DE69032080T2 - Verwendung von konservierten Oligonukleotid-Primern zur Amplifizierung von menschlichen Papillomavirus-DNS-Sequenzen - Google Patents
Verwendung von konservierten Oligonukleotid-Primern zur Amplifizierung von menschlichen Papillomavirus-DNS-SequenzenInfo
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Description
- Die Infektion des anogenitalen Traktes durch den humanen Papillomavirus (HPV) wird heute als eine übertragbare Geschlechtskrankheit angesehen, die oft mit der Pathogenese von Krebs und dessen Vorläuferlesionen assoziiert ist. Von den über 50 bekannten HPV-Typen infizieren mindestens 21 den anogenitalen Trakt. Diese mukosotropen Viren werden am häufigsten mit gutartigem Condyloma oder latenten Infektionen in Verbindung gebracht. Jedoch zeigt die Anwesenheit von HPV in premalignanten Lesionen und invasiven Carcinomen, insbesondere der Cervix, möglicherweise das oncogene Potential dieser Viren auf. Siehe P.M. Howley, in Imoortant Advances in Oncology, D.T. Devita, Jr., et al., eds., J. B. Lippincott, Philadelphia, PA (1987) auf den Seiten 55-73.
- Bestimmte Virustypen, insbesondere HPV 16 und 18 und zu einem geringeren Ausmaß auch HPV 31, 33 und 35 werden in einem hohen Anteil bei invasiven cervicalen Carcinomen und deren Metastasen aufgefunden. Andererseits werden viele HPV's, die den anogenitalen Trakt infizieren, wie etwa HPV 6 und 11, meistens in benignen Condylomata gefunden und eher selten in invasiven Carcinomen. So können die HPV's, die im anogenitalen Trakt nachgewiesen werden, grob eingeteilt werden in niedrig- (HPV 6 und 11), intermediär (HPV 31, 33 und 35) oder hoch- (HPV 16 und 18) riskante Viren, basierend auf ihrer Assoziation mit Bösartigkeit. A.T. Lorincz et al., J. Natl. Cancer Inst., 79, 671 (1987). In einer aktuellen Studie wurde HPV 18 nicht in prämalignen Lesionen nachgewiesen, jedoch in 17% der invasiven cervicalen Carcinome, was zu der Vermutung führt, daß dieses Virus mit einem schnellen Verlauf der Erkrankung assoziiert sein könnte. R.J. Kurman et al., Am. J. Obstet. Gynecol., 159, 293 (1988). Zusätzlich tendierte HPV 18 dazu, häufiger mit höhergradigen Tumoren und Metastasen bei jüngeren Patienten assoziiert zu sein als HPV 16. W. Barnes et al., Gynecol. Oncol., 29, 269 (1988)
- Aus diesen Gründen besteht ein Bedürfnis an Verfahren zur Identifikation und Typisierung von HPV in klinischen Proben. In breiter Weise kreuzreaktive polyklonale Antiseren, die durch die Immunisierung von Tieren mit zerstückelten Virionen hergestellt wurden, haben sich als fähig erwiesen, HPV-Antigene in etwa 30- 70% von kutanen und schleimhautständigen Warzen nachzuweisen. Iminunologische Tests haben zwei Hauptnachteile. Nur gut differenzierte Zellen scheinen in der Lage zu sein, virale Antigene zu exprimieren. Daher enthalten HPV-infizierte Gewebe, die einen höheren Grad an Neoplasie aufweisen, wie etwa Carcinoma in situ, selten HPV-Antigen. Zweitens ist der Test nicht in der Lage, spezifische virale Typen zu identifizieren.
- Da zur Zeit kein immunologischer Test zur Typisierung von Viren verfügbar ist, wurden zum Nachweis und zur Typisierung von HPV-DNA und -RNA in klinischen Proben molekulare Hybridisierungstechniken verwendet. Siehe A.T. Lorinez, Obstetrics and Gynecol. Clinics of N. Amer., 14, 451 (1987). Viele dieser Techniken verwendeten markierte einzelsträngige DNA-Sonden, welche komplementär zu bekannten Bereichen des viralen Genoms sind und welche daher an diese binden können. Beim Southern blotting wird virale DNA aus lysierten Zellen isoliert, gereinigt und durch Aufschluß mit Restriktionsenzymen in Fragmente mit bekanntem Molekulargewicht aufgespalten. Die Fragmente werden denaturiert und physikalisch durch Gelelektrophorese aufgetrennt. Die einzelsträngigen- Fragmente werden dann entweder mit einer Mischung von markierten HPV- Sonden, um eine Infektion zu diagnostizieren, oder mit einem Panel von HPV-Typ-spezifischen Sonden in Kontakt gebracht. Die HPV-Fragmente, die mit den Sonden reagieren, können über den Nachweis des gebundenen Markers identifiziert werden.
- Der Einsatz von solchen molekularen Hybridisierungstechniken, um homologe DNA-Sequenzen nachzuweisen, ist sensitiv und kann hochspezifisch sein, wenn Sonden eingesetzt werden, die an Nukleinsäuresequenzen binden, die für einen bestimmten HPV-Typ einzigartig sind. Jedoch sind die Schritte, die benötigt werden, um die virale DNA zu isolieren und zu reinigen, technisch aufwendig, und die Konzentrationen der gesamten viralen DNA in einer gegebenen klinischen Probe können unterhalb der Sensitivitätsgrenze des Tests liegen. Zum Beispiel ist die Menge von viraler DNA in dysplastischen cervicalen Lesionen bei zunehmender Dysplasie reduziert. Eine in situ RNA-Sonde war in der Lage, HPV bei einem cervicalen squamösen Zellcarcinom nachzuweisen und zu typisieren, aber man benötigte vier Wochen für die Autoradiographie, um die gebundende Sonde nachzuweisen.
- Um dieses Problem zu umgehen, können die viralen DNA- Sequenzen durch die Verwendung der. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert werden, und die Produkte können durch den Einsatz herkömmlicher Hybridisierungstechniken zur Identifikation des Virus-Typs, wie etwa Southern Blotting identifiziert werden. Siehe C. Oste, Biotechnigues, 6, 163 (1988) und KB. Mullis (US. Patent Nr. 4,683,202). Eine Reihe von Nukleotiden, die komplementär sind zu dem 5'-Ende eines anvisierten Bereiches des HPV-Genoms und eine zweite Reihe, die komplementär ist zu dem 3'-Ende dieses Bereiches werden zunächst synthetisiert. Diese olegonukleotide werden als "Primer" bezeichnet. Wenn es diesen Amplifikationsprimern gestattet wird, mit der vollständigen denaturierten zellulären DNA in einer klinischen Probe zu anelieren ("annealing"), bilden sie mit der einzelsträngigen HPV-DNA, falls diese vorhanden ist, Duplexe aus. In Anwesenheit einer DNA-Polymerase und einer Mischung von Deoxynukleotidtriphosphaten wird jeder Strang verlängert, wie dies in Figur 1 gezeigt ist. Wenn dieser Zyklus von Denaturierung, Primeranelierung und Kettenverlängerung wiederholt wird, wird der anvisierte Bereich der HPV-DNA sich exponentiel anhäu en, bis hin zu etwa 1g DNA nach 30 Zyklen. Dieses Produkt ist auf einem Agarosegel leicht sichtbar, was somit die Anwesenheit der HPV-Sequenz in dem Gewebe andeutet. Die Diagnose kann überprüft werden, indem die DNA auf Nitrozellulose übertragen wird, und indem mit einer spezifischen Sonde für den HPV-Typ, von dem man annimmt, daß er anwesend ist, getestet wird.
- Anderenfalls kann man Vorteile aus dem Umstand ziehen, daß man bekannte Restriktionsstellen innerhalb der HPV-DNA kennt, um zu zeigen, daß die amplifizierte DNA die erwartete Sequenz enthält, indem man das/die Spaltungsmuster untersucht, das/die von einer oder mehreren Restriktionsendonukleasen erzeugt wird/werden. Die Überprüfung der Authentizität der amplifizierten Sequenz kann aus zwei Gründen notwendig sein: (i) um Sicherzustellen, daß die Sequenzen, die zu den amplifizierenden Primern komplementär sind, nicht zufällig in der zellulären DNA vorhanden sind, die keine HPV-DNA enhält, und (ii) um zu überprüfen, welcher HPV-Typ vorliegt. Wenn die für die Amplifikation ausgewählten Sequenzen den HPV-Typen gemeinsam sind, impliziert die Auffindung eines amplifizierten Produktes keinen besonderen HPV-Typ. Es sollte ebenfalls möglich sein, die Größe des amplifizierten Produktes beruhend auf den Bindungspositionen der beiden Primer vorherzusagen. So kann man, wenn das Produkt aufgefunden wird, relativ sicher sein, daß HPV anwesend ist. Jedoch können zwei unterschiedliche EPV-Typen ein Produkt gleicher Größe ergeben, oder Untertypen eines bestimmten HPV können Produkte unterschiedlicher Größe ergeben. Daher sollten Hybridisierungstechniken angewendet werden, um die Identität der amplifizierten Sequenz zu bestätigen, bis Vertrauen dafür besteht, daß die Interpretation der Ergebnisse die richtige ist. Es muß betont werden, daß bei Abwesenheit "universeller" Primer die PCR-Technik nur eng verwandte oder Typ-spezifische Sequenzen identifizieren wird, da nur ein kleiner Anteil des Genoms analysiert wird.
- Die Vorteile der PCR-Technik sind, daß (i) der Nachweis von DNA innerhalb einer Probe durchgeführt werden kann, ohne die DNA zuerst zu extrahieren, daß (ii) die Sensitivität erhöht wird, indem die DNA amplifiziert wird, die in der Lesion vorhanden ist. Die Amplifikation von HPV-DNA Sequenzen durch PCR, gefolgt von molekularer Hybridisierung ist insofern die sensitivste Technik, als daß ein einzelnes Molekül oder eine "Kopie" von HPV-DNA theoretisch nach einer angemessenen Anzahl von Amplifikationen nachgewiesen werden kann. In der Praxis liegt das Niveau der Sensitivität bei ca. 50-100 Kopien pro Probe. Die am nächsten sensitive Technik ist das Dot-Blotting, das etwa 10.000 Moleküle nachweisen kann, wohingegen Southern Blotting verläßlich etwa 100.000 Kopien von DNA nachzuweisen vermag.
- Nichtsdestoweniger wurde PCR zum Nachweis von HPV in frischen klinischen Proben (L.S. Young et al., Brit. Med. J., 298, 14 (1989)) verwendet, und das Verfahren wurde ebenfalls zum Nachweis von HPV-Sequenzen in Abschnitten von Formalin-fixierten Paraffin-eingebetteten cervicalen intraepithelialen Neoplasien und invasiven Carcinomen angepaßt. HPV-Sequenzen wurden sogar in fixierten Geweben, die über vierzig Jahre alt waren (D. Shibata et al., Cancer Res., 48 4566 (1988)), nachgewiesen. Ein gewisser Nachteil ist die Möglichkeit von falsch positiven Ergebnissen, aufgrund von Kreuzkontaminationen von Proben oder aufgrund von Kontamination von Proben mit amplifizierten Materialien.
- Virustyp-spezifische Primer wurden verwendet zur Amplifikation von HPV 11-; 16- und 18- Sequenzen (D. Shibata et al., J. Exp. Med.; 167, 225 (1988)). Jedoch macht die beträchtliche Anzahl von Primern, die notwendig sind, um die DNA von jedem Virustyp, der den anogentitalen Trakt infiziert, zu amplifizieren, die PCR für die Diagnosestellung oder für die Typisierung von HPV in klinischen Proben undurchführbar. Auch hängt der Umstand, ob derzeit untypisierte HPV-Stämme mittels PCR nachgewiesen werden können, davon ab, ob ein universelles Paar von Primern existiert oder nicht, das verwendet werden kann, um einen Bereich nachzuweisen, der bei allen HPV-Typen beibehalten wird. Daher besteht ein Bedürfnis an einem Verfahren, um DNA aus der großen Zahl der HPVs zu amplifizieren, welche den anogenitalen Trakt infizieren, unter Einsatz eines einzigen Satzes von "universellen" Primern. Die Identifikation eines bestimmten viralen Typs könnte dann durch molekulare Hybridisierung mit Oligonukleotidsonden durchgeführt werden, die zu den Sequenzen in dem amplifizierten Bereich, die für jeden Virustyp spezifisch sind, komplementär sind.
- Die vorliegende Erfindung betrifft zwei Oligonukleotide, welche als amplifizierende Primer dienen, wenn sie zusammen bei der Polymerasekettenreaktion verwendet werden. Die beiden Primer, die durch die Abkürzungen IU und IWDO bezeichnet sind, weisen die folgenden Formeln auf:
- worin N&sub1; gleich A oder G ist, N &sub2;gleich C oder T ist, und worin N&sub3; gleich A oder T ist. Die Nukleotidbestandteile von IU und IWDO werden dargestellt durch einen einbuchstabigen Code für die entsprechenden Nukleotidbasen, wobei A gleich Adenin ist, C gleich Cytosin ist, G gleich Guanin ist, und wobei T gleich Thymin ist und wobei I gleich Deoxyinosin-5-O-phosphat ist. Die Deoxymosinreste können mit jeder Base Paare bilden, wodurch der Duplex stabilisiert wird. Wie angegeben, sollen die Strukturen von IU und IWDO von der 5'-Hydroxymethylgruppe auf dem Deoxyribosering der Nukleotide T bzw. N aus in Richtung auf die 3'-Hydroxylgruppe hin gelesen werden, die an die 5'- Hydroxymethylgruppe des nächsten Nukleosidzuckerrests über eine Phosphatbindung gebunden ist.
- Aufgrund der Variation, die gestattet ist, an den mit N&sub1;, N&sub2; und N&sub3; bezeichneten Positionen, sind die bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Primer in etwa eine äquimolare Mischung eines jeden der einzelnen möglichen Oligonukleotide. Beispielsweise wird in der Praxis IU präpariert und verwendet als eine in etwa äquimolare Mischung von 8 Oligonukleotiden, jedes davon mit einer fixierten Sequenz, während IWDO präpariert und verwendet wird, als eine Mischung von 16 Gligonukleotiden. Jedoch kann von jedem dieser individuellen Oligonukleotide angenommen werden, daß es für sich alleine als ein HPV-PCR Primer nützlich ist, und in jedem Fall ist es als Bestandteil von IU oder IWDO nützlich. Daher fällt ]edes oligonukleotid innerhalb der Bedeutung der Formeln von IU oder IWDO unter den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung.
- Die vorliegenden "Allgemeinsequenz"-Primer sind komplementär zu DNA-Sequenzen in der 5'-Hälfte des E1 ORF von HPV und anelieren mit einer großen Vielfalt von menschlichen und tierischen Papillomavirus-DNAS. Die vorliegenden allgemeinen Primer wurden zur Amplifikation von HPV 6-, 11-, 16,- 18- und 33-DNA verwendet, um Mengen zu liefern, die mit konventionellen Hybridisierungsverfahren nachweisbar sind. Außerdem gelang es, unter Einsatz der vorliegenden Primer, sowohl die Genome von menschlichen wie tierischen kutanen und mukösen viralen DNAs, deren Sequenzen unbekannt waren, bis hin zu nachweisbaren Mengen zu amplifizieren. Virale Genome in: klinischen Proben können ebenfalls mit den vorliegenden Primern amplifiziert werden, was so einen allgemeinen Assay für HPV-Infektionen liefert.
- So stellen die Primer TU und IWDO, falls sie zusammen verwendet werden, ein Verfahren zur Diagnose von HPV-Infektionen in einer Probe physiologischen Materials zur Verfügung, das folgendes umfäßt
- (a) das Denaturieren der doppelsträngigen HPV-DNA in der Probe zur Erzeugung eines ersten Einzelstranges und eines zweiten Einzelstranges von HPV-DNA;
- (b) Umsetzen des ersten Stranges von HPV-DNA mit einem molaren Überschuß des Oligodeoxynukleotidprimers
- IU : dessen komplementärem Bereich auf dem ersten Strang und Umsetzen des zweiten Stranges von HPV-DNA mit einem molaren Überschuß des Oligodeoxynukleotidprimers IWDO : dessen komplementärem Bereich auf dem zweiten Strang unter Bedingungen derart, daß jeder Primer mit seinem komplementären Bereich aneliert und daß ein verlängerungsprodukt jedes Primers synthetisiert wird, welches komplementär zu dem Strang ist, an welchen der Primer aneliert ist;
- (c) Abtrennen der Primerverlängerungsprodukte von den Strängen, an welchen sie synthetisiert wurden, um einzelsträngige Moleküle zu erzeugen; und
- (d) das Umsetzen der einzelsträngigen Moleküle, die in Schritt (c) erzeugt wurden, mit den beiden Primern des Schritts (b), in einem molaren Überschuß von Primer : dessen komplementärem Bereich, unter Bedingungen derart, daß ein Primerverlängerungsprodukt synthetisiert wird unter Einsatz von jedem der einzelsträngigen Moleküle als Schablone.
- Vorzugsweise werden die Schritte (c)-(d) mindestens einmal wiederholt, aber es ist vorzuziehen, sie etwa 10-50 mal zu wiederholen, um die Synthese einer nachweisbaren Menge einer DNA-Sequenz zu erreichen, welche der doppelsträngigen HPV-DNA entspricht, welche mit den Bindungsstellen der beiden Primer überlappt und die dazwischen enthalten ist. Diese synthetische doppelsträngige HPV-DNA kann dann markiert, denaturiert und in Bezug auf ihre Fähigkeit getestet werden, Sonden zu binden, die komplementäre Einzelstränge von DNA umfassen.
- Alternativ kann unmarkierte amplifizierte HPV-DNA denaturiert werden und mit markierten Sonden mit bekannten Sequenzen umgesetzt werden. In jedem Fall erzeugt die Hybridisierung der Sonde an die synthetische einzelsträngige HPV-DNA ein doppelsträngiges HPV-DNA-Molekül, welches einen Marker umfaßt, dessen Nachweis die Anwesenheit von HPV in der klinischen Probe bestätigt. Wie hierin verwendet, soll der Ausdruck "Marker" oder "Markierung" sowohl einen direkt nachweisbaren Marker bezeichnen, wie etwa ein Radioisotop oder ein Enzym oder einen indirekt nachweisbaren Marker, wie eine Bindungsstelle für einen nachweisbaren Marker, z.B. ein Avidinmolekül, welches ein biotinyliertes Enzym zu binden vermag. Vorzugsweise wird die synthetische doppelsträngige HPV-DNA Spaltungsstellen enthalten, so daß sie vor der Denaturierung mit einer oder mehreren Restriktionsendonukleasen fragmentiert werden kann. Nach der Denaturierung können die Fragmente mittels chromatographischer Verfahren getrennt werden, und die einzelnen Fragmente können mit nachweisbaren einzelsträngigen Sonden von bekannter Sequenz identifiziert werden. Typ-spezifische Sonden sind offenbart, z.B. in der veröffentlichten Europäischen Pantentanmeldung Nr. 301,968 und von A. Cravador et al., in Molecular and Cellular Probes, 3, 143 (1989), auf deren Offenbarungen hiermit verwiesen wird. Natürlich können solche Sonden mit IWDO anstatt mit IU verwendet werden, um die typ-spezifische Amplifikation und Identifikation von HPV-Strängen durchzuführen.
- Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft diese Erfindung diagnostische Kits zum Nachweis von HPV-DNA in einer Probe von der angenommen wird, daß sie mit HPV infiziert ist, wobei das Kit folgendes in verpackter Form enthält: eine Mehrfachbehältereinheit, die folgendes aufweist:
- (a) jeweils einen Behälter mit den Primern IU und IWDO, wobei jeder der Primer im wesentlichen zu einem Strang der HPV-DNA komplementär ist, so daß ein Verlängerungsprodukt, das von einem Primer synthetisiert wird, wenn es von seinem Komplement abgetrennt ist, als Schablone dienen kann für die Synthese des Verlängerungsproduktes des anderen Primers;
- (b) einen Behälter, der ein Polymerisationsmittel für Nukleosidtriphosphate enthält;
- (c) je einen Behälter für jedes der vier unterschiedlichen Nukleosidtriphosphate;
- (d) einen Behälter, der Mittel enthält, wie etwa eine Sonde, die in der Lage ist, die Anwesenheit der DNA in der Probe nachzuweisen; und, wahlweise,
- (e) ein Behälter, der Mittel enthält, zum Nachweis von Hybriden der Sonde und der Sequenz.
- Die vorliegende Erfindung liefert ebenfalls ein Verfahren zur Synthese eines Segmentes des HPV-Genoms, welches einem Abschnitt des offenen E1-Leserasters (ORF, "open reading frame") entspricht. Dieses DNA-Fragment kann sequenziert werden, um bislang unbekannte HPV-Typen zu charakterisieren Die Synthese von relativ großen Mengen bekannter DNA aus diesem Bereich kann sinnvoll sein, um Material für immunologische Studien zu liefern, z.B. für die Herstellung von Untereinheits-Vaccinen oder monoklonalen Antikörpern gegen HPV. Repräsentative DNA- Sequenzen, die mit der PCR unter Einsatz von TU und IWDO synthetisiert werden können, sind in Tabelle A unten zusammengefaßt. Tabelle A. Nukleotidpositionen für die primären Anelierungsstellen der Primer IU und IWDO im E1 ORFa von HPV
- a Siehe Figur 2. Das HPV-6b E1 ORF umfaßt die Nukleotide 715-2278.
- b Prozent Homologie.
- ¹ A. L. Chad et al., Virology, 118, 254 (1982); O. Danos et al., EMBO J., 1, 231 (1982).
- ² K. R. Zachow et al., Virology, 158, 251 (1987).
- ³ E. Schwarz et al., EMBO J., 2, 2341 (1983).
- &sup4; P. G. Fuchs et al., J. Virol., 58, 626 (1986).
- &sup5; K. Dartman et al., Virology, 151, 124 (1986).
- &sup6; C. C. Baker et al., J. Virol., 61, 962 (1987), A. L. Chad et al., ibid.
- &sup7; S. T. Cole et al., J. Mol. Biol., 193, 599 (1987).
- &sup8; S.T. Cole et al., J. Virol., 58, 991 (1986).
- Figur 1 ist eine schematische Darstellung der Amplifikation einer anvisierten DNA-Sequenz durch PCR. Der durchgehende und der gepunktete Block stellen die beiden Oligonukleotide dar, die an die interessante Sequenz angrenzen (amplifizierende Primer). Die senkrechten Striche stellen multiple Basenpaare dar. Wenn sie mit denaturierter DNA vermischt werden und die Anelierung gestattet wird, werden diese Primer an ihre komplementären Sequenzen auf der DNA hybridisieren. DNA-Polymerase wird dann die DNA als Schablone yerwenden und das Oligonukleotid als Primer, um einen neuen DNA-Strang zu synthetisieren. Wiederholte Zyklen von Denaturierung, Anelierung und Primerverlängerung werden eine Menge von amplifizierten Zielsequenzen erzeugen; eine solche Sequenz ist unten gezeigt.
- Figur 2A ist eine schematische Darstellung des HPV-6b Genoms. Die Symbole "A" auf der 0-7902 Nukleotidskala stellen Polyadenylierüngsstellen dar. Die unterbrochenen Linien in den Kästchen, welche HPV-ORF's darstellen, zeigen die -ungefähren Positionen der ATG Startcodons.
- Zeichnung 2B ist eine schematische Darstellung des Einsatzes von PCR, um eine DNA-Sequenz im E1 ORF von HPV unter Einsatz der Primer der vorliegenden Erfindung zu amplifizieren.
- Im wesentlichen verwendet das vorliegende Verfahren die PCR um, bezogen auf die Anzahl der beinhalteten Reaktionsschritte, mindestens eine spezifische HPV-DNA-Sequenz in exponentiellen Mengen zu erzeugen. Das Erzeugnis der Kettenreaktion wird eine bestimmte Einheit von doppelsträngier DNA sein mit Schlußstücken, die den Enden der verwendeten Primer entsprechen.
- Jede Quelle von HPV-DNA in gereinigter oder nicht gereinigter Form kann als Ausgangsmaterial zur Amplifikation verwendet werden, vorausgesetzt sie enthält HPV-DNA oder es wird dies von ihr vermutet.
- Die Oligonukleotidprimer können unter Verwendung jedes geeigneten Verfahrens hergestellt werden, wie beispielsweise der Phosphotriester- und Phosphodiesterverfahren oder automatisierten Ausführungen davon. Bei einer solchen automatisierten Ausführung werden Diethylphosphoramidite als Ausgangsmaterialien verwendet und können synthetisiert werden, wie beschrieben von Beaucage et al., Tetrahedron Letters, 22, 1859 (1981). Ein Verfahren zur Synthese von Oligonukleotiden auf einem modifizierten festen Träger ist beschrieben im U.S. Patent Nr. 4,458,066.
- Es ist notwendig, die Stränge der HPV-DNA zu trennen, bevor sie als Schablonen verwendet werden können, entweder als einzelner Schritt oder simultan mit der Synthese der Primerverlängerungsprodukte. Diese Strangtrennung kann mit jedem geeigneten Verfahren durchgeführt werden, einschließlich physikalischer, chemischer oder enzymatischer Mittel. Ein physikalisches Verfahren zur Trennung der Stränge der Nukleinsäuren beinhaltet das Erhitzen der Nukleinsäuren, bis sie vollständig (> 99%) denaturiert sind. Die typische Hitzedenaturierung kann Temperaturen einschließen, die von etwa 80ºC bis 105ºC reichen, und zwar für Zeiträume von etwa 1 bis 10 Minuten. Die Strangtrennung kann ebenfalls durch ein Enzym aus der Klasse der Enzyme induziert werden, die als Helicasen bekannt sind, oder durch das Enzym RecA, welches Helicaseaktivität besitzt und das bei Vorhandensein von riboATP bekannterweise DNA denaturiert. Die Reakti6nsbedingungen, die zur Trennung von Nukleinsäuresträngen mit Helicasen geeignet sind, sind in den Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, Vol XLIII "DNA:Replication and Recombination" (New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1978) beschrieben, wie auch in Kuhn et al., "DNA Helicases", Seiten 63-67, und Verfahren zum Einsatz von RecA sind übersichtsweise in C. Radding, Ann. Rev. Genetics, 16, 405 (1982) dargestellt.
- Die PCR kann unter Einsatz jedes geeigneten Verfahrens durchgeführt werden. Im allgemeinen wird sie in einer gepufferten wässerigen Lösung durchgeführt, vorzugsweise bei einem pH von 7-9, noch bevorzugter bei ungefähr 8. Vorzugsweise wird ein molarer Überschuß (für geklonte DNA im allgemeinen etwa 1000:1 Primer:Schablone, und für genomische Nukleinsäure, etwa 106:1 Primer:Schablone) der beiden Oligonukleotidprimer zu dem Puffer, der die getrennten HPV-DNA-Stränge enthält, hinzugefügt. Es ist jedoch offensichtlich, daß die Menge an komplementärem Strang nicht bekannt sein kann, wenn das hierin verwendete Verfahren für diagnostische Anwendungen verwendet wird, so daß die Menge von Primer bezüglich zur Menge an komplementärem Strang nicht mit Sicherheit bestimmt werden kann. Bei der praktischen Anwendung jedoch wird die. Menge von hinzugefügtem Primer im allgemeinen in molarem Überschuß über der Menge seines komplementären Stranges (Schablone) liegen, wenn die zu amplifizierende Sequenz in einer komplexen Mischung von langkettigen Nukleinsäuresträngen enthalten ist. Ein großer molarer Überschuß wird bevorzugt, um die Effizienz des Verfahrens zu verbessern.
- Die Deoxyribonukleosidtriphosphate dATP, dCTP, dGTP und TTP werden ebenfalls zu der Synthesemischung in angemessenen Mengen hinzugefügt, und die sich ergebende Lösung wird auf etwa 90ºC - 100ºC für etwa 1-10 Minuten erhitzt, vorzugsweise 1-4 Minuten lang. Nach diesem Erwärmungszeitraum wird der Lösung gestattet, abzukühlen und die Hybridisierung der Primer.wird bei etwa 35ºC - 55ºC durchgeführt. Zu der gekühlten Mischung wird ein geeignetes Mittel zur Induzierung oder Katalyse der Primerverlängerungsreaktion hinzugefügt, und die Reaktion wird laufen gelassen unter Bedingungen, die dem Fachmann bekannt sind. Diese Synthesereaktion kann von Raumtemperatur bis hin zu
- einer Temperatur, überhalb welcher das induzierende Mittel nicht mehr effizient arbeitet, ablaufen. So liegt beispielsweise, wenn Taa DNA-Polymerase als induzierendes Mittel verwendet wird, die Temperatur im allgemeinen etwa bei 50ºC - 75ºC
- Das induzierende Mittel kann jede Verbindung oder jedes System sein, das unter Erzielung der Synthese von Primerverlängerungsprodukten arbeiten wird, einschließlich Enzymen. Geeignete Enzyme für diesen Zweck umfassen beispielsweise E. coli DNA-Polymerase I, das Klenow Fragment der E. coli DNA-Polymerase I, T4 DNA-Polymerase und andere verfügbare DNA-Polymerasen, sowie die thermostabile DNA- Polymerase, erhalten aus Thermus aquaticus (Tag DNA-Polymerase). Der Einsatz von Tag DNA-Polymerase ist vorzuziehen, da das Hinzufügen von frischen Enzymen nach jedem thermischen Denaturationsschritt nicht erforderlich ist. Im allgemeinen wird die Synthese am 3'-Ende jedes Primers initiiert und schreitet in 5'-Richtung entlang dem Schablonenstrang fort, bis die Synthese abbricht, wodurch Moleküle unterschiedlicher Länge erzeugt werden. Jeder neu synthetisierte Strang und dessen komplementärer Nukleinsäurestrang bilden ein doppelsträngiges Molekül, das in den folgenden Schritten des Verfahrens verwendet wird. Im nächsten Schritt werden die Stränge der beiden doppelsträngigen Moleküle getrennt, um vier einzelsträngige Moleküle zu erzeugen.
- Es werden neue Nukleinsäuren an den einzel-strängigen Molekülen synthetisiert. Zusätzliche induzierende Mittel, Nukleotide und Primer können falls notwendig hinzugefügt werden, damit die Reaktion unter den oben beschriebenen Bedingungen weiter fortschreitet. Erneut wird die Synthese an einem Ende des Olegonukleotidprimers initiiert und schreitet entlang den einzelnen Strängen der Schablone fort, wobei zusätzliche Nukleinsäuren erzeugt werden. Nach diesem Schritt besteht die Hälfte des Verlängerungsproduktes aus der spezifischen Nukleinsäuresequenz, die durch die beiden Primer gebunden ist. Die Schritte dieses Verfahrens können unendlich oft wiederholt werden, eingeschränkt nur durch die Menge an Primer, induzierendem Mittel und vorhandenen Nukleotiden. Die Menge an ursprünglicher Nukleinsäure bleibt während des gesamten Verfahrens konstant, da sie nicht repliziert wird. Die Menge der langen Produkte nimmt linear zu, da sie nur aus der ursprünglichen Nukleinsäure erzeugt werden. Die Menge der spezifischen Sequenz vergrößert sich exponentiell. Daher wird die spezifische Sequenz zur vorherrschenden Art.
- Die vorliegende Erfindung kann schrittweise durchgeführt werden, wobei nach jedem Schritt neue Reagenzien hinzugefügt werden, oder simultan, wobei sämtliche Reagenzien im anfänglichen Schritt hinzugefügt werden oder anteilig schrittweise und anteilig simultan, wobei frische Reagenzien nach einer bestimmten Anzahl von Schritten hinzugefügt werden. Wenn ein Verfahren der Strangtrennung angewendet wird, das das induzierende Mittel inaktiviert, wie etwa Hitze im Falle eines hitzelabilen Enzyms, dann ist es notwendig, das induzierende Mittel nach jedem Strangtrennungsschritt zu erneuern. Das simultane Verfahren kann verwendet werden, wenn ein enzymatisches Mittel beim Strangtrennungsschritt verwendet wird. Beim simultanen Verfahren kann die Reaktionsmischung zusätzlich zu den Nukleinsäuresträngen, die die gewünschte Sequenz enthalten, das Strangtrennungsenzym (z.B. Helicase), eine geeignete Energiequelle für das strangtrennende Enzym, wie etwa rATP, die fünf Nukleotide, die Oligönukleotidprimer in molarem Überschuß und das induzierende Mittel, z.B. das Klenow Fragment von E. coli DNA-Polymerase I enthalten. Falls Hitze zur Denaturierung bei einem simultanen Verfahren verwendet wird, kann ein hitzestabiles induzierendes Mittel wie etwa Tag DNA- Polymerase verwendet werden, das bei einer erhöhten Temperatur, vorzugsweise 65ºC - 90ºC, in Abhängigkeit vom induzierenden Mittel, arbeitet, wobei bei dieser Temperatur die DNA aus Einzel- und Doppelsträngen besteht, die sich im Gleichgewicht befinden. Die obere Temperatur hängt von der Zersetzungstemperatur des Enzyms ab oder von der Temperatur überhalb der ein unzureichendes Niveau an Primerhybridisation auftreten wird. Jeder Schritt des Verfahrens wird sequenziell ablaufen, ungeachtet der anfänglichen Anwesenheit sämtlicher Reagenzien. Zusätzliche Materialien können hinzugefügt werden, wenn dies erforderlich ist. Nachdem eine geeignete Zeitspanne abgelaufen ist, um die gewünschte Menge an spezifischer Nukleinsäuresequenz zu erzeugen, kann die Reaktion angehalten werden, indem die Enzyme auf irgendeine bekannte Weise inaktiviert werden, oder durch das Auftrennen der Reaktionsbestandteile. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann kontinuierlich durchgeführt werden. Bei einer Ausführungsform eines automatisierten Verfahrens kann die Reaktion zyklisch durch einen Denaturierungsbereich, einen Reagenzzugabebereich und einen Reaktionsbereich hindurchgeführt werden.
- Ein schnellere Maßnahme zur Synthese von fluoreszierenden Derivaten von Oligonukleotiden ist entwickelt worden. Dieses Verfahren bietet ein zusätzliches nickt-radioaktives Mittel zum Nachweis von spezifischen DNA-Fragmenten. Synthetische Kopien eines Abschnittes von jeder genspezifischen Sonde werden synthetisiert und es werden fluoreszierende Derivate ausgebildet. Unterschiedliche Farbstoffoligonukleotidkonjugate können für jeden HPV-Untertyp synthetisiert werden, jedes Konjugat mit unterschiedlichen spektralen Eigenschaften. Diese fluoreszenten Sonden können auf identische Weise verwendet werden, wie dies für die radioaktiven Sonden beschrieben ist, und die Hybridisation wird mittels Fluorometrie nachgewiesen. Jedoch könnte ebenfalls eine Mischung von Sonden verwendet werden, um eine einzelne DNA-Fragmentmischung zu untersuchen, da die Hybridisation einer jeden Sonde durch eine Fluoreszenzbande bei einer bestimmten Wellenlänge sichtbar dargestellt werden kann.
- Zum Einsatz als Sonde bei einer DNA:DNA Hybridisationsanalyse wird die markierte DNA denaturiert, d.h in ein.zelsträngige DNA überführt, wie etwa durch Aussetzen mit erhöhten Temperaturen in einem wässerigen Medium. Die sich ergebende einzelsträngige DNA wird mit denaturierten DNA-Fragmenten in Kontakt gebracht, die aus dem PCR Reaktionsgemisch abgeleitet wurden. Die markierte Sonde hybridisiert oder verbindet sich nur mit DNA-Strängen, die komplementäre Basenpaarsequenzen enthalten, wodurch die DNA- Fragmente, die von HPV abgeleitet wurden, identifiziert werden.
- Eine Reihe von experimentellen Techniken ist entwickelt worden, um Mischungen genomischer DNA-Fragmente mit radiomarkierten DNA-Sonden zu untersuchen. Ein bevorzugter Test wurde von E. M. Southern, in J. Mol. Bio., 98 503 (1975) offenbart. Beim "Southern Blotting" werden die zu untersuchenden DNA-Fragmente von einem Agarosegel auf einen festen Träger wie Nitrozellulose oder eine Nylonmembran übertragen. Die Membran erlaubt, die gebundene DNA durch DNA:DNA- oder DNA:RNA- Hybridisationsverfahren zu untersuchen. In einem ersten Schritt werden die Fragmente, die durch Verdauung genomischer DNA durch eine oder mehrere Restriktionsendonukleasen erzeugt wurden, chromatographisch in einem Agarosegel durch Elektrophorese gemäß ihrer Größe aufgetrennt. Die Fragmente in dem Gel werden bei Raumtemperatur in wässeriger Säure behandelt und dann unter basischen Bedingungen denaturiert. Schließlich wird das Gel neutralisiert und auf mit Puffer gesättigtes Filterpapier gelegt. Die Enden des Filterpapiers erstrecken sich in einen Behälter, der den Puffer enthält. Die obere Oberfläche des Gels wird mit der Membran bedeckt, auf die die DNA absorbiert oder "geblottet" werden soll. Die Membran wird dann mit trockenem Filt erpapier und einem Stapel von trockenen absorbierenden Papiertüchern überschichtet. Ein Gewicht wird auf den Stapel von Papier gelegt, um einen gleichmäßigen Kontakt zwischen der Membran und dem Gel zu bewerkstelligen. Puffer, der die einzelsträngige DNA enthält, wird durch das trockene Papier absorbiert, wenn es durch das Gel tritt. Die DNA bindet dann an die Membran. Das Blottingverfahren dauert üblicherweise zwischen 4 und 16 Stunden, um die gesamte DNA von dem Gel auf die Membran zu übertragen. Nach der Übertragung wird die Membran erhitzt, um die DNA fest an die Membran zu binden. Lösungen, die radiomarkierte Sonden enthalten, können dann mit den genomischen DNA Fragmenten, die auf der Membran fixiert sind, in Kontakt gebracht werden. Sämtliche Hybridisation wird durch Autoradiographie nachgewiesen, z.B. indem die Membran mit einem Röntgenfilm ausgesetzt wird.
- Das Vorhandensein oder das Fehlen der Ziel-HPV-DNA-Sequenz kann durch den Einsatz einzelsträngier markierter HPV-DNA-Sonden bekannter Sequenz nachgewiesen werden. Diese Sonden können durch das Heraustrennen von Bereichen des E1 ORF bekannter rekombinanter Plasmidvektoren einschließlich Bereichen des HPV- Genoms abgeleitet werden.
- Um die Synthese der vorliegenden Sonden abzuschließen, werden nachweisbare Marker eingeführt, z.B. ein Radiomarker oder ein fluoreszentes Molekül. Z.B. können Sonden durch das Verfahren der "Nicktranslation" radioaktiv gemacht werden. Einzelsträngige Abschnitte, oder "Nicks" werden in weit getrennten Intervallen in doppelsträngige DNA durch einen eingeschränkten Aufschluß mit dem Enzym DNase I eingeführt. An jeder Bruchstelle wird DNA- Polymerase I von E. coli verwendet, um 1) radiomarkierte Nukleotide an einer freie 3'-OH Gruppe einzuführen und 2) den Nick entlang der DNA Doppelhelix durch die 5'-3'- exonukleolytische Aktivität von Polymerase. 1 zu verlängern. Das Endergebnis ist ein doppelsträngiges DNA Molekül, das radiomarkierte Nukleotide nach dem Zufallsprinzip in jeden Strang eingebaut enthält.
- Die starke und spezifische Assoziation zwischen Biotin (Vitamin H) und dem Eiweiß Glycoprotein Avidin kann die Basis für ein nicht-radioaktives Mittel zum Nachweis von DNA:DNA Hybridisation liefern. Siehe Ward, Europäisches Patent Nr. 63 879. Der enzymatische Einschluß durch Nick-Translation von biotinylierten Nukleotiden in doppelsträngige DNA wurde bereits offenbart. Die biotinylierte DNA wird dann verwendet, um Ziel- DNA-Fragmente auf eine Weise zu testen, die dem Einsatz von radiomarkierten Sonden ähnelt. Spezifische DNA:DNA Hybridisation wird dann nachgewiesen, indem der Blot mit einer Lösung getränkt wird, die das Avidinprotein enthält. Avidin bindet die DNA:DNA- Komplexe über die Biotingruppe auf der DNA-Sonde. Die Avidin:Biotin:DNA-Komplexe werden unter Einsatz eines Indikatorenzyms, das an das Avidinprotein angebunden ist, nachgewiesen. Dieses Enzym katalysiert die Bildung eines Niederschlags, der die Visualisierung des DNA:DNA-Komplexes als Bande gefärbter Substanz erlaubt. Siehe z.B. U.S. Patent Nr. 4,228,237, dessen Offenbarung hiermit in Bezug genommen wird. Der Amplifikationsvorgang kann ebenfalls verwendet werden, um ausreichende Mengen DNA zu erzeugen, so daß der Nachweis durch eine einfache nicht-spezifische DNA-Färbung, wie Ethidiumbromid verwendet werden kann, so daß eine direkte DNA-Diagnose durchgeführt werden kann.
- Zusätzlich zum Nachweis von HPV in dem Genom von Organismen kann das hierin beschriebene Verfahren ebenfalls verwendet werden, um DNA Polymorphismen nachzuweisen, die eventuell mit keinem bekannten pathologischen Zu'tand, der mit HPV in Zusammenhang gebracht wird, assoziiert sind.
- Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden detaillierten Beispiele weiter beschrieben.
- Von Probanden, die wahrscheinlich eine genitale HPV-Infektion haben, wurden Abschabe- oder Abstrichproben von Cervix, Vulva oder Penis gesammelt und in einer Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung (PBS) suspendiert. Die gesamte zelluläre DNA wurde gereinigt, indem die Zellen in 0,6%igem Natriumdodecylsulfat und 0,01M EDTA, das 100 ug/ml Proteinase K enthielt, lysiert wurden. Die Proben wurden 18 Stunden lang bei C inkubiert. Die Proteine wurden durch zwei Extraktionen mit Phenol, gefolgt von zwei Extraktionen mit Chloroform:Isoamylalkohol (24:1 V/V) entfernt. Die Nukleinsäuren wurden mit Ethanol ausgefällt. Die RNA wurde durch Behandlung mit Rnase entfernt, gefolgt vom Aufschluß mit Proteinase K und den Extraktionen mit Phenol und Chloroform wie oben. Die DNA wurde mit Ethanol ausgefällt, erneut in Wasser gelöst und mit BamHI und HindIII nach dem Verfahren von W. D. Lancaster et al., in The Human Oncogenic Viruses, A. A. Luderer et al., eds., Humana Press, Clifton, NJ (1986) auf Seiten 153-183 aufgeschlossen. Ca. 0,01-0,1g DNA wurde in. der PCR verwendet.
- HPV-Sequenzen in bekannten Plasmiden wurden von flankierenden Vektorsequenzen befreit durch die Abtrennung an der einzigartigen Restriktionsenzymstelle für die Insertion. Sämtliche Abtrennstellen lagen außerhalb des E1 ORF. Die Plasmidquellen der HPV-Sequenzen sind in der Tabelle B unten angegeben. Tabelle B. HPV-Plasmide
- Die Primer IU und IWDO wurden mit einem DNA-Synthetiser (Modell 380, Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) gemäß dem allgemeinen synthetischen Verfahren von M. D. Matteucci et al., Tetrahedron Letters, 21, 719 (1980) gemäß den Verbesserungen von L. J. McBride et al., Tetrahedron Letters, 24, 245 (1983) synthetisiert. Kurz gesagt, wird ein erstes 2-Deoxynukleosid an einen festen Träger wie carboxyliertes Silicagel oder poröse Glasperlen gebunden, indem eine Esterbindung zwischen der 3'-OH Gruppe des Nukleosids und einer carboxylierten Säuregruppe, die an dem Träger angebunden ist, erzeugt wird, wobei die 5'-OH Gruppe des Nukleosids geschützt ist, z.B. mit einer Dimethoxytritylmethylgruppe. Diese Reaktion kann in Pyridin unter Einsatz von Dicyclohexylcarbodiimid als kondensierendes Mittel durchgeführt werden. Nachdem die verbleibenden Carboxylgruppen auf dem Träger blockiert worden sind, wird die 5'-OH Schutzgruppe abgespalten, und die OH-Gruppe des immobilisierten Nukleosids wird mit einem Phosphomonochloriditnukleosid umgesetzt, das hergestellt wird, indem ein 5'-O-geschütztes Nukleosid mit einem Methylphosphorodichloridit in Anwesenheit von Base bei geringer Temperatur zur Reaktion gebracht wird. Alternativ kann die Chlor-Austrittsgruppe des Phosphomonochloridits durch die Gruppe -NH(iPr)&sub2; ersetzt werden, und zwar durch die Reaktion eines geschützten Nukleosids mit einem Phosphoramidit in alkalischem Milieu, und die Kupplungsreaktion kann unter Verwendung einer schwachen Säure durchgeführt werden. Das sich ergebende immobilisierte Dinukleosidphosphit wird zum Phosphat oxidiert, z.B. unter Eynsatz von Jod in einer Mischung von Wasser/Lutidin/THF. Die POMe-Gruppe wird mit Thiophenoxid abgetrennt, um die Phosphatbindung zu ergeben, die basischen Aminogruppen werden entschützt, und das vollendete Oligonukleotid wird von dem Träger abgetrennt, z.B. mit verdünnter Base.
- Die einzelnen Oligonukleotide, die IU und IWDO ausbilden, können getrennt oder zusammen synthetisiert werden, oder Mischungen aus zwei geschützten Phosphomonochloriditnukleosiden können in den geeigneten Schritten im Rahmen der Synthese jedes Primers hinzugefügt werden. Siehe ebenfalls M. H. Caruthers et al. (US. Patent Nr. 4,458,066) für eine detaillierte Beschreibung dieses Syntheseweges. Die Primer umfassen 21 Nukleosidreste der folgenden Sequenz:
- Deoxymosin (1) Reste werden anstelle der vier Basen (A, C, T, G) Permutationen verwendet, um die Stabilisierung während der Anelierung zu erleichtern (E. Ohtsuka et al., J. Biol. Chem., 260, 2605 (1985)). Die Bindungsstellen dieser Primer auf sequenzierten HPV-Genomen sind in Tabelle A angegeben.
- Eine PCR zur Amplifikation von DNA-Sequenzen wurde durchgefüht, wie von Saiki et al., Science, 230, 1350 (1985) beschrieben und wie in Figur 2 zusammengefaßt. Kurz gesagt, wurden die Amplifikationsreaktionen in einem Volumen von 100 ul in 0,5ml Mikrozentrifugenröhrchen in 10mm Tris-HCl, pH 8,3, 1,5mm MgCl&sub2;, 50mM KCl mit den Deoxyribonukleotiden (dATP, dGTP, dCTP, TTP) bei einer endgültigen Konzentration von jeweils 200 uM und Primer bei jeweils 1 uM durchgeführt. HPV DNAs bei einer Konzentration von 1ng in 100 ul der Amplifikationsmischung wurden bei 95ºC 5 Minuten lang denaturiert, vor dem Zusatz von 2,5U Taq DNA-Polymerase (Perkin-Elmer, Cetus). (H. A. Erlich et al., Nature, 331, 461 (1988)). Das Amplifikationsgemisch wurde mit 100 ul Mineralöl überschichtet, und die Amplifikationen wurden in einem DNA thermal Cycler (Perkin-Elmer, Cetus) durchgeführt. Die DNA's wurden aneliert, bei 37ºC über 2 Minuten und bei einer Steigerung der Temperatur auf 55ºC über einen Zeitraum von 90 Sekunden hinweg. Die erste Verlängerung wurde bei 55ºC 1 Minute lang durchgeführt, gefolgt von einem Anstieg der Temperatur auf 72ºC in 40-60 Sekunden bei einer 3 minütigen Verlängerungsperiode. Die DNA's wurden bei 94ºC denaturiert und die Schritte wurden in weiteren 24 Zyklen wiederholt, es sei denn, etwas anderes ist angegeben.
- Die PCR-Produkte, die von rekombinanten HPV-DNA-Schablonen abgeleitet worden waren, wurden in niedrig schmelzenden Agarosegelen einer Elektrophorese unterzogen. Mit Ethidiumbromid gefärbte 850-Basenpaarfragmente, die das ungefähre Molekulargewicht der erwarteten Amplifikationsprodukte besaßen, wurden ausgeschnitten und mit alpha-³²P-dATP unter Anwendung der zufallsgesteuerten Primertechnik unter Einsatz von Klenow Polymerase direkt in der tiefschmelzenden Agarose markiert (A. P. Feinberg et al., Anal. Biochem., 132, 6 (1983)). Spezifische Aktivitäten von etwa 108 Zählungen/min/g DNA wurden routinegemäß nach diesem Verfahren erzielt. Die markierten PCR-Produkte wurden unter stringenten Bedingungen an Pst I-Aufschlüsse der bekannten HPV-DNA's hybridisiert.
- Basierend auf dem Guanin+Cytosin- (G+C) Gehalt und der Größe der universellen Primer IWDO und IU war die berechnete Dissoziationstemperatur (Td) der beiden Primer 58ºC bzw. 48ºC (B. D. Hames et al., Nucleic Acid Hybridization - A Practical Approach, IRL Press, Oxford, England (1985)). Die Anelierung dieser Primer wurde 11ºC unterhalb der Dissoziationstemperatur (Td) von IU durchgeführt.
- In vorläufigen Studien wurde herausgefunden, daß die Amplifikationsreaktionen kein nachweisbares Produkt lieferten, wenn sie bei der optimalen Temperatur von Taq Polymerase (72ºC) durchgeführt wurden. Es ist anzunehmen, daß einer oder beide Primer von der Schablone abdissoziierten, bevor die Verlängerung initiiert wurde. Um die Haftung des Primers an der Schablone aufrecht zu erhalten, wurde die Reaktionstemperatur langsam während der ersten Periode der Polymerisation (1 Minute) von 37º C auf 55ºC erhöht, gefolgt von einer zweiten Periode der Verlängerung bei 72ºC für 3 Minuten. Sämtliche HPV-DNA's, die unter diesen Bedingungen amplifiziert wurden, enthielten das erwartete 850er Nukleotidfragment. Zusätzlich zu der erwarteten Bande zeigte HPV18 stets die Anwesenheit eines Fragmentes mit einer Länge von ungefähr 550 Nukleotiden.
- Um die Quelle dieses zusätzlichen Fragmentes zu bestimmen, wurde eine PCR unter Einsatz nur eines der beiden Primer durchgeführt. Wenn IWDO als Primer verwendet wurde, zeigten HPV6- und HPV18-DNA's Fragmente von jeweils etwa 850 und 550 Nukleotiden. Es wurde keine Amplifikation mit HPV11-, HPV16- oder HPV33-DNA's beobachtet, wenn IWDO als einziger Primer verwendet wurde. Wenn IU als Primer verwendet wurde, wurde eine sehr blasse Bande bei etwa 850 Basenpaaren nur für HPV33 nachgewiesen. Die Extrafragmente für HPV6 und HPV33, die nach Amplifikation mit einem einzigen Primer beobachtet wurden, wurden bei Reaktionen mit zwei Primern aufgrund einer Co-Migration mit dem erwarteten 850er Basenpaarfragment nicht nachgewiesen.
- Die Untersuchung der viralen Sequenzen zeigte potentielle alternative Anelierungsstellen bei 69% Homologie mit IWDO nur für HPV6 und HPV18. Dieses Ausmaß an Fehlpaarung würde unter den Bedingungen der Primeranelierung (37ºC) toleriert werden. Die Anelierungs-(Ziel-)Stelle für IWDO auf HPV18-DNA liegt an der Position 2012 des codierenden (positiven) Stranges. Eine potentielle alternative Bindungsstelle für IWDO in der richtigen Ausrichtung zur Amplifikation wurde auf dem negativen Strang entdeckt, 545 Basenpaare (bp) stromaufwärts der Zielstelle. Andere Anelierungsstellen wurden ebenfalls lokalisiert, aber nur ein zusätzlicher Satz war korrekt orientiert, um eine Amplifikation zu erlauben. Eine Stelle war an der Position 3783 auf dem positiven Strang, und die andere Stelle war 575 Nukleotide stromabwärts auf dem negativen Strang. Für HPV6 wurde nur ein Satz von zusätzlichen alternativen Anelierungsstellen nachgewiesen. Eine Stelle befand sich an der Position 3006 auf dem positiven Strang, und die andere befand sich 859 Basenpaare stromabwärts auf dem negative Strang. Für HPV33 befand sich die Zielstelle für IU an der Position 1122 auf dem codierenden Strang; jedoch wurde keine alternative Bindungsstelle in der richtigen Ausrichtung, die ein Fragment von 850 Basenpaaren ergeben würde, auf dem nicht-codierenden Strang nachgewiesen. Jedoch befand sich ein Satz von alternativen Bindungsstellen an der Position 976 auf dem positiven Strang und 845 Basenpaare stromabwärts in der richtigen Ausrichtung auf dem negativen Strang.
- Um alle alternativen Primerbindungsstellen zu eliminieren, wurde die Anelierungstemperatür erhöht. Die PCR wurde für HPV6, 18 und 33 unter Einsatz nur eines Primers wiederholt, und die Anelierungstemperatur wurde von 37ºC auf 46ºC erhöht. HPV6 und 33 zeigten keine Amplifikation bei dieser Temperatur, aber eine 550 Basenpaarbande für HPV18 war weiterhin vorhanden. Als die Anelierungstemperatur von 46ºC auf 52ºC erhöht wurde, amplifizierte HPV18 bei Verwendung eines einzelnen Primes nicht mehr. Bei einer Anelierungstemperatur von 52ºC wurde keine Verlängerungszeit bei dieser Temperatur eingeschlossen, sondern es vervollständigte stattdessen ein langsamer Anstieg der Temperatur von 52ºC auf 72ºC über einen Zeitraum von 90 Sekunden, gefolgt von einer Verlängerung, den Zyklus. Durch das Erhöhen der Temperatur auf 52ºC wurde die Anelierung von IU oder IWDO an sekundäre Stellen verhindert. Dies wurde durch das Verschwinden der zusätzlichen Banden bei HPV6, 18 und 33 bestätigt. Eine Amplifikation unter Verwendung dieser beiden Primer war erfolgreich, obwohl die Anelierung bei einer Temperatur durchgeführt wurde, die 4ºC höher war als die niedrigste Td für IU.
- Es wurden keine Unterschiede in der Intensität der mit Ethidiumbromid gefärbten Fragmente festgestellt, die bei Anelierungstemperaturen von 46ºC anstelle von 52ºC erzeugt worden waren. Jedoch zeigte die serielle Verdünnung der HPV6 Schablone ungefähr zwei Größenordnungen Unterschied in der Menge amplifizierter DNA bei Beschränkung der Mengen an Schablone. Bei 46ºC konnten 0,01 pg amplifizierten Fragments nachgewiesen werden, wohingegen nur 1,0pg bei 52ºC nach 40 Amplifikationszyklen nachgewiesen wurden. Die Hybridisation zeigte auf, daß das Produkt der Amplifikatißn bei 46ºC in so geringen Mengen wie 0,001 fg (1-10 Moleküle) HPV6-DNA nachgewiwesen werden konnte und bei 52ºC in Mengen von 1pg oder 2 x 10&sup5; Molekülen.
- Um die Nützlichkeit der Primer als allgemeine HPV-Primer einzuschätzen, wurde die Amplifikation einer Mehrzahl von menschlichen und tierischen Papillomavirus DNA's, deren Sequenzen nicht verfügbar sind, versucht. Geklonte HPV2, 4, 31, 35 und 52 wie auch Rinderpapillomavirus Typ 7 (BPV 7) und canine orale Papillomavirus (CO PV) DNA-Sequenzen wurden getestet. Bei einer Anelierungstemperatur von 520 C erzeugte die Amplifikation all dieser DNA's, außer BPV7, Fragmente mit einer Länge von etwa 850 Basenpaaren. Obwohl gleiche Mengen (1ng) viraler DNA zur Amplifikation verwendet wurden, erzeugte HPV2 ein nachweisbares aber schwächeres Signal, was zu der Vermutung Anlaß gibt, daß einer oder gar beide Primer nicht effizient an die Schablone anelierte(n)
- Die amplifizierten Fragmente wurden markiert und an PstI- Aufschlüsse der bekannten HPV-DNA's unter Standardbedingungen (Tm-25ºC) hybridisiert. In allen Fällen hybridisierte das PCR Produkt eines jeden HPV nur an seine entsprechende Schablonen-DNA.
- Weiterhin hybridisierte nur das Fragment, das die Zielstellen für die Primer enthielt, an das PCR Produkt (siehe Tabelle A). So wurde ein PCR Produkt erzeugt, das spezifisch war, sowohl für den Virustyp als auch für den vorhergesagten Bereich der viralen DNA.
- DNA's aus klinischen Proben, die zuvor durch Southern Blot Hybridisation typisiert worden waren, wurden zur Amplifikation unter Einsatz dieser universellen Primer ausgewählt. Nach einem doppelten Aufschluß mit BamHI und HindIII wurden die Proben 25 Amplifikationszyklen in Anwesenheit von IU und IWDO wie auch von B-Globinprimern bei einer Anelierungstemperatur von 46ºC unterworfen. Aliquote Anteile (15 ul) des Amplifikationsgemisches wurden durch 0,8%ige Agarosegele elektrophoresiert, auf Nylonmembranen transferiert und mit markierten amplifizierten Fragmenten von HPV6, 11, 16, 18 oder 31 sowie auch B-Globinoligomeren unter Standardbedingungen (Tm- 25C) hybridisiert. Für negative Kontrollen wurden drei Proben, die zuvor mittels Southern Blot als negativ bestimmt worden waren, verwendet, sowie ebenfalls 1g DNA aus der humanen Zellinie 293.
- Alle Proben hybridisierten an eine B-Globinsonde, was anzeigt, daß ausreichend zelluläre DNA innerhalb der Probe vorhanden war, und daß die Amplifikationsreaktion nicht gehemmt wurde. Die Ergebnisse der HPV-Hybridisation an der amplifizierten DNA korrelierten mit jenen der vorangegangenen Southern Blots. Zwei der zuvor gemäß Southern Blot negativen Proben waren für HPV31 leicht positiv. Diese Proben stellten eine Biopsie normaler Vulva und ein squamöses Zellcarcinom der Cervix dar. Die positive normale Vulva könnte das Ergebnis einer latenten Infektion sein, und der squamöse Zellcervicalkrebs könnte beim Southern Blot aufgrund einer geringen Konzentration der Virus-DNA negativ gewesen sein. Alternativ könnten diese beiden Proben während der zahlreichen Manipulationen, die bei der DNA-Extraktion, beim Aufschluß mit Restriktionsenzymen und bei der PCR auftreten, kontaminiert worden sein. Dies scheint jedoch unwahrscheinlich, da die anderen negativen Kontrollproben (normale Cervix) und die DNA aus der humanen Zellinie 293 negativ blieben. Weiterhin wurde in keinem Fall HPV-DNA von zwei unterschiedlichen Typen in irgendeiner Probe entdeckt.
- Die obigen Ergebnisse bestätigen, daß IU und IWDO in Kombination als universelle Primer zur Amplifikation von HPV's, die mit Infektionen des genitalen Traktes assoziiert sind, verwendet werden könnnen. Die Primer der vorliegenden Erfindung sind "universell" in dem Sinne, daß sie der Notwendigkeit für typenspezifische Primer bei der PCR abhelfen.
- Da diese Primer unterschiedliche Ausmaße an Homologie zu den Schablonen aufweisen, wurde oftmals eine Anelierungstemperatur verwendet, die auf der niedrigstmöglichen Td basierte. Die Amplifikation bei dieser Temperatur erzeugte unerwartete Banden, die ausgeschaltet wurden, indem die Anelierungstemperatur angehoben wurde. Jedoch ergab dieser Temperaturanstieg eine Verminderung des Wirkungsgrades der Amplifikation in einem zweistelligen Ausmaß. Dies könnte durch die Degeneration der Primer erklärt werden, bei der nur ein kleiner Anteil aller Primer thermostabile Paare mit der Schablone ausbildete. Deoxymosin wurde anstelle einer möglichen Vier-Basenredundanz verwendet, um die thermische Stabilität der beiden Primer zu erhöhen. Dies hat den zusätzlichen Vorteil, die Reduktion der Konzentration von Primern zu vermeiden, wenn degenerierte Positionen vorhanden sind. Die Amplifikation von normaler zellulärer DNA mit den universellen Primern bei geringen Anelierungstemperaturen erzeugte keine DNA-Fragmente, die an HPV-Sonden hybridisierten.
- Obwohl erwartet wurde, daß die allgemeinen Primer dieser Erfindung zur Amplifikation von HPV6-, 11-, 16-, 18- und 33-DNA effektiv sein würden, da diese Sequenzen bekannt waren, konnte eine Reihe von nicht sequenzierten HPV-DNA's amplifiziert werden, die aus einer Mehrzahl von Gewebeproben abgeleitet worden waren. Da die universellen Primer an Sequenzen anelieren, die unter den getesteten HPV's hochgradig konserviert werden, sind diese Sequenzen wahrscheinlich solche, die für die gesamte Virusart charkteristisch sind. Daher können die hierin beschriebenen universellen Primer zum Nachweis von bislang uncharakterisierten Virustypen verwendet werden. Sie können ebenfalls zur Bestätigung von HPV in Lesionen verwendet werden, die normalerweise nicht mit HPV-Infektionen assoziiert sind. Diese breite Nützlichkeit ist auf HPV's beschränkt, da BPV7-DNA nicht amplifiziert werden konnte, obwohl COPV-DNA amplifiziert wurde. IU zeigte eine geringe Homologie zu den BPV-1 und COPV- Sequenzen, wohingegen IWDO einen hohen Grad an Homologie besaß. Dies zeigt an, daß die Anelierungsstellen nur für einen der beiden Primer vorhanden waren.
- Da benigne und premaligne Lesionen episomale HPV-DNA- Sequenzen enthalten, kann eine PCR, die diese universellen Primer verwendet, als ein allgemeines Screening zum Nachweis von viralen Sequenzen in klinischen Proben sinnvoll sein. Die sich ergebenden amplifizierten Fragmente können dann mit spezifischen Oligonukleotidsonden typisiert werden.
Claims (9)
1. Verfahren zum Nachweis des humanen Papillomavirus (HPV) in
einer Probe eines physiologischen Materials, das mit HPV
infiziert ist, das folgendes umfaßt:
(a) Auftrennen doppelsträngiger DNA aus dem offenen E1-
Leseraster von HPV in der Probe, wobei ein erster Einzelstrang
von HPV-DNA und ein zweiter Einzelstrang von HPV-DNA erzeugt
werden;
(b) Umsetzen des ersten Einzelstrangs von HPV-DNA mit einem
molaren Überschuß des Oligodeoxynucleotidprimers IU : dessen
komplementärem Bereich auf dem ersten Strang, wobei IU gleich
ist, wobei I gleich Deoxyinosin-5-O-phosphat ist, wobei N&sub1; gleich
A oder G ist, und wobei N&sub2; gleich C oder T ist,
und Umsetzen des zweiten Strangs von HPV-DNA mit einem molaren
Überschuß des Oligodeoxynukleotidprimers IWDO : dessen
komplemetärem Bereich auf dem zweiten Strang der HPV-DNA, wobei
IWDO gleich
ist, wobei I, N&sub1; und N&sub2; unabhängig voneinander die oben
definierte Bedeutung haben, und wobei N&sub3; gleich A oder T ist,
unter solchen Bedingungen, daß jeder Primer mit seinem
komplementären Bereich aneliert und daß ein Verlängerungsprodukt
eines jeden Primers synthetisiert wird, das zu dem Strang
komplementär ist, an den der Primer aneliert ist;
(c) Abtrennen der Primerverlängerungsprodukte von den Strängen,
an denen sie synthetisiert worden sind, um vier einzelsträngige
Moleküle zu erzeugen;
(d) Umsetzen der vier einzelsträngigen Moleküle, die in Schritt
(c) erzeugt worden sind, mit den beiden Primern nach Schritt (b)
bei einem molaren Überschuß von Primer : dessen komplementärem
Bereich, unter derartigen Bedingungen, daß jeder Primer an
seinen komplementären Bereich aneliert, unter derartigen
Bedingungen, daß ein Verlängerungsprodukt eines jeden Primers
unter Verwendung eines jeden der einzelsträngigen Moleküle als
Schablone synthetisiert wird; und
(e) Wiederholen der Schritte (c)-(d), um eine nachweisbare Menge
an doppelsträngiger DNA anzuhäufen, die der HPV-DNA zwischen den
HPV-DNA-Sequenzen entspricht, die komplementär zu den DNA-
Sequenzen der Oligodeoxynucleotidprimer sind; und
(f) Nachweisen der nachweisbaren DNA-Menge.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die nachweisbare Menge
nachgewiesen wird, indem sie denaturiert wird, wobei zwei
Einzelstränge von HPV-DNA erzeugt werden, indem wenigstens einer
der Einzelstränge an eine markierte Oligonukleotidsonde aneliert
wird, und wobei die Markierung nachgewiesen wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die markierte
Oligonukleotidsonde mit einer Bindungsstelle für einen
nachweisbaren Marker markiert ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die nachweisbare Menge
nachgewiesen wird, indem ein nachweisbarer Marker daran gebunden
wird, und wobei der Marker nachgewiesen wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Schritte (c)-(d)
ungefähr 10-50 mal wiederholt werden.
6. Verfahrewnach Anspruch 1, wobei die Trennung in Schritt (a)
und in Schritt (c) mittels thermischer Denaturierung der
doppelsträngigen DNA vollzogen wird.
7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Schritte (b) und (d)
mittels Behandlung mit vier unterschiedlichen
Nucleosidtriphosphaten und einem Polymerisationsmittel vollzogen
werden, die zusammen mit oder getrennt von Primer IU und Primer
IWDO zugesetzt werden.
8. Oligonucleotid nach folgender Formel:
worin I gleich Deoxyinosin-5-O-phosphat ist, worin N&sub1; gleich A
oder G ist, und worin N&sub2; gleich C oder T ist; oder dessen
komplementäre Sequenz.
9. Oligonucleotid nach folgender Formel:
worin I gleich Deoxyinosin-5-O-phosphat ist, worin N&sub1; gleich A
oder G ist, und worin N&sub2; gleich C oder T ist, und worin N&sub3; gleich
A oder T ist; oder dessen komplementäre Sequenz.
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