CN109266617B - 一种人乳头瘤病毒16型全基因组感染性细胞模型 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及到一种人乳头瘤病毒16型全基因组感染性细胞模型的建立。通过克隆东北地区人乳头状瘤病毒16型全基因组，分析HPV16全基因组序列，再将环化的HPV16全基因组转染细胞，建立含有中国东北地区HPV16全基因组的细胞模型。本发明建立一个能充分代表HPV感染人体宿主细胞的体外模拟系统，并将其转化为抗HPV16药物的体外药效学模型。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及到人乳头瘤病毒16型全基因组感染性细胞模型的建立。
背景技术
人乳头瘤病毒(HPV)是一种小型无包膜、双链环状DNA病毒，其分型依据是根据L1基因的序列相似性制定，L1基因的序列相似性<90%为新的型别，相似性在90%~98%之间为同一型别的不同亚型，相似性>98%为同一型别的不同变异株。
人乳头瘤病毒( HPV) 是一种嗜上皮性小DNA病毒，为人类多种疣病的病原微生物，近年来更发现其与多种恶性肿瘤相关。HPV病毒由核心的闭环双链 DNA 与外周的蛋白衣壳组成，基因组全长约7.9kb，由8个主要的开放阅读框与上游的长控制区组成。根据基因结构的差异，HPV 可分为上百个型别，其中较重要的包括高危型的HPV16、18 等。
全世界约70%的宫颈癌和高危型HPV16、18型直接相关，大约25%的口腔癌与高危型HPV有关，辽宁省沈阳地区宫颈癌发生率与感染HPV16具有较高的相关性。由于HPV的种属特异性，至今不能在实验动物体成功接种并生长。而且HPV的生长周期与宿主细胞的分化状态密切相关，使它不能像许多可培养病毒一样在体外的组织培养系统中生长、繁殖。HPV体内、体外模型的困境使关于HPV生物学行为的研究以及抗HPV药物研发受到很多限制。随着分子生物学的发展，研究者通过基因水平的手段研究乳头瘤病毒在其自然宿主内的生命周期。在高危型HPV，国外学者的研究有一些进展，如将HPVDNA克隆转染至角质形成细胞，形成含有游离病毒DNA的细胞系。因为高危型HPV的E6、E7基因具有转化和永生化能力，已出现数种转化细胞系（如CIN612、W12、HeLa、Siha等）供高危型病毒的研究。而目前国内关于此领域未见报道。HPV感染具有高度的组织特异性及分化依赖性。长期以来HPV无法在体外培养体系中复制扩增。研究表明，仅当宿主细胞充分分化时，HPV才表达晚期衣壳蛋白并组装生成子代病毒颗粒。常规的单层细胞培养中细胞处于低分化状态，故无法实现HPV的体外扩增，这在相当一段时间内阻碍了人们对HPV的深入研究。20世纪80年代出现的HPV裸鼠异体移植模型在一定程度上推进HPV的研究，但存在实验周期长，技术复杂等明显缺陷。近20年来，细胞分化诱导培养技术日趋成熟，HPV的体外研究技术也随着出现了突破，并在HPV研究中发挥了重要作用。目前国内关于此领域未见报道。
发明内容
鉴于现有技术存在的缺陷，本发明通过克隆东北地区人乳头状瘤病毒16型（humanpapillomavirus type 16，HPV16）全基因组，分析HPV16全基因组序列，并以全基因组序列信息为基础构建含HPV16全基因组的表达载体。成功将构建携带HPV16全基因组的质粒转染人永生化角质形成细胞（human keratinocyte cell line, HaCaT），并证明在一定传代次数及冻存、复苏后，细胞中HPV16游离型基因组能稳定维持，病毒基因正常复制和表达。并且通过器官型raft培养，证实该方法建立的体外模拟系统能支持HPV16的完整生命周期。本发明建立一个能充分代表HPV感染人体宿主细胞的体外模拟系统，并将其转化为抗HPV16药物的体外药效学模型。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
1）HPV16 全基因组克隆：收集 10例东北地区HPV16感染的宫颈细胞标本，并提取总DNA，在 GenBank 中下载不同的 HPV16 全基因组序列并用 DNAStar 软件进行序列比对，将 HPV16 全基因组分成 4 个区段，即 HPV-M1、HPV-M2、HPV-M3 和 HPV-M4，分别设计4对特异性引物，分段克隆HPV16全基因组，测序后进行序列拼接及核苷酸序列分析。
2）建环化的HPV16全基因组DNA：对含有HPV16的质粒DNA进行增殖扩增，酶切回收线性HPV16全基因组DNA，再用连接酶使其自环化。
3）HPV16全基因组DNA和pTK-neo质粒共转染HaCaT 细胞。pTK-neo质粒是一种专供哺乳动物细胞稳定转染后用于筛选的质粒，它携带有新霉素耐药基因，当pTK-neo与目的基因按合适比例共转染时，二者倾向于同时进入同一受体细胞，通过G418筛选，含有pTK-neo质粒的细胞因具有抗药性而存活，获得了含有HPV16完整基因组信息的HaCaT重组细胞。
本发明提供了一种重组质粒，包含：人乳头瘤病毒16型毒株HPV16的全长基因组DNA序列，该毒株HPV16的全长基因组DNA序列如SEQ1所示。优选的，所述全长基因DNA序列内部含有一个标志性酶切位点BamHI，以BamHI-HPV16-BamHI顺序连接的毒株HPV16的全长基因组DNA，与pcDNA3.3质粒连接，得到pcDNA3.3-HPV16克隆质粒。pcDNA3.3-HPV16克隆质粒图谱如图7所示。
本发明提供了一种感染性克隆毒株，所述感染性克隆毒株是通过将上述重组质粒采用BamHI内切酶线性化，再将该线性化的全长DNA 环化转染到HaCaT中而获得的感染性人乳头瘤病毒16型病毒，人工建立模拟HPV16感染的细胞模型。
与现有技术相比，本发明成功克隆中国东北地区 HPV16 全基因组并对其全基因组进行了序列分析，再将环化的HPV16全基因组转染细胞，建立含有中国东北地区HPV16全基因组的细胞模型。中国东北地区宫颈癌发生率与感染HPV16具有较高的相关性，且以单一感染为主。HPV16基因组变异可能导致其编码蛋白功能的改变，HPV16的E6基因与E7基因共转染原代人包皮角质细胞（primary human foreskin keratinocytes, PHFKs），能使PHFK永生化，但如果E6基因编码的蛋白中3个位点的氨基酸Q14H/ H78Y/L83V发生改变，即变异较小的E6基因与E7基因共转染PHFK，不仅能使PHFK永生化、生命力更强，而且能使PHFK在体外转化，表现出更强的致癌性。此前关于中国东北地区HPV16全基因组序列的报道仍处于空白。
本发明成功克隆中国东北地区 HPV16 全基因组并对其全基因组进行了序列分析，再将环化的HPV16全基因组转染细胞，建立含有中国东北地区HPV16全基因组的细胞模型。本发明是国内首次完成中国东北地区HPV16全基因组的序列分析，成功建立含有中国东北地区HPV16全基因组的细胞模型，为开展HPV16致病机制研究奠定基础。中国东北地区HPV16全基因克隆的建立为中国东北地区及国际学术界对于HPV16全基因组序列变异及致病机制的研究提供基础数据。
附图说明
图1是Direct-load Star Marker Plus (D2000 Plus) 示意图。
图2是基因组1-2470 nt 片段胶图。
图3是基因组2471-4306 nt 片段胶图。
图4是基因组4307-5646 nt片段胶图。
图5是基因组5647-7905 nt 片段胶图。
图6是PCR鉴定胶图。
图7是pcDNA3.3-HPV16质粒图谱。
图8是HaCaT细胞形态图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例详细描述本发明，以下所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
在实施例中，涉及的材料、试剂、引物合成、操作方法如下所示。
1、生物材料。
HPV16全基因组模板由中国医科大学附属盛京医院提供，-20℃保存；载体pcDNA3.3由辽宁佰昊生物科技有限公司提供，-80℃保存；菌株E.coli DH5α感受态细胞和HaCaT细胞以及其他载体均由中国医科大学附属盛京医院保存，感受态细胞保存条件为-80℃，HaCaT细胞存于液氮。
2、主要试剂。
PrimerSTAR Max DNA Polymerase、 Exonuclease III 购自Takara 公司；QIAquick Gel Extraction Kit (250) 购自QIAGEN公司；EndoFree Mini Plasmid kit购自TIANGEN公司；限制性内切酶购自Thermo公司、T4 DNA Ligasse、pGEM-TEasy 购自PROMEGA；Direct-load Star Marker Plus (D2000 Plus) 购自GenStar。
3、引物的设计及合成。
根据HPV16全基因序列，用Primer5软件设计了8对引物（Thermo公司合成），如下表1. 所示。
实施例 pcDNA3.3-HPV16感染性克隆质粒的构建。
根据Genbank中登录号为U89348.1的HPV16毒株全基因组序列，设计合成4对PCR扩增引物。从HPV16感染的宫颈鳞状上皮细胞中提取病毒基因组DNA，以其作为PCR 模板，利用4 对引物进行PCR 扩增，获得4个DNA片段，将4个DNA片段分别连接在T载体上，挑选阳性克隆并测序。确认克隆无误后，采用LIC克隆技术将4个片段按照BamHI-HPV16-BamHI顺序连接在pcDNA3.3载体上，得到重组pcDNA3.3-HPV16克隆质粒，抗性筛选后挑选阳性克隆并测序。
利用DNAStar中的SeqMan 软件，将测得序列进行拼接，获得全长病毒基因组序列。并用DNAStar中的MegAlign软件将测得的HPV16基因组序列与Genbank中登录号为U89348.1的HPV16毒株全基因组序列进行比对分析。
具体过程如下。
1. 引物设计。
根据Genbank中登录号为U89348.1的HPV16毒株全基因组序列，设计合成4对正常顺序扩增引物及4对顺序为BamHI-HPV16-BamHI的扩增引物，分别命名为：HPV16-F1-F、HPV16-F1-R、HPV16-F2-F、HPV16-F2-R、HPV16-F3-F、HPV16-F3-R、HPV16-F4-F、HPV16-F4-R；HPV16-M1-F、HPV16-M1-R、HPV16-M2-F、HPV16-M2-R、HPV16-M3-F、HPV16-M3-R、HPV16-M4-F、HPV16-M4-R。
2. HPV16全基因组克隆。
2.1 病毒基因组DNA的提取。
参照 QIAamp DNA Mini Kit 产品说明书，简述如下： QIAamp DNA Mini Kit采用快速离心柱，组织细胞用蛋白酶K裂解，试剂盒含有优化的缓冲液，能有效裂解样本，可稳定核酸，并促进DNA选择性结合到QIAamp硅胶膜上。DNA特异性结合到QIAamp硅胶膜上，污染物流走。将乙醇加入到裂解物中，并上样到QIAamp离心柱上。洗涤缓冲液用于去除杂质，高纯的即用型DNA可用水或低盐缓冲液洗脱。PCR抑制剂，如：二价阳离子和蛋白，可通过两步有效的洗涤被去除，结合在离心柱上的纯DNA可用水或试剂盒中的缓冲液洗脱。
2.2 病毒DNA 的PCR 扩增。
参照PrimerSTAR Max DNA Polymerase产品说明书，以2.1中提取的DNA 为模板，全基因组分成四个片段进行扩增，使用的四对引物分别为：HPV16-F1-F、HPV16-F1-R、HPV16-F2-F、HPV16-F2-R、HPV16-F3-F、HPV16-F3-R、HPV16-F4-F、HPV16-F4-R。每个PCR 体系50μl，包括PrimerSTAR Max DNA Polymeras 25μl，上、下游引物各1μl（10μmol/L），DNA 2μl，补充水至50μl，PCR扩增条件见表2.。
PCR 完成后，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，采用2%琼脂糖凝胶，180V，20 min。结果如图1-5 所示，获得了大小分别约为2470bp、1836bp、1340bp 和2259bp 的四条目的片段。图中，图1 DNA 分子质量标准Direct-load Star Marker Plus (D2000 Plus)的示意图，图2是基因组1-2470 nt 片段，图3是基因组2471-4306 nt 片段，图4是基因组4307-5646 nt片段，图5是基因组5647-7905 nt 片段。
2.3 目的片段克隆。
以QIAquick Gel Extraction Kit (250) 胶回收试剂盒回收PCR 目的条带。回收的四个DNA 片段分别克隆进T载体，参照说明书，每个反应体系20 μl，包括：回收产物2 μl、2×Buffer 10μl和T载体2μl，无核酸酶水6μl。4℃连接16 h，转化Turbo感受态细胞，37℃培养转化菌。以小量质粒快速提取纯化试剂盒提取质粒，PCR鉴定，获得的四个片段克隆分别称之为pTF1、pTF2、pTF3、pTF4。
胶回收操作步骤如下。
2.3.1 将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。
2.3.2 向胶块中加入3倍体积缓冲液QG（100mg~100μl），最大加入体积为400mg，50℃水浴放置，其间每隔2-3 min温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。
2.3.3 加入1体积异丙醇，与样品混匀。
2.3.4 将上一步所得溶液加入QIAquick spin column中（吸附柱放入收集管中），12000 rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液。
2.3.5 向入QIAquick spin column中加入500μl缓冲液QG，12000 rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液。
2.3.6 向入QIAquick spin column中加入750μl缓冲液PE，12000 rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液。再次离心1 min，去除残余液体。
2.3.7 将QIAquick spin column放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μl洗脱缓冲液EB，室温放置1 min。12000 rpm离心2 min收集DNA溶液。
2.4 目的片段连接。
采用LIC克隆技术将pTF1、pTF2、pTF3、pTF4与pcDNA3.3载体连接。每个反应体系10μl，包括：目的基因片段50-10 ng、表达载体片段50-100ng、10×ExoIII buffer 1μl。冰上放置5min，在混合物中加入1 µl ExoIII(20units)，4℃ 60min，加入1 µl 0.5M 的EDTA(pH 8.0)反复吸打，终止反应，将混合物置于65℃，5min，冰上5min，转化Turbo感受态细胞，37℃培养转化菌。以小量质粒快速提取纯化试剂盒提取质粒，PCR鉴定，采用1%琼脂糖凝胶，180V，20min，鉴定为阳性的质粒进行测序验证，鉴定结果见图6。
2.5 HPV16全基因组序列。
将2.4获得的质粒委托Thermo生物公司进行序列测定，并以DNASTAR 中的SeqMan软件，将测得的序列进行拼接，获得了HPV16株全基因组序列，全长7905 bp，其序列如SEQ1所示。与野毒株相比，HPV16基因组存在55处核苷酸位点的突变及5处核苷酸位点插入，见下表3.。
2.6 病毒DNA按照BamHI-HPV16-BamHI顺序PCR扩增。
以2.4中合成的质粒为模板，全基因组分成四个片段进行扩增，使用的四对引物分别为：HPV16-M1-F、HPV16-M1-R、HPV16-M2-F、HPV16-M2-R、HPV16-M3-F、HPV16-M3-R、HPV16-M4-F、HPV16-M4-R。反应体系与反应条件参见2.2。PCR 完成后，以QIAquick GelExtraction Kit (250)胶回收试剂盒对PCR产物进行回收，具体操作参见2.3。
2.7 目的片段克隆与鉴定。
将2.6中回收的四个DNA片段克隆进pcDNA3.3载体，反应体系与反应条件参见2.4，测序鉴定与2.5中HPV16全基因组序列一致，按照BamHI-HPV16-BamHI顺序的插入片段信息见SEQ 2，克隆质粒命名为pcDNA3.3-HPV16，质粒图谱见图7。
2.8 HPV16全基因组转染到细胞，建立模拟HPV16感染的细胞模型。
2.8.1 将生长至80% 融合的HaCaT 细胞消化离心，并计数。按2-4×105孔接种至六孔板中，37℃、5% CO2 孵箱中培养过夜，使细胞达到50%-80% 融合度。
2.8.2 取环状HPV16 DNA1.2μ g，pTK-neo DNA 0.4μg，均加入100μl opti-MEM 培养基中，轻柔混匀，标记为溶液A。将4-8μl LipofectamineTM2000加入100μl opti-MEM培养基中，轻柔混匀，标记为溶液B，室温静置5min。将溶液A与溶液B轻柔混匀，室温静置20min。
2.8.3 将六孔板中的旧培养基吸弃，并用opti-MEM培养基轻轻冲洗细胞1-2次。
2.8.4 向Lipofectamine-DNA混合物中加入800μ l opti-MEM培养基，轻柔混匀。将此1ml混合液逐滴加至HaCaT细胞表面，轻轻晃匀，使之分布均匀。同时设置阴性对照如下： (1)只加LipofectamineTM2000，不加HPV16DNA及pTK-neoDNA。(2)加入LipofectamineTM2000及HPV16DNA，不加pTK-neoDNA。(3)加入Lipo-fectamineTM2000及pTK-neoDNA，不加HPV16DNA。(4)不加LipofectamineTM 2000，只加HPV16DNA及pTK-neoDNA。(5)不加任何处理(空白对照)。
2.8.5 将六孔板置于37℃、5%CO2孵箱中继续培养化后，换液，重新加入DMEM完全培养基，继续培养。
2.8.6 当转染后的细胞生长至约80% 融合时，消化细胞并离心，重悬细胞后，按1:10传入新的细胞培养板中，37℃、5% CO2孵箱中培养过夜。
2.8.7 弃培养基，更换为含500μg/mlG418的DMEM培养基，继续培养。
2.8.8 每天观察细胞。约4-7天后，当空白对照孔细胞大部分死亡时，更换为含250μg /ml G418的DMEM培养基，继续培养。
2.8.9 当抗性细胞克隆形成后，将其消化合并，转种入含250μg/mlG418的DMEM培养基继续培养。对阴性对照组细胞做同上处理，直至细胞全部死亡。
2.8.10按45%胎牛血清、45%DMEM培养基、10%DMSO的比例配制的细胞冻存液，DMSO应缓慢滴加至前二者的混合液中。收集生长状态良好的筛选后细胞（见图8），将细胞采用0.25%胰蛋白酶消化，室温1000 rpm离心5 min，以细胞冻存液重悬。将细胞悬液转移至冻存管中，标记、程序降温盒中进行冻存，液氮长期保存。
<110> 中国医科大学附属盛京医院
<120> 一种人乳头瘤病毒16型全基因组感染性细胞模型
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7910
<212> DNA
<213> 人工合成(Human papillomavirus type 16)
<400> 1
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tatttaatag ggctggtgct gttggtgaaa atgtaccaga cgatttatac attaaaggct 6480
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ttacctctga tgcccaaata ttcaataaac cttattggtt acaacgagca cagggccaca 6600
ataatggcat ttgttggggt aaccaactat ttgttactgt tgttgatact acacgcagta 6660
caaatatgtc attatgtgct gccatatcta cttcagaaac tacatataaa aatactaact 6720
ttaaggagta cctacgacat ggggaggaat atgatttaca gtttattttt caactgtgca 6780
aaataacctt aactgcagac gttatgacat acatacattc tatgaattcc actattttgg 6840
aggactggaa ttttggtcta caacctcccc caggaggcac actagaagat acttataggt 6900
ttgtaacatc ccaggcaatt gcttgtcaaa aacatacacc tccagcacct aaagaagatc 6960
cccttaaaaa atacactttt tgggaagtaa atttaaagga aaagttttct gcagacctag 7020
atcagtttcc tttaggacgc aaatttttac tacaagcagg attaaaggcc aaaccaaaat 7080
ttacattagg aaaacgaaaa gctacaccca ccacctcatc tacctctaca actgctaaac 7140
gcaaaaaacg taagctgtaa gtattgtatg tatgttgact cagtgttgtt tgttgtttat 7200
atgtctgtat gtgcttgtat gtgcttgtaa atattaagtt gtatgtgtgt ttgtatgtat 7260
ggtataataa acatgtgtgt atgtgttttt caatgcttgt gtaactattg tgtcatgcaa 7320
cataaataaa cttattgttt caacacctac taattgtgtt gtggttattc attgtatata 7380
aactatattt gctacatcct gtttttgttt tatatatact atattttgta gcgccagcgg 7440
ccattttgta gcttcaaccg aattcggttg catgcttttt ggcacaaaat gtgttttttt 7500
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ccaaatccct gttttcctga cctgcactgc ttgccaacca ttccattgtt ttttacactg 7620
cactatgtgc aactactgaa tcactatgta cattgtgtca tataaaataa atcactatgc 7680
gccaacgcct tacataccgc tgttaggcac atatttttgg cttgttttaa ctaccctaat 7740
tgcatatttg gcataaggtt taaacttcta aggccaacta aatgtcaccc tagttcatac 7800
atgaactgtg taaaggttag tcatacattg ttcatttgta aaactacaca tgggtgtgtg 7860
caaaccgttt tgggttgcac atttacaagc aacttatata ataatactaa 7910
<210> 2
<211> 7911
<212> DNA
<213> 人工合成(Human papillomavirus type 16)
<400> 2
ggatccccat gtaccaatgt tgcagtaaat ccaggtgatt gtccaccatt agagttaata 60
aacacagtta ttcaggatgg tgatatggtt gatactggct ttggtgctat ggactttact 120
acattacagg ctaacaaaag tgaagttcca ctggatattt gtacatctat ttgcaaatat 180
ccagattata ttaaaatggt gtcagaacca tatggcgaca gcttattttt ttatttacga 240
agggaacaaa tgtttgttag acatttattt aatagggctg gtgctgttgg tgaaaatgta 300
ccagacgatt tatacattaa aggctctggg tctactgcaa atttagccag ttcaaattat 360
tttcctacac ctagtggttc tatggttacc tctgatgccc aaatattcaa taaaccttat 420
tggttacaac gagcacaggg ccacaataat ggcatttgtt ggggtaacca actatttgtt 480
actgttgttg atactacacg cagtacaaat atgtcattat gtgctgccat atctacttca 540
gaaactacat ataaaaatac taactttaag gagtacctac gacatgggga ggaatatgat 600
ttacagttta tttttcaact gtgcaaaata accttaactg cagacgttat gacatacata 660
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acacctccag cacctaaaga agatcccctt aaaaaataca ctttttggga agtaaattta 840
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aagttgtatg tgtgtttgta tgtatggtat aataaacacg tgtgtatgtg tttttaaatg 1140
cttgtgtaac tattgtgtga tgcaacataa ataaacttat tgtttcaaca cctactaatt 1200
gtgttgtggt tattcattgt atataaacta tatttgctac aatctgtttt tgttttatat 1260
atactatatt ttgtagcgcc agcggccatt ttgtagcttc aaccgaattc ggttgcatgc 1320
tttttggcac aaaatgtgtt tttttaaata gttctatgtc agcaactata gtttaaactt 1380
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aactaaatgt caccctagtt catacatgaa ctgtgtaaag gttagtcata cattgttcat 1680
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atataataat actaaactac aataatccat gtataaaact aagggcgtaa ccgaaatcgg 1800
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catgaatata tgttagattt gcaaccagag acaactgatc tctactgtta tgagcaatta 2400
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catgcgttgt ttactgcaca ggaagcaaaa caacatagag atgcagtaca ggttctaaaa 2880
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gaaacaattg aaaaattgct gtctaaacta ttatgtgtgt ctccaatgtg tatgatgata 3540
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catagtttta atgattgtac atttgaatta tcacagatgg tacaatgggc ctacgataat 3720
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tatagatgtg atagggtaga tgatggaggt gattggaagc aaattgttat gtttttaagg 3960
tatcaaggtg tagagtttat gtcattttta actgcattaa aaagattttt gcaaggcata 4020
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ttttggttac aaccattagc agatgccaaa ataggtatgt tagatgatgc tacagtgccc 4200
tgttggaact atatagatga caatttaaga aatgcattgg atggaaattt agtttctatg 4260
gatgtaaagc atagaccatt ggtacaacta aaatgccctc cattattaat tacatctaac 4320
attaatgctg gtacagattc taggtggcct tatttacata atagattggt ggtgtttaca 4380
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tacatggcat tggacaggac ataatgtaaa acataaaagt gcaattgtta cacttacata 5520
tgatagtgaa tggcaacgtg accaattttt gtctcaagtt aaaataccaa aaactattac 5580
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gcgtgctttt tgctttgctt ttgtgtgctt ttgtgtgtct gcctattaat acgtccgctg 5700
cttttgtctg tgtctacata cacatcatta atactattgg tattactatt gtggataaca 5760
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ctatattaga tattaataat actgttacta ctgttactac acataataat cccactttca 6480
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gcaggaacat ccagactact tgcagttgga catccctatt ttcctattaa aaaacctaac 7560
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attagtggcc atcctttatt aaataaattg gatgacacag aaaatgctag tgcttatgca 7800
gcaaatgcag gtgtggataa tagagaatgt atatctatgg attacaaaca aacacaattg 7860
tgtttaattg gttgcaaacc acctataggg gaacactggg gcaaaggatc c 7911
Claims (2)
1.一种人乳头瘤病毒16型全基因组感染性细胞模型，其特征在于，所述细胞模型含有中国东北地区HPV16全基因组，其基因组序列如SEQ ID NO.1所示的序列。
2.如权利要求1所述的一种人乳头瘤病毒16型全基因组感染性细胞模型，其特征在于，其建立方法的具体步骤如下：
1）HPV16全基因组克隆：收集10例东北地区HPV16感染的宫颈细胞标本并提取总DNA，在GenBank中下载不同的HPV16全基因组序列并用DNAStar软件进行序列比对，将HPV16全基因组分成4个区段，即HPV-M1、HPV-M2、HPV-M3和HPV-M4，分别设计4对特异性引物，分段克隆HPV16全基因组，测序后进行序列拼接及核苷酸序列分析；
2）建环化的HPV16全基因组DNA：对含有HPV16的质粒DNA进行增殖扩增，酶切回收线性HPV16全基因组DNA，再用连接酶使其自环化；
3）HPV16全基因组DNA和pTK-neo质粒共转染HaCaT细胞，pTK-neo质粒是一种专供哺乳动物细胞稳定转染后用于筛选的质粒，它携带有新霉素耐药基因，当pTK-neo与目的基因按合适比例共转染时，二者倾向于同时进入同一受体细胞,通过G418筛选，含有pTK-neo质粒的细胞因具有抗药性而存活，获得了含有HPV16完整基因组信息的HaCaT重组细胞。
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| "人乳头瘤病毒16型全基因组克隆及其表达载体构建";孙云峰;《中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》;20141115(第11期);第14页2.2.1总DNA提取、第15页2.2.2 HPV16全基因克隆、第22-23页2.2.3构建环化的HPV16全基因组和第41页最后一段-第43页第一段 * |
| 吕涛."HPV-16在HEK293T细胞中的复制以及HPV-16 L1病毒载体疫苗免疫效果的研究".《中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》.2015,(第08期),第14页摘要和第16页1.1材料. * |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Sun Zhengrong Inventor after: Wu Yingying Inventor after: Lu Yiping Inventor after: Wu Si Inventor after: Wang Shuang Inventor after: Yu Miao Inventor after: Liu Miao Inventor after: Yao Xuechun Inventor after: Lu Xingzhong Inventor before: Wu Yingying Inventor before: Lu Yiping Inventor before: Wu Si Inventor before: Wang Shuang Inventor before: Yu Miao Inventor before: Liu Miao Inventor before: Yao Xuechun Inventor before: Lu Xingzhong |
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| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20240408 Address after: No. 42 Lianhe Road, Dadong District, Shenyang City, Liaoning Province, 110000, 702 Patentee after: Liaoning Lanyi Stem Cell Biotechnology Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: 110003, 36, Miyoshi street, Heping District, Liaoning, Shenyang Patentee before: SHENGJING HOSPITAL OF CHINA MEDICAL University Country or region before: China |
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| TR01 | Transfer of patent right |