 있다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "ctDNA"는 세포 무함유 또는 순환성 종양 DNA를 의미한다. ctDNA는 암 환자의 혈액에서 자유롭게 순환하는 것으로 확인된 종양 DNA이다. 이론에 국한하는 것은 아니나, ctDNA는 죽은 종양 세포로부터 기원하는 것으로 여겨지고 다양한 수준 및 돌연변이체 대립유전자 분획에, 광범위한 암에 존재할 수 있다. 일반적으로, ctDNA는 기원하는 종양 세포에서 형성되는 고유한 체세포 돌연변이를 보유하지만 숙주의 건강한 세포에는 존재하지 않는다. 이와 같이, ctDNA 체세포 돌연변이는 암-특이적 바이오마커로서 작용할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, "대사산물"은 세포 물질대사의 중간체 및/또는 생성물인 소형 분자를 의미한다. 대사산물은 세포에서 다양한 기능, 예를 들어, 구조적, 신호전달, 효소에 대한 자극 및/또는 억제 효과를 수행할 수 있다. 일부 실시형태에서, 대사산물은 예컨대, 제한없이, 아세틸스퍼미딘, 디아세틸스퍼민, 리소포스파티딜콜린 (18:0), 리소포스파티딜콜린 (20:3) 및 인돌-유사체를 포함하는, 비-단백질, 혈장-유래 대사산물 마커일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, "인돌-유사체"는 인돌로부터 유래된 화합물을 의미한다. 인돌은 화학식 C8H7N을 갖는 방향족 복소환 유기 화합물이다. 이것은 5-원 질소-함유 피롤 고리에 융합된 6-원 벤젠 고리로 이루어진 이환식 구조를 갖는다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 인돌-유사체는 인돌의 임의 유도체일 수 있다. 대표적인 예는 제한없이, 트립토판, 인돌-3-에탄올, 10,11-메틸렌디옥시-20(S)-CPT, 9-메틸-20(S)-CPT, 9-아미노-10,11-메틸렌디옥시-20(S)-CPT, 9-클로로-10,11-메틸렌디옥시-20(S)-CPT, 9-클로로-20(S)-CPT, 10-히드록시-20(S)-CPT, 9-아미노-20(S)-CPT, 10-아미노-20(S)-CPT, 10-클로로-20(S)-CPT, 10-니트로-20(S)-CPT, 20(S)-CPT, 9-히드록시-20(S)-CPT, (SR)-인돌린-2-카르복실산, IAA, IAA-L-Ile, IAA-L-Leu, IBA, ICA-OEt, ICA, 인돌-3-아크릴산, 인돌-3-카르복실산 메틸 에스테르, 인돌-3-카르복실산, 인돌-4-카르복실산 메틸 에스테르, Boc-L-Igl-OH를 포함한다.
췌장암의 진단, 병기구분 및 치료.
췌장암을 분류하는 가장 일반적인 방식은 수술로 제거될 수 있는지 여부 및 이것이 절제성, 경계 절제성, 국소 진행성, 또는 전이성으로 확산된 부위를 기반으로 4개 범주로 나누는 것이다. 절제성 췌장암은 수술로 제거될 수 있다. 이 종양은 췌장 안에만 국재할 수 있거나 또는 그것을 넘어 확장될 수 있지만, 그 영역 내에서 중요한 동맥 또는 정맥내로 성장하지 않았다. 종양이 췌장의 외부 영역으로 확산되었다는 증거는 존재하지 않는다. 오늘날 의약 산업에서 일반적인 표준 방법을 사용하여, 환자의 오직 약 10% 내지 15% 만이 이 병기에서 진단된다. 경계 절제성은 이것이 최초 진단되었을 때 수술적으로 제거하는 것이 어려울 수 있지만, 불가능하지는 않으나, 화학요법 및/또는 방사선 요법이 종양을 먼저 수축시킬 수 있다면, 음성 가장자리로 나중에 제거될 수도 있는 종양을 설명한다. 음성 가장자리는 가시적인 암 세포가 배후에 남아있지 않다는 것을 의미한다. 국소 진행형 췌장암은 여전히 췌장 주변 영역에만 국재하지만, 근처 동맥 또는 정맥 또는 근처 장기로까지 성장되었기 때문에 수술적으로 제거될 수 없다. 그러나, 신체의 임의의 먼 부분까지 확산된 징후는 존재하지 않는다. 현재 의약 산업에서 통상적인 표준 방법을 사용하여, 환자의 대략 35% 내지 40%가 이 병기에서 진단된다. 전이성은 암이 췌장 영역을 넘어서 다른 장기, 예컨대 간 또는 복부의 먼 영역까지 확산된 것을 의미한다. 오늘날 의약 산업에서 통상적인 표준 방법을 사용하여 환자의 대략 45% 내지 55%가 이 병기에서 진단된다. 대안적으로, 다른 암에 대해 통용되는 (그러나 췌장암에서는 일반적이지 않은) TNM 병기구분 체계가 사용될 수 있다. 이 체계는 종양 크기 (T), 림프절로의 확산 (M), 및 전이 (M)를 기반으로 한다.
췌장암 치료의 선택안은 암성 조직의 부분 또는 완전 외과적 제거를 위한 수술 (예를 들어, 휘플 시술, 원위 췌장절제술, 또는 췌장전적술), 하나 이상의 화학치료 약물의 투여, 및 영향받은 조직에 치료적 방사선의 투여 (예를 들어, 통상/표준 분획 방사선 요법, 정위 체부 방사선 (SBRT))을 포함한다. 췌장암의 치료에 승인된 화학치료 약물은 제한없이, 카페시타빈 (Xeloda), 엘로티닙 (Tarceva), 플루오로우라실 (5-FU), 젬시타빈 (Gemzar), 이리노테칸 (Camptosar), 류코보린 (Wellcovorin), 나브-파클리탁셀 (Abraxane), 나노리포솜 이리노테칸 (Onivyde), 및 옥살리플라틴 (Eloxatin)을 포함한다.
췌장암은 조기에, 바람직하게는 경계 절제성 병기 시에 또는 그 이전에, 보다 바람직하게는 절제성 병기에 진단될 때 가장 효과적으로 치료된다.
실시예
하기 실시예는 개시 내용의 실시형태를 입증하기 위해 포함된다. 하기 실시예는 본 개시 내용을 사용하는 당업자를 보조하기 위해 단지 예시로서 제시된다. 실시예들은 달리 개시 내용의 범주를 한정하는 임의 방식으로 의도되는 것이 아니다. 당업자는 본 개시 내용의 관점에서, 개시된 특정한 실시형태에서 많은 변화가 만들어질 수 있고 개시 내용의 범주 및 사조를 벗어나지 않고 유사하거나 또는 비슷한 결과를 여전히 얻을 수 있다는 것을 이해해야 한다.
실시예 1: 질량 분광분석 방법.
인간 혈장 샘플의 정량적 질량 분광법 (MS) 분석은 이전에 기술된 대로 수행하였다 (Faca et al., PLoS Med. 5(6):e123, 2008). 그 혈액은 증상의 개시 및 진단 이전에 채혈한 췌장 사례로 이루어진 하나의 풀의 경우에는 1,2,3-13C-아크릴아마이드 중 동위원소로 표지시키는 한편 대조군 풀은 풀의 혼합 전에 가벼운 아크릴아마이드로 표지하였다. 단백질은 Workstation Class-VP 7.4 (Shimadzu Corporation)에 의해 제어되는 자동화 온라인 2D-HPLC 시스템을 통해서 분리시켰다. 분리는 음이온 교환 크로마토그래피 이후에 역상 크로마토그래피로 이루어졌다. 각각의 분획을 동결견조시켰고, 용액 중 분해시켰으며, NanoLC-1D (Eksigent)와 커플링된 LTQ-Orbitrap (Thermo) 질량 분광계를 사용해 MS로 분석하였다.
획득된 LC-MS/MS 데이타는 CPAS (Computational Proteomics Analysis System) 파이프라인을 통해서 처리되었다 (Rauch et al., J. Proteome Res. 5(1):112-21, 2006). 커스텀 스코어링-플러그인 코멧 (custom scoring-plugin Comet)과 X!Tandem을 인간 국제 단백질 인덱스 (human International Protein Index) (IPI) 버전 3.13의 데이타베이스에 대한 검색 엔진으로서 사용하였다. 검색 알고리즘 변수는 트립신 특이도 및 최대 2개 누락 절단에 대해 설정하였다. 질량 공차는 전구체 이온의 경우 1.5 Da이었고 단편 이온의 경우에 0.5 Da이었다. [12C] 아크릴아마이드 (+71.03657)에 의한 시스테인 알킬화는 고정 변형으로서 설정되었고, [13C] 아크릴아마이드 (+3.01006) 및 메티오닌의 산화 (+15.99491)는 가변 변형으로서 설정되었다. 동정된 펩티드는 PeptideProphet (Keller et al., Anal. Chem. 74(20):5383-92, 2002)를 통해서 더욱 검증하였고 단백질은 ProteinProphet (Nesvizhskii et al., Anal. Chem. 75(17):4646-58, 2003)을 통해서 추론하였다. 단백질 동정은 ProteinProphet 평가를 기반으로 5% 오차율로 여과되었다. 단백질 정량 정보는 MS/MS에 의해 동정된 시스테인 잔기를 함유하는 펩티드의 각 쌍을 정량하기 위해 지정된 툴 Q3으로 추출하였다 (Faca et al., J. Proteome Res. 5(8):2009-18, 2006). 최소 0.75의 PeptideProphet 점수, 및 최대 20 ppm 분율 델타 질량을 갖는 펩티드만을 정량을 위해 선택하였다. [13C] 아크릴아미드-표지 대 [12C] 아크릴아미드-표지 펩티드의 비율은 히스토그램 (log2 규모) 상에서 그래프화되었고, 분포의 중간치는 0에 집중되었다. 특별한 단백질에 대한 모든 정규화된 펩티드 비율은 전체 단백질 비율을 산출하도록 평균내었다.
분석은 그 결과로 0.8 이상의 ProteinProphet 점수와 5% 미만의 오차율을 사용하여, 1,732개 단백질을 동정하였다. 결과는 또한 후속 분석에 사용되는 적어도 2종의 정량된 펩티드와 395 단백질의 정량을 포함하였다.
실시예 2: ELISA 방법.
모든 ELISA 실험의 경우에, 각각의 샘플은 이중으로 어세이되었고, 흡광도 또는 화학발광도는 SpectraMax M5 마이크로플레이트 판독기 (Molecular Devices)에서 측정되었다. 내부 대조군 샘플은 모든 플레이트에서 실시되었고 샘플의 각각의 값은 플레이트 내 가변성을 보정하기 위해서 동일한 플레이트 내 내부 대조군의 평균 값으로 나누었다.
NPC2
재조합 NPC2 (aa 20-151; SEQ ID NO:3; UniProtKB: P61916)에 대한 마우스 단일클론 항체 (#635 및 #675)를 생성시켰고 샌드위치 ELISA에서 사용하였다.
Figure pct00003
96웰 폴리스티렌 플레이트 (Corning, Canton, NY, USA)는 1 ㎍/mL의 항-NPC2 마우스 단일클론 항체 (#635)를 포획 항체로서 코팅하였고, 그 다음으로 시약 희석제 (R&D Systems)로 차단하였다. 혈청 샘플은 1:200으로 희석하였고 재조합 단백질의 연속 희석물을 표준 그래프를 만들기 위해 적용하였다. 1:4000으로 희석된 바이오틴화된 항-NPC2 마우스 단일클론 항체 (#675)가 검출에 사용되었다. 세척 후, 각 웰을 스트렙타비딘-HRP와 인큐베이션시킨 후에 발색 시약 및 중지 용액 (R&D Systems)과 인큐베이션시켰다.
실시예 3: 혈액 샘플 세트.
독립적인 복수 혈액 샘플 코호트를 PDAC 사례 (n=187), 양성 췌장 질환 (n=93), 및 건강한 대조군 (n=169)으로 이루어진 풀로부터 추출하였다. 모든 혈액 샘플은 기관 감사 위원회 (미시간 대학교 종합 암 센터, 에반스톤 병원, 유타 대학교, 텍사스 대학교 MD 앤더슨 암 센터 및 국제 암 연구 기관) 승인 및 서면 동의에 따라서 수득되었다.
초기 발굴 세트
심층 정량적 MS를 사용한 실험을 위해서, 혈장의 풀을 6명의 진단전 PDAC 사례 (성별, 남성; 중간 연령, 66.5세; 범위, 62-76세) 및 6명의 부합되는 대조군 (성별, 남성; 중간 연령, 67.0세, 범위: 61-76세)으로 구성하였다. 이들 샘플은 카로텐 및 레티놀 유효성 시험의 일부로서 샘플 채취 이후 평균 9.3개월 (범위, 8-12개월)에 병기 IA (N = 1), IB (N = 2), 및 IIB (N = 3) PDAC로 이후에 진단받은 대상체로부터 그리고 연령, 성별 및 흡연 이력이 부합되고 4년 추적 조사 기간 동안 암으로 진단받지 않은 동일 코호트의 5명 대조군으로부터 채취되었다.
환자분류 세트
75명 PDAC 사례, 27명 건강한 대조군, 및 19명 만성 췌장염 사례로 이루어진 조기 검출 연구 네트워크 후원 하의 미시간 대학교 종합 암 센터에서 수득된 혈장 샘플을 초기 검증 및 바이오마커 선택 (환자분류 세트)을 위해 사용하였다.
검증 세트
초기-병기 PDAC를 갖는 73명 환자, 60명의 건강한 대조군, 만성 췌장염을 갖는 60명 환자, 및 양성 췌장 낭종을 갖는 14명 환자로부터의 추가적인 혈장 샘플 세트를 바이오마커 순차적 검증 및 패널 개발을 위해 사용하였다. 모든 만성 췌장염 샘플은 급성 질병이 없는 클리닉에서 선택된 상황에서 채취되었다.
에반스톤 병원의 검증 세트 #1은 병기 IB 내지 IIB PDAC 사례 (n=10), 건강한 대조군 (n=10), 및 만성 췌장염 사례 (n=10)로 이루어졌고; 유타 대학의 검증 세트 #2는 초기-병기 (IA 내지 IIA) PDAC 사례 (n=42), 건강한 대조군 (n=50), 및 만성 췌장염 사례 (n=50)로 이루어졌으며; 텍사스 대학교 MD 앤더슨 암 센터의 검증 세트 #3은 절제성 PDAC 사례 (n=21) 및 양성 췌장 낭종 사례 (n=14)로 이루어졌다.
3종 검증 세트의 인구통계는 표 1에 표시되어 있다.
검사 세트
바이오마커 패널을 검사하기 위한 추가의 독립적인 혈장 샘플 세트는 39명의 초기-병기 PDAC 및 82명의 건강한 대조군으로 이루어진 국제 암 연구 기관 (International Agency for Research on Cancer)에서 수득하였다. 시험 세트에 대한 인구통계는 표 2에 표시되어 있다.
Figure pct00004
Figure pct00005
실시예 4: 통계 방법.
미가공 어세이 데이타는 각 어세이에 대한 최저 검출값의 전가 이후에, 검출 하한치 값으로 log2-변환되었다. 단측 윌콕슨 순위합 검정을 사용하여 PDAC 사례를 건강한 대조군, 만성 췌장염 사례, 및 췌장 낭종 사례와 비교하는 p-값을 산출하였다. 적용된 검정은 대체 가설 AUC > 0.50 대비 AUC = 0.50의 귀무 가설을 시험하기 위한 목적이므로 단측이었다. 수신자 조작 특성 (ROC) 그래프 분석은 PDAC 사례를 건강한 대조군, 만성 췌장염 사례, 및 췌장 낭종 사례와 구별하는 바이오마커의 효율을 평가하기 위해 수행되었다. 각 세트의 작은 샘플 크기로 인해서, 검증 세트 #1, #2, 및 #3은 평균이 0이고 표준 편차는 건강한 대조군의 경우 1이도록 데이타를 표준화함으로써 모델 개발을 위해 병합되었다. 검증 세트 #3이 건강한 대조군을 포함하지 않기 때문에, 결과는 양성 췌장 낭종 샘플이 만성 췌장염 샘플과 동일한 평균 및 표준 편차를 갖도록 표준화시켰다. 통계 분석은 MATLAB R2014b 및 SAS 버전 9.3을 사용해 수행되었다. p <0.05는 모든 분석에서 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
7종의 검증된 바이오마커 후보물의 모든 가능한 조합은 아카이케 정보 기준 (Akaike information criterion) (AIC)을 기반으로 췌장암을 건강한 대조군, 만성 췌장염 및 췌장 낭종과 구별하기 위한 로지스틱 회귀 모델을 선택하기 위해 조사되었다. 총 127개의 로지스틱 회귀 모델이 적합화되었다. 표준 오차, 신뢰 구간, 및 p 값은 계수의 가변성을 고려하여 부트스트랩의 1000회로 수득되었다. 바이오마커 패널 및 CA19-9 단독을 비교하기 위한 p 값은 1000회 부트스트랩에 의해 계산되었고 대체 AUC(패널) > AUC(CA19-9) 대비 AUC(패널) = AUC(CA19-9)의 귀무 가설을 의미한다. 우도비 검정이 또한 CA19-9 단독에 대한 바이오마커 패널의 적합도를 비교하기 위해 적용되었다. LeaveMOut 교차-검정 기술이 수득된 로지스틱 회귀 모델을 검증하기 위해 적용되었다. 데이타는 훈련 및 시험 세트로 분할되었고, 이들은 각각, 본래 데이타의 2/3 및 1/3에 상응한다. 모델은 그러한 분할 계획의 1000회 반복 및 시험 세트로부터 수득된 1000 AUC를 평균내어 검증되었다. 변형된 디자인 공변량 매트릭스가 췌장암을 만성 췌장염 및 양성 췌장 낭종 환자와 구별할 수 있는 OR 규칙으로 로지스틱 회귀 모델을 구축하기 위해 적용되었다: [I(Ca19-9>=a) Ca19-9*I(Ca19-9>=a) I(Ca19-9<a) TIMP1*I(Ca19-9<a) LRG1*I(Ca19-9<a) CA19-9*I(Ca19-9<a)]. CA19-9 한계치 "a"의 모든 가능한 값은 1000회 부트스트랩에 의해 최고 가능한 AUC를 획득하기 위해 스캐닝되었다. 부트스트랩에 의해 초기에 선택되지 않은 측정을 사용하여 예측 지수를 생성시켰고 AUC를 평가하였다. 그 절차를 1000회 반복하였고 양측 p-값은 수득된 1000 AUC에 대해 계산되었다. 최고 AUC는 "a" = 1.6로 수득되었다.
3종의 바이오마커 TIMP1, LRG1, CA19-9와 함께 공변량 (동원 센터, 성별, 연령, 흡연 상태 및 알콜 음주로 대표됨)을 포함하는 로지스틱 회귀 모델의 시험 세트의 개발에서 과적합화를 피하기 위해 2-단계 전략을 따랐다. 먼저 공변량-기반 지수를 공변량만을 포함하는 로지스틱 회귀 모델을 적합화시켜 생성시켰고, 그 다음으로 공변량-기반 지수를 단일 공변량으로서 3-바이오마커 로지스틱 회귀 모델에 첨가하였다.
실시예 5: 바이오마커 패널 후보의 선택.
상기 기술된 바와 같은 NPC2 어세이가 이 실험에서 활용되었다. 적어도 17종의 추가적인 바이오마커 패널 후보가 표 3에 열거되어 있다.
Figure pct00006
실시예 6: 바이오마커 패널 조성의 발굴.
환자분류
실험의 흐름도가 도 1에 표시되어 있다. 간략하게, 18종 바이오마커 후보의 풀은 환자분류 세트에 대한 스크리닝에 의해 조정되었다. 12종 바이오마커의 수준은 건강한 대조군과 비교하여 PDAC에서 통계적으로-유의한 정도로 더 높았고, 각각은 곡선하 면적 (AUC) > 0.60 및 p < 0.05 (윌콕슨 순위합 검정)였다 (도 2A). 이들 바이오마커 중 7종 (IGFBP2, LRG1, CA19-9, REG3A, COL18A1, TIMP1, 및 TNFRSF1A)의 수준은 또한 > 0.60의 AUC로 만성 췌장염 사례와 비교하여 PDAC 사례에서 통계적으로 유의한 정도로 더 높았다 (p < 0.05, 윌콕슨 순위합 검정) (도 2B). 이들 7종의 바이오마커 후보는 검증 세트 #1, #2 및 #3에 대한 추가 평가를 위한 환자분류 패널로서 선택되었다.
검증
환자분류 패널에서 7종 바이오마커 후보에 대해서 상기 기술된 바와 같은 3개 검증 세트를 사용한 분석을 수행하였다. 환자분류 세트에서 선택된 모든 7종 바이오마커에 대한 AUC 값은 그들 혈장 수준이 검증 세트 #1, #2 및 #3에서 부합되는 대조군과 비교하여 PDAC 환자에서 일관적으로 상승되었다는 것을 의미한다 (표 4, 5, 및 6). 검증 세트 #2에서의 만성 췌장염 사례 대비 PDAC의 비교에서 IGFBP2를 제외하고, 이들 7종 마커에 대한 AUC는 검증 세트 #1 및 #2 둘 모두에서 PDAC 사례를 건강한 대조군을 비롯하여 만성 췌장염 사례로부터 구별시에 > 0.60이었다. 또한, 4종 바이오마커 (CA19-9, TIMP1, LRG1, 및 IGFBP2)는 또한 검증 세트 #3에서 양성 췌장 낭종 사례와 비교되는 PDAC 사례 유래의 혈장 샘플 중에서 AUC > 0.60을 산출하였다 (표 6).
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
패널 구축
초기-병기 PDAC에 대한 바이오마커 패널을 개발하기 위해서, 검증 세트 #1, #2, 및 #3의 결과를 표준화시켰고 조합시켰다. 복합 검증 세트에서 전체 7종 바이오마커의 수준은 건강한 대조군 및 양성 췌장 질환 사례 (조합된 만성 췌장염 및 양성 췌장 낭종 사례) 보다 PDAC 사례에서 통계적으로 유의한 정도 (AUC > 0.60; p < 0.05, 윌콕슨 순위합 검정)로 더 높았다 (표 7). 다음으로, 로지스틱 회귀 모델을 기반으로 초기-병기 PDAC에 대한 바이오마커 패널을 개발하였다.
최종적인 회귀 모델은 다음과 같을 수 있다:
Figure pct00010
여기서 p 는 소정 샘플에서 사례일 확률을 의미한다. 이 모델은 로지트 연결 함수를 이용하는 정규 로지스틱 회귀 모델이다. 이원 질환 상태는 반응의 역할을 하고 마커는 공변량의 역할을 한다. 이러한 회귀 모델을 적합화하기 위한 알고리즘은 표준 알고리즘이고 일반화된 선형 모델의 표준 참고서에 상술된 반복 재가중 절차를 기반으로 한다 (McCullogh et al., Generalized Linear and Mixed Models (2008); Wiley Series in Probability and Statistics, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey). 그러나, 이러한 표준 접근법이 이를 적합화시킨 모델에 적용되더라도, 기본 AUC에 대한 추론을 제공할 수 없다. AUC를 의미하는 p-값 및 신뢰 구간을 제공하기 위해, 추정된 계수의 가변성을 고려할 수 있기 위해서 계수의 재추정을 각 부트스트랩 샘플 (총 1000개) 내에서 수행한 부트스트랩 계획이 적용되었다.
LeaveMOut 교차-검증 기술은 최종 로지스틱 회귀 모델을 검증하기 위해 적용되었다. PDAC 사례와 건강한 대조군의 비교에서, 최종 패널은 CA19-9 단독의 AUC 보다 훨씬 크게 통계적으로 유의한 정도 (AUC (95% CI) = 0.882 (0.809-0.956); p = 0.003, 부트스트랩; p < 0.001, 우도 비율 검정; 표 8 및 도 3A)인, 0.949 (0.917-0.981)의 AUC (95% CI) 및 0.936의 교차-검정 관련 평균 AUC를 산출하는 TIMP1, LRG1, 및 CA19-9로 이루어졌다. 이 패널은 각각 95% 및 99% 특이도에서 0.849 및 0.658의 감도를 산출하였는데 반해, CA19-9 단독의 경우에 95% 및 99% 특이도에서 감도는 각각 0.726 및 0.411이었다. 건강한 대조군과 PDAC 사례의 비교에서 CA19-9 단독에 대한 상당한 개선은 동일한 바이오마커 조합 (TIMP1, LRG1, 및 CA19-9)을 기반으로 하는 모델이 검증 세트 #2에서 훈련되고 검증 세트 #1에서 고정 계수에 의해 시험되었을 때 관찰되었다 (p = 0.04, 훈련 세트에서 부트스트랩; p = 0.02, 시험 세트에서 부트스트랩; (표 9). 결과는 또한 종양 크기가 이용가능했던 검증 세트 #2에서, 패널-기반 바이오마커 지수가 종양 크기에 대한 통계적 유의성과 상관되지 않았다는 것을 의미한다. 이론에 국한하려는 것은 아니나, 이것은 작은 치수의 종양을 검출하는 바이오마커 조합의 능력을 시사한다 (도 4).
동일한 바이오마커 조합 (TIMP1, LRG1, 및 CA19-9)을 기반으로 하는 로지스틱 회귀 모델은 PDAC을 양성 췌장 질환 사례와 구별하도록 개발되었다 (AUC (95% CI) = 0.846 (0.781-0.911) 및 교차-검증 관련 평균 AUC = 0.830, 표 8). CA19-9 단독 또는 모든 3종 마커의 조합에 의한, "OR" 규칙-기반 선형 회귀 모델이 PDAC 및 양성 췌장 질환 사례를 구별할 수 있는지 여부를 또한 조사하였다. TIMP1, LRG1, 및 CA19-9의 "OR" 규칙 조합은 0.890 (0.802-0.978)의 AUC (95% CI)를 산출하였는데, 이것은 CA19-9 단독의 것보다 훨씬 더 크게 통계적으로 유의한 정도였다 (AUC (95% CI) = 0.831 (0.754-0.907); p < 0.001 부트스트랩; p < 0.001, 우도 비율 검정; 표 8 및 도 3B).
양성 췌장 질환으로부터 PDAC의 구별을 위한 회귀 모델은 다음과 같을 수 있다:
Figure pct00011
여기서 log는 밑수가 2인 로그를 의미한다. 이것은 로지트 연결 함수를 적용하고 반응으로서 이원 질환 상태 및 공변량으로서 마커를 사용하여 정규 로지스틱 회귀 모델을 적합화시켜 수득되었다. 이러한 회귀 모델을 적합화시키기 위한 알고리즘은 표준 알고리즘이고 일반화된 선형 모델의 표준 참고서에 상술된 반복 재가중 절차를 기반으로 한다 (McCullogh et al., supra). OR 규칙은 CA19-9 단독 및 3종 마커 패널 간 트레이드오프가 그리드 서치를 통해 변화될 수 있는 결정값을 기반으로 고려되었다는 것을 더욱 고려하였다. 즉 정규 로지스틱 회귀 모델은 디자인 매트릭스가 CA19-9를 통해서만 또는 3종 마커 전부를 통해서 기여된 것을 고려하였다. 이러한 기여를 결정하는 한계치 지점의 미세 그리드를 기반으로, 예시적인 AUC는 모든 그리드 지점에 대해 모든 모델을 반복적으로 적합화시킨 후에 유도될 수 있는 것을 추출하였다.
패널은 95% 특이도에서 0.452의 감도를 산출하였는데, 이것은 CA19-9 단독에 대한 95% 특이도에서 0.288의 감도보다 개선을 의미한다. TIMP1, LRG1, 및 CA19-9의 "OR" 규칙 조합은 그 결과로 0.955 (0.890-1)의 AUC (95% CI)를 산출하는 건강한 대조군 대비 PDAC 환자의 비교에 적용시 높은 진단 정확도를 생성시켰다 (p vs. CA19-9: p < 0.001 부트스트랩; p < 0.001, 우도 비율 검정; 표 8).
Youden 지수-기반 최적 컷-오프 지점에서 오즈비를 추정하였다. 건강한 대조군 대비 초기-병기 PDAC 사례를 위한 모델의 경우, log (오즈비)는 0.849의 감도 및 0.950의 특이도의 컷-오프 지점에서 4.67 (95% CI = 3.29-6.05)이었다. 양성 췌장 질환 사례 대비 초기-병기 PDAC 사례를 위한 모델의 경우에, log (오즈비)는 0.863의 감도 및 0.757의 특이도의 컷-오프 지점에서 2.98 (95% CI = 2.04-3.91)이었다.
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
실시예 7: 바이오마커 패널의 평가.
3종의 바이오마커 TIMP1, LRG1, 및 CA19-9의 패널의 추가 맹검 검증을 시험 세트를 사용해 수행하였다. 모든 3종 바이오마커의 수준은 건강한 대조군보다 PDAC 사례에서 유의하게 높았는데 AUC (95% CI)가 CA19-9의 경우 0.821 (0.736-0.906)이었고, TIMP1의 경우 0.730 (0.626-0.834)이었으며, LRG1 (표 10)의 경우 0.832 (0.755-0.909)였다. 3종 마커의 선형 조합은 0.903 (0.838-0.967)의 AUC (95% CI)를 산출하였는데, 이것은 AC19-9 단독의 AUC 보다 훨씬 크게 통계적으로 유의한 정도였다 (p = 0.001, 부트스트랩; p < 0.001, 우도 비율 검정; 표 11). 게다가, TIMP1, LRG1, CA19-9 및 공변량 (동원 센터, 성별, 연령, 흡연 상태, 및 알콜 소비로 표시됨)의 선형 조합은 0.929 (0.878-0.980)의 AUC (95% CI)를 산출하였는데, 이것은 CA19-9 및 공변량 조합 단독에 대한 것보다 통계적으로 유의한 개선을 나타낸다 (AUC (95% CI) = 0.848 (0.778-0.920); p = 0.01, 부트스트랩; p < 0.001, 우도 비율 검정; 표 11). 공변량의 포함은 그 결과로 3종 바이오마커 패널 단독과 비교하여 효율에 통계적으로 유의한 개선이 일어나게 하였다 (p = 0.03, 부트스트랩; p = 0.004, 우도 비율 검정; 표 11).
특히, 건강한 대조군 대비 PDAC에 대한 복합 검증 세트에서 개발된 고정 계수와 CA19-9, TIMP1 및 LRG1의 로지스틱 회귀 모델은 0.887의 AUC를 산출하여, 역시 CA19-9 단독과 비교해 통계적으로 유의하게 개선된 효율을 가졌다 (p = 0.008, 우도 비율 검정; 표 10 및 도 5). 이 모델은 95% 및 99% 특이도에서, 각각, 0.667 및 0.410의 감도를 산출한데 반해서, CA19-9 단독에 대한 95% 및 99% 특이도에서 감도는 각각 0.538 및 0.462였다. Youden 지수-기반 최적 컷-오프 지점에서 Log-변환된 오즈비는 0.872의 감도 및 0.780의 특이도로 컷-오프 지점에서 3.19 (95% CI = 2.11-4.26)였다.
실시예 8: 다양한 회귀 모델 진단 지수에서 특이도 및 감도
상이한 시약을 사용하여 포함될 수 있는 바이오마커 검출, 정량 및 분석의 상이한 방법 또는 어세이가 회귀 모델의 변형을 요구할 수 있는 상이한 결과를 생성시키게 될 것이라는 것을 당업자는 이해하게 될 것이다. 특히, 상이한 어세이는 예를 들어, 상이한 단위로 표시되는 결과를 생성시킬 수 있다. 또한, 동일 샘플의 이중 어세이에서 이중 반응이 또한 상이한 미가공 결과를 생성시킬 수 있다. 그러나, 본 명세서에 개시된 바와 같은 회귀 모델에 통합시킬 때, PDAC의 확정적인 진단을 하는 것은 적어도 3종의 바이오마커 TIMP1, LRG1, 및 CA19-9의 조합된 검출, 정량 및 분석이다.
3종의 바이오마커를 검출하고, 정량하고, 분석하는데 사용되는 각각의 특정한 어세이에 대해 보고되는 다양한 결과들은 부분적으로, 감도 또는 특이도의 정도에 의존하는 최종 PDAC-예측 지수의 일정 범위를 가지게 될 것이다 (표 12; Youden 기수를 기반으로 하는 바람직한 컷오프는 0.95의 특이도 및 0.8493의 감도에서 0.8805이다). PDAC-예측 지수를 생성시키는데 사용되는 회귀 모델은 마커를 시험하는데 활용된 특별한 어세이에 의존적일 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 상이한 어세이는 3종의 바이오마커의 상이한 에피토프를 표적으로 할 수 있거나 또는 상이한 친화성 및 감도를 가질 수 있다. 이와 같이, PDAC-예측 지수를 생성시키는데 사용되는 회귀 모델 알고리즘은 이들 어세이 변동성을 고려하여 변형시킬 수 있다.
실시예 9: 샘플 어세이 및 PDAC-환자 진단.
일례에서, 본 명세서에 개시된 3-바이오마커 패널을 기반으로 PDAC에 대해 스크리닝된 환자는 혈액 샘플 (또는 다른 유체 또는 조직 생검)을 채취하여 환자에서 TIMP1, LRG1, 및 CA19-9의 수준을 정량하기 위해 ELISA (또는 다른 어세이)에 의해 어세이된다. 사용되는 특별한 어세이 (예를 들어, ELISA; 표 3)에서 고려되는 적어도 이들 바이오마커에 대한 정규화된 값은 예를 들어 TIMP1 = 0.6528 ng/mL; LRG1 = 2.0498 ng/mL; 및 CA19-9 = 1.8160 U/mL일 수 있다. 그 다음에 미가공 어세이 데이타는 log2-변환되고, 각 코호트에서 건강한 샘플에 대한 평균 및 표준 편차가 계산된다. 그 다음으로 데이타는 건강한 샘플이 0의 평균 및 1의 표준 편차를 갖도록 표준화된다: (판독치j - 평균건강) / (std건강), 여기서 j는 j번째 샘플이다.
하기 회귀 모델을 사용해 분석했을 때, 상기 환자는 2.1653의 조합 지수를 가진다:
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특이도 및 감도를 고려한 바람직한 컷오프의 관점에서 (표 12), 이러한 조합 지수를 갖는 환자는 거의 확실하게 PDAC를 가질 것이므로 결론적으로 본 명세서에서 논의되고 당업자에게 공지된 다른 형식을 사용하여 PDAC에 대한 후속 시험 및 치료가 지시될 것이다. 본 명세서에 기술된 회귀 모델을 사용하여, 조합된 PDAC-예측 지수가 보다 양성일수록, 더 확실하게 환자는 PDAC를 갖는다. 반대로, 조합된 PDAC-예측 지수가 보다 음성일수록, 더 확실하게 환자는 PDAC를 갖지 않는다.
대조적으로, 다른 예에서, 사용되는 특별한 어세이에서 고려되는 바이오마커 TIMP1, LRG1, 및 CA19-9에 대한 정규화된 값이 예를 들어 TIMP1 = -2.0370 ng/mL; LRG1 = -1.5792 ng/mL; 및 CA19-9 = 1.0712 U/mL일 수 있다. 상기와 동일한 회귀 모델을 사용하여 분석했을 때, 이러한 환자는 -6.2666의 조합 지수를 갖게 된다. 특이도 및 감도 둘 모두의 고려에 바람직한 컷오프 관점에서 (표 12), 이러한 조합 지수를 갖는 환자는 거의 확실하게 PDAC를 갖지 않을 것이고, 그러므로 임의의 다른 임상적 병태의 강도를 기반으로 추가 시험을 후속하거나 또는 그러할 필요가 없을 것이다.
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실시예 10: 초기 병기 췌장암의 검출을 위한 혈장 대사산물 및 단백질 마커를 조합한 패널
비표적화 대사체 접근법을 사용하여, 혈장-유래 대사산물 바이오마커 패널이 절제성 췌관 선암종 (PDAC)에 대해 개발되었다. 액상 크로마토그래피/질량 분광법을 사용한 다중-어세이 대사체 접근법을 20명 (10명의 초기 및 10명의 후기 병기) PDAC 사례 및 20명의 부합되는 대상체 (10명의 건강한 대상체; 만성 췌장염을 갖는 10명 대상체)로부터 채취된 혈장에 적용하여 PDAC에 대한 후보 대사산물 마커를 동정하였고; 후보 마커는 9명 PDAC 및 50명의 양성 췌장 질환 (BPD)을 갖는 대상체로 이루어진 제2 '확증' 코호트를 기반으로 좁혀주었다. 맹검 검증은 39명 절제성 PDAC 사례 및 82명의 부합되는 대조군으로 이루어진 독립 코호트에서 수행되었다. 아세틸스퍼미딘, 디아세틸스퍼민, 리소포스파티딜콜린 (18:0), 리소포스파티딜콜린 (20:3) 및 인돌-유사체를 포함하는 5종의 대사산물은 PDAC에 대한 후보 바이오마커로서 발굴 및 '확증' 코호트에서 동정되었다. 대사산물 패널은 로지스틱 회귀 모델을 기반으로 개발되었고 조합된 발굴 및 '확증' 코호트에서 건강한 대조군으로부터 PDAC를 구별하는 그 능력에 대해 평가되었다. 최종 패널은 0.90의 곡선하 면적 (AUC) (95% C.I.: 0.818-0.989)을 산출하였다. 대사산물 패널의 맹검 검증은 독립 검증 코호트에서 0.89의 AUC (95% C.I.: 0.828-0.956)를 산출하였다. 중요한 것은 우리의 이전에 동정된 단백질 마커 (CA19-9, TIMP1 및 LRG1)와 조합한 대사산물 마커의 평가는 검증 코호트에서 0.92의 AUC를 산출하였고, 이것은 단백질 패널 단독보다 통계적으로 유의하게 더 커서 (AUC= 0.86; p-값: 0.024), 3-단백질 마커 패널과 조합했을 때 대사산물 패널의 보완적인 성질을 강조한다.
췌관 선암종 (PDAC)은 5년간 전체 생존율이 겨우 ∼8%로, 미국에서 여성과 남성 둘 모두에서 3번째로 주요한 암-관련 사망률의 원인이다. 안타깝게도 초기 병기에서 PDAC의 진단은 흔치 않고 일반적으로 국소 진행성 또는 전이성 질환을 나타내는 대부분의 환자 (∼85%)에서 우연하게 일어난다.
현재, 무증상성 개체에서 초기 병기 PDAC에 대해 바람직한 효율 특징을 나타내는 임상 마커(들)는 존재하지 않는다. 스크린 바이오마커로서 CA19-9의 현재 사용은 이의 가변적인 정확도, 질환의 진단전 병기에서 낮은 효율, 및 푸코실트랜스퍼라제 결핍된 대상체의 ∼10%에서의 검출불능성에 의해 제한적이다. 결론적으로, 무증상성 개체에서 저용량 PDAC의 신뢰할만한 검출을 위해 총체적으로 더 높은 감도 및 특이도를 나타내는 추가 마커에 대한 결정적인 요구가 존재한다. 이러한 상황에서, 혈액-기반 바이오마커(들)는 이상적이며 초기 병기 질환을 검출하기 위한 비교적 비침습적이고 비용-효율적인 방법을 의미한다.
최근에, CA19-9를 보완할 수 있는, 초기-병기 PDAC를 검출하기 위한 단백질-기반 바이오마커 패널의 개발 및 순차적 검증이 수행되었다. CA19-9 단독에 비해 분류 효율이 개선되었지만, 개선의 여지가 여전히 남아있다. 따라서, 이러한 도전적인 적용을 위한 최적 바이오마커 조합 모델을 개발할 수 있는, 상이한 유 형의 바이오마커, 예컨대 대사산물의 상대적 기여도를 시험하려는 요구가 존재한다.
본 연구에서, 비표적화 대사체 접근법은 PDAC에 대한 혈장-유래 대사산물 바이오마커 패널을 개발하기 위해 적용되었다. 고정된 바이오마커 패널은 이전에 동정된 단백질 패널에 대한 비교이외에도 39명의 절제성 PDAC 사례 및 82명의 부합되는 건강한 대조군으로 이루어진 독립 시험 코호트에서 이후에 맹검으로 검증되었다. 대사산물 패널의 효율은 양성 췌장 낭종으로 진단된 대상체로부터 PDAC 사례를 구별하기 위해 추가적으로 시험되었다.
실험 개체군
모든 인간 혈액 샘플은 기관 감사 위원회 승인 및 서면 동의에 따라 수득되었다. 초기 대사산물 발굴 실험을 위해서, 10명의 초기-병기 및 10명의 후기 병기 PDAC를 포함하는 PDAC를 갖는 20명의 환자, 10명의 건강한 대조군, 및 만성 췌장염을 갖는 10명의 환자 유래의 혈장 샘플은 에반스톤 병원 (발굴 세트)에서 수득하였다. 모든 만성 췌장염 샘플은 급성 질병의 부재 하에서 클리닉의 선택 상황에서 채취되었다. 저등급 이형성 췌장 낭종을 갖는 50명 환자 및 침습성 IPMN (5명의 초기-병기 및 4명의 후기-병기 선암종)을 갖는 9명의 환자로 이루어진, 인디아나 대학 의과대학에서 수득한 혈장 샘플을 바이오마커의 순차적 선택 및 초기 검증 (확증 세트)에 사용하였다. 모든 환자는 그들의 낭종 병변의 외과적 절제술을 겪었고, 혈장 샘플은 수술 전에 채취되었다. 이형성 등급은 외과적 절제술 이후에 조직병리학으로 확인되었고 WHO 기준에 따라 결정되었다. 조합된 바이오마커 패널을 시험하기 위한 추가의 독립적인 혈장 샘플은 국제 암 연구 기관에서 수득하였고, 39명의 초기-병기 PDAC 및 82명의 건강한 대조군 (시험 세트 #1)으로 이루어졌다. 저등급 이형성 췌장 낭종을 갖는 102명 환자, 절제성 침습성 IPMN을 갖는 12명 환자, 및 IPMN을 갖는 절제성 8명 PDAC 환자로 이루어진 인디아나 대학 의과 대학으로부터의 제2 샘플 세트를 시험 세트 #2로서 적용하였다. 검증 세트 및 시험 세트 내 환자의 임상적 특징 및 실험 흐름도는 도 5 및 표 13 및 14에 표시되어 있다.
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세포주 대사체 실험
PDAC 세포주 (CFPAC, MiaPaCa, SU8686, BxPC3, CAPAN2, PANC03.27 및 SW1990)는 10% FBS가 포함된 RPMI-1640에서 성장시켰다. 각 세포주의 정체성은 PowerPlex 1.2 키트 (Promega)를 사용한 mRNA 및 총 단백질 용해물 제조시에 짧은 탠덤 반복부를 통한 DNA 핑거프린팅을 통해서 확인되었다. 핑거프린팅 결과는 세포주의 초대 공급원에 의해 유지된 기준 핑거프린트와 비교되었다. 세포는 6-cm 디쉬 (Thermo Scientific)에 파종되어서 초기 파종 후 24시간에, 70% (50-80%) 컨플루언시에 도달하였다. 24시간 후에, 세포 용해물을 사전 냉각된 0.9% NaCl로 2× 세척시켰고 그 다음으로 1 mL의 사전 냉각된 추출 완충액 (3:1 이소프로판올:초순수)을 첨가하여 켄칭시키고 세포 배지를 제거하였다. 그 다음으로 세포를 추출 용매 중에서 25-cm 세포 스크래퍼 (Sarstedt)로 긁어 모아서 1.5-mL 에펜도르프 튜브로 옮겼다. 잠시 와류 시킨 후에, 추출된 세포 용해물은 4℃에서 10분 동안 2,000 x g에서 원심분리시켰다. 그 이후에, 추출된 대사산물을 함유하는 1 mL의 상청액을 1.5-mL 에펜도르프 튜브로 옮겼고 대사체 분석이 필요할 때까지 -20℃에 저장하였다.
세포외대사체 실험
세포를 12웰 디쉬 (Costar) 중 1 mL의 RPMI 1640 + 10% FBS에서 성장시켜, 초기 파종 후 24시간에, 70% (50-80%) 컨플루언시에 도달되었다. 실험 당일에, 세포를 5 mM 포도당 및 0.5 mM 글루타민을 함유하는 500 ㎕의 무혈청 RPMI (Fisher Scientific)로 2회 세척하였다. 그 다음으로 5 mM 포도당 및 0.5 mM 글루타민을 함유하는 무혈청 RPMI (300 ㎕)를 각 웰에 첨가하였고 세포를 인큐베이션시켰다. 사전 결정된 인큐베이션 시간 (1시간, 2시간, 4시간, 및 6시간) 후에, 250 ㎕의 조건화 배지를 수집하였다. 기준치 (T0)의 경우, 250 ㎕의 배지를 300 ㎕의 첨가 직후에 수집하였다. 모든 시점은 삼중 또는 사중으로 수행되었다. 배지만을 함유하는 블랭크 샘플을 포함시켰고 T0 및 T6에 수집되었다. 6-시간 샘플은 데이타 정규화를 위해 세포수를 계측하는데 사용되었다. 모든 배지 샘플이 수집되면, 튜브를 2000 x g에서 10분 동안 원심분리하여 잔여 찌꺼기를 제거하였고 상청액을 1.5-mL 에펜도르프 튜브로 옮기고 대사체 분석에 사용될 때까지 -80℃에 저장하였다.
주요 대사산물 및 생원성 아민
혈장 대사산물은 96-웰 마이크로플레이트 (Eppendorf) 중에서 30 ㎕의 LCMS 등급 메탄올 (ThermoFisher)을 사용해 사전-분취된 EDTA 혈장 (10 ㎕)으로부터 추출되었다. 플레이트를 가열 밀봉시켰고, 5분 동안 750 rpm에서 와류시켰고, 2000 x g에서 10분동안 실온에서 원심분리시켰다. 상청액 (10 ㎕)을 조심스럽게 96-웰 플레이트로 옮겼고, 침전된 단백질은 남겨두었다. 상청액을 10 ㎕의 100 mM 암모늄 포르메이트, pH 3으로 더욱 희석하였다. 친수성 상호작용 액상 크로마토그래피 (HILIC) 분석을 위해서, 샘플을 60 ㎕의 LCMS 등급 아세토니트릴 (ThermoFisher)로 희석하는 한편, C18 분석용 샘플은 60 ㎕의 물 (GenPure Ultrapure Water system, ThermoFisher)로 희석하였다. 각각의 샘플 용액을 LCMS 분석을 위해 384-웰 마이크로플레이트 (Eppendorf)로 옮겼다.
세포 용해물의 경우, 100 ㎕ (3:1 이소프로판올:초순수)를 2개 300 ㎕, 96-웰 플레이트 (Eppendorf)로 옮겼고 진공 하에 건조 증발시켰다. 다음으로 샘플을 하기와 같이 재구성시켰다: HILIC 어세이의 경우, 건조된 샘플을 65 ㎕의 ACN (Fisher Scientific): 100 mM 암모늄 포르메이트 pH 3 (9:1)에 용해시킨 한편 역상 C18 어세이의 경우 건조된 샘플을 65 ㎕의 H2O: 100 mM 암모늄 포르메이트 pH 3 (9:1)에 용해시켰다. 다음으로 샘플을 스핀 다운시켜서 임의의 불용성 물질들을 제거시켰고 LCMS를 사용한 고속 대량 분석을 위해 384-웰 플레이트로 옮겼다.
냉동된 배지 샘플을 얼음에서 해동시켰고, 30 ㎕를 100 mM 암모늄 포르메이트, pH 3.0를 함유하는 96-웰 마이크로플레이트 (Eppendorf)로 옮겼다. 마이크로플레이트를 가열 밀봉시켰고, 5분 동안 750 rpm에서 와류시켰으며, 2000 x g에서 10분 동안 실온에서 원심분리시켰다. 친수성 상호작용 액상 크로마토그래피 (HILIC) 분석의 경우, 25 ㎕의 샘플을 75 ㎕ 아세토니트릴을 함유하는 새로운 96-웰 마이크로플레이트로 옮겼고, 다른 한편으로 C18 분석을 위한 샘플은 75 ㎕의 물 (GenPure Ultrapure Water system, ThermoFisher)을 함유하는 새로운 96-웰 마이크로플레이트로 옮겼다. 각각의 샘플은 LCMS 분석을 위해 384-웰 마이크로플레이트 (Eppendorf)로 옮겼다.
각 뱃치의 경우, 샘플을 임의추출하였고 매트릭스-부합되는 기준 품질 관리 및 뱃치-특이적 풀링된 품질 관리를 포함시켰다.
복합 지질
사전 분취된 EDTA 혈장 샘플 (10 ㎕)은 96-웰 마이크로플레이트 (Eppendorf) 중에서 30 ㎕의 LCMS 등급 2-프로판올 (ThermoFisher)을 사용해 추출되었다. 플레이트를 가열-밀봉하였고, 5분 동안 750 rpm에서 와류시켰으며, 2000 x g에서 10분 동안 실온에서 원심분리시켰다. 상청액 (10 ㎕)을 조심스럽게 96-웰 플레이트로 옮겼고, 침전된 단백질은 남겨두었다. 상청액은 90 ㎕의 1:3:2의 100 mM 암모늄 포르메이트, pH 3 (Fischer Scientific): 아세토니트릴: 2-프로판올로 더 희석하였고 LCMS를 사용한 지질 분석을 위해 384-웰 마이크로플레이트 (Eppendorf)로 옮겼다.
세포 용해물의 경우에, 300 ㎕, 96-웰 플레이트에서, 추출된 세포 용해 대 사산물의 10 ㎕ 상청액 (3:1 이소프로판올:초순수)을 90 ㎕의 1:3:2의 100 mM 암모늄 포르메이트, pH 3: 아세토니트릴: 2-프로판올 (Fisher Scientific)로 희석하였고 LCMS를 사용한 분석을 위해 384-웰 마이크로플레이트 (Eppendorf)로 옮겼다.
각각의 뱃치의 경우, 샘플을 임의추출하였고 매트릭스-부합된 기준 품질 대조군 및 뱃치-특이적 풀링된 품질 대조군을 포함시켰다.
주요 대사산물 및 생원성 아민의 비표적화 분석
비표적화 대사체 분석은 Xevo G2-XS 4중극 비행시간 (qTOF) 질량 분광계에 커플링된 2D 컬럼 재생 구성 (I-클래스 및 H-클래스)을 갖는 Waters Acquity™ UPLC 시스템에서 수행되었다. 크로마토그래피 분리는 45℃에서 HILIC (Acquity™ UPLC BEH 아미드, 100Å, 1.7 ㎛, 2.1×100 mm, Waters Corporation, Milford, U.S.A) 및 C18 (Acquity™ UPLC HSS T3, 100Å, 1.8 ㎛, 2.1×100 mm, Water Corporation, Milford, U.S.A) 컬럼을 사용해 수행되었다.
4원 용매계 이동상은 (A) 수중 0.1% 포름산, (B) 아세토니트릴 중 0.1% 포름산 및 (D) 100 mM 암모늄 포르메이트, pH 3이었다. 샘플은 다음의 농도구배 프로파일을 사용해 분리되었다: HILIC 분리의 경우 95% B 및 5% D의 출발 농도 구배가 0.4 mL/분 유속으로 5-분 기간 동안 70% A, 25% B 및 5% D로 선형으로 증가되었고, 그 다음으로 0.4 mL/분 유속에서 1분 등용매 농도구배였다. C18 분리의 경우, 크로마토그래피 농도구배는 다음과 같다: 출발 조건, 100% A, 5% A, 95% B의 최종 조건까지 선형 증가 이후, 1분 동안 95% B, 5% D에서 등용매 농도구배.
바이너리 펌프가 컬럼 재생 및 평형화에 사용되었다. 용매계 이동상은 (A1) 100 mM 암모늄 포르메이트, pH 3, (A2) 2-프로판올 중 0.1 % 포름산 및 (B1) 아세토니트릴 중 0.1 % 포름산이었다. HILIC 컬럼은 5분 동안 90% A2를 사용해 스트립핑된 후에 0.3 mL/분 유속으로 100% B1을 사용해 2분 평형화되었다. 역상 C18 컬럼 재생은 2분 동안 95% A1, 5% B1을 사용해 수행된 후에 5분 동안 5% A1, 95% B1을 사용해 컬럼 평형화되었다.
복합 지질의 비표적화 분석
지질체 어세이를 위해 비표적화 대사체 분석이 Xevo G2-XS 4중극 비행시간 (qTOF) 질량 분광계에 커플링된 2D 컬럼 재생 구성 (I-클래스 및 H-클래스)을 갖는 Waters Acquity™ UPLC 시스템에서 수행되었다. 크로마토그래피 분리는 C18 (Acquity™ UPLC HSS T3, 100Å, 1.8 ㎛, 2.1×100 mm, Water Corporation, Milford, U.S.A) 컬럼을 사용해 55℃에서 수행되었다. 이동상은 (A) 물, (B) 아세토니트릴, (C) 2-프로판올 및 (D) 500 mM 암모늄 포르메이트, pH 3이었다. 20% A, 30% B, 49% C, 및 1% D의 출발 용리 농도구배는 5.5분 동안 10% B, 89% C 및 1 % D로 선형으로 증가되었고, 그 이후에 1.5분 동안 10% B, 89% C 및 1% D에서 등용매 용리 및 1분 동안 초기 조건으로 컬럼 평형화되었다.
질량 분광법 데이타 획득
질량 분광법 데이타는 주요 대사산물의 경우 50-1200 Da 범위 내에서 그리고 복합 지질의 경우에 100-2000 Da 내에서의 감도, 양성 및 음성 전기분무 이온화 방식으로 획득되었다. 전기분무 획득의 경우, 연속 방식으로 0.5초의 스캔 시간으로, 모세관 전압은 1.5 kV (양성), 3.0 kV (음성), 30 V의 샘플 콘 전압, 120℃의 소스 온도, 50 L/h의 콘 가스 흐름, 및 800 L/h의 탈용매 가스 흐름으로 설정되었다. 류신 엔케팔린; 락스프레이 보정 및 스캔을 위해 556.2771 Da (양성) 및 554.2615 Da (음성)은 0.5분 동안 수행되었다. 각 샘플에 대한 주입 부피는 달리 명시하지 않으면 3 ㎕였다. 샘플 획득 시간 동안 장비 감도를 최적화시키기 위해 장비 자동 이득 제어로 수행되었다.
풀링된 품질 관리 샘플은 주입 순서에 의해 LOESS 보정을 가능하게 하고 복제 정확성을 평가하기 위해 정해진 수의 샘플 이후에 분석되었다. 추가 데이타는 풀링된 품질 대조 샘플에 대해 MSe 기능을 사용해 포착되었다.
데이타 프로세싱
LC-MS 및 MSe 데이타의 피크 선택 및 체류 시간 정렬은 Progenesis QI (Nonlinear, Waters)를 사용해 수행되었다. 데이타 프로세싱 및 피크 주석달기는 인-하우스 자동화 파이프라인을 사용해 수행되었다. 주석은 NIST MSMS, LipidBlast 또는 HMDB v3 이론적 단편화에 대해 실험적 탠덤 질량 분광법을 일치시키고/시키거나 진짜 표준으로부터 생성된 맞춤형 라이브러리를 사용해 정확한 질량과 체류 시간을 일치시켜 결정되었다. 주입 순서 이동에 대해 보정하기 위해, 각 특성은 작업 서열 전반에서 10회 주입 마다 수집된 품질 대조 샘플의 반복 주입으로부터의 데이타를 사용해 정규화되었다. 측정 데이타는 이전에 기술된 바와 같이 국소 가중 산점도 평활 (Locally Weighted Scatterplot Smoothing) (LOESS) 신호 보정 (QC-RLSC)으로 평활화시켰다 (1). 오직 품질 대조 샘플에서 30 미만의 상대 표준 편차 (RSD)를 나타내는 검출 특성을 추가 통계 분석에 고려하였다. 데이타 매트릭스 복잡성을 감소시키기 위해서, 다수 부가물 또는 획득 방식 반복이 있는 주석달린 특성을 하나의 대표적인 고유 특성으로 정리시켰다. 특성들은 복제 정확성 (RSD<30), 강도 및 이론적 동위원소 분포에 일치되는 최고 동위원소 유사성을 기반으로 선택되었다. 값은 소정 피분석물에 대한 모든 분석 뱃치로 작업된 역사적 품질 제어 기준 샘플의 중앙값에 대한 비율로서 기록된다.
효소-연결 면역흡착 어세이
CA19-9, LRG1, 및 TIMP1에 대한 혈장 단백질 농도는 이전에 기술된 대로 결정되었다 (Capello et al., 2017). 모든 ELISA 실험의 경우, 각각의 샘플은 이중으로 어세이되었고 흡광도 또는 화학발광도는 SpectraMax M5 마이크로플레이트 판독기 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)에서 측정되었다. 내부 대조군 샘플은 모든 플레이트에서 실시되었고 샘플의 각 값은 보간 가변성에 대한 보정을 위해서 동일 플레이트 내 내부 대조군의 평균 값으로 나누었다.
유전자 발현 데이타 및 네트워크
Badea 데이타세트에 대한 유전자 발현은 oncomine 데이타베이스로부터 다운로드하였다. 네트워크는 사이토스케이프를 사용해 시각화시켰다.
통계 분석
수신자 조작 특성 (ROC) 그래프 분석은 양성 췌장 질환 (만성 췌장염 또는 췌장 낭종)으로 진단받은 대상체 및 건강한 대조군으로부터 PDAC 사례를 구별하는데 있어서 바이오마커의 효율을 평가하기 위해 수행되었다.
모든 바이오마커의 개별 효율에 상응하는 AUC는 수신자 조작 특성 그래프 (ROC)의 경험적 추정자 하의 영역을 사용해 추정된다. 각각의 바이오마커의 개별 효율에 대해 제시되는 표준 오차 (S.E.) 및 상응하는 95% 신뢰 구간은 대조군 및 질환있는 1000 부트스트랩 샘플에 대한 별도의 교체로 재-샘플채취가 수행된 부트스트랩 절차를 기반으로 하였다. 마커 LPC (18:0), LPC (20:3), 및 인돌-3-락테이트의 경우, 이들 마커가 암 관련 샘플에 상응하는 것들과 비교되는 대조군에 대해 더 높은 측정치를 나타내는 경향이 있기 때문에, 역 방향성이 고려되었다는 것을 언급하였다. 모델 구축은 로지트 연결 함수를 사용하는 로지스틱 회귀 모델을 기반으로 하였다. 제안된 대사산물 패널의 추정 AUC (0.9034)는 모델에 상응하는 선형 조합의 경험적 추정자를 사용해 유도되었다. 대사산물 패널 기반 AUC (0.8180-0.9889)에 대해 보고된 95% 신뢰 구간은 모든 부트스트랩 반복에서, 적절한 추론을 제공하기 위해, 모델의 계수가 재추정되는, 1000회 반복의 부트스트랩을 사용하여, 기초 로지스틱 회귀 모델의 계수를 추정하였고, 그리하여 가변성을 나타낸다는 사실을 고려한다. 하이퍼-패널, 즉 하나는 단백질이고 하나는 대사산물인, 2개의 기초 패널의 조합을 의미하는 이 패널은 그들 개별 계수가 고정인 것을 고려하여, 2개 복합 마커로서 이들 2개 패널을 사용해 개발되었다 (단백질에 대한 하나 및 대사산물에 대한 하나의 복합 마커). 하이퍼-패널은 우리가 로지트 연결 함수를 고려한 로지스틱 회귀 모델을 사용하여 이들 2개의 기초 복합 마커를 조합하여 개발되었다.
결과
췌장암 대사산물 바이오마커의 동정
비표적화 대사체 분석은 20명의 PDAC 사례 (10명의 초기 및 10명의 후기 병기) 및 20명의 부합되는 대조군 (10명의 건강한 대상체 및 만성 췌장염 (CP)을 갖는 10명 대상체)로 이루어진 발굴 코호트 (세트#1)에 대해 수행되었다 (도 6). 후보 바이오마커는 초기에 유의한 ROC AUC (양측 윌콕스 순위합 검정 <0.05)를 기반으로 선택되어 그 결과 91개 대사산물이 생성되었다 (표 15). 후보 목록을 더욱 협소화시키기 위해서, 대사체 분석은 9명 PDAC (5명의 초기 및 4명의 후기 병기) 및 양성 췌장 질환 (BPD) (양성 췌장 낭종)을 갖는 50명 대상체로 이루어진 독립적인 '확증' 코호트 (세트#2)에 대해 수행하였다. 91종의 본래 특성들 중에서, 16종이 유의한 AUC를 보유하였고 세트#1에서 관찰된 바와 같이 동일한 상대적 변화 방향 (증가/감소)을 유지하였다 (표 16). 후보 대사산물은 (1) 초기-병기 PDAC 및 CP를 갖는 대상체 간에 유사한 수준을 나타내는 대사산물 (단측 만-위트니 U 검정 p<0.1) 및 (2) CP 및 건강한 대조군 간에 상이한 대사산물 (단측 만-위트니 U 검정 p<0.1)은 배제하도록 추가적으로 세밀화시켰다 (표 16). 개별 지질종의 경우에서, 외부 인자 예컨대 식이 패턴으로 인한 비-특이도를 완화시키기 위해, 대조군에 비해 사례에서 동향의 증가/감소를 나타내는 소정 지질 부류에서 검출된 개별 지질의 전체 지질 부류 (즉, > 80%) 중 효율 특징의 균일성을 보이는 지질들을 강조하였다 (도 7). 상기 언급된 기준을 충족하는 총 5종의 대사산물이 선택되었다. 이들 5종의 대사산물은 (N1/N8)-아세틸스퍼미딘 (AcSperm), 디아세틸스퍼민 (DAS), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (18:0), LPC (20:3), 및 인돌-유사체였다 (도 8 및 표 17).
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다음으로, PDAC에 대한 바이오마커 패널은 로지스틱 회귀 모델을 기반으로 개발되었다. 세트#1 및 #2로부터의 PDAC 사례 (n=29)를 조합하였고 세트#1 (도 7)로부터의 건강한 대상체 (n=10)에 대해 평가되었다. 로지트 연결 함수를 도입한 로지스틱 회귀 모델에 의해 얻은 추정 계수는 표 18에 제공된다. 조합된 데이타세트에 대한 5종 대사산물 마커의 개별 효율은 표 17에 제공되어 있다. PDAC와 건강한 대상체의 비교에서, AcSperm + DAS + LPC (18:0) + LPC (20:3) + 인돌-유사체의 최종 패널은 0.90 (95% C.I.= 0.818-0.989)의 AUC를 산출하였고, 99% 특이도에서 69% 감도를 나타냈다 (도 9A). BPD (만성 췌장염 및 저등급 낭종)로부터 PDAC를 구분하는 대사산물 패널의 효율은 0.69의 AUC (95% C.I.=0.557-0.819)를 산출하였고, 95% 특이도에서 41% 감도를 가졌지만; 최대 획득 AUC는 인돌-유사체 단독으로 수득되었다 (AUC=0.833) (도 9B).
절제성 PDAC 혈장 샘플의 2개 독립 세트에서 대사산물 바이오마커 패널의 시험
개별적으로 그리고 패널로서 5종 대사산물의 맹검 검증을 39명의 절제성 PDAC 사례 및 82명의 부합되는 건강한 대조군 (시험 세트 #1)으로 이루어진 혈장 샘플의 독립 세트에서 수행하였다. 5종 바이오마커 전부는 개별 AUC가 0.73 내지 0.84 범위로 건강한 대조군과 비교하여 PDAC 사례에서 유의하게 상이하였다 (단측 p<0.001) (표 19). 5종 대사산물 전부는 초기 코호트에서 관찰된 것과 동일한 변화 방향 (증가/감소)을 나타내었다. 5-대사산물 패널에 대한 로지스틱 회귀 모델은 0.89의 AUC (95% C.I.= 0.828-0.956)를 산출하였고; 95% 특이도에서 67% 감도를 나타내었다 (도 10 및 표 19).
계수는 로지트 연결 함수를 대입한 로지스틱 회귀 모델에 의해 수득되었다.
Figure pct00040
Figure pct00041
BPD (저등급 낭종)로부터 PDAC를 구별하는 개별 대사산물 및 패널의 능력은 확증 세트 (세트#2)와 동일한 실험에서 유래되었지만 개별적으로 분석된 20명의 절제성 PDAC 및 BPD로 진단받은 102명 대상체로 이루어진 제2 코호트 (시험 세트 #2)에서 시험되었다. 개별 분류 효율은 0.60-0.73 범위였다 (표 2). 5-대사산물 패널에 대한 고정 로지스틱 회귀 모델은 0.70의 AUC (95% C.I. = 0.573-0.833)를 산출하였고; 95% 특이도에서 15% 감도를 나타내었다 95% 특이도 (도 10B 및 표 19).
대사산물-마커 및 단백질-마커의 조합은 분류 효율은 개선시킨다
이전에, 초기-병기 PDAC에 대한 단백질-유래 바이오마커 패널을 개발하여, 본 명세서에 기술된 동일한 독립 코호트 (시험 세트 #1)에서 검증하였다. 그러므로 대사산물-패널 및 단백질-패널로 이루어진 하이퍼-패널이 단백질-패널 단독과 비교하여 분류 효율을 개선시키는지 여부를 조사하였다. 훈련 세트 (29명 PDAC 대 10명 건강한 대조군) 내 하이퍼-패널의 AUC는 95% CI (0.9278-1.000)로 0.97의 AUC를 산출하였다. 1%의 FPR 값에 대한 대사산물 패널 단독의 감도는 0.6897로 추정된다. 이러한 추정치는 훈련 세트에서 하이퍼-패널이 고려될 때 0.8621로 통계적으로 유의하게 개선된다 (상응하는 단측 p-값 = 0.0390). 훈련 세트에서 AUC의 관점에서 단백질 패널 (AUC=0.95) 및 하이퍼-패널 (AUC=0.97)의 비교는 0.1074의 p-값을 산출하였다 (도 11A). 단백질 패널에 대한 맹검 검증 (시험 세트 #1) 동안 상응하는 추정치는 0.86의 AUC를 산출한데 반해 하이퍼-패널은 0.92의 AUC였고 비교를 위한 상응하는 단측 p-값은 0.0236과 같았다 (도 11B). 이것은 단백질 패널과 비교하여 하이퍼-패널의 효율의 전체 통계적으로 유의한 개선을 입증하고 대사산물 패널 및 단백질 패널이 보완적임을 의미한다.
PDAC는 아세틸화된 폴리아민을 분비한다
혈장 AcSperm 및 DAS의 상승이 질환 상태와 연관되었는지 여부를 결정하기 위해서 5종의 PDAC 세포주 (CFPAC-1, MiaPaCa, SU8686, PANC03-27 및 SW1990) 유래의 세포 용해물 및 무혈청 조건화 배지를 분석하였다. 세포 용해물의 대사체 분석은 모든 5종 세포주에서 AcSperm 및 DAS의 검출가능한 수준을 밝혀주었다. 조건화 배지의 분석은 AcSperm 축적의 양성율을 의미한데 반해서 DAS 축적의 양성율은 5종 세포주 중 3종에서 관찰되었다 (도 12A). Badea 데이타세트에서 폴리아민-관련 효소의 mRNA 발현의 조사는 인접한 대조군 조직과 비교하여 스퍼민 신타제 (SMS) 및 스퍼미딘/스퍼민 아세틸트랜스퍼라제 (SAT1)에서 유의한 (쌍별 T-검정) PDAC-연관 상승을 의미하는데 반해서 스퍼미딘 신타제 (SRM), 폴리아민 옥시다제 (PAOX) 및 스퍼민 옥시다제 (SMOX)는 유의하게 감소 (도 11B)되어서, 종합적으로 그들 산화보다는 폴리아민의 증가된 아세틸화 및 후속 분비를 시사한다.
PDAC는 세포외 리소포스파티딜콜린을 이화한다
PDAC 세포가 세포외 지질을 이화하고/제거하는지 여부를 결정하기 위해서, PANC1 및 Su8686 세포 유래의 혈청-함유 배지의 지질 조성을 조건화 이후 24시간, 48시간 및 72시간에 조사하였다. 분석은 LPC (18:0) 및 LPC (20:3)를 포함하는 몇몇 리소인지질 (도 13)에서 시간-의존적 감소를 의미한다 (도 12A). 부수적으로, LPC의 분해 산물인 글리세로포스포콜린은 조건화 배지에서 시간-의존적 증가를 나타내어 (도 12B) 종합적으로 세포외 LPC의 활성 이화작용을 의미한다. 인지질 및 리소인지질의 이화작용에 관여되는 효소에 대한 mRNA 발현의 평가 (도 12C)는 Badea 데이타세트에서 인접한 대조군 조직에 비해서 가용성 포스포리파제 A2-X (PLA2G10), 오토탁신 (ENPP2) 및 리소포스포리파제 LYPLA1 의 유의한 (2-측 만-위트니 U-검정) PDAC-연관적 상승을 의미하였다 (도 12D).
고찰
이 연구의 주요 목적은 절제성 PDAC에 대한 혈장 대사산물-유래 바이오마커 패널을 동정하고 검증하는 것이었다. 비표적화 대사체 접근법을 사용하여, 5-마커 대사산물 바이오마커 패널이 동정되었고 건강한 대조군으로부터 절제성 PDAC 사례를 구별할 수 있다는 것이 검증되어 검증 코호트에서 0.89의 AUC를 산출하였다 (시험 세트 #1). 대사산물-패널 및 이전에 동정된 단백질-패널로 이루어진 하이퍼-패널이 단백질-패널 단독과 비교하여 분류 효율을 개선시킨다 (AUC: 0.92 vs 0.86; p:0.024; 시험 세트 #1)는 것이 동등하게 입증되어 대사산물 패널의 보완적 성질이 강조되었다.
PDAC의 낮은 출현율을 고려하면, 다중-마커 서명은 평균 위험 개체군보다는 고-위험 대상체를 표적으로 하는 스크리닝 프로그램에 최고로 적합할 것이다. 이들은 신규 발병된 진성 당뇨병을 갖는 50세 이상의 개체, 고위험 패밀리의 무증상성 동류, 만성 췌장염을 갖는 대상체 및 췌장의 뮤신-분비 낭종으로 우연히 진단된 환자를 포함한다. 대사산물-바이오마커 패널은 2개의 개별 샘플 세트에서 저등급 췌장 낭종으로부터 PDAC를 유의하게 구별할 수 있고, 개별적으로 확증 세트 및 시험 세트 #2에서 0.69 및 0.70과 동등한 AUC를 산출하였다.
특히, 혈장 분지쇄 아미노산 (BCAA)의 편차가 이전 발견과 대조적으로 사례와 개별 대조군 간에 관찰되지 않았다. 그러나, BCAA의 예측값은 진단 이전 2-5년에 가장 현저하였고 진단 이전 기초 0-2년으로 그 수준이 되돌아가서, 진단 시에 채취된 혈장 BCAA에 편차가 없다는 관찰과 일관적이었다는 것을 주의해야 한다.
변경된 폴리아민 물질대사는 세포 주기 진행에 친밀하게 관여되는, 과증식성 질병 및 종양형성과 오랜동안 연결되었다. 폴리아민 합성은 속도-제한 효소 ODC1 및 AMD1에 의해 조절되는 반면 그들의 이화작용은 SAT1에 의해 조절된다. 이전의 발견은 조직학적으로 비질환인 췌장과 비교하여 췌장 암종에서 푸트레신 및 AcSperm의 증가된 존재비를 의미하였다. 반대로, AcSperm을 포함하는 많은 폴리아민이 건강한 대조군과 비교하여 사례들의 혈청에서 상승된다고 이전에 확인되었다. 이러한 발견들은 Badea 데이타세트에서 인접한 대조군 조직에 비해 PDAC에서 SAT1 의 상승된 mRNA 발현 및 세포 용해물에서 AcSperm 및 DAS의 검출 및 조건화 배지에서 그들의 동시발생적 축적과 일치된다 (도 11). 이 실험에 기술된 발견, 및 다른 발견들은 폴리아민 이화작용의 증폭을 의미하고, 이 개념은 PDAC를 갖는 대상체의 혈장에 반영된다. 특히, DAS의 상승은 고유하게 췌장암에 기여하지 않아서, 본질적으로 암에 대한 스크리닝 마커로서 이의 광범위한 활용에서 보다 일반적인 역할을 시사한다.
이전 연구들은 혈장 LPC가 건강한 대조군 또는 만성 췌장염을 갖는 대상체에 비해 PDAC에서 유의하게 더 낮게 나타나서, 본 연구의 발견과 일관된다. 세포주 데이타는 PDAC 세포가 리소인지질을 이화시키는 것을 의미하는데, 이러한 개념은 Badea 데이타세트의 유전자 발현 데이타에 의해 뒷받침되며 (도 12), 그리하여 PDAC 대상체의 혈장 LPC의 관찰된 감소에 대해 타당성을 제공한다. 그럼에도 불구하고, PDAC 단독은 특히 초기 질환 병기에서, 혈장 LPC 수준의 감소를 전체적으로 설명할 수 없다. 지질 물질대사를 조절하는 핵심 장기인 간으로의 전이는 췌장암의 초기 병기에 발생하는 것으로 확인되었다. 따라서, 혈장 LPC의 감소는 질환과 동시 발생된 변경된 간 기능을 비롯하여 암성 세포에 의한 증가된 이화작용 둘 모두의 반영일 수 있다는 것이 타당하고, 이 개념은 현재 연구와 독립적인 추가의 연구를 필요로 할 것이다.
결론적으로, 초기-병기 PDAC에 대한 대사산물-유래 바이오마커 패널이 개발되었고 이전에 동정된 단백질-기반 바이오마커 패널을 보완한다는 것이 검증되었다.
다른 실시형태
상기 기재된 상세한 설명은 본 개시 내용을 실시하는 당업자를 보조하기 위해 제공된다. 그러나, 본 명세서에 기술되고 청구된 개시 내용은 이들 실시형태가 본 개시 내용의 몇몇 측면의 예시로서 의도되는 것이므로 본 명세서에 개시된 특정한 실시형태에 의해 범주가 국한되는 것이 아니다. 임의의 동등한 실시형태를 본 개시 내용의 범주 내에 포함시키고자 한다. 실제로, 본 명세서에 표시되고 기술된 것들 이외에도 개시내용의 다양한 변형은 본 발명의 범주 또는 사조를 벗어나지 않고 전술한 설명으로부터 당업자에게 자명해질 것이다. 이러한 변형을 또한 첨부된 청구항의 범주 내에 포함시키고자 한다.
SEQUENCE LISTING <110> M.D. Anderson <120> METHODS FOR THE DETECTION AND TREATMENT OF <130> MDA0024-401-PC <150> 62/435,024 <151> 2016-12-15 <150> 62/435,020 <151> 2016-12-15 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 200 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Pro Phe Glu Pro Leu Ala Ser Gly Ile Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Ile Ala Pro Ser Arg Ala Cys Thr Cys Val Pro Pro His Pro Gln 20 25 30 Thr Ala Phe Cys Asn Ser Asp Leu Val Ile Arg Ala Lys Phe Val Gly 35 40 45 Thr Pro Glu Val Asn Gln Thr Thr Leu Tyr Gln Arg Tyr Glu Ile Lys 50 55 60 Met Thr Lys Met Tyr Lys Gly Phe Gln Ala Leu Gly Asp Ala Ala Asp 65 70 75 80 Ile Arg Phe Val Tyr Thr Pro Ala Met Glu Ser Val Cys Gly Tyr Phe 85 90 95 His Arg Ser His Asn Arg Ser Glu Glu Phe Leu Ile Ala Gly Lys Leu 100 105 110 Gln Asp Gly Leu Leu His Ile Thr Thr Cys Ser Phe Val Ala Pro Trp 115 120 125 Asn Ser Leu Ser Leu Ala Gln Arg Arg Gly Phe Thr Lys Thr Tyr Thr 130 135 140 Val Gly Cys Glu Glu Cys Thr Val Phe Pro Cys Leu Ser Ile Pro Cys 145 150 155 160 Lys Leu Gln Ser Gly Thr His Cys Leu Trp Thr Asp Gln Leu Leu Gln 165 170 175 Gly Ser Glu Lys Gly Phe Gln Ser Arg His Leu Ala Cys Leu Pro Arg 180 185 190 Glu Pro Gly Leu Cys Thr Trp Gln 195 200 <210> 2 <211> 347 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ser Ser Trp Ser Arg Gln Arg Pro Lys Ser Pro Gly Gly Ile Gln 1 5 10 15 Pro His Val Ser Arg Thr Leu Phe Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ser 20 25 30 Ala Trp Gly Val Thr Leu Ser Pro Lys Asp Cys Gln Val Phe Arg Ser 35 40 45 Asp His Gly Ser Ser Ile Ser Cys Gln Pro Pro Ala Glu Ile Pro Gly 50 55 60 Tyr Leu Pro Ala Asp Thr Val His Leu Ala Val Glu Phe Phe Asn Leu 65 70 75 80 Thr His Leu Pro Ala Asn Leu Leu Gln Gly Ala Ser Lys Leu Gln Glu 85 90 95 Leu His Leu Ser Ser Asn Gly Leu Glu Ser Leu Ser Pro Glu Phe Leu 100 105 110 Arg Pro Val Pro Gln Leu Arg Val Leu Asp Leu Thr Arg Asn Ala Leu 115 120 125 Thr Gly Leu Pro Pro Gly Leu Phe Gln Ala Ser Ala Thr Leu Asp Thr 130 135 140 Leu Val Leu Lys Glu Asn Gln Leu Glu Val Leu Glu Val Ser Trp Leu 145 150 155 160 His Gly Leu Lys Ala Leu Gly His Leu Asp Leu Ser Gly Asn Arg Leu 165 170 175 Arg Lys Leu Pro Pro Gly Leu Leu Ala Asn Phe Thr Leu Leu Arg Thr 180 185 190 Leu Asp Leu Gly Glu Asn Gln Leu Glu Thr Leu Pro Pro Asp Leu Leu 195 200 205 Arg Gly Pro Leu Gln Leu Glu Arg Leu His Leu Glu Gly Asn Lys Leu 210 215 220 Gln Val Leu Gly Lys Asp Leu Leu Leu Pro Gln Pro Asp Leu Arg Tyr 225 230 235 240 Leu Phe Leu Asn Gly Asn Lys Leu Ala Arg Val Ala Ala Gly Ala Phe 245 250 255 Gln Gly Leu Arg Gln Leu Asp Met Leu Asp Leu Ser Asn Asn Ser Leu 260 265 270 Ala Ser Val Pro Glu Gly Leu Trp Ala Ser Leu Gly Gln Pro Asn Trp 275 280 285 Asp Met Arg Asp Gly Phe Asp Ile Ser Gly Asn Pro Trp Ile Cys Asp 290 295 300 Gln Asn Leu Ser Asp Leu Tyr Arg Trp Leu Gln Ala Gln Lys Asp Lys 305 310 315 320 Met Phe Ser Gln Asn Asp Thr Arg Cys Ala Gly Pro Glu Ala Val Lys 325 330 335 Gly Gln Thr Leu Leu Ala Val Ala Lys Ser Gln 340 345 <210> 3 <211> 151 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Arg Phe Leu Ala Ala Thr Phe Leu Leu Leu Ala Leu Ser Thr Ala 1 5 10 15 Ala Gln Ala Glu Pro Val Gln Phe Lys Asp Cys Gly Ser Val Asp Gly 20 25 30 Val Ile Lys Glu Val Asn Val Ser Pro Cys Pro Thr Gln Pro Cys Gln 35 40 45 Leu Ser Lys Gly Gln Ser Tyr Ser Val Asn Val Thr Phe Thr Ser Asn 50 55 60 Ile Gln Ser Lys Ser Ser Lys Ala Val Val His Gly Ile Leu Met Gly 65 70 75 80 Val Pro Val Pro Phe Pro Ile Pro Glu Pro Asp Gly Cys Lys Ser Gly 85 90 95 Ile Asn Cys Pro Ile Gln Lys Asp Lys Thr Tyr Ser Tyr Leu Asn Lys 100 105 110 Leu Pro Val Lys Ser Glu Tyr Pro Ser Ile Lys Leu Val Val Glu Trp 115 120 125 Gln Leu Gln Asp Asp Lys Asn Gln Ser Leu Phe Cys Trp Glu Ile Pro 130 135 140 Val Gln Ile Val Ser His Leu 145 150

Claims (81)

  1. 췌관 선암종에 대한 환자의 감수성을 결정하는 방법으로서,
    환자로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
    생물학적 샘플 중 CA19-9 항원의 수준을 측정하는 단계;
    생물학적 샘플 중 TIMP1 항원의 수준을 측정하는 단계;
    생물학적 샘플 중 LRG1 항원의 수준을 측정하는 단계
    를 포함하고;
    CA19-9 항원, TIMP1 항원, 및 LRG1 항원의 양은 환자를 췌관 선암종에 감수성이거나 또는 췌관 선암종에 감수성이 아닌 것으로 분류시키는 것인 방법.
  2. 췌관 선암종에 대한 환자의 감수성을 결정하는 방법으로서,
    환자로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
    샘플을 CA19-9 항원에 결합하는 제1 리포터 분자와 접촉시키는 단계;
    샘플을 TIMP1 항원에 결합하는 제2 리포터 분자와 접촉시키는 단계;
    샘플을 LRG1 항원에 결합하는 제3 리포터 분자와 접촉시키는 단계
    를 포함하고;
    제1 리포터 분자, 제2 리포터 분자, 및 제3 리포터 분자의 양은 환자를 췌관 선암종에 감수성이거나 또는 췌관 선암종에 감수성이 아닌 것으로 분류시키는 것인 방법.
  3. 췌관 선암종에 대한 환자의 감수성을 결정하는 방법으로서,
    환자로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
    CA19-9 항원, TIMP1 항원, 및 LRG1 항원에 결합하기 위한 수단을 표면에 제공하는 단계;
    표면을 생물학적 샘플과 인큐베이션시키는 단계;
    표면을 CA19-9 항원에 결합하는 제1 리포터 분자와 접촉시키는 단계;
    표면을 TIMP1 항원에 결합하는 제2 리포터 분자와 접촉시키는 단계;
    표면을 LRG1 항원에 결합하는 제3 리포터 분자와 접촉시키는 단계;
    표면과 회합된 제1 리포터 분자의 양을 측정하는 단계;
    표면과 회합된 제2 리포터 분자의 양을 측정하는 단계;
    표면에 회합된 제3 리포터 분자의 양을 측정하는 단계
    를 포함하고;
    제1 리포터 분자, 제2 리포터 분자, 및 제3 리포터 분자의 양은 환자를 췌관 선암종에 감수성이거나 또는 질환에 감수성이 아닌 것으로 분류시키는 것인 방법.
  4. 췌관 선암종에 대한 환자의 감수성을 결정하는 방법으로서,
    환자로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
    CA19-9 항원을 결합시키기 위한 수단을 제1 표면에 제공하는 단계;
    TIMP1 항원을 결합시키기 위한 수단을 제2 표면에 제공하는 단계;
    LRG1 항원을 결합시키기 위한 수단을 제3 표면에 제공하는 단계;
    제1 표면을 생물학적 샘플과 인큐베이션시키는 단계;
    제2 표면을 생물학적 샘플과 인큐베이션시키는 단계;
    제3 표면을 생물학적 샘플과 인큐베이션시키는 단계;
    제1 표면을 CA19-9 항원에 결합하는 제1 리포터 분자와 접촉시키는 단계;
    제2 표면을 TIMP1 항원에 결합하는 제2 리포터 분자와 접촉시키는 단계;
    제3 표면을 LRG1 항원에 결합하는 제3 리포터 분자와 접촉시키는 단계;
    제1 표면과 회합된 제1 리포터 분자의 양을 측정하는 단계;
    제2 표면과 회합된 제2 리포터 분자의 양을 측정하는 단계;
    제3 표면과 회합된 제3 리포터 분자의 양을 측정하는 단계
    를 포함하고;
    제1 리포터 분자, 제2 리포터 분자, 및 제3 리포터 분자의 양은 환자를 췌관 선암종에 감수성이거나 또는 질환에 감수성이지 않은 것으로 분류시키는 것인 방법.
  5. 췌관 선암종에 대한 환자의 감수성을 결정하는 방법으로서,
    환자로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
    CA19-9 항원, TIMP1 항원, 및 LRG1 항원을 결합시키기 위한 수단을 표면에 제공하는 단계;
    표면을 생물학적 샘플과 인큐베이션시키는 단계;
    표면을 CA19-9 항원에 결합하는 제1 릴레이 분자와 접촉시키는 단계;
    표면을 TIMP1 항원에 결합하는 제2 릴레이 분자와 접촉시키는 단계;
    표면을 LRG1 항원에 결합하는 제3 릴레이 분자와 접촉시키는 단계;
    표면을 제1 릴레이 분자에 결합하는 제1 리포터 분자와 접촉시키는 단계;
    표면을 제2 릴레이 분자에 결합하는 제2 리포터 분자와 접촉시키는 단계;
    표면을 제3 릴레이 분자에 결합하는 제3 리포터 분자와 접촉시키는 단계;
    제1 릴레이 분자 및 CA19-9 항원과 회합된 제1 리포터 분자의 양을 측정하는 단계;
    제2 릴레이 분자 및 TIMP1 항원과 회합된 제2 리포터 분자의 양을 측정하는 단계;
    제3 릴레이 분자 및 LRG1 항원과 회합된 제3 리포터 분자의 양을 측정하는 단계
    를 포함하고;
    제1 리포터 분자, 제2 리포터 분자, 및 제3 리포터 분자의 양은 환자를 췌관 선암종에 감수성이거나 또는 췌관 선암종에 감수성이 아닌 것으로 분류시키는 것인 방법.
  6. 췌관 선암종에 대한 환자의 감수성을 결정하는 방법으로서,
    환자로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
    CA19-9 항원에 결합하기 위한 수단을 제1 표면에 제공하는 단계;
    TIMP1 항원에 결합하기 위한 수단을 제2 표면에 제공하는 단계;
    LRG1 항원에 결합하기 위한 수단을 제3 표면에 제공하는 단계;
    제1 표면을 생물학적 샘플과 인큐베이션시키는 단계;
    제2 표면을 생물학적 샘플과 인큐베이션시키는 단계;
    제3 표면을 생물학적 샘플과 인큐베이션시키는 단계;
    제1 표면을 CA19-9 항원에 결합하는 제1 릴레이 분자와 접촉시키는 단게;
    제2 표면을 TIMP1 항원에 결합하는 제2 릴레이 분자와 접촉시키는 단계;
    제3 표면을 LRG1 항원에 결합하는 제3 릴레이 분자와 접촉시키는 단계;
    제1 표면을 제1 릴레이 분자에 결합하는 제1 리포터 분자와 접촉시키는 단계;
    제2 표면을 제2 릴레이 분자에 결합하는 제2 리포터 분자와 접촉시키는 단계;
    제3 표면을 제3 릴레이 분자에 결합하는 제3 리포터 분자와 접촉시키는 단계;
    제1 릴레이 분자 및 CA19-9 항원과 회합된 제1 리포터 분자의 양을 측정하는 단계;
    제2 릴레이 분자 및 TIMP1 항원과 회합된 제2 리포터 분자의 양을 측정하는 단계;
    제3 릴레이 분자 및 LRG1 항원과 회합된 제3 리포터 분자의 양을 측정하는 단계를 포함하고;
    제1 리포터 분자, 제2 리포터 분자, 및 제3 리포터 분자의 양은 환자를 췌관 선암종에 감수성이거나 또는 췌관 선암종에 감수성이 아닌 것으로 분류시키는 것인 방법.
  7. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 표면 중 적어도 하나는 CA19-9, TIMP1, 및 LRG1로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원에 선택적으로 결합하는 적어도 하나의 수용체 분자를 포함하는 것인 방법.
  8. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 표면 중 적어도 하나는 고체 입자의 표면인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 고체 입자는 비드인 방법.
  10. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 리포터 분자 중 적어도 하나는 효소에 연결되는 것인 방법.
  11. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 리포터 분자 중 적어도 하나는 검출가능한 신호를 발생시키는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 검출가능한 신호는 분광분석 방법으로 검출가능한 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 분광분석 방법은 질량 분광법인 방법.
  14. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 리포터 분자는 CA19-9 항원에 선택적으로 결합하는 것인 방법.
  15. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 리포터 분자는 TIMP1 항원에 선택적으로 결합하는 것인 방법.
  16. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 리포터 분자는 LRG1 항원에 선택적으로 결합하는 것인 방법.
  17. 췌관 선암종에 대한 환자의 감수성을 결정하는 방법으로서,
    환자로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
    생물학적 샘플을 CA19-9 항체와 접촉시키고 항원과 항체 간 결합을 관찰하여 생물학적 샘플 중 CA19-9 항원의 수준을 측정하는 단계;
    생물학적 샘플을 TIMP1 항체와 접촉시키고 항원과 항체 간 결합을 관찰하여 생물학적 샘플 중 TIMP1 항원의 수준을 측정하는 단계;
    생물학적 샘플을 LRG1 항체와 접촉시키고 항원과 항체 간 결합을 관찰하여 생물학적 샘플 중 LRG1 항원의 수준을 측정하는 단계;
    CA19-9, TIMP1, 및 LRG1 수준의 측정에 의한 결정에 따라, 환자의 병태를 췌관 선암종에 감수성이거나 또는 췌관 선암종에 감수성이 아닌 것으로 지정하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  18. 췌관 선암종에 대한 환자의 감수성을 결정하는 방법으로서,
    환자로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
    생물학적 샘플 중 CA19-9 항원의 수준을 측정하는 단계;
    생물학적 샘플 중 TIMP1 항원의 수준을 측정하는 단계;
    생물학적 샘플 중 LRG1 항원의 수준을 측정하는 단계;
    제1 표준값에 대한 CA19-9 항원의 수준을 결정하는 단계로서, 비율은 췌관 선암종을 예측하는 것인 단계;
    제2 표준값에 대한 TIMP1 항원의 수준을 결정하는 단계로서, 비율은 췌관 선암종을 예측하는 것인 단계;
    제3 표준값에 대한 LRG1 항원의 수준을 결정하는 단계로서, 비율은 췌관 선암종을 예측하는 것인 단계; 및
    CA19-9, TIMP1, 및 LRG1 수준의 비율의 통계적 분석에 의한 결정에 따라, 환자의 병태를 췌관 선암종에 감수성이거나 또는 췌관 선암종에 감수성이 아닌 것으로 지정하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  19. 췌관 선암종에 대한 환자의 감수성을 예측하는 단계로서,
    환자로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
    생물학적 샘플 중 CA19-9, TIMP1, 및 LRG1 항원의 수준을 측정하는 단계; 및
    CA19-9, TIMP1, 및 LRG1 수준의 통계적 분석에 의한 결정에 따라 예측 인자를 계산하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  20. 췌관 선암종에 대한 환자의 감수성을 결정하는 방법으로서,
    환자로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
    생물학적 샘플 중 CA19-9, TIMP1, 및 LRG1 항원의 수준을 측정하는 단계; 및
    생물학적 샘플 중 CA19-9 항원, TIMP1 항원, 및 LRG1 항원의 수준의 통계적 분석에 의한 결정에 따라 환자의 병태를 췌관 선암종에 감수성이거나 또는 췌관 선암종에 감수성이 아닌 것으로 지정하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  21. 환자로부터 수득된 생물학적 샘플을 사용하여 췌관 선암종에 대한 감수성을 검출하기 위한 방법으로서,
    생물학적 샘플에 존재하는 CA19-9 항원의 수준을 CA19-9 항원에 특이적인 적어도 하나의 항체 또는 항체 분획을 사용하여 어세이하는 단계; 및
    생물학적 샘플에 존재하는 TIMP1 항원의 수준을 TIMP1 항원에 특이적인 적어도 하나의 항체 또는 항체 분획을 사용하여 어세이하는 단계; 및
    생물학적 샘플에 존재하는 LRG1 항원의 수준을 LRG1 항원에 특이적인 적어도 하나의 항체 또는 항체 분획을 사용하여 어세이하는 단계; 및
    CA19-9 항원, TIMP1 항원, 및 LRG1 항원의 수준이 췌관 선암종을 갖는 환자를 의미하는지 여부를 결정하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  22. 췌관 선암종에 대한 감수성을 검출하기 위한 방법으로서,
    대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
    항-CA19-9 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용해 샘플에 대해 면역어세이를 수행하는 단계;
    항-LRG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용해 샘플에 대해 면역어세이를 수행하는 단계;
    항-TIMP1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용해 샘플에 대해 면역어세이를 수행하는 단계
    를 포함하고,
    항체의 결합은 대상체에서 췌관 선암종을 의미하고 면역어세이는 초기 병기의 췌관 선암종을 검출할 수 있는 것인 방법.
  23. 췌관 선암종에 대한 감수성을 검출하기 위한 방법으로서,
    개체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
    항-CA19-9 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용해 면역어세이를 수행하는 단계;
    항-LRG1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용해 면역어세이를 수행하는 단계;
    항-TIMP1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용해 면역어세이를 수행하는 단계;
    CA19-9 항원, TIMP1 항원, 및 LRG1 항원의 수준이 췌관 선암종을 갖는 환자를 의미하는지 여부를 결정하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, CA19-9, LRG1, 및 TIMP1 수준의 결정은 실질적으로 동시에 수행되는 것인 방법.
  25. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, CA19-9, LRG1, 및 TIMP1 수준의 결정은 단계식 방식으로 수행되는 것인 방법.
  26. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 췌관 선암종을 갖거나 또는 췌관 선암종을 갖지 않는 것으로의 지정에 환자 이력 정보의 포함 단계를 포함하는 것인 방법.
  27. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 췌관 선암종을 갖는 것으로 지정된 환자에 대해 적어도 하나의 대체 진단 검사를 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 적어도 하나의 대체 진단 검사는 적어도 하나의 ctDNA의 어세이 또는 시퀀싱을 포함하는 것인 방법.
  29. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 언급된 바와 같은 방법을 위한 키트로서,
    CA19-9 항원의 검출을 위한 제1 용질;
    LRG1 항원의 검출을 위한 제2 용질; 및
    TIMP1 항원의 검출을 위한 제3 용질
    을 포함하는 시약 용액을 포함하는 키트.
  30. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 언급된 바와 같은 방법을 위한 키트로서,
    CA19-9 항원의 검출을 위한 제1 용질을 포함하는 제1 시약 용액;
    LRG1 항원의 검출을 위한 제2 용질을 포함하는 제2 시약 용액; 및
    TIMP1 항원의 검출을 위한 제3 용질을 포함하는 제3 시약 용액
    을 포함하는 키트.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 시약 용액을 생물학적 샘플과 접촉시키기 위한 장치를 포함하는 것인 키트.
  32. 제29항 또는 제30항에 있어서, 적어도 하나의 항원을 결합시키기 위한 수단을 갖는 적어도 하나의 표면을 포함하는 것인 키트.
  33. 제32항에 있어서, 적어도 하나의 항원은 CA19-9, LRG1, 및 TIMP1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 키트.
  34. 제33항에 있어서, 적어도 하나의 표면은 ctDNA를 결합시키기 위한 수단을 포함하는 것인 키트.
  35. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법에 있어서,
    생물학적 샘플 중 (N1/N8)-아세틸스퍼미딘 (AcSperm)의 수준을 측정하는 단계;
    생물학적 샘플 중 디아세틸스퍼민 (DAS)의 수준을 측정하는 단계;
    생물학적 샘플 중 리소포스파티딜콜린 (LPC) (18:0)의 수준을 측정하는 단계;
    생물학적 샘플 중 리소포스파티딜콜린 (LPC) (20:3)의 수준을 측정하는 단계; 및
    생물학적 샘플 중 인돌-유사체의 수준을 측정하는 단계
    를 더 포함하고;
    (N1/N8)-아세틸스퍼미딘 (AcSperm), 디아세틸스퍼민 (DAS), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (18:0), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (20:3), 및 인돌-유사체의 양은 환자를 췌관 선암종에 감수성이거나 또는 췌관 선암종에 감수성이 아닌 것으로 분류시키는 것인 방법.
  36. 췌관 선암종에 대한 환자의 감수성을 결정하는 방법으로서,
    환자로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
    생물학적 샘플 중 (N1/N8)-아세틸스퍼미딘 (AcSperm)의 수준을 측정하는 단계;
    생물학적 샘플 중 디아세틸스퍼민 (DAS)의 수준을 측정하는 단계;
    생물학적 샘플 중 리소포스파티딜콜린 (LPC) (18:0)의 수준을 측정하는 단계;
    생물학적 샘플 중 리소포스파티딜콜린 (LPC) (20:3)의 수준을 측정하는 단계; 및
    생물학적 샘플 중 인돌-유사체의 수준을 측정하는 단계
    를 포함하고;
    (N1/N8)-아세틸스퍼미딘 (AcSperm), 디아세틸스퍼민 (DAS), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (18:0), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (20:3), 및 인돌-유사체의 양은 환자를 췌관 선암종에 감수성이거나 또는 췌관 선암종에 감수성이 아닌 것으로 분류시키는 것인 방법.
  37. 혈장-유래 바이오마커 패널 및 단백질 마커 패널을 포함하는, 췌관 선암종에 대한 환자의 감수성을 결정하는 방법으로서,
    혈장-유래 바이오마커 패널은 (N1/N8)-아세틸스퍼미딘 (AcSperm), 디아세틸스퍼민 (DAS), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (18:0), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (20:3), 및 인돌-유사체를 포함하고;
    단백질 바이오마커 패널은 CA19-9, LRG1, 및 TIMP1을 포함하며;
    상기 방법은
    환자로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
    생물학적 샘플 중 혈장-유래 바이오마커 및 단백질 바이오마커의 수준을 측정하는 단계를 포함하고;
    혈장-유래 바이오마커 및 단백질 바이오마커의 양은 환자를 췌관 선암종에 감수성이거나 또는 췌관 선암종에 감수성이 아닌 것으로 분류시키는 것인 방법.
  38. 하나 이상의 단백질 바이오마커 및 하나 이상의 대사산물 마커의 수준을 결정하는 단계를 포함하는, 췌관 선암종에 대한 환자의 감수성을 결정하는 방법으로서, 상기 방법은
    환자로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
    샘플을 CA19-9 항원에 결합하는 제1 리포터 분자와 접촉시키는 단계;
    샘플을 TIMP1 항원에 결합하는 제2 리포터 분자와 접촉시키는 단계;
    샘플을 LRG1 항원에 결합하는 제3 리포터 분자와 접촉시키는 단계; 및
    하나 이상의 바이오마커의 수준을 결정하는 단계로서, 하나 이상의 바이오마커는 (N1/N8)-아세틸스퍼미딘 (AcSperm), 디아세틸스퍼민 (DAS), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (18:0), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (20:3), 및 인돌-유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계
    를 포함하고;
    제1 리포터 분자, 제2 리포터 분자, 제3 리포터 분자, 및 하나 이상의 바이오마커의 양은 환자를 췌관 선암종에 감수성이거나 또는 췌관 선암종에 감수성이 아닌 것으로 분류시키는 것인 방법.
  39. 췌관 선암종에 대한 환자의 감수성을 결정하는 방법으로서,
    환자로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
    생물학적 샘플 중 CA19-9, TIMP1, 및 LRG1 항원의 수준을 측정하는 단계; 및
    생물학적 샘플 중 (N1/N8)-아세틸스퍼미딘 (AcSperm), 디아세틸스퍼민 (DAS), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (18:0), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (20:3), 및 인돌-유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 대사산물 마커의 수준을 측정하는 단계;
    생물학적 샘플 중 CA19-9 항원, TIMP1 항원, LRG1 항원, (N1/N8)-아세틸스퍼미딘 (AcSperm), 디아세틸스퍼민 (DAS), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (18:0), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (20:3), 및 인돌-유사체의 수준의 통계적 분석에 의한 결정에 따라, 환자의 병태를 췌관 선암종에 감수성이거나 또는 췌관 선암종에 감수성이 아닌 것으로 지정하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  40. 췌관 선암종에 대한 감수성이 의심되는 환자를 치료하는 방법으로서,
    제36항 내지 제39항 중 어느 한 항에 언급된 바와 같은 방법을 사용하여 췌관 선암종에 대한 감수성에 대해 환자를 분석하는 단계;
    선암종에 대한 치료의 치료적 유효량을 투여하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 치료는 수술, 화학요법, 방사선 요법, 표적 요법, 또는 이의 조합인 방법.
  42. 제36항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, CA19-9, TIMP1, 및 LRG1로 이루어진 군으로부터 선택된 항원에 선택적으로 결합하는 적어도 하나의 수용체 분자를 포함하는 것인 방법.
  43. 제36항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, CA19-9, TIMP1, LRG, (N1/N8)-아세틸스퍼미딘 (AcSperm), 디아세틸스퍼민 (DAS), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (18:0), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (20:3), 또는 인돌-유사체의 양의 검출은 고체 입자의 사용을 포함하는 것인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 고체 입자는 비드인 방법.
  45. 제36항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 리포터 분자 중 적어도 하나는 효소에 연결되는 것인 방법.
  46. 제36항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 또는 대사산물 마커 중 적어도 하나는 검출가능한 신호를 발생시키는 것인 방법.
  47. 제36항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 검출가능한 신호는 분광분석 방법으로 검출가능한 것인 방법.
  48. 제47항의 방법에 있어서, 분광분석 방법은 질량 분광법인 방법.
  49. 제36항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 췌관 선암종을 갖거나 또는 췌장 선암종을 갖지 않는 것으로의 지정에 환자 이력 정보의 포함 단계를 포함하는 것인 방법.
  50. 제36항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 췌관 선암종을 갖는 것으로 지정된 환자에 대해 적어도 하나의 대체 진단 검사를 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  51. 제50항에 있어서, 적어도 하나의 대체 진단 검사는 적어도 하나의 ctDNA의 어세이 또는 시퀀싱을 포함하는 것인 방법.
  52. 제36항 내지 제40항 중 어느 한 항에 언급된 바와 같은 방법을 위한 키트로서,
    CA19-9 항원의 검출을 위한 제1 용질;
    LRG1 항원의 검출을 위한 제2 용질;
    TIMP1 항원의 검출을 위한 제3 용질;
    (N1/N8)-아세틸스퍼미딘 (AcSperm)의 검출을 위한 제4 용질;
    디아세틸스퍼민 (DAS)의 검출을 위한 제5 용질;
    리소포스파티딜콜린 (LPC) (18:0)의 검출을 위한 제6 용질;
    리소포스파티딜콜린 (LPC) (20:3)의 검출을 위한 제7 용질; 및
    인돌-유사체의 검출을 위한 제8 용질
    을 포함하는 시약 용액을 포함하는 키트.
  53. 제36항 내지 제40항 중 어느 한 항에 언급된 바와 같은 방법을 위한 키트로서,
    CA19-9 항원의 검출을 위한 제1 용질을 포함하는 제1 시약 용액;
    LRG1 항원의 검출을 위한 제2 용질을 포함하는 제2 시약 용액;
    TIMP1 항원의 검출을 위한 제3 용질을 포함하는 제3 시약 용액;
    (N1/N8)-아세틸스퍼미딘 (AcSperm)의 검출을 위한 제4 용질을 포함하는 제4 시약 용액;
    디아세틸스퍼민 (DAS)의 검출을 위한 제5 용질을 포함하는 제5 시약 용액;
    리소포스파티딜콜린 (LPC) (18:0)의 검출을 위한 제6 용질을 포함하는 제6 시약 용액;
    리소포스파티딜콜린 (LPC) (20:3)의 검출을 위한 제7 용질을 포함하는 제7 시약 용액; 및
    인돌-유사체의 검출을 위한 제8 용질을 포함하는 제8 시약 용액
    을 포함하는 키트.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, 시약 용액을 생물학적 샘플과 접촉시키기 위한 장치를 포함하는 것인 키트.
  55. 제52항 또는 제53항에 있어서, 적어도 하나의 항원을 결합시키기 위한 수단을 갖는 적어도 하나의 표면을 포함하는 것인 키트.
  56. 제55항에 있어서, 적어도 하나의 항원은 CA19-9, LRG1, 및 TIMP1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 키트.
  57. 제55항에 있어서, 적어도 하나의 표면은 ctDNA를 결합시키기 위한 수단을 포함하는 것인 키트.
  58. CA19-9 항원, TIMP1 항원, 및 LRG1 항원의 수준이 환자를 췌관 선암종 (PDAC)을 갖거나 또는 췌관 선암종 (PDAC)에 대해 감수성인 것으로 분류시킨 환자에서 췌관 선암종의 진행의 치료 또는 예방 방법으로서,
    i. 화학치료 약물을 PDAC를 갖는 환자에게 투여하는 단계;
    ii. 치료적 방사선을 PDAC를 갖는 환자에게 투여하는 단계; 및
    iii. PDAC를 갖는 환자에서 암성 조직의 부분 또는 완전 외과적 제거를 위한 수술 단계
    중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  59. 제58항에 있어서, CA19-9 항원, TIMP1 항원, 및 LRG1 항원의 수준은 상승되는 것인 방법.
  60. 제58항에 있어서, CA19-9 항원, TIMP1 항원, 및 LRG1 항원의 수준은 PDAC를 갖지 않는 기준 환자 또는 그룹에서의 CA19-9 항원, TIMP1 항원, 및 LRG1 항원의 수준과 비교하여 상승되는 것인 방법.
  61. 제60항에 있어서, 기준 환자 또는 그룹은 건강한 것인 방법.
  62. 제58항에 있어서, AUC (95% CI)는 적어도 0.850인 방법.
  63. 제58항에 있어서, AUC (95% CI)는 적어도 0.900인 방법.
  64. 제58항에 있어서, PDAC를 갖는 것으로서 환자의 분류는 각각 95% 및 99% 특이도에서 0.849 및 0.658의 감도를 갖는 것인 방법.
  65. 제58항에 있어서, CA19-9 항원, TIMP1 항원, 및 LRG1 항원의 수준은 만성 췌장염을 갖는 기준 환자 또는 그룹에서의 CA19-9 항원, TIMP1 항원, 및 LRG1 항원의 수준과 비교하여 상승되는 것인 방법.
  66. 제58항에 있어서, CA19-9 항원, TIMP1 항원, 및 LRG1 항원의 수준은 양성 췌장 질환을 갖는 기준 환자 또는 그룹에서의 CA19-9 항원, TIMP1 항원, 및 LRG1 항원의 수준과 비교하여 상승되는 것인 방법.
  67. 제66항에 있어서, AUC (95% CI)는 적어도 0.850인 방법.
  68. 제66항에 있어서, AUC (95% CI)는 적어도 0.900인 방법.
  69. 제58항에 있어서, PDAC를 갖는 것으로서 환자의 분류는 각각 95% 및 99% 특이도에서 0.849 및 0.658의 감도를 갖는 것인 방법.
  70. 제58항에 있어서, PDAC는 경계 절제성 병기 시에 또는 그 이전에 진단되는 것인 방법.
  71. 제58항에 있어서, PDAC는 절제성 병기에서 진단되는 것인 방법.
  72. CA19-9 항원, TIMP1 항원, LRG1, (N1/N8)-아세틸스퍼미딘 (AcSperm), 디아세틸스퍼민 (DAS), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (18:0), 리소포스파티딜콜린 (LPC) (20:3), 및 인돌-유사체의 수준이 환자를 췌관 선암종 (PDAC)을 갖거나 또는 췌관 선암종 (PDAC)에 감수성인 것으로 분류한 환자에서 췌관 선암종의 진행의 치료 또는 예방 방법으로서,
    i) 화학치료 약물을 PDAC를 갖는 환자에게 투여하는 단계;
    ii) 치료적 방사선을 PDAC를 갖는 환자에게 투여하는 단계; 및
    iii) PDAC를 갖는 환자에서 암성 조직의 부분 또는 완전 외과적 제거를 위한 수술 단계
    중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  73. 제72항에 있어서, CA19-9 항원, TIMP1 항원, 및 LRG1 항원의 수준은 상승되는 것인 방법.
  74. 제72항에 있어서, CA19-9 항원, TIMP1 항원, 및 LRG1 항원의 수준은 PDAC를 갖지 않는 기준 환자 또는 그룹에서의 CA19-9 항원, TIMP1 항원, 및 LRG1 항원의 수준과 비교하여 상승되는 것인 방법.
  75. 제72항에 있어서, 기준 환자 또는 그룹은 건강한 것인 방법.
  76. 제72항에 있어서, CA19-9 항원, TIMP1 항원, 및 LRG1 항원의 수준은 만성 췌장염을 갖는 기준 환자 또는 그룹에서의 CA19-9 항원, TIMP1 항원, 및 LRG1 항원의 수준과 비교하여 상승되는 것인 방법.
  77. 제72항에 있어서, CA19-9 항원, TIMP1 항원, 및 LRG1 항원의 수준은 양성 췌장 질환을 갖는 기준 환자 또는 그룹에서의 CA19-9 항원, TIMP1 항원, 및 LRG1 항원의 수준과 비교하여 상승되는 것인 방법.
  78. 제72항에 있어서, 환자는 PDAC에 고위험성인 방법.
  79. 제58항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 50세 이상이며 새롭게 발병된 진성 당뇨병을 갖거나, 만성 췌장염을 갖거나 췌장의 뮤신-분비 낭종으로 우연히 진단받았거나, 또는 이들 고-위험 그룹 중 하나의 무증상성 동류인 방법.
  80. 췌관 선암종에 대한 감수성으로 의심되는 환자를 치료하는 방법으로서,
    제1항 내지 제79항 중 어느 한 항에 언급된 바와 같은 방법으로 췌관 선암종에 대한 감수성에 대해 환자를 분석하는 단계;
    선암종에 대한 치료의 치료적 유효량을 투여하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  81. 제80항에 있어서, 치료는 수술, 화학요법, 방사선 요법, 표적 요법, 또는 이의 조합인 방법.
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