JP5118115B2

JP5118115B2 - 野生型ｐ５３の異なる多形性形態に関連した疾患を発症する危険を有する個体を測定するスクリーニング方法

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Publication number: JP5118115B2
Application number: JP2009257000A
Authority: JP
Inventors: マトラシュースキ，グレッグ・ジェイ; バンクス，ローレンス; ストーリー，アラン
Original assignee: ザ・ロイヤル・インスティテューション・フォア・ザ・アドバンスメント・オブ・ラーニング／マクギル・ユニヴァーシティ; インペリアル・キャンサー・リサーチ・テクノロジー（アイシーアールティー）; インターナショナルセンターフォージェネティックエンジニアリングアンドバイオテクノロジー
Priority date: 1997-09-02
Filing date: 2009-11-10
Publication date: 2013-01-16
Anticipated expiration: 2018-08-31
Also published as: EP1012336B1; JP2001514860A; DE69830911T2; WO1999011817A1; CA2214461A1; BR9811441A; ATE299949T1; AU8969098A; EP1012336A1; US6489105B1; DE69830911D1; JP2010029215A

Description

（ａ）発明の分野
本発明は、野生型ｐ５３の異なる多形性形態に関連した疾患を発症する危険を有する個体を同定するためのスクリーニング方法に関する。

（ｂ）従来の技術
細胞性腫瘍抑圧蛋白質ｐ５３は細胞増殖の主要な制御因子のひとつである。刺激のコンテクストに依存して、ｐ５３は細胞成長停止またはプログラムされた細胞死（アポトーシス）を誘発する。結果として、これはＤＮＡ変異を獲得した細胞の引き続く増殖を妨害し、そしてこれは癌に対する生物の鍵となる防御を代表する。多くのヒト腫瘍において、ｐ５３の不活性化は腫瘍の発生における主要な因子の一つである。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）関連の癌においては、しかしながら、ｐ５３はほとんどいつも野生型である。これは、ユビキチン媒介性分解のためにｐ５３を標識するウイルス性Ｅ６蛋白質の活性のためであり、即ち、正常なｐ５３機能に打ち勝つ。このため、ＨＰＶｓは女性における頸部癌（ｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒ）の発生のための主要な発癌物質であり、全世界の癌のもっとも共通の形態の一つである。

ｐ５３の２つの多形性形態が存在し、ｐ５３蛋白質のアミノ酸位置７２においてプロリンまたはアルギニン残基の何れかをコードしうる。この多形性はポリアクリルアミドゲルにおけるｐ５３の移動の変化をもたらすが、しかし、現在のところ、両形態のｐ５３は識別不可能なレベルの活性を有するらしい。事実、何れかの多形性がいくつかのヒト腫瘍の発症の危険性因子を表すか否かを測定するために、莫大な免疫学の調査がここ６−７年にわたり実施された。現在まで、アミノ酸位置７２におけるプリロリンまたはアルギニンの存在はあらゆる特定の癌の発症における重要な危険因子ではないとの見解に賛同した証拠が圧倒的である。

しかしながら、我々の最近の観察に基づくと、野生型ｐ５３の異なる多形性形態に関連した疾患を発症する危険を有する個体を同定するためのスクリーニング方法を提供することは極めて望ましい。

Ｓｃｈｅｆｆｎｅｒ，Ｍ．ｅｔａｌ．，１９９０；Ｃｅｌｌ，６３：１１２９−１１３６Ｍａｔｌａｓｈｅｗｓｋｉ，Ｇ．ｅｔａｌ．１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：９６１−９６３ＳｔｏｒｅｙＡ．ｅｔａｌ．，１９８６，ＩｒｅｎｅＬｅｉｇｈらによるケラチノサイトハンドブック中、ケンブリッジ大学出版、１９９４、ｐ４３９−４５７Ｚｈａｎｇ，Ｗ．ｅｔａｌ．，１９９２，Ｇｅｎｅ，１１７：２７１−２７５ＢｉｒｇａｎｄｅｒＲ．ｅｔａｌ．，１９９５，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１６：２２３３−２２３６ＷｅｓｔｏｎＡ．ｅｔａｌ．，１９９４，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１５：５８３−５８７ＷｅｓｔｏｎＡ．ｅｔａｌ．，１９９２，Ｅｎｖ．ＨｅａｌｔｈＰｅｒｓ．，９８：６１−６７Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｇ．ｅｔａｌ．，１９９４，Ｈｕ．Ｈｅｒｅｄ．，４４：２６６−２７０

本発明の一つの目的は、野生型ｐ５３の異なる多形性形態に関連した疾患を発症する危険を有する個体を同定するためのスクリーニング方法を提供することである。

本発明によれば、野生型ｐ５３関連疾患の発症の危険にある個体を同定する方法が提供され、該方法は、以下の工程：
ａ）生物学上のサンプルを患者から得て；そして
ｂ）上記サンプル中のｐ５３ｐｒｏまたはｐ５３ａｒｇの存在を決定するが、その際ｐ５３ｐｒｏ／ｐ５３ｐｒｏ，ｐ５３ａｒｇ／ｐ５３ａｒｇ，ｐ５３ｐｒｏ／ｐ５３ａｒｇからなる群から選択される患者の対立遺伝子パターンが疾患を発症する危険因子の指標であること
からなる。

上記疾患は、新形成（ｎｅｏｐｌａｓｉａ）、癌、ウイルス感染およびウイルスにより引き起こされるかもしれない（そうでないかもしれない）ウイルス性病理からなる群から選択される。

そのようなウイルスは、限定ではないが、ヒトパピローマウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、アデノウイルスまたはヒトに感染するあらゆる他のウイルスを含む。

より特定すれば、疾患は、限定ではないが、頸部のいぼ（ｃｅｒｖｉｃａｌｗａｒｔｓ）、頸部の新形成または頸部癌を含む。

例えば、患者の対立遺伝子パターンがｐ５３ａｒｇ／ｐ５３ａｒｇである場合、それは、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の感染に関連した頸部のいぼ、頸部の新形成または頸部癌を含む疾患の発症の大きな危険性を有する患者の指標である。

ウイルスの病理は、ヒトパピローマウイルスにより引き起こされる皮膚癌も含み、そして長期間のウイルス感染並びにｐ５３ａｒｇ／ｐ５３ａｒｇの患者における初期ウイルス感染の感受性を含む。より正確には、本発明の方法の上記工程ｂ）の測定は、限定ではないが以下の少なくとも一つを含む：
ａ）ポリメラーゼ鎖反応により増幅すること；
ｂ）ＤＮＡまたは蛋白質を配列決定すること；
ｃ）ｐ５３ｐｒｏまたはｐ５３ａｒｇのＤＮＡの何れかに特異的な少なくとも一つのプローブとハイブリダイズすること；および
ｄ）ｐ５３ｐｒｏまたはｐ５３ａｒｇの対立遺伝子を同定するためにｐ５３ｐｒｏ蛋白質またはｐ５３ａｒｇ蛋白質の何れかに特異的な少なくとも一つの抗体を用いて免疫検出すること。

本発明のスクリーニング方法は、免疫抑圧治療下にある患者およびウイルス感染およびウイルス病理に関して、より感受性の患者をスクリーンすることにも使用してよい。

本発明によれば、あらゆるＨＰＶ予防接種プログラムにおける有力な予防接種候補をスクリーニングする方法も提供され、該方法は以下の工程：
ａ）患者から生物学上のサンプルを得て；そして
ｂ）上記中のｐ５３ｐｒｏまたはｐ５３ａｒｇ野生型対立遺伝子の存在を測定するが、その際ｐ５３ａｒｇ／ｐ５３ａｒｇの患者が優先的に予防接種されるべきであること
からなる。

本発明の上記方法によれば、患者は、異常なＰＡＰスメア、低級の頸部病巣を有してよく、新生児であってよく、または生殖器のＨＰＶ感染を有する母の新生児であってよい。

本発明の目的のために、以下の用語および略語を以下に定義する。

「野生型ｐ５３の異なる多形性形態に関連した疾患」は、ｐ５３を包含するあらゆる疾患であって、野生型ｐ５３ａｒｇまたはｐ５３ｐｒｏが別々に挙動する疾患を意図する。そのような疾患は、限定ではないが、ウイルス例えばパピローマウイルスにより引き起こされる癌を含む。

「ｐ５３ａｒｇ」は、ｐ５３アルギニンを意図し、但しアルギニンはｐ５３野生型蛋白質のアミノ酸位置７２において見いだされる。

「ｐ５３ｐｒｏ」は、ｐ５３プロリンを意図し、但しプロリンはｐ５３野生型蛋白質のアミノ酸位置７２において見いだされる。

「ＨＰＶ」は、ヒトパピローマウイルスを意図する。

図１は、インビボにおけるｐ５３Ｐｒｏおよびｐ５３ＡｒｇのＨＰＶ−１８Ｅ６誘発性分解の比較を示す。図２は、インビボ分解に関してＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１１Ｅ６がｐ５３Ｐｒｏよりもｐ５３Ａｒｇを優先的に標的とすることを示す。図３Ａは、ｐ５３遺伝子を示し、蛋白質の機能ドメインを示す。図３Ｂは、プラスミドＤＮＡからのＡｒｇおよびＰｒｏのｐ５３対立遺伝子の検出を示す。図３Ｃは、ＡｒｇおよびＰｒｏの同型接合個体からのゲノミックＤＮＡからのｐ５３配列の増幅を示す。

発明の詳細な説明
本発明に従い、我々は、２つの形態のｐ５３がヒトパピローマウイルスＥ６蛋白質により別々に標的化されるか否かを測定することに興味を注いだ。我々は、ｐ５３のアルギニン形態が、ｐ５３のプロリン形態よりも、Ｅ６媒介性分解に対してより顕著に感受性であることを示した。これは、ウイルス感染またはウイルス形質転換においては、アルギニンｐ５３のみを発現する個体がウイルスの作用に対してより感受性であることを示すはずである。これによる予測は、ｐ５３アルギニンのみの個体はＨＰＶ関連腫瘍を発症する可能性がより高いはずであることである。この仮説を試験するため、我々は、頸部癌を有する一連の患者並びに皮膚癌を有する一連の腎移植レシピエント（ＲＴＲｓ）をスクリーンした。頸部癌の後、皮膚癌はＨＰＶ関連腫瘍の第２の主要な群を代表する。このスクリーンの結果は、正常な対照集団に比して癌患者中のｐ５３アルギニンのみの個体の圧倒的優勢を証明する。この結果は、ｐ５３アルギニンのみの個体が、同型接合患者またはｐ５３プロリンのみの個体に比してＨＰＶ関連主要を発症する可能性がより高いことを証明する。

野生型ｐ５３の異なる多形性形態がＨＰＶ不活性化に異なる感受性を持つことの証明は、絶対的に新規である。ｐ５３アルギニンのみの個体がＨＰＶ関連癌をより発症しやすいとの証明も絶対的に新規である。

腫瘍関連ＨＰＶ種に由来するＥ６癌原蛋白質は、細胞性腫瘍抑圧因子蛋白質のｐ５３に結合してその分解を誘発する（Ｓｃｈｅｆｆｎｅｒ，Ｍ．ｅｔａｌ．，１９９０；Ｃｅｌｌ，６３：１１２９−１１３６）。ｐ５３蛋白質の変異がしばしばＥ６媒介性分解に対して蛋白質を非感受性にさせることが示されたが、野生型ｐ５３の異なる多形性形態に対するＥ６の作用に関する同様な報告はない。この研究において、我々は、野生型ｐ５３蛋白質の７２位におけるプロリン／アルギニン多形性の作用を調査した（Ｍａｔｌａｓｈｅｗｓｋｉ，Ｇ．ｅｔａｌ．１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：９６１−９６３）。その結果は、インビボにおいてｐ５３Ａｒｇが、ｐ５３Ｐｒｏに比して、ＨＰＶＥ６由来の高い危険性による分解に、より顕著に感受性であることを示す。さらに、低い危険性のＨＰＶ−１１からのＥ６はｐ５３Ａｒｇの分解を媒介することもできたが、Ｐ５３Ｐｒｏの分解は媒介できなかった。よって、ｐ５３Ａｒｇは、ｐ５３Ｐｒｏに比して、低危険性並びに高危険性ＨＰＶ種の両者からのＥ６蛋白質の分解に、より感受性である。これを考慮すると、これらの結果は、野生型ｐ５３内のプロリン／アルギニン多形性がＨＰＶ誘発癌の感受性マーカーを代表することを暗示する。

頸部癌の発症が特定のヒトパピローマウイルス種、例えばＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８の存在に密接に関連することが、うまく確立された。対照的に、他のＨＰＶ種、例えばＨＰＶ−６およびＨＰＶ−１１による感染は、主に良性の病巣の発症に関連する（ＳｔｏｒｅｙＡ．ｅｔａｌ．，１９８６，ＩｒｅｎｅＬｅｉｇｈらによるケラチノサイトハンドブック中、ケンブリッジ大学出版、１９９４、ｐ４３９−４５７）。ＨＰＶ−１６とＨＰＶ−１８は、２つの主要な癌原蛋白質のＥ６とＥ７をコードする。Ｅ７蛋白質は、細胞性腫瘍抑圧因子蛋白質のｐＲｂに結合して不活性化し；Ｅ６は細胞性腫瘍抑圧因子ｐ５３に結合して、次にユビキチン経路を通して直接その分解を指示する。これら２つの腫瘍抑圧因子蛋白質のＨＰＶによる不活性化は腫瘍発生の間、重要であると見なされるが、感染された個体が頸部癌を発症するように傾ける他の遺伝因子が存在するか否かについては明確な指標がない。ｐ５３蛋白質はしばしば多数のヒト腫瘍において変異するが、初期の頸部癌においてはいつもきまって野生型であることから、Ｅ６によるｐ５３の不活性化が不活性化変異に類似するとの概念を導く。文献に記載の変異ｐ５３蛋白質の多くはＥ６媒介性分解に感受性でないことから、これら２つの蛋白質の間の相互作用が容易に破壊できることを示唆する。我々は、野生型ｐ５３蛋白質内の多形性が、ユビキチン媒介分解に関して、ＨＰＶＥ６のｐ５３標識能力に影響するか否かを調査することに興味を注いだ。我々は、ｐ５３蛋白質内のアミノ酸位置７２におけるプロリン／アルギニン多形性に我々の注意を集めたが、なぜならば、これが保存的アミノ酸変化ではなく、そして事実この変化がＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のｐ５３蛋白質の移動に劇的な変化をもたらすからである（Ｍａｔｌａｓｈｅｗｓｋｉ，Ｇ．ｅｔａｌ．１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：９６１−９６３）。

ＨＰＶ−１８Ｅ６蛋白質が優先的にｐ５３の２つの形態の何れかを認識しうるか否かを調査するため、我々は最初に一連のインビボ分解アッセイを実施した。ｐ５３の存在しないＳａｏｓ−２細胞に、ｐ５３の２つの多形性形態の一方または他方を発現するプラスミドと、増加量のＨＰＶ−１８Ｅ６発現プラスミドを感染させた。２４時間後、細胞を抽出して、抗ｐ５３モノクローナル抗体のプールを用いたウエスタンブロット分析により残存のｐ５３蛋白質を検出した。

図１は、インビボにおけるｐ５３Ｐｒｏとｐ５３ＡｒｇのＨＰＶ−１８Ｅ６誘発性分解の比較を示す。この実験においては、示されるとおり、Ｓａｏｓ−２細胞に、３ｕｇのｐＣＤＮＡ−ｐ５３ＰｒｏまたはｐＣＤＮＡ−ｐ５３Ａｒｇの何れかと、増加量のｐＣＤＮＡ−１８Ｅ６あるいは対照プラスミドｐＣＤＮＡ−３をトランスフェクトした。２４時間後、細胞を５０ｍＭＨｅｐｅｓｐＨ７．０，２５０ｍＭＮａＣｌ，０．１％ＮＰ４０および１％ＡＰＲＯＴＩＮＩＮ（登録商標）の溶液中に抽出した。蛋白質の濃度はバイオラッドのプロテインアッセイを用いて測定して、等量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動してニトロセルロース膜に転写した。ｐ５３蛋白質は抗ｐ５３モノクローナル抗体ｐＡＢ１８０１、１８０２および１８０３のプールを用いて検出し、アマシャムＥＣＬシステムを用いてウエスタンブロットを現像した。トランスフェクション効率は、平行のプレート上でのｌａｃＺ発現プラスミドとの同時トランスフェクションおよびｌａｃＺ発現の染色を通して監視した。Ｃ３３細胞はｐ５３発現に関する陽性対照を代表する。

図１に示すとおり、増加量のＨＰＶ−１８Ｅ６はｐ５３Ａｒｇの量の劇的な低下を誘発することが明らかである。対照的に、同一の条件下では、ｐ５３Ｐｒｏの顕著な分解は検出されなかった。これらの結果は、ｐ５３中のアミノ酸位置７２におけるプレート／アルギニン多形性がインビボにおけるＨＰＶ−１８Ｅ６誘発性分解に対するその感受性を変更すること、およびｐ５３ａｒｇがｐ５３に比してＨＰＶ−１８Ｅ６に対してより感受性であることを示す。

我々は、次に、Ｅ６誘発性分解に対するｐ５３の感受性のこの変化がＨＰＶ−１８由来のＥ６に制限されるのか否か、またはそれが他のＨＰＶ種由来のＥ６蛋白質にも真実なのかも決定することに興味を注いだ。これを調査するため、我々は、図１において実施したインビボ分解アッセイを繰り返したが、増加量のＨＰＶ−１６Ｅ６およびＨＰＶ−１１Ｅ６を含んだ。得られた結果を図２に示す。

Ｓａｏｓ−２細胞に、ｐＣＤＮＳ−ｐ５３ＰｒｏまたはｐＣＤＮＡ−ｐ５３Ａｒｇ、並びに増加量のｐＣＤＮＡ−１６Ｅ６（図２、パネルＡ）またはｐＣＤＮＡ−１１Ｅ６（図２、パネルＢ）あるは対照プラスミドｐＣＤＮＡ−３を示すとおりにトランスフェクトした。残存のｐ５３蛋白質は図１に示すとおりに検出した。ｐＣＤＮＡ−１８のＥ６も比較のために含んだ。

ＨＰＶ−１６Ｅ６蛋白質（図２Ａ）は異なる形態のｐ５３を分解する能力を示し、ＨＰＶ−１８Ｅ６を用いて観察されたのと同様であった。観察されうるとおり、高いＥ６投入においてのみｐ５３Ｐｒｏの顕著な分解が得られ、一方、はるかに低い濃度のＨＰＶ１６Ｅ６蛋白質はｐ５３Ａｒｇの完全な分解を生じる。特に興味深いのは、しかしながら、ＨＰＶ−１１Ｅ６蛋白質を用いた結果である（図２Ｂ）。多数のインビトロ研究が以前に示したことは、ＨＰＶ−１１Ｅ６がユビキチン媒介性分解に関してｐ５３を標的にできないことであった。インビボにおいてｐ５３Ｐｒｏを用いた結果はこの見解を確かに支持するが、何故ならば、ＨＰＶ−１１Ｅ６はｐ５３Ｐｒｏの分解を媒介できなかったからである（図２Ｂ）。しかしながら、ＨＰＶ−１１Ｅ６はインビボアッセイにおいてはｐ５３Ａｒｇの分解を明らかに誘発したが、とはいえ、癌原性ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８のＥ６蛋白質により誘発されたほどの効率ではなかった。これらの結果は、ｐ５３蛋白質内の７２位におけるプロリン／アルギニン多形性が、ＨＰＶの種類に拘わらず、Ｅ６媒介性分解に対する野生型ｐ５３の感受性を決定することを証明した点において極めて顕著である。本発明に従い、我々は、Ｅ６媒介性分解に対する野生型ｐ５３の２つの多形性形態の感受性における明確な差異を示した。ＨＰＶ−１６のＥ６およびＨＰＶ−１８のＥ６の両者はｐ５３のプロリン形態の分解を誘発できるが、この分解はｐ５３のアルギニン形態の分解よりもはるかに効率が低い。さらに、ＨＰＶ−１１のＥ６蛋白質はｐ５３Ｐｒｏに関しては完全に不活性であるが、それでもなおｐ５３Ａｒｇに対する分解の低いがしかし顕著なレベルを示す。ｐ５３は腫瘍形成に対しての宿主防御において鍵となる制御点を表すから、これらの研究は、この多形性がＨＰＶ感染の有望な結果に対して顕著な関係を有することを予測するはずである。いくつかの研究は、非ＨＰＶ関連腫瘍内のｐ５３多形性に接近して、ｐ５３の特定の多形性形態の存在または不在との顕著な相関を示すことに失敗した（Ｚｈａｎｇ，Ｗ．ｅｔａｌ．，１９９２，Ｇｅｎｅ，１１７：２７１−２７５；ＢｉｒｇａｎｄｅｒＲ．ｅｔａｌ．，１９９５，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１６：２２３３−２２３６；ＷｅｓｔｏｎＡ．ｅｔａｌ．，１９９４，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１５：５８３−５８７；ＷｅｓｔｏｎＡ．ｅｔａｌ．，１９９２，Ｅｎｖ．ＨｅａｌｔｈＰｅｒｓ．，９８：６１−６７）。対照的に、我々の研究は、ＨＰＶ関連腫瘍において、ｐ５３の７２位における多形性が重要な危険因子を代表するとの仮説を強く支持する。この仮説を試験するため、我々は、一連のＨＰＶ関連頸部癌および皮膚癌においてｐ５３遺伝子型（ｐ５３ｐｒｏまたはｐ５３ａｒｇ）を試験した。これらのＨＰＶ関連腫瘍におけるｐ５３多形性に関するこのスクリーンの結果は、この仮説を確証する（表１および２の結果を参照）。その中で詳細なとおり、これらのデータは、ＨＰＶ関連頸部癌（表１）および皮膚癌（表２）を有する個体の８５％以上がｐ５３ａｒｇ対立遺伝子に関して同型接合であったことを証明する。我々は、アミノ酸位置７２におけるｐ５３多形性の性質がＨＰＶ関連腫瘍原性における重大な因子であること、およびｐ５３ａｒｇに関して同型接合である個体はこれらの腫瘍を発症する危険性が大きいことを結論する。
野生型ｐ５３の遺伝子型（ｐ５３ｐｒｏまたはｐ５３ａｒｇ）の測定方法
腫瘍生検は侵入性および皮膚偏平細胞の両方を含んだ。全ての病巣は組織学上確認されて生検切除または外科的切除の時に回収して、スナップ凍結して−７０℃に保存した。７つの頸部ＳＣＣｓを、ホルマリン固定してパラフィンを埋め込んだ公的材料から得た。対照群に関するサンプルは、健常ボランティアから採血した全血から抽出されたＤＮＡからなった。
ＤＮＡ抽出
凍結した組織からのＤＮＡをプロテイナーゼＫ消化およびフェノールクロロホルム抽出により抽出し、パラフィン埋め込み組織からのＤＮＡを脱パラフィン後に同じようにして抽出した。ＮｕｃｌｅｏｎＤＮＡ抽出キット（Ｓｃｏｔｌａｂ）を用いて対照の個体からの全血からＤＮＡを抽出した。
ｐ５３多形性配列のＰＣＲ増幅
ｐ５３Ｐｒｏ配列は、ＰＣＲによりプライマー対ｐ５３Ｐｒｏ＋／ｐ５３−（ｐ５３Ｐｒｏ＋：5'GCCAGAGGCTGCTCCCCC（配列番号：１）、ｐ５３−：5'CGTGCAAGTCACAGACTT（配列番号：２）により検出し、そしてｐ５３Ａｒｇはプライマー対ｐ５３＋／Ａｒｇ−（ｐ５３＋：5'TCCCCCTTGCCGTCCCAA（配列番号：３）、Ａｒｇ−：5'CTGGTGCAGGGGCCACGC（配列番号：４））を用いて検出した。プライマー対（各２ｕｇ）を混合して５０ｕＣｉ［α３２Ｐ］ＡＴＰ（アマシャム）を含む５０ｕｌの全量にてポリヌクレオチドキナーゼ（プロメガ）により［３２ｐ］で末端標識した。１ｕｌの標識されたプライマー混合物をＰＣＲ反応あたり用いた。ＰＣＲ反応（２５サイクル）は、０．２ユニットのレッドホットポリメラーゼ（アドバンスドバイオテクノロジーズ）を用いて、全量５０ｕｌにて、反応バッファーＩＶ（製造者により供給された）中にて１．５ｍＭＭｇ＋＋にて実施した。１０ｕｌの反応産物を８％ポリアクリルアミドゲル上において１ＸのＴＢＥバッファー中で分画し、乾燥して、そしてＸ線フィルム上に露出するかあるいはストーム８４０ホスホルイメージャー（モリキュラーダイナミックス）およびイメージクワントソフトウエアを用いて定量した。
ｐ５３遺伝子型決定の結果
我々は、最初に一連の頸部癌生検中のｐ５３ＰｒｏおよびＡｒｇ対立遺伝子の頻度を調査し、そしてこれを対照群において観察された頻度と比較した（表１）。各々の相対頻度を括弧で示す。

両群は広く類似の人種バックグランドの個体からなり、そして我々の対照ＤＮＡサンプル中にて我々が観察した対立遺伝子の頻度は以前に報告された研究において観察されたのと類似であり、ｐ５３対立遺伝子頻度は異なる人種群間で変化する（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｇ．ｅｔａｌ．，１９９４，Ｈｕ．Ｈｅｒｅｄ．，４４：２６６−２７０）。我々の研究においては、Ａｒｇ対立遺伝子の検出頻度はＡｒｇ／Ｐｒｏ遺伝子型のそれに比して顕著な相違があり、頸部癌生検と正常対照の間には顕著な相違が存在し、（χ２＝２１８．８９，ｐ＝０．００００１３）、Ａｒｇ対立遺伝子のみがはるかに多数のサンプル中において観察され（癌中８８％に対して対照中３６％）、観察されたＰｒｏ／Ａｒｇ遺伝子型の数の付随的低下を伴った（癌中４％に対して対照中５７％）。この研究においてはＰｒｏ対立遺伝子のみの検出頻度間に顕著な差異はなかったが、各群の数は小さかった。

対照群に比べた頸部癌のサンプルの対立遺伝子頻度の明確な識別は、Ｐｒｏ対立遺伝子の不在下においてｐ５３ａｒｇの存在が、危険性の高いＨＰＶ種を有する頸部癌腫瘍における疾患の発症に対する感受性を付与することを示す。これは、他の腫瘍とは顕著に対照的であり（Ｚｈａｎｇ，Ｗ．ｅｔａｌ．，１９９２，Ｇｅｎｅ，１１７：２７１−２７５；ＢｉｒｇａｎｄｅｒＲ．ｅｔａｌ．，１９９５、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１６：２２３３−２２３６；ＷｅｓｔｏｎＡ．ｅｔａｌ．，１９９４，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１５：５８３−５８７；ＷｅｓｔｏｎＡ．ｅｔａｌ．，１９９２，Ｅｎｖ．ＨｅａｌｔｈＰｅｒｓ．，９８：６１−６７）、腫瘍生検と対照生検の間でｐ５３多形性頻度の顕著な相違は観察されなかった。ｐ５３Ａｒｇ蛋白質がＥ６媒介性の蛋白質分解性の分解に、より感受性であることにより、より容易に不活性化されるとの事実は、腫瘍ｐ５３の遺伝子型の発見に強く相関する。

頸部癌中におけるそれらの十分に実証された役割に加えて、ＨＰＶｓは皮膚癌の発症に関与することが仮定された。免疫上抑圧された個体、例えば腎移植レシピエントにおいて、広い範囲のウイルス種が病巣および同じでない頸部腫瘍において見いだされ、これらの病巣はしばしば一つより多いＨＰＶ種を有する。以前に定義されたＨＰＶ種に加えて、いくつかの新たに同定されたＥＶ−関連ＨＰＶ配列もＲＴＲｓからの生検において同定された。我々は、次に、腎移植レシピエント由来の腫瘍を含むように、我々のｐ５３多形性研究を広げ、その結果を表２に示す。

これらの結果は、再び、これらの皮膚ＨＰＶ含有腫瘍において、Ａｒｇ／Ｐｒｏ（１２．５％）およびＰｒｏ（０％）の対立遺伝子に対して激しく過剰なＡｒｇ（８７．５％）を伴うｐ５３ａｒｇ対立遺伝子に関連した腫瘍に対して断固たる感受性を明らかにする。

腫瘍の生検はきまって間質組織または炎症細胞の何れかにより汚染されているから、我々は、単一反応においてｐ５３Ａｒｇまたはｐ５３ＰｒｏのＤＮＡ鋳型の何れかを混合する作用を決定することに興味を注いだが、汚染した非腫瘍細胞のレベルに関するガイドとして機能するはずである。ｐ５３Ａｒｇまたはｐ５３Ｐｒｏ配列の何れかを９５：５または５：９５で含むプラスミドＤＮＡを用いて大きい方のインプットとして何れかのＤＮＡ１００ｎｇを用いてＰＣＲ反応を実施した場合、低コピー数の対立遺伝子に由来する産物はこれらの条件下において高いインプットＤＮＡ由来の産物と同じほどに効果的に増幅されたことから（図３Ｂ）、一方の対立遺伝子の増幅が他方の存在により影響されなかったことを示す。

ＡｒｇまたはＰｒｏ対立遺伝子の何れかをコードすることが知られているプラスミドＤＮＡをｐｃＤＮＡベクターにクローン化し、何れか一方をＰＣＲ増幅するか、または他方の対立遺伝子を含むプラスミドの存在下で、一方の対立遺伝子を特異的に検出するプライマーを用いた。Ａｒｇ（１４１ｂｐ）またはＰｒｏ（２７７ｂｐ）対立遺伝子の特異的産物は、その対立遺伝子を含むプラスミドのみから、過剰な競合鋳型の存在下でさえも検出された。

コドン７２における多形性の位置およびＰＣＲ研究において使用されたプライマーの位置を図３Ａに示す。

汚染する非腫瘍組織を含むそれらの腫瘍生検から、真の同型接合ＤＮＡサンプルを識別することは相対的に簡単であることを証明したが、なぜならば、同型接合の個体からのゲノミックＤＮＡの増幅は、日常的にほぼ等しい強度であり、そして放射性標識産物の定量により測定されたとおり２倍の誤差を決して越えなかった産物を生じるからである。可能性のある間質の汚染を評価するため、ＰｒｏまたはＡｒｇ対立遺伝子の何れかに関して同型接合であることが知られているゲノミックＤＮＡサンプルを、同じ比率で、高いインプットとして１００ｎｇの全ゲノミックＤＮＡを用いて混合した。この場合、我々は、もっとも低いコピー数のＤＮＡがもっとも高いコピー数のＤＮＡよりもはるかに低い程度で増幅されたことを見いだした（図３Ｃ）。

鋳型の混合は、図３Ｂ中において、１００ｎｇの全ゲノミックＤＮＡを大きい方のインプットとして用いた。

わずか２つのサンプルにおいて、ＰＣＲ産物の比率により非腫瘍性組織による汚染が測定されたが、一方、Ａｒｇ／Ｐｒｏ産物の強度の比は１：２０から１：４０に及び、図３Ｃ中の故意に混合したサンプルにより生じたバンドパターンに極めて類似した。

この研究に基づき、ＨＰＶ関連疾患のコンテクストにおいて、ｐ５３ａｒｇ対立遺伝子のみを有する個体は、従って、ｐ５３ｐｒｏ対立遺伝子少なくとも１コピーを有する個体に比して悪性腫瘍を発症することについて、極めて高い危険性を有すると考えることができる。他の対立遺伝子を用いて我々のサンプルの５％汚染を我々が容易に検出できたこと、および腫瘍生検が間質組織１０−５０％で日常的に汚染されていることを考えると、Ｐｒｏ対立遺伝子が大多数の腫瘍生検において検出されなかったとの事実は、患者らがＡｒｇ対立遺伝子に関して同型接合であることを示唆する。注目すべきは、コドン７２の多形性が、ｐ５３による効果的な成長抑圧に必要な最近同定されたＳＨ３ドメイン中に位置することである。

参酌すれば、これらの結果は、ＨＰＶ関連悪性腫瘍に対しての、ｐ５３Ａｒｇ対立遺伝子に関連した顕著な感受性を証明し、さらに、該ｐ５３多形性変異体が以前から信じられてきたとおり機能的に均等ではないことを暗示する。これらの発見は、スクリーニングプログラムに対して直接の衝撃を有することになり、それら発見は、ｐ５３遺伝子型が異常なＰＡＰスメアおよび／または頸部新形成を有する個体および免疫上抑圧された個体の悪性腫瘍においても今考慮されなければならない。そのようなプログラムは、ＨＰＶ感染およびＨＰＶ関連新形成を有する個体の増加した観察およびおそらくは初期の治療のための長期間の含蓄を有する。

本発明は、以下の実施例を参照することにより、より容易に理解されることになるが、実施例は発明を例示するために提供され、発明を限定するために提供されるのではない。

実施例Ｉ
ｐ５３遺伝子型は、異常なＰＡＰスメアを伴って提示される個体において測定できた。ｐ５３Ａｒｇ対立遺伝子に関して同型接合である（ｐ５３Ａｒｇ／ｐ５３Ａｒｇ）と決定された個体は、従って、ＨＰＶに関連した頸部新形成および頸部癌を発症する危険性がより高いとして分類されるはずである。同型接合ｐ５３Ａｒｇの個体は、次に、少なくともｐ５３Ｐｒｏ対立遺伝子上に有する個体よりも攻撃的な様式で臨床医により治療される。
実施例ＩＩ
かなりの努力が、頸部新形成および頸部癌の範囲を減じるためのＨＰＶに対するワクチンの開発に注がれている最中である。ｐ５３Ａｒｇ対立遺伝子に関して同型接合（ｐ５３Ａｒｇ／ｐ５３Ａｒｇ）であると決定された個体は、従って、ＨＰＶ関連頸部新形成および頸部癌の発症の危険性が高いとして分類されるはずである。同型接合ｐ５３Ａｒｇの個体は次に優先的に予防接種されるが、なぜならば、それらはＨＰＶ関連の病理例えば癌を発症する危険性が高いからである。
実施例ＩＩＩ
個体は様々な理由例えば免疫抑圧性薬剤または感染因子例えばＨＩＶのために免疫抑圧性になりうる。ｐ５３Ａｒｇ対立遺伝子に関して同型接合（ｐ５３Ａｒｇ／ｐ５３Ａｒｇ）であると決定された免疫抑圧個体は、従って、ＨＰＶ関連病理例えば癌を発症する危険性が高いとして分類されるはずである。

本発明は特定の態様に関して記載されてきたが、さらに修飾することが可能であり、そして本出願はあらゆる変更物、使用、または適合を包含することを意図し、一般的には本発明の原理に従いそして本開示からのそのような逸脱を包含するが、それらは発明が属する分野において公知または日常の実施の範囲内であり、そして前記の本質的特徴に適合させてよく、請求の範囲に従う。

Claims

野生型ｐ５３の異なる多形性形態に関連したヒトパピローマウイルス関連の悪性腫瘍を発症する危険性のあるＨＰＶ−感染個体を同定するスクリーニング方法であって、患者の生物学上のサンプル中のｐ５３ａｒｇ^７２野生型対立遺伝子の存在を測定する工程を含み、ｐ５３ａｒｇ^７２／ｐ５３ａｒｇ^７２のサンプル中の対立遺伝子パターンがヒトパピローマウイルス関連の悪性腫瘍を発症する危険因子の指標であるスクリーニング方法。
悪性腫瘍が、新形成、癌、およびウイルス感染からなる群から選択される、請求項１記載のスクリーニング方法。
悪性腫瘍が、頸部のいぼ、子宮頸部新形成または子宮頸部癌である、請求項１記載のスクリーニング方法。
測定工程が：
ａ）ポリメラーゼ鎖反応により増幅すること；
ｂ）ＤＮＡまたは蛋白質を配列決定すること；および
ｃ）ｐ５３ａｒｇ^７２のＤＮＡに特異的な少なくとも一つのプローブとハイブリダイズさせること；
の少なくとも一つからなる、請求項１記載のスクリーニング方法。
患者が免疫抑圧治療下にあり、そしてウイルス感染およびウイルスによる病状に対してより感受性である、請求項１記載のスクリーニング方法。
ウイルスによる病状がヒトパピローマウイルスに関連した皮膚癌である、請求項３記載のスクリーニング方法。
あらゆるＨＰＶ予防接種プログラムにおける有力な予防接種候補をスクリーニングする方法であって、患者からの生物学上のサンプル中のｐ５３ａｒｇ^７２野生型対立遺伝子の存在を測定する工程を含み、その際ｐ５３ａｒｇ^７２／ｐ５３ａｒｇ^７２の患者が優先的に予防接種されるべきであることからなる、スクリーニング方法。
患者が、異常ＰＡＰスメア、頸部のいぼ、または低級の頸部病巣を有する、請求項１ないし７の何れか１項記載のスクリーニング方法。
患者が新生児または生殖器のＨＰＶ感染を有する母の新生児である、請求項１ないし７の何れか１項記載のスクリーニング方法。