CN103397018A - 一种dna病毒基因组的定点改造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种DNA病毒基因组的定点改造方法,解决了现有技术诱导DNA病毒基因组定点突变困难,插入外源片段操作复杂,重组率较低的问题。将携带有核酸酶系统的质粒转染细胞后,再感染病毒,待细胞出现病变后,收集病变细胞,经冻融或超声处理后再离心,将上清液分离即得到子代病毒。本发明能够实现在筛选病毒减毒疫苗株、构建病毒性基因载体和溶瘤病毒、研究病毒功能序列等的应用,在病毒基因组进行改造过程中,提高诱变效率,精确控制DNA病毒进行基因组定点突变和特定基因敲除,简化外源基因插入DNA病毒载体的操作步骤,提高外源基因整合进入病毒基因组的效率,从而便于进行高通量的重组病毒筛选工作。
Description
技术领域
本发明涉及DNA病毒基因组的改造方法,尤其涉及DNA病毒基因组的定点改造方法。
背景技术
目前对于DNA病毒基因组的定点突变,主要有两种方法,一种方法是借助于限制性内切酶等工具酶对病毒基因组进行细胞外的基因重组操作,但对于较大的病毒基因组,很难找到可以使用的限制性酶切位点。另一种方法是借助于细胞内的同源重组系统,通过向病毒感染细胞中转染与病毒基因组相似的同源序列,完成对特定区域基因组序列的定点编辑,由于这种同源重组效率极低,因此并不适合高通量的病毒疫苗株筛选,为了克服这种困难,往往需要向病毒导入外源性抗性基因用于重组病毒的筛选,这种操作不但费时费力,而且在生物安全性上并不适合疫苗株的要求。如何简单、高效、精确地对大型DNA病毒基因组进行定点编辑,仍是疫苗开发中的一个技术瓶颈。
基于病毒的载体有很多种,常用的载体包括逆转录病毒、腺病毒、腺联病毒、慢病毒、单纯疱症病毒、脊髓灰质炎病毒、痘病毒以及多种病毒组装的嵌合病毒等。DNA病毒由于基因组稳定,对外源基因的容量较大,在基因转导中具有其独特的优势,如腺病毒载体和单纯疱症病毒载体等。将外源基因插入病毒基因组或是敲除特定病毒基因的方法是通过同源重组的方式完成,以腺病毒为例,第一代病毒载体是在真核细胞中进行同源重组和筛选,第二代病毒载体是在原核细胞中进行重组,虽然大大提高了重组效率,但是既需要在原核细胞、也需要在哺乳动物细胞中进行操作,工作相对复杂,产生出重组病毒往往需要数周的时间。
如果要在宿主细胞内对病毒进行定点改造,病毒基因组并不像细胞染色体在细胞核内占据相应的染色体领域,而是相对游离,其大小通常5K-200k bp,只是细胞基因组的百万分之一到万分之一,大部分病毒基因组均为线状(非环状),理论上理解,基因组一旦切断,就很容易断裂,从而导致病毒传代流产;并且病毒复制时间通常很短(复制周期约在12h-48之间)核酸酶系统的切断以及DNA基因组的修复过程在时间限制上也可能会严重影响病毒的产生,该方法的应用目前还未见相关研究报道。
综上所述,高效地对病毒基因组进行定点突变、定点基因敲除或提高外源基因插入病毒基因组的重组效率、以及简化重组的操作步骤,无论是对于DNA病毒疫苗株的筛选,DNA病毒载体的构建,还是溶瘤病毒载体的构建方面都具有显著的应用价值。
发明内容
针对现有技术诱导DNA病毒基因组定点突变困难,插入外源片段操作复杂,重组率较低的问题,本发明提供一种DNA病毒基因组的定点改造方法,能高效地对DNA病毒基因组进行定点改造,实现定点突变和特定基因敲除,定点插入外源基因、特定序列的大片段缺失及定点同源重组。
为了达到上述目的,本发明提供如下技术方案:
一种DNA病毒基因组的定点改造方法,是通过以下步骤实现的:
步骤一,构建定点切割的核酸酶系统:构建包含导向功能的分子和具有核酸酶活性的蛋白核酸酶系统;
步骤二,将步骤一的定点切割的核酸酶系统转染细胞,得到转染细胞,其中,控制细胞数量与表达核酸酶系统的质量之间的比例为1×105:0.25-2μg;
步骤三,将经步骤二处理后的细胞培养板的每个孔中加入病毒液,吸附,然后吸去病毒液,再加入细胞维持液,培育至细胞完全病变,得到病变细胞;
步骤四,收集步骤三得到的病变细胞和/或上清,冻融或超声处理后,离心去除细胞碎片,所得上清即为子代病毒收获液;
步骤五,从步骤四得到的子代病毒收获液中,挑取来源于单克隆的子代病毒,通过核酸测序鉴定,分离出子代病毒;完成DNA病毒基因组的定点改造方法。
进一步的技术方案是,将上述步骤四得到的子代病毒,可通过任选嗜斑法或有限稀释法之一,挑取来源于单克隆的子代病毒,通过核酸测序鉴定,获得改造后的目的重组病毒。其中,除了进行核酸测序检测以外,也可以通过抗性筛选、报告基因检测、蛋白丰度以及蛋白特异性检测等多种方法进行鉴定。
本发明中,具体地,步骤一中所述核酸酶系统可以是RNA导向的核酸酶(RNA-guided Nucleases, RGN)系统、锌指核酸酶(Zinc
finger nucleases, ZFn)系统、转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription activator-like effector
nucleases, TALEN)系统之一。其中,ZFn系统和TALEN系统的导向分子是蛋白,RGN是蛋白和RNA的复合物。
具体地,所述步骤一中构建规律性重复短回文序列簇相关系统(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)
associated system, CASs),简称CRISPR/CAS系统,其属于RGN,利用AG230质粒进行构建的过程如下:将AG230质粒酶切、纯化后,再利用连接酶连入插入序列,构建得到新质粒,即CRISPR/CAS系统。其中,所述的AG230质粒为Addgene公司的pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(质粒编号:42230,简称AG230)。
进一步地,所述插入序列可以为双链。所述插入序列的个数至少为1个,插入序列的个数与进行定点改造的定点数量相关,插入序列为1个,则对基因组进行单个定点切割,插入序列为2个或以上时,则对基因组进行两个或以上个定点切割,也可以导入多个质粒分先后或同时对多个特定位点进行切割。
本发明的步骤一中构建的核酸酶系统可以DNA形式、病毒载体形式、蛋白和RNA复合物形式、编码RNA形式或者非编码RNA形式之一。
本发明的步骤二中,不同细胞、不同厂家的脂质体,转染条件有所不同,例如,人胚肾HEK293细胞的转染效率比较高,所以可以选择它的改造细胞293FT;脂质体可以采用Invitrogen公司的lipofectamine 2000,其最适转染效果是1x105个细胞转染0.25 -1μg DNA (DNA和lipofectamine 2000脂质体的比例是1μg:2.5μL.),转染效率可以达到90%以上的细胞被转染,但是换成其他公司的脂质体(配方不同),最适条件可能要变,但在有限次试验内是可以总结归纳出来的。
进一步地,步骤二中的转染方法为:将细胞接种于细胞培养板上加入DNA-脂质体复合物进行转染;或者,将细胞和DNA-脂质体复合物混合后,再接种于细胞培养板上进行培养;或者,采用电转方法,即利用电击将DNA导入细胞;或者,还可以采用病毒载体形式、编码RNA和非编码RNA、或者蛋白和RNA复合物之一等形式进行转染。
本发明可以采用上述的任一方法导入核酸酶系统,例如,采用上述的任一方法导入的CRISPR/CAS系统。
进一步地,步骤二中转染12-36h后得到转染细胞。
进一步地,步骤三中所述病毒液的用量与转染细胞的比例为moi=0.01-100。
进一步地,步骤三中所述吸附的具体操作为:在35-37℃下吸附1-12h。
进一步地,步骤三中的培育条件为:35-37℃、体积分数为5%的CO2的培养箱中。
进一步地,步骤三中的培育时间至少为12h。培育时间越长,病毒的插缺效率越高,但是36h之后,病毒的插缺效率的增幅不大,综合考虑,投入与产出的平衡,优选的是,培育时间为24h-36h。
进一步的技术方案是,步骤二中将细胞转染步骤一的核酸酶系统及同源重组供体序列,所述同源重组供体序列通过以下方式进行构建:构建双链DNA序列,其两端与目标序列相同(>50bp),中间插入需要改造的目的序列。实现定点同源同组目的。
具体地,收毒的时间一般是看到细胞完全病变后收毒,但是只要等待病毒完成一个复制周期,即使细胞不病变,也可以收获具有感染性的病毒,一般等到细胞完全病变后再收毒只是为了观察方便。
本发明的步骤四中,由于有的病毒存在于上清,有的病毒存在于细胞内,还有的病毒即使冻融后也和细胞碎片粘在一起,因此需要视具体的病毒种类而定,收集的是细胞还是上清,需要进行冻融还是超声分离处理。
本发明的定点改造原理如下:
鉴于背景技术中所言,病毒基因组并不像细胞染色体在细胞核内占据相应的染色体领域,而是相对游离,其大小通常5K-200k bp,只是细胞基因组的百万分之一到万分之一,大部分病毒基因组均为线状(非环状),理论上理解,基因组一旦切断,就很容易断裂,从而导致病毒传代流产;其次病毒复制时间通常很短(复制周期约在12h-48之间)CRISPR/CAS等核酸酶系统的切断以及DNA基因组的修复过程在时间限制上也可能会严重影响病毒的产生。
本发明在病毒基因组改造过程中,通过步骤一至步骤三的诱导步骤增加对病毒DNA进行定点切割,人工诱导病毒基因组在特定位点的基因信息改变,不但大幅提升了DNA病毒基因组的改造效率,而且还能将突变控制在特定的区域内。具体地,在病毒感染细胞前或感染过程中,导入能够进入细胞核并发挥核酸酶作用的CRISPR/CAS系统,在病毒基因组一个或多个特定位点进行切割后,利用宿主的非同源末端连接机制修复双链断裂,采用插缺式方法在切割位点处形成碱基的插入或缺失,造成特定病毒基因的表达缺陷或非编码DNA序列的功能异常,如果在进行DNA双链切割的过程中,采用同源重组方法,通过提供与被切割序列两边同源的DNA供体序列,则可诱导高效的同源重组,从而将外源基因插入病毒基因组中,并且在子代病毒产生后,可通过嗜斑法或有限稀释法等,挑取来源于单克隆的子代病毒,通过核酸测序鉴定,获得改造后的目的重组病毒。由于突变率显著提高,导致可以在下游工作中,简单、快速地获得改造后的单克隆子代病毒。
其中,对于子代病毒的挑选,除了进行核酸测序检测以外,也可以通过抗性筛选、报告基因检测、蛋白丰度以及蛋白特异性检测等多种方法进行鉴定。
本发明中,核酸酶不但可以切割DNA双链,也可以切割单链,以减少病毒基因组的损伤,这个方案也能提高DNA序列同源重组事件的发生率。
本发明中,用于DNA重组的供体序列,既可在病毒感染前导入,也可在病毒感染过程中导入,序列可以包含外源大片段基因,也可以仅仅为了置换相应的目标序列,造成特定的碱基突变、缺失和插入等。
本发明中,子代病毒可以通过一个完整的实验循环产生,也可以为了提高重组病毒在子代病毒中的比例,将改造后的子代病毒再进行一次切割和重组,如此反复多次以产生更高比例的重组子代病毒。
综上所述,本发明能够高效地实现DNA病毒基因组进行定点改造,可以用于:高效快速敲除DNA病毒的特定基因;高效快速将目的外源基因插入病毒载体中;病毒特定序列的大片段缺失;标记病毒特定蛋白,研究病毒感染过程中,特定病毒蛋白的表达时序以及定位状况,并可以作为实时监测病毒感染过程的标记物;在特定基因非编码序列进行碱基的插缺,改变特定基因的表达效率。实现在筛选病毒减毒疫苗株、构建病毒性基因载体和溶瘤病毒、研究病毒功能序列等的应用,需要对病毒基因组进行改造的过程中,提高诱变效率,精确地控制DNA病毒进行基因组定点突变和特定基因敲除,简化外源基因插入DNA病毒载体的操作步骤,提高外源基因整合进入病毒基因组的效率,从而便于进行高通量的重组病毒筛选工作。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明的实施例3中的片段缺失突变后的病毒和没有突变的病毒的PCR检测结果;
图2是实施例6中步骤三的培育时间对获得的子代病毒插缺率影响的SURVEYOR分析测试结果;
图3是实施例6中步骤三中感染ADV-152病毒的不同感染复数(moi)对子代病毒插缺率影响的SURVEYOR分析测试结果;
图4是实施例6中感染病毒后收集子代病毒的时间对子代病毒插缺率影响的SURVEYOR分析测试结果。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例,对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1:单纯疱疹病毒基因组TK基因定点敲除
采用I型单纯疱疹病毒(HSV1)的毒株,此毒株采用现有方法分离和保存即可,例如,用临床I型单纯疱症病人口唇疱症液感染Vero细胞,扩增获得HSV1 8F病毒,其中,8F为制取过程中的病毒株的代号。
单纯疱疹病毒基因组TK基因的定点敲除改造方法,是通过以下步骤实现的:
步骤一,将AG230质粒经过BbsI酶切、纯化后,利用T4 DNA ligase(NEB)连入经P109(5'- CAC CGA GGG CGC AAC GCC GTA CGT -3')和P110(5'- AAA CAC GTA CGG CGT TGC GCC CTC
-3')两条合成引物退火后形成的双链插入序列,构建质粒pCW206,质粒pCW206经过无内毒素质粒大提试剂盒提取后备用;
步骤二,将人胚肾细胞293FT接种于6孔细胞培养板上,接种密度为6×105个细胞/孔,24小时后,根据脂质体lipofectamine 2000(Invitrogen)使用说明,毎孔转染2µg步骤一得到的pCW206质粒DNA,转染24小时,得到转染后的人胚肾细胞293FT;
步骤三,经步骤二处理后,向细胞培养板的每个孔中感染HSV1病毒1mL(感染复数moi=10),37℃吸附两小时后,吸去病毒液,PBS洗两次后,加入2mL含有2%胎牛血清的DMEM维持液,放入37℃、体积分数为5%
CO2的培养箱培育,直到细胞完全病变,得到病变人胚肾细胞293FT;
步骤四,24h后收集步骤三得到的病变人胚肾细胞293FT和上清,冻融一次后,1000g,5分钟离心去细胞碎片,所得上清即为子代病毒收获液;
步骤五,采用嗜斑法分离TK基因缺失的HSV1单个克隆病毒,将子代病毒进行连续10倍倍比稀释,分别感染Vero细胞,6天后挑取分离较好的“嗜斑”,接种Vero细胞后进一步扩增,取少量病毒提取基因组DNA,利用P111(5'-AAG CCC CCA GCA CCC GCC AGT AAG T-3')和P112(5'-CAC CAG GAC GGG GCA CAG GTA CAC TAT CTT G-3')进行PCR扩增后酶切鉴定和DNA测序,挑取数个病毒,约有一半的单克隆子代病毒在TK基因位点发生了碱基插缺,引发TK基因读码框移码,从而导致TK蛋白表达缺陷,所述TK基因为胸腺激酶基因。
本实施例中,步骤二采用的人胚肾细胞293FT为Invitrogen(Life
Science)产品,培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养液中。步骤五中所述Vero细胞为非洲绿猴肾细胞,来源于美国细胞典藏中心,培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养液中。
本实施例中为了敲除HSV1胸腺激酶基因(thymidine kinase,TK),以HSV1基因组上的UL23(TK)基因为靶点,设计gRNA-206(即pCW206质粒),能够制导Cas9蛋白的切割位点位于BsiWI限制性内切酶识别的序列内。
本实施例中采用如下方法监测单纯疱疹病毒基因组TK基因特定位点碱基插缺效率:取200μL步骤四得到的子代病毒收获液,利用病毒DNA基因组提取试剂盒(MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0 ,TAKARA)提取病毒基因组,以提取的病毒基因组DNA为模板,P111(5'-AAG
CCC CCA GCA CCC GCC AGT AAG T-3')和P112(5'-CAC CAG GAC GGG GCA CAG GTA CAC TAT CTT G-3')为引物,利用Phusion高保真DNA聚合酶(NEB)扩增获得单一目的片段666bp,片段经过BsiWI限制性内切酶酶切后,未发生突变的对照全部切开(切割为204bp和462bp两条片段),而发生突变的片段不能被BsiWI切开,未切开部分即为包含有碱基插缺的序列。可见,本实施例中引入了CAS9系统的细胞中,在TK基因的BsiWI位点处,病毒基因组发生了高效的突变,PCR产物不能够被BsiWI切开的片段约占48.3%。
本实施例中,为了验证子代病毒中TK基因的定点敲除效率,进行了如下试验:未经CRISPR/CAS9系统处理的野生型的HSV1病毒,病毒滴度为6.71×108 TCID50/mL,在100μg/mL
阿昔洛韦存在下,野生型的HSV1病毒能够被完全抑制。而本实施例的由存在CRISPR/CAS9系统的细胞产生的子代HSV1病毒,在未加阿昔洛韦时,病毒滴度为6.81×107 TCID50/mL,而加阿昔洛韦处理的病毒,病毒滴度为3.16×107 TCID50/mL,将病毒最高稀释度的阿昔洛韦处理病毒进行基因组测序证实,这些病毒为在TK基因gRNA-175切割位点出现了突变。因此TK基因敲除的效率约为46.4%,这个突变效率,显然比自然突变的效率提高了约7-8个数量级。本实施例能将单纯疱疹病毒基因组的TK基因高效快速地进行了定点敲除。其中,阿昔洛韦(Acyclovir)是治疗HSV1的药物,其作用的靶蛋白为TK蛋白,它能够使感染HSVI的宿主细胞致死,从而抑制病毒的增值。如果病毒的TK基因发生了功能缺失,阿昔洛韦将不能抑制HSV1的增值。
实施例2:外源红色荧光蛋白快速定点插入重组腺病毒载体
采用表达绿色荧光蛋白的重组腺病毒ADV-152,此毒株采用stratagene 的AdEasy™ Adenoviral Vector System系统,在重组腺病毒的基因组中插入来源于水母的增强型绿色荧光蛋白编码基因,转染及再感染AD293细胞后,即可制备和扩增ADV-152重组腺病毒。该实施例是将绿色荧光蛋白更换为红色荧光蛋白。其中,ADV-152中的152是制取过程中病毒株的代号。
重组腺病毒载体的定点插入外源红色荧光蛋白的改造方法,是通过以下步骤实现的:
步骤一,将AG230质粒经过BbsI酶切、纯化后,利用T4 DNA ligase(NEB)连入经P069(5'- CAC CGC TGA AGC ACT GCA CGC CGT -3')和P070(5'- AAA CAC GGC GTG CAG TGC TTC AGC
-3')两条合成引物退火后形成的双链插入序列,构建质粒pCW175;将珊瑚红色荧光蛋白基因从pDsRedN1质粒(Clontech)切下,通过KpnI和NotI位点连入pShuttle-CMV质粒(Stratagene)构建质粒pCW167;质粒pCW175和质粒pCW167经过无内毒素质粒大提试剂盒提取后备用;
步骤二,将人胚肾细胞293FT接种于6孔细胞培养板上,接种密度为6×105个细胞/孔,24小时后,根据脂质体lipofectamine 2000(Invitrogen)使用说明,毎孔共转染1.5µg质粒pCW175和1.5µg质粒pCW167,共转染24小时,得到转染后的人胚肾细胞293FT;
步骤三,经步骤二处理后,向细胞培养板的每个孔中感染ADV-152病毒,1mL(感染复数moi=10),37℃吸附两小时后,吸去病毒液,PBS洗两次后,加入2mL含有2%胎牛血清的DMEM维持液,放入37℃、体积分数为5%
CO2的培养箱培育,直到细胞完全病变,得到病变人胚肾细胞293FT;
步骤四,收集步骤三得到的病变人胚肾细胞293FT和上清,冻融一次后,1000g,5分钟离心去细胞碎片,所得上清即为子代病毒收获液;
步骤五,采用嗜斑法分离同源重组携带红色荧光蛋白的重组腺病毒单个克隆病毒,将子代病毒进行连续10倍倍比稀释,分别感染人胚肾细胞AD293细胞,7天后在荧光显微镜下挑取分离较好的红色“嗜斑”,接种人胚肾细胞AD293细胞后进一步扩增,即可快速获得经过重组的腺病毒。
本实施例中,步骤二采用的人胚肾细胞293FT为Invitrogen(Life
Science)产品,培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养液中。步骤五中所述的人胚肾细胞AD293为Stratagene产品,培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养液中。
本实施例中携带红色荧光蛋白基因的病毒显著增加,约占总病毒量的百分之二,重组效率较自然发生的重组效率(10-8)提高了约10万倍。
实施例3:重组腺病毒特定序列的大片段缺失
采用表达绿色荧光蛋白的重组腺病毒ADV-152,此毒株采用stratagene 的AdEasy™ Adenoviral Vector System系统,在重组腺病毒的基因组中插入来源于水母的增强型绿色荧光蛋白编码基因,转染及再感染AD293细胞后,即可制备和扩增病毒ADV-152。
重组腺病毒基因组的特定序列的大片段缺失改造方法,是通过以下步骤实现的:
步骤一,将AG230质粒经过BbsI酶切、纯化后,利用T4 DNA ligase(NEB)连入经P067(5'-
CAC CGG AGC GCA CCA TCT TCT TCA -3')和P068(5'- AAA CTG AAG AAG
ATG GTG CGC TCC -3')两条合成引物退火后形成的双链插入序列,构建质粒pCW174;然后再将AG230质粒经过BbsI酶切、纯化后,利用T4 DNA ligase(NEB)连入经P069(5'- CAC CGC TGA AGC ACT GCA CGC CGT -3')和P070(5'- AAA CAC GGC GTG CAG TGC TTC AGC -3')两条合成引物退火后形成的双链插入序列,构建质粒pCW175;质粒pCW175和质粒pCW174经过无内毒素质粒大提试剂盒提取后备用;
步骤二,将人胚肾细胞293FT接种于6孔细胞培养板上,接种密度为6×105个细胞/孔,24小时后,根据脂质体lipofectamine 2000(Invitrogen)使用说明,毎孔共转染1.5µg质粒pCW174和1.5µg质粒pCW175,共转染24小时,得到转染后的人胚肾细胞293FT;
步骤三,经步骤二处理后,向细胞培养板的每个孔中感染ADV-152病毒,1mL(感染复数moi=10),37℃吸附两小时后,吸去病毒液,PBS洗两次后,加入2mL含有2%胎牛血清的DMEM维持液,放入37℃、体积分数为5%
CO2的培养箱培育,直到细胞完全病变,得到病变人胚肾细胞293FT;
步骤四,收集步骤三得到的病变人胚肾细胞293FT和上清,冻融一次后,1000g,5分钟离心去细胞碎片,所得上清即为子代病毒收获液;
步骤五,将子代病毒经过DNA基因组提取试剂盒(MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0
,TAKARA,日本)提取病毒基因组,利用引物P075(5'- GGA TCC ACC GGC CGG TCG-3')和P079(5'- ACG GGG CCG TCG CCG ATG G-3')进行PCR鉴定。突变后的病毒和没有突变的病毒的PCR检测结果如图1所示,可见,对照组为没有突变的病毒的PCR产物大小约600bp,而经本实施例处理后的突变后的病毒的PCR产物大小约为500bp,突变后的病毒其PCR产物大小明显缩短约100bp。
本实施例中,步骤二采用的人胚肾细胞293FT为Invitrogen(Life
Science)产品,培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养液中。步骤五中所述的人胚肾细胞AD293为Stratagene产品,培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养液中。
实施例4:标记病毒特定蛋白,并利用抗性基因分离同源重组病毒
采用Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV1)的毒株,此毒株采用现有方法分离和保存即可,例如,用临床病人疱症液感染Vero细胞,扩增获得HSV1 8F病毒。
单纯疱疹病毒的定点改造方法,是通过以下步骤实现的:
步骤一,将AG230质粒经过BbsI酶切、纯化后,利用T4 DNA ligase(NEB)连入经P109(5'-
CAC CGA GGG CGC AAC GCC GTA CGT -3')和P110(5'- AAA CAC GTA CGG CGT TGC GCC CTC -3')两条合成引物退火后形成的双链插入序列,构建质粒pCW206;pCW226质粒构建如下:EGPF与抗puromycin的抗性基因通过口蹄疫病毒2A蛋白相连,蛋白表达盒的两端为HSV1-TK基因两端的同源序列,质粒pCW206和质粒pCW226经过无内毒素质粒大提试剂盒提取后备用;
步骤二,将人胚肾细胞293FT接种于6孔细胞培养板上,接种密度为6×105个细胞/孔,24小时后,根据脂质体lipofectamine 2000(Invitrogen)使用说明,毎孔共转染1.5µg质粒pCW206和1.5µg质粒pCW226,共转染24小时,得到转染后的人胚肾细胞293FT;
步骤三,经步骤二处理后,向细胞培养板的每个孔中感染HSV1病毒1mL(感染复数moi=10),37℃吸附两小时后,吸去病毒液,PBS洗两次后,加入2mL含有2%胎牛血清的DMEM维持液,放入37℃、体积分数为5%
CO2的培养箱培育,直到细胞完全病变,得到病变人胚肾细胞293FT;
步骤四,收集步骤三得到的病变人胚肾细胞293FT和上清,冻融一次后,1000g,5分钟离心去细胞碎片,所得上清即为子代病毒收获液;
步骤五,利用步骤四得到的子代病毒收获液感染Vero细胞得到感染Vero细胞,再加入抗生素Puromycin(Invitrogen)处理感染Vero细胞,得到病变Vero细胞,然后收集病变Vero细胞和上清,冻融处理后,离心去细胞碎片,所得上清即为经药物筛选后的重组子代病毒;
步骤六,为了分离HSV1单克隆病毒,可采用嗜斑法分离单个克隆的病毒,将子代病毒用进行连续10倍倍比稀释,分别感染Vero细胞,6天后挑取分离较好的显示出绿色荧光的“嗜斑”,接种Vero细胞后进一步扩增,即可。
本实施例中,步骤二采用的人胚肾细胞293FT为Invitrogen(Life
Science)产品,培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养液中。步骤五中所述Vero细胞为非洲绿猴肾细胞,来源于美国细胞典藏中心,培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养液中。
本实施例能够构建出携带有绿色荧光蛋白的HSV1报告病毒,其绿色荧光蛋白的表达受控于病毒早期启动子的调控,且绿色荧光蛋白与部分TK基因融合表达。
本实施例用于标记病毒特定蛋白,研究病毒感染过程中,特定病毒蛋白的表达时序以及定位状况,并可以作为实时监测病毒感染过程的标记物。
实施例5:非编码基因的定点改造方法
采用Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV1)的毒株,此毒株采用现有方法分离和保存即可,例如,用临床病人疱症液感染Vero细胞,扩增获得HSV1 8F病毒。
单纯疱疹病毒非编码基因的定点改造方法,是通过以下步骤实现的:
步骤一,将AG230质粒经过BbsI酶切、纯化后,利用T4 DNA ligase(NEB)连入经Pa(5'-
CAC CGC TGG GTC CTA GGC TCA ATG -3')和Pb(5'- AAA CCA TTG AGC CTA GGA CCC
AGC -3')两条合成引物退火后形成的双链插入序列,构建质粒pLX45,然后质粒pLX45经过无内毒素质粒大提试剂盒提取后备用;
步骤二,将人胚肾细胞293FT接种于6孔细胞培养板上,接种密度为6×105个细胞/孔,24小时后,根据脂质体lipofectamine 2000(Invitrogen)使用说明,毎孔转染2µg质粒pLX45,转染24小时,得到转染后的人胚肾细胞293FT;
步骤三,经步骤二处理后,向细胞培养板的每个孔中感染HSV1病毒1mL(感染复数moi=10),37℃吸附两小时后,吸去病毒液,PBS洗两次后,加入2mL含有2%胎牛血清的DMEM维持液,放入37℃、体积分数为5%
CO2的培养箱培育,直到细胞完全病变,得到病变人胚肾细胞293FT;
步骤四,收集步骤三得到的病变人胚肾细胞293FT和上清,冻融一次后,1000g,5分钟离心去细胞碎片,所得上清即为子代病毒收获液;
步骤五,子代病毒采用嗜斑法分离单个克隆的病毒,将子代病毒用进行连续10倍倍比稀释,分别感染人胚肾细胞AD293,7天后挑取分离较好“嗜斑”,接种人胚肾细胞AD293后进一步扩增,单克隆病毒经过基因组DNA测序,检定出TK启动子区域发生碱基插缺的单克隆子代病毒。
本实施例中,进一步可以对TK基因转录水平、病毒对药物敏感性以及重组病毒感染宿主后的病理性反应进行评测,用于病毒启动子研究、抗病毒药物以及疫苗株的筛选等。
本实施例中,步骤二采用的人胚肾细胞293FT为Invitrogen(Life
Science)产品,培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养液中。步骤五中所述的人胚肾细胞AD293为Stratagene产品,培养于含有10%胎牛血清的DME M培养液中。
本实施例用于在特定基因非编码序列进行碱基的插缺,改变特定基因的表达效率。
实施例6:重组腺病毒的定点改造
采用表达绿色荧光蛋白的重组腺病毒ADV-152,此毒株采用stratagene 的AdEasy™ Adenoviral Vector System系统,在重组腺病毒的基因组中插入来源于水母的增强型绿色荧光蛋白编码基因,转染及再感染AD293细胞后,即可制备和扩增病毒。
重组腺病毒基因组的定点改造方法,是通过以下步骤实现的:
步骤一,将AG230质粒经过BbsI酶切、纯化后,利用T4 DNA ligase(NEB)连入经P069(5'- CAC CGC TGA AGC ACT GCA CGC CGT -3')和P070(5'- AAA CAC GGC GTG CAG TGC TTC AGC
-3')两条合成引物退火后形成的双链插入序列,构建质粒pCW175;质粒pCW175经过无内毒素质粒大提试剂盒提取后备用;
步骤二,将人胚肾细胞293FT接种于6孔细胞培养板上,接种密度为6×105个细胞/孔,24小时后,根据脂质体lipofectamine 2000(Invitrogen)使用说明,毎孔转染2µg质粒pCW175,转染24小时,得到转染后的人胚肾细胞293FT;
步骤三,经步骤二处理后,向细胞培养板的每个孔中感染ADV-152病毒,感染复数moi=1,37℃吸附两小时后,吸去病毒液,PBS洗两次后,加入2mL含有2%胎牛血清的DMEM维持液,放入37℃、体积分数为5% CO2的培养箱培育24h,直到细胞完全病变,得到病变人胚肾细胞293FT;
步骤四,收集步骤三得到的病变人胚肾细胞293FT和上清,冻融一次后,1000g,5分钟离心去细胞碎片,所得上清即为子代病毒收获液;
步骤五,采用嗜斑法分离重组腺病毒单个克隆病毒,将子代病毒进行连续10倍倍比稀释,分别感染人胚肾细胞AD293细胞,7天后在荧光显微镜下挑取分离较好的“嗜斑”,接种人胚肾细胞AD293细胞后进一步扩增,即可快速获得经过重组的腺病毒。
本实施例中,步骤二采用的人胚肾细胞293FT为Invitrogen(Life
Science)产品,培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养液中。步骤五中所述的人胚肾细胞AD293为Stratagene产品,培养于含有10%胎牛血清的DME M培养液中。
本实施例中采用如下方法监测CRISPR/CAS9系统对ADV-152病毒的后的病毒基因组经过修复后的插缺效率,取200μL子代病毒收获液,利用病毒DNA基因组提取试剂盒(MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit
Ver.4.0 ,TAKARA,日本)提取病毒基因组,以提取的病毒基因组DNA为模板, P075(5'- GGA
TCC ACC GGC CGG TCG-3')和P079(5'-
ACG GGG CCG TCG CCG ATG G-3')为引物,利用Phusion高保真DNA聚合酶(NEB)扩增获得单一目的片段604bp,片段经过SUVEYOR核酸酶突变检测试剂盒(Transgenomic)检测碱基插缺效率。
本实施例中,对步骤三的培育时间对获得的子代病毒插缺率的影响进行了试验,分别对培育时间为6h、12h、24h、36h和48h进行试验,如图2所示,图中“-”对应的图形为没有经过CRISPR/CAS9系统处理的ADV-152病毒的PCR产物经过SUVEYOR核酸酶突变检测试剂盒检测后的结果,“+”对应的图形是本实施例的经过CRISPR/CAS9系统处理后的子代病毒的PCR产物经过SUVEYOR核酸酶突变检测试剂盒检测后的结果,且相邻的“-”和“+”为一组对照试验,可见,培育时间在12h后代病毒插缺率达到30%以上,在培育时间为36h时达到高值,48.7%,再延长,反而有所降低,因此,较优的培育时间为24h-36h。
另外,本实施中,还对步骤三中感染ADV-152病毒的不同感染复数moi对子代病毒插缺率的影响进行了试验,分别对感染复数moi为0、0.1、1、10和100进行试验,测试结果如图3所示,在感染复数为0-1之间时,随感染复数的增大,子代病毒插缺率逐渐增大,至峰值47.5%,但感染复数moi为10时,反而降低至42.5%,至moi为100时,降至21.8%,因此,控制感染复数为1-10之间为佳。
对于收毒时间一般是看到细胞完全病变后收毒,但是只要等待病毒完成一个复制周期,即使细胞不病变,也可以收获具有感染性的病毒,一般等到细胞完全病变后再收毒只是为了观察方便。本实施中,对感染病毒后收集子代病毒的时间对子代病毒插缺率的影响进行了试验,测试结果如图4所示,可见,收集时间大于36h以上,子代病毒插缺率的变化不大,综合考虑,收集时间为36h为宜。
以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1. 一种DNA病毒基因组的定点改造方法,其特征在于:是通过以下步骤实现的:
步骤一,构建定点切割的核酸酶系统:构建包含导向功能的分子和具有核酸酶活性的蛋白核酸酶系统;
步骤二,将步骤一的定点切割的核酸酶系统转染细胞,得到转染细胞,其中,控制细胞数量与表达核酸酶系统的质量之间的比例为1×105:0.25-2μg;
步骤三,将经步骤二处理后的细胞培养板的每个孔中加入病毒液,吸附,然后吸去病毒液,再加入细胞维持液,培育至细胞完全病变,得到病变细胞;
步骤四,收集步骤三得到的病变细胞和/或上清,冻融或超声处理后,离心去除细胞碎片,所得上清即为子代病毒收获液;
步骤五,从步骤四得到的子代病毒收获液中,挑取来源于单克隆的子代病毒,通过核酸测序鉴定,分离出子代病毒;完成DNA病毒基因组的定点改造方法。
2. 根据权利要求1所述的一种DNA病毒基因组的定点改造方法,其特征在于:将上述步骤四得到的子代病毒,通过嗜斑法或有限稀释法之一,挑取来源于单克隆的子代病毒,通过核酸测序鉴定,获得改造后的目的重组病毒。
3. 根据权利要求1或2所述的一种DNA病毒基因组的定点改造方法,其特征在于:所述定点切割的核酸酶系统是RNA导向的核酸酶系统、锌指核酸酶系统或者转录激活因子样效应物核酸酶系统之一。
4. 根据权利要求3所述的一种DNA病毒基因组的定点改造方法,其特征在于:所述步骤一中构建属于RGN系统的规律性重复短回文序列簇相关系统,即CRISPR/CAS系统,利用AG230质粒进行构建的过程如下:将AG230质粒酶切、纯化后,再利用连接酶连入插入序列,构建得到新质粒,即CRISPR/CAS系统。
5. 根据权利要求4所述的一种DNA病毒基因组的定点改造方法,其特征在于:所述插入序列为双链,所述插入序列的个数至少为1个。
6. 根据权利要求1、2、4或5所述的一种DNA病毒基因组的定点改造方法,其特征在于:步骤一中构建的核酸酶系统以DNA形式、病毒载体形式、蛋白和RNA复合物形式、编码RNA形式或者非编码RNA形式之一导入。
7. 根据权利要求6所述的一种DNA病毒基因组的定点改造方法,其特征在于:步骤二中的转染方法为:将细胞接种于细胞培养板上加入DNA-脂质体复合物进行转染;或者,将细胞和DNA-脂质体复合物混合后,再接种于细胞培养板上进行培养;或者,采用电转方法;或者,采用病毒载体形式、编码RNA和非编码RNA、或者蛋白和RNA复合物之一的形式进行导入。
8. 根据权利要求1、2、4、5或7所述的一种DNA病毒基因组的定点改造方法,其特征在于:步骤二中转染12-36h后得到转染细胞。
9. 根据权利要求8所述的一种DNA病毒基因组的定点改造方法,其特征在于:步骤三中的培育时间至少为12h。
10. 根据权利要求1、2、4、5、7或9所述的一种DNA病毒基因组的定点改造方法,其特征在于步骤二中将细胞转染步骤一的核酸酶系统及同源重组供体序列,所述同源重组供体序列通过以下方式进行构建:构建双链DNA序列,其两端与目标序列相同,中间插入需要改造的目的序列。
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CN (1) | CN103397018B (zh) |
Cited By (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103757053A (zh) * | 2014-01-28 | 2014-04-30 | 中国医学科学院医学生物学研究所 | 一种特异性的dna病毒基因组定点改造及筛选方法 |
CN104975036A (zh) * | 2015-06-12 | 2015-10-14 | 重庆高圣生物医药有限责任公司 | 一种高效建立转基因小鼠模型的辅助质粒及其构建方法 |
CN105039401A (zh) * | 2015-06-23 | 2015-11-11 | 重庆高圣生物医药有限责任公司 | 一种高效构建人稳定表达细胞株的辅助质粒及其构建方法 |
WO2016057061A2 (en) | 2014-10-10 | 2016-04-14 | Massachusetts Eye And Ear Infirmary | Efficient delivery of therapeutic molecules in vitro and in vivo |
WO2016141893A1 (zh) * | 2015-03-12 | 2016-09-15 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种提高植物对入侵的dna病毒的抵御能力的方法 |
CN108103033A (zh) * | 2017-12-07 | 2018-06-01 | 武汉博威德生物技术有限公司 | 一种rna病毒基因组的定点改造方法 |
CN108913684A (zh) * | 2018-07-27 | 2018-11-30 | 中国医学科学院医学生物学研究所 | 一种外源片段高效定点定向插入dna病毒基因组的方法 |
CN109153980A (zh) * | 2015-10-22 | 2019-01-04 | 布罗德研究所有限公司 | Vi-b型crispr酶和系统 |
CN111508558A (zh) * | 2020-03-23 | 2020-08-07 | 广州赛业百沐生物科技有限公司 | 一种基于CRISPR-Cas9技术设计点突变模型的方法及系统 |
CN111961683A (zh) * | 2015-10-06 | 2020-11-20 | 基础科学研究院 | 用于以高效率从植物原生质体生成基因组工程改造的植物的方法 |
CN113930455A (zh) * | 2014-10-09 | 2022-01-14 | 生命技术公司 | Crispr寡核苷酸和基因剪辑 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20100076057A1 (en) * | 2008-09-23 | 2010-03-25 | Northwestern University | TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA |
CN102191224A (zh) * | 2010-03-12 | 2011-09-21 | 复旦大学 | 一种单纯疱疹病毒的重靶向修饰方法及其应用 |
CN103233028A (zh) * | 2013-01-25 | 2013-08-07 | 南京徇齐生物技术有限公司 | 一种无物种限制无生物安全性问题的真核生物基因打靶方法及螺旋结构dna序列 |
-
2013
- 2013-08-20 CN CN201310364133.2A patent/CN103397018B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20100076057A1 (en) * | 2008-09-23 | 2010-03-25 | Northwestern University | TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA |
CN102191224A (zh) * | 2010-03-12 | 2011-09-21 | 复旦大学 | 一种单纯疱疹病毒的重靶向修饰方法及其应用 |
CN103233028A (zh) * | 2013-01-25 | 2013-08-07 | 南京徇齐生物技术有限公司 | 一种无物种限制无生物安全性问题的真核生物基因打靶方法及螺旋结构dna序列 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
HIROTAKA EBINA ET AL.: "Harnessing the CRISPR_Cas9 system to disrupt latent HIV-1 provirus", 《SCIENTIFIC REPORTS》 * |
YANWEI BI ET AL.: "High-efficiency targeted editing of large viral genomes by RNA-guided nucleases", 《PLOS PATHOGENS》 * |
张智辉 等: "基因组定点编辑技术的研究进展", 《生命科学》 * |
Cited By (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103757053B (zh) * | 2014-01-28 | 2016-05-25 | 中国医学科学院医学生物学研究所 | 一种特异性的dna病毒基因组定点改造及筛选方法 |
CN103757053A (zh) * | 2014-01-28 | 2014-04-30 | 中国医学科学院医学生物学研究所 | 一种特异性的dna病毒基因组定点改造及筛选方法 |
CN113930455A (zh) * | 2014-10-09 | 2022-01-14 | 生命技术公司 | Crispr寡核苷酸和基因剪辑 |
EP3204032A4 (en) * | 2014-10-10 | 2018-10-10 | Massachusetts Eye & Ear Infirmary | Efficient delivery of therapeutic molecules in vitro and in vivo |
CN107530399A (zh) * | 2014-10-10 | 2018-01-02 | 马萨诸塞眼科耳科诊所 | 治疗分子在体外和体内的有效递送 |
WO2016057061A2 (en) | 2014-10-10 | 2016-04-14 | Massachusetts Eye And Ear Infirmary | Efficient delivery of therapeutic molecules in vitro and in vivo |
WO2016141893A1 (zh) * | 2015-03-12 | 2016-09-15 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种提高植物对入侵的dna病毒的抵御能力的方法 |
CN104975036B (zh) * | 2015-06-12 | 2020-04-24 | 重庆高圣生物医药有限责任公司 | 一种高效建立转基因小鼠模型的辅助质粒及其构建方法 |
CN104975036A (zh) * | 2015-06-12 | 2015-10-14 | 重庆高圣生物医药有限责任公司 | 一种高效建立转基因小鼠模型的辅助质粒及其构建方法 |
CN105039401A (zh) * | 2015-06-23 | 2015-11-11 | 重庆高圣生物医药有限责任公司 | 一种高效构建人稳定表达细胞株的辅助质粒及其构建方法 |
CN105039401B (zh) * | 2015-06-23 | 2020-04-24 | 重庆高圣生物医药有限责任公司 | 一种高效构建人稳定表达细胞株的辅助质粒及其构建方法 |
CN111961683A (zh) * | 2015-10-06 | 2020-11-20 | 基础科学研究院 | 用于以高效率从植物原生质体生成基因组工程改造的植物的方法 |
CN109153980B (zh) * | 2015-10-22 | 2023-04-14 | 布罗德研究所有限公司 | Vi-b型crispr酶和系统 |
CN109153980A (zh) * | 2015-10-22 | 2019-01-04 | 布罗德研究所有限公司 | Vi-b型crispr酶和系统 |
CN108103033A (zh) * | 2017-12-07 | 2018-06-01 | 武汉博威德生物技术有限公司 | 一种rna病毒基因组的定点改造方法 |
CN108913684A (zh) * | 2018-07-27 | 2018-11-30 | 中国医学科学院医学生物学研究所 | 一种外源片段高效定点定向插入dna病毒基因组的方法 |
CN111508558A (zh) * | 2020-03-23 | 2020-08-07 | 广州赛业百沐生物科技有限公司 | 一种基于CRISPR-Cas9技术设计点突变模型的方法及系统 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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CN103397018B (zh) | 2015-04-22 |
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