CN103757053A - 一种特异性的dna病毒基因组定点改造及筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种特异性的DNA病毒基因组定点改造及筛选方法，如下：一、构建定点切割单链、双链核酸酶系统及同源序列；二、导入定点切割单链核酸酶系统和同源序列的细胞感染DNA病毒，待细胞病变，收集P1子代病毒；三、导入定点切割双链核酸酶系统的细胞感染P1子代病毒，待细胞病变，收集P2子代病毒；最后从P2子代病毒中分离纯化获得目的子代病毒。上述二为病毒基因组同源重组步骤，在不引入随机突变的情况下，提高病毒基因组同源重组效率约十万倍；上述三为特异性扩增步骤，进一步提高特异性突变病毒在子代病毒中的比例约十倍左右。本发明能有效控制突变类型，并快速方便地筛选获得具有特定突变、缺失或插入的重组病毒。

Description

一种特异性的DNA病毒基因组定点改造及筛选方法

技术领域

本发明涉及DNA病毒基因组的改造方法，尤其涉及一种特异性的DNA病毒基因组定点改造及筛选方法。

背景技术

目前对于DNA病毒基因组的定点突变，主要有两种方法，一种方法是借助于限制性内切酶等工具酶对病毒基因组进行细胞外的基因重组操作，但对于较大的病毒基因组，很难找到可以使用的单个限制性酶切位点。另一种方法是借助于细胞内的同源重组系统，通过向病毒感染细胞中转染与病毒基因组相似的同源序列，完成对特定区域基因组序列的定点编辑，由于这种同源重组效率极低，因此并不适合高通量的病毒疫苗株筛选，为了克服这种困难，往往需要向病毒导入外源性抗性基因用于重组病毒的筛选，这种操作不但费时费力，而且在生物安全性上并不适合疫苗株的要求。如何简单、高效、精确地对大型DNA病毒基因组进行定点编辑，仍是疫苗开发中的一个技术瓶颈。

在申请号为201310364133.2，公开日为2013年11月20日的名称为“一种DNA病毒基因组的定点改造方法”的发明专利申请中公开了一种能够高效地对病毒基因组进行定点突变、定点基因敲除或提高外源基因插入病毒基因组的重组效率、以及简化重组的定点改造方法，但是其所产生的突变类型具有很大的随机性，这种随机突变不能严格达到对生物安全的要求，也常常无法满足在产品开发过程中需要在特定的病毒基因组位点精确插入或缺失数个碱基以及突变为特定的目标序列。

发明内容

针对现有技术的上述缺陷和问题，本发明的目的是提供一种特异性的DNA病毒基因组定点改造及筛选方法，解决现有的DNA病毒基因组定点改造方法存在的突变类型具有很大的随机性，且这种随机突变不能严格达到对生物安全的要求，也常常无法满足在产品开发过程中需要在特定的病毒基因组位点精确插入或缺失数个碱基以及突变为特定的目标序列的问题。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种特异性的DNA病毒基因组定点改造及筛选方法，是通过以下步骤实现的：

步骤一，构建定点切割的核酸酶系统：构建包含导向功能的分子和具有定点切割单链DNA活性的蛋白核酸酶系统Ⅰ，以及包含导向功能的分子和具有定点切割双链DNA活性的蛋白核酸酶系统Ⅱ；

步骤二，构建包含有特异性突变、缺失或插入序列的同源序列；

步骤三，将步骤一构建的蛋白核酸酶系统Ⅰ和步骤二构建的同源序列共同转染细胞，得到转染细胞，其中，控制细胞数量与表达核酸酶系统Ⅰ的质量之间的比例为1×10⁵:0.1-2μg，控制细胞数量与同源序列的质量之间的比例为1×10⁵:0.1-2μg；

步骤四，向经步骤三处理后的细胞培养板的每个孔中加入病毒液，吸附，然后吸去病毒液，再加入细胞维持液，培育至细胞病变，得到病变细胞Ⅰ；

步骤五，收集步骤四得到的病变细胞Ⅰ和/或上清，冻融或超声处理后，离心去除细胞碎片，所得上清即为子代病毒收获液P1；

步骤六，将步骤一中构建的蛋白核酸酶系统Ⅱ转染细胞，得到转染细胞，其中，控制细胞数量与表达核酸酶系统Ⅱ的质量之间的比例为1×10⁵:0.1-2μg；

步骤七、向经步骤六处理后的细胞培养板的每个孔中加入步骤五得到的子代病毒收获液P1，吸附，然后吸去病毒液，再加入细胞维持液，培育至细胞病变，得到病变细胞Ⅱ；

步骤八，收集步骤七得到的病变细胞Ⅱ和/或上清，冻融或超声处理后，离心去除细胞碎片，所得上清即为子代病毒收获液P2；

步骤九，从步骤八得到的子代病毒收获液P2中，挑取来源于单克隆的子代病毒，通过核酸测序鉴定，分离出纯化获得具有特异性突变的子代病毒；完成DNA病毒基因组的特异性定点改造及筛选方法。

进一步的技术方案是，将上述步骤九得到的具有特异性突变的子代病毒，可通过任选嗜斑法或有限稀释法之一，挑取来源于单克隆的子代病毒，通过核酸测序鉴定，获得改造后的目的重组病毒。其中，除了进行核酸测序检测以外，也可以通过核酸杂交、抗性筛选、报告基因检测、蛋白丰度以及蛋白特异性检测等多种方法进行鉴定。

本发明中，具体地，所提及的病毒包括所有以DNA为遗传物质的病毒，如腺病毒、单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒、卡波氏肉瘤病毒、痘病毒等病毒以及经过人工重组的嵌合病毒等。

本发明步骤一中构建至少一个核酸酶系统Ⅰ，比如构建2个核酸酶系统Ⅰ，步骤三中可以同时采用2个单链核酸酶系统Ⅰ进行转染细胞，其精确控制突变的也较单点切割双链的效果要好。

具体地，步骤一中所述核酸酶系统Ⅰ（即单链核酸酶系统）可以是突变后的切割单链DNA的RNA导向核酸酶（RNA-guided Nucleases,RGN）系统、切割单链的锌指核酸酶（Zinc finger nucleases,ZFn）系统、或切割单链的转录激活因子样效应物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases,TALEN）系统之一。其中，ZFn系统和TALEN系统的导向分子是蛋白，单个的ZFn和TALEN分子只能识别与结合一条单链DNA，RGN是蛋白和RNA的复合物，可以结合双链DNA，但是经过核酸酶结构域改造后，只能切割单链DNA。

具体地，步骤一中所述核酸酶系统Ⅱ（即双链核酸酶系统）可以是切割双链DNA的RGN系统，或者成对的切割双链DNA的TALEN或ZFn系统之一，一般而言RGN系统最为简单高效。

具体地，所述步骤一中构建规律性重复短回文序列簇相关系统（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR）associated system,Cas），简称CRISPR/Cas系统，其属于RNA介导的核酸酶（RGN），，其中以产脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的Cas9蛋白系统最为简单。分别利用AG335和AG230质粒进行构建的过程如下：将质粒酶切、纯化后，再利用连接酶连入插入序列，构建获得编码CRISPR/Cas9系统的新质粒，即CRISPR/Cas系统（两个质粒各是一个蛋白，单链的是突变体Cas9n，双链的是野生型Cas9，而且两个质粒插入的片段可以相同也可以不同，单链的切割位点位于同源序列区域内，双链的切割位点在野生型病毒基因组中有，而在突变体中没有）。其中，所述的AG335质粒为Addgene公司的pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n（D10A）（质粒编号：42335，简称AG335），该质粒编码的Cas9蛋白第10位的天冬氨酸突变为丙氨酸。所述的AG230质粒为Addgene公司的pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9（质粒编号：42230，简称AG230）。进一步地，所述插入序列可以为双链。构建成功的DNA可以通过转染工程菌进行扩增并纯化。

本发明的步骤一中构建的表达核酸酶系统的载体可以DNA形式、病毒载体形式、蛋白和RNA复合物形式、编码RNA形式或者非编码RNA形式之一。

具体地，本发明的步骤一中的核酸酶系统Ⅰ可以是包含有D10A的Cas9n突变体，只切割gRNA的互补DNA单链，也可以是其它的RuvC或HNH结构域发生突变的Cas9n突变体，如H840A（Cas9的840氨基酸由组氨酸突变为丙氨酸）等，其特点是能够在DNA特定位点切割单链DNA。

本发明的步骤二中，所述同源序列（又称供体DNA）是两端与目标序列相同（大于50个碱基对（bp）或大于50个核苷酸（nt）)，其间插入需要改造的目的序列，所述目的序列可以是线性、环状双链DNA或者是单链DNA，通常通过核酸合成或PCR以及工程菌扩增等基因工程的方法获得并纯化。

本发明的步骤三和步骤六中，不同细胞、不同厂家的脂质体，转染条件有所不同，例如，人胚肾HEK293细胞的转染效率比较高，所以可以选择它的改造细胞293FT；脂质体可以采用Invitrogen公司的lipofectamine 2000，其最适转染效果是1x10⁵个细胞转染0.1-2μg DNA（DNA和lipofectamine 2000脂质体的比例是1μg：2.5μL.），转染效率可以达到90%以上的细胞被转染，但是换成其他公司的脂质体（配方不同），最适条件可能要变，但在有限次试验内是可以总结归纳出来的。而步骤三中过高浓度的表达核酸酶系统Ⅰ（如CRISPR-Cas9n系统）转入细胞内，会产生非特异的插缺突变，不同的表达核酸酶系统Ⅰ载体与细胞数量的比例，其组合切割效率会不同，一般而言一个35mm的培养皿（约6x10⁵个293FT细胞），携带表达核酸酶系统Ⅰ的质粒DNA的转染量不超过2ug。

进一步地，步骤三和步骤六中的所述转染的方法为：将细胞接种于细胞培养板上加入DNA-脂质体复合物进行转染；或者，将细胞和DNA-脂质体复合物混合后，再接种于细胞培养板上进行培养；或者，采用电转方法，即利用电击将DNA导入细胞；或者，还可以采用病毒载体形式、编码RNA和非编码RNA、或者蛋白和RNA复合物之一等形式进行感染或转染。

本发明可以采用上述的任一方法导入核酸酶系统，例如，采用上述的任一方法导入的CRISPR/Cas系统。

进一步地，步骤三中转染12-36h后得到转染细胞。

进一步地，步骤四中所述病毒液的用量与转染细胞的比例为moi（感染复数）=0.01-100。

进一步地，步骤四中所述吸附的具体操作为：在35-37℃下吸附1-12h。

进一步地，步骤四中的培育条件为：35-37℃、体积分数为5%的CO₂的培养箱中。

进一步地，步骤四中的培育时间至少为12h。培育时间越长，病毒的重组效率越高，但是36h之后，病毒的同源重组效率的增幅不大，综合考虑，投入与产出的平衡，优选的是，培育时间为24h-36h。

进一步地，步骤六中转染12-36h后得到转染细胞。

进一步地，步骤七中所述病毒液的用量与转染细胞的比例为moi=0.01-100。

进一步地，步骤七中所述吸附的具体操作为：在35-37℃下吸附1-12h。

进一步地，步骤七中的培育条件为：35-37℃、体积分数为5%的CO₂的培养箱中。

进一步地，步骤七中的培育时间至少为12h。培育时间越长，病毒的重组效率越高，但是36h之后，病毒的同源重组效率的增幅不大，综合考虑，投入与产出的平衡，优选的是，培育时间为24h-36h。

具体地，步骤四和步骤七中，收毒的时间一般是看到细胞病变后收毒，但是只要等待病毒完成一个复制周期，即使细胞不病变，也可以收获具有感染性的病毒，一般等到细胞病变后再收毒只是为了观察方便。

具体地，步骤四和步骤七，除了感染病毒的方法以外，也可以通过转染等方法直接导入病毒基因组DNA，此时，病毒基因组的导入在时序上可以先于核酸酶系统的导入，也可以与核酸酶系统同时导入，同样可以达到本发明的目的。

根据病毒的感染周期类型，步骤三和步骤四的顺序可以颠倒，步骤六和步骤七的顺序也可以颠倒，即先对细胞进行病毒感染，再导入核酸酶系统。具体地，对于腺病毒、单纯疱症病毒等进行体外裂解增殖的病毒，由于裂解细胞时间较快，因此核酸酶和同源序列要先导入细胞，但是对于倾向于潜伏感染细胞的EB病毒或感染周期较长的巨细胞病毒等，病毒基因组在细胞内可以保留足够的时间，因此核酸酶和同源序列的导入时序同EB病毒基因组导入细胞的时序可以根据实验需要进行随意搭配。

本发明的步骤五和步骤八中，由于有的病毒存在于上清，有的病毒存在于细胞内，还有的病毒即使冻融后也和细胞碎片粘在一起，因此需要视具体的病毒种类而定，收集的是细胞还是上清，需要进行冻融还是超声分离处理。

在本发明中，步骤一至五为病毒基因组同源重组步骤，可以在不引入随机突变的情况下，将病毒基因组同源重组的效率提高约十万倍，此步之后，可以直接在P1病毒中进行重组病毒的筛选工作，只是筛选的工作量较大而已。

步骤六至九为特异性扩增步骤，可以进一步提高含有特异性突变病毒在子代病毒中的比例约十倍左右，以至于在最后一步，挑取数个单克隆病毒（不超过10个），就能方便地获得具有特异性突变的重组病毒。

本发明中，子代病毒可以通过一个完整的实验循环产生，包含一个同源重组步骤和一个特异性扩增步骤。也可以为了提高重组病毒在子代病毒中的比例，进行多次重复的同源重组步骤，例如进行3-5次重复。或进行多次的特异性扩增步骤，例如进行3-5次的特异性扩增步骤，每次重复的步骤Cas9n或Cas9的切割位点可以相同也可以不同。

本发明的一种特异性的DNA病毒基因组定点改造及筛选方法的原理如下：

基本原理1：属于细菌的获得性免疫系统的规律性重复短回文序列相关系统（CRISPR/Cas），能够在导向性RNA（gRNA）的指导下结合特定的DNA序列，并发挥核酸酶的活性，切割双链DNA。已知产脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的Cas9蛋白，其蛋白含有RuvC和HNH两个核酸酶结构域，如图1所示，HNH核酸酶结构域切割与gRNA互补的DNA单链，而RnvC核酸酶结构域切割与gRNA序列类似的DNA单链，如图2所示，其中任意一个结构域突变失活（如D10A，H840A等），都能够使切割双链DNA的Cas9蛋白变为只切割单链的Cas9n缺口酶。

基本原理2：通过向感染细胞导入能够在病毒DNA基因组上定点切割的核酸酶系统（如规律性重复短回文序列相关系统CRISPR/Cas等），将病毒的DNA基因组双链切断。双链断裂的DNA可以利用宿主细胞的非同源末端连接修复（NHEJ）或同源重组修复（HDR）系统修复双链DNA。但由于NHEJ系统易于导入插缺突变，因此利用能够切断病毒双链DNA的核酸酶，很难控制基因组突变的类型。而利用适当浓度的切割单链DNA的缺口核酸酶，不产生双链断裂，可以排除NHEJ系统修复过程中随机突变的影响。同时单链缺口酶保持了高效诱导保真性较高的HDR发挥作用，通过提供同源性的供体DNA，能够有效地控制病毒基因组突变类型。

基本原理3：当病毒基因组包含有gRNA互补序列时，CRISPR/Cas9系统能够高效地切割病毒基因组DNA，从而抑制病毒的复制，但不影响识别序列发生突变的病毒DNA复制。利用这种特性可以选择性地提高某一类病毒的比例。例如一种CRISPR/Cas9系统能够特异性地抑制野生型病毒的复制，而不影响含有特定突变的DNA病毒，那么当野生型和突变型的病毒同时导入含有Cas9:gRNA的宿主细胞时，可以极大提高含有特定突变的DNA病毒在总量病毒中的比例，因此可以大幅减少筛选突变型DNA病毒的工作量和缩短工作周期。

综上所述，本发明能够高效地实现DNA病毒基因组进行定点的特异性改造，特异性地控制诱导突变的类型，并能够快速方便地筛选获得具有特定突变类型的重组病毒，突变类型的随机性降低，能更安全地应用于：特异性敲除DNA病毒的特定基因；标记病毒特定蛋白，研究病毒感染过程中，特定病毒蛋白的表达时序以及定位状况，并可以作为实时监测病毒感染过程的标记物；在特定基因非编码序列进行特异性的碱基插缺或突变，改变特定基因的表达效率。实现在筛选病毒减毒疫苗株、构建病毒性基因载体和溶瘤病毒、研究病毒功能序列等的应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明的产脓链球菌Cas9核酸酶切割原理中产脓链球菌Cas9蛋白结构域分布示意图；

图2是本发明的产脓链球菌Cas9核酸酶切割原理中Cas9核酸酶结构域切割双链DNA原理示意图；

图3是本发明的实施例1中P0、P1和P2病毒的XbaI内切酶限制性片段长度多态性实验检测结果图；

图4是本发明得到的具有特异性突变的子代病毒的深度测序结果图，图中包含了实施例1、实施例4、实施例5和实施例6的深度测序结果，黑色柱体表示突变病毒所占子代病毒的总比例，白色柱体表示特异性插入TCTAGA的突变体所占子代病毒的比例；

图5是本发明的实施例2中不同每孔中不同转染剂量下插缺突变率的SUVEYOR测试结果图，图中“μg/well”代表每孔中的转染剂量；

图6是本发明实施例3得到的病变细胞的SUVEYOR检测结果图；

图7是实施例3中的PCR产物测序结果举例。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例采用表达水母增强型绿色荧光蛋白的腺病毒ADV-EGFP，该病毒采用安捷伦公司的AdEasy系统构建。病毒经过扩增纯化后，分装储存于深低温冰箱保存待用，避免反复冻融。取出一份储存病毒，通过嗜斑法检测病毒ADV-EGFP滴度，滴度约为2x10⁸PFU/ml，以便于知道感染的moi（每个细胞感染的病毒数——感染复数）。

一种特异性的DNA病毒基因组定点改造及筛选方法，是通过以下步骤实现的：

步骤一，构建定点切割的单链核酸酶系统，具体地构建规律性重复短回文序列簇相关系统

（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR）associated system,Cas），简称CRISPR/Cas系统，其属于RGN，具体如下：将AG335质粒经过BbsI酶切、纯化后，利用T4 DNA ligase（NEB）连入经P069（5’-CAC CGC TGA AGC ACT GCA CGC CGT-3’）和P070（5’-AAA CAC GGC GTGCAG TGC TTC AGC-3’）两条合成引物退火后形成的双链插入序列，构建质粒pCW180；

以及将AG230质粒经过BbsI酶切、纯化后，利用T4DNA ligase（NEB）连入经P069和P070两条合成引物退火后形成的双链插入序列，构建质粒pCW175。构建后的质粒通过测序进行鉴定。

步骤二，以pEGFP-N2（美国国立卫生院基因库的登录号（GeneBankAccession）：U57608）的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）编码基因通过KpnI和NotI转移至pShuttle-CMV载体（安捷伦科技（Agilent Technologies），#240007），构建质粒pCW152，为了在EGFP基因内插入一个XbaI位点，以pCW152为模板，W340（5’-GGT CTA TAT AAG CAG AGC TGG TTT AG-3’）和W341（5’-CGC TCT AGA CGT AGG TCA GGG TGG TC-3’）为引物，PCR扩增获得片段F1，同时以W342（5’-ACG TCT AGA GCG TGC AGT GCT TCA G-3’）和W343（5’-GTG GTA TGG CTG ATT ATG ATC AG-3’）为引物，PCR扩增获得片段F2，将KpnI和XbaI酶切后的F1以及XbaI和XhoI酶切后的F2共同连入经过KpnI和XhoI酶切后的pShuttle-CMV质粒，构建含有同源序列的供体质粒pCW270。构建后的质粒通过测序验证。

步骤三，将人胚肾细胞293FT接种于6孔细胞培养板上，接种密度为6×10⁵个细胞/孔，置于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养，接种20小时后，进行DNA转染，按照脂质体lipofectamine 2000（Invitrogen）使用说明，毎孔转染1.5μg步骤一得到的pCW180质粒DNA和1.5μg步骤二得到的pCW270与7.5μLLipofectamine 2000转染试剂混合后，转染人胚肾细胞293FT，24小时后，得到转染后的人胚肾细胞293FT；

步骤四，经步骤三处理后，向细胞培养板的每个孔中感染ADV-EGFP病毒40μL（感染复数MOI约为10），吸附病毒2h后，吸去病毒液，用PBS洗2次，加入2ml含2%胎牛血清的DMEM维持液，置于37℃、5%CO₂的培养箱中继续培养约36h，得病变人胚肾细胞293FT；

步骤五，收集步骤四得到的病变人胚肾细胞和上清，将细胞反复冻融2次，离心，收集上清，分装，冻存于-80℃，得子代病毒收获液P1，标记为P1病毒；

步骤六，将人胚肾细胞293FT接种于6孔细胞培养板上，接种密度为6×10⁵个细胞/孔，置于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养，接种20小时后，进行DNA转染，按照脂质体lipofectamine 2000（Invitrogen）使用说明，毎孔转染2μg步骤一得到的pCW175质粒DNA与5μL Lipofectamine 2000转染试剂混合后，转染人胚肾细胞293FT，24小时后，得到转染后的人胚肾细胞293FT；

步骤七，经步骤六处理后，向细胞培养板的每个孔中感染步骤五得到的子代病毒收获液P1 100μL，吸附病毒2h后，吸去病毒液，用PBS洗2次，加入2ml含2%胎牛血清的DMEM维持液，置于37℃、5% CO₂的培养箱中继续培养约36h，得病变人胚肾细胞293FT；

步骤八，收集步骤七得到的病变人胚肾细胞293FT和上清，将细胞反复冻融2次，离心，收集上清，分装，冻存于-80℃，得子代病毒收获液P2，标记为P2病毒；

步骤九，从步骤八得到的子代病毒收获液P2中，挑取来源于单克隆的子代病毒，通过核酸测序鉴定，分离出纯化得具有XbaI酶切序列特异性插入的子代病毒；完成DNA病毒基因组的特异性定点改造及筛选方法。

其中，步骤一中所述的AG335质粒为Addgene公司的pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n（D10A）（质粒编号：42335，简称AG335），该质粒编码的Cas9蛋白第10位的天冬氨酸突变为丙氨酸。所述的AG230质粒为Addgene公司的pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9（质粒编号：42230，简称AG230）。

本实施例中采用的人胚肾细胞293FT为Invitrogen（Life Science）产品，培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养液中。

为了比较定点突变的比例，本实施例1中进行如下对比试验：

将本实施例ADV-EGFP原代病毒P0、步骤五得到的P1病毒和步骤八得到的P2病毒分别感染AD293细胞（安捷伦科技（Agilent Technologies）），感染后48小时，利用提取细胞内病毒基因组，用P075（5’-GGA TCC ACC GGC CGGTCG-3’）和P079（5’-ACG GGG CCG TCG CCG ATG G-3’）进行PCR扩增，将扩增后的PCR产物分别进行XbaI酶切鉴定，是否在EGFP基因特定位置插入了XbaI位点，利用XbaI限制性片段长度多态性实验检测本发明精确引入特异性突变的效率，结果如图3所示，在P0病毒感染后的子代病毒中，没有检测到含有XbaI位点的病毒，在P1病毒感染后的子代病毒中，含有突变病毒的比例约为1.2%,而P2病毒感染后的子代病毒中，含有XbaI位点插入的突变病毒，其比例增加为20.3%。图3中，ADV-EGFP为表达绿色荧光蛋白的重组腺病毒。

本实施例1中还对P1病毒感染AD293细胞后的子代病毒突变区域利用罗氏公司的454测序仪进行深度测序（deep sequencing），测序结果如图4中所示。

实施例2

定点切割单链核酸酶系统导入细胞的浓度对产生插缺突变的影响

本实施例采用表达水母增强型绿色荧光蛋白的腺病毒ADV-EGFP，该病毒采用安捷伦公司的AdEasy系统构建。病毒经过扩增纯化后，分装储存于深低温冰箱保存待用，避免反复冻融。取出一份储存病毒，通过嗜斑法检测病毒ADV-EGFP滴度，滴度约为2x10⁸PFU/ml，以便于知道感染的moi（每个细胞感染的病毒数——感染复数）。

步骤一，构建定点切割的单链核酸酶系统，具体地构建规律性重复短回文序列簇相关系统

（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR）associated system,Cas），简称CRISPR/Cas系统，其属于RGN，具体如下：将AG335质粒经过BbsI酶切、纯化后，利用T4 DNA ligase（NEB）连入P065（5’-CAC CGT GAA CCG CAT CGA GCT GAA-3’）和P066（5’-AAA CTT CAG CTC GAT GCGGTT CAC-3’）两条合成引物退火后形成的双链插入序列，构建质粒pCW178；或者连入经P069（5’-CAC CGC TGA AGC ACT GCA CGC CGT-3’）和P070（5’-AAACAC GGC GTG CAG TGC TTC AGC-3’）两条合成引物退火后形成的双链插入序列，构建质粒pCW180。

步骤二，将人胚肾细胞293FT接种于6孔细胞培养板上，接种密度为6×10⁵个细胞/孔，置于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养，接种20小时后，进行DNA转染，按照脂质体lipofectamine 2000（Invitrogen）使用说明，毎孔分别转染1μg、2μg、3μg及4μg AG335或者步骤一得到的pCW178或者pCW180质粒DNA，与适量的Lipofectamine 2000转染试剂混合后（质粒质量与转染试剂体积之比为1μg:2.5μL），转染人胚肾细胞293FT，24小时后，得到转染不同浓度质粒DNA后的人胚肾细胞293FT，其中转染AG335的后的人胚肾细胞293FT记为Ⅰ，转染pCW178后的人胚肾细胞293FT记为Ⅱ，转染pCW180后的人胚肾细胞293FT记为Ⅲ，转染1μg质粒DNA的记为1，转染2μg质粒DNA的记为2，转染3μg质粒DNA的记为3，转染4μg质粒DNA的记为4，即转染1μg AG335后的人胚肾细胞293FT记为Ⅰ-1，依次类推即可；

步骤三，经步骤二处理后，向细胞培养板的每个孔中感染ADV-EGFP病毒40μL（感染复数MOI约为10），吸附病毒2h后，吸去病毒液，用PBS洗2次，加入2ml含2%胎牛血清的DMEM维持液，置于37℃、5%CO₂的培养箱中继续培养约36h，得病变人胚肾细胞293FT；

步骤四，分别提取病变细胞Ⅰ-1、2、3、4，Ⅱ-1、2、3、4，和Ⅲ-1、2、3、4中的病毒基因组，用P075（5’-GGA TCC ACC GGC CGG TCG-3’）和P079（5’-ACG GGG CCG TCG CCG ATG G-3’）进行PCR扩增，将扩增后的PCR产物分别进行SURVEYOR检测。分别得到单链缺口酶Cas9n在无gRNA、gRNA173以及gRNA175指导下切割病毒基因组DNA后产生的插缺突变率，如图5所示。

由图5可以得出，单链缺口酶Cas9n切割病毒基因组DNA后是否产生插缺突变依赖于转染剂量。过高浓度的CRISPR-Cas9n系统转入细胞内，会产生非特异的插缺突变，不同的Cas9n:gRNA组合切割效率会不同，一般而言一个35mm的培养皿（约6x10⁵个293FT细胞），携带CRISPR-Cas9n系统的质粒DNA的转染量不超过2μg。

实施例3 对比实验

野生型Cas9切割病毒基因组双链DNA，通过以下步骤实现：

步骤一，将AG230质粒经过BbsI酶切、纯化后，利用T4DNA ligase（NEB）连入经P069（5’-CAC CGC TGA AGC ACT GCA CGC CGT-3’）和P070（5’-AAACAC GGC GTG CAG TGC TTC AGC-3’）两条合成引物退火后形成的双链插入序列，构建质粒pCW175；质粒pCW175经过无内毒素质粒大提试剂盒提取后备用；

步骤二，将人胚肾细胞293FT接种于6孔细胞培养板上，接种密度为6×10⁵个细胞/孔，24小时后，根据脂质体lipofectamine 2000（Invitrogen）使用说明，毎孔转染2μg质粒AG230或质粒pCW175，转染24小时，得到转染后的人胚肾细胞293FT；

步骤三，经步骤二处理后，向细胞培养板的每个孔中感染ADV-EGFP病毒，感染复数moi=1，37℃吸附两小时后，吸去病毒液，PBS洗两次后，加入2mL含有2%胎牛血清的DMEM维持液，放入37℃、体积分数为5%CO₂的培养箱培育36h，直到细胞病变，得到病变人胚肾细胞293FT；

步骤四，分别提取病变细胞中的病毒基因组，用P075（5’-GGA TCC ACC GGCCGG TCG-3’）和P079（5’-ACG GGG CCG TCG CCG ATG G-3’）进行PCR扩增，将扩增后的PCR产物分别进行SURVEYOR检测。分别得到野生型双链Cas9在无gRNA以及gRNA175指导下切割病毒基因组DNA的插缺突变率。检测结果如图6所示。与图5比较，分析图6可知，在相同的转染浓度下，本实施例3中ADV-EGFP病毒经过Cas9切割后，产生大量的插缺突变。

将本实施例3中的这些PCR产物连入T载体后进行测序，测序结果如图7所示，可以观察到不同的突变类型（D1、D2、D3、D5、+6等），括号里是测序检测到的突变个数，说明突变类型非常多样。

实施例4

本实施例4与实施例1不同的是，步骤一中构建pCW178代替pCW180，其余步骤中凡是采用pCW180的地方均由pCW178代替。其中，pCW178的构建方式如下：将AG335质粒经过BbsI酶切、纯化后，利用T4DNA ligase（NEB）连入经P065（5’-CAC CGT GAA CCG CAT CGA GCT GAA-3’）和P066（5’-AAA CTT CAGCTC GAT GCG GTT CAC-3’）两条合成引物退火后形成的双链插入序列，构建质粒pCW178。

本实施例4中对P1病毒感染AD293细胞后的子代病毒突变区域利用罗氏公司的454测序仪进行深度测序，测序结果如图4中所示。

实施例5  采用2个单链核酸酶系统Ⅰ进行转染细胞

本实施例5与实施例1不同的是步骤一和步骤三的操作，其余步骤与实施例1相同。其中，步骤一操作如下：构建定点切割的单链核酸酶系统，具体地构建规律性重复短回文序列簇相关系统

（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR）associated system,Cas），简称CRISPR/Cas系统，其属于RGN，具体如下：将AG335质粒经过BbsI酶切、纯化后，利用T4DNA ligase（NEB）连入经P069（5’-CAC CGC TGA AGC ACT GCA CGC CGT-3’）和P070（5’-AAA CAC GGC GTGCAG TGC TTC AGC-3’）两条合成引物退火后形成的双链插入序列，构建质粒pCW180；构建质粒pCW178的过程如下：将AG335质粒经过BbsI酶切、纯化后，利用T4DNA ligase（NEB）连入经P065（5’-CAC CGT GAA CCG CAT CGA GCT GAA-3’）和P066（5’-AAA CTT CAG CTC GAT GCG GTT CAC-3’）两条合成引物退火后形成的双链插入序列，构建质粒pCW178。

步骤三的操作如下：将人胚肾细胞293FT接种于6孔细胞培养板上，接种密度为6×10⁵个细胞/孔，置于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养，接种20小时后，进行DNA转染，按照脂质体lipofectamine 2000（Invitrogen）使用说明，毎孔转染1μg步骤一得到的pCW180质粒DNA、1μg步骤一得到的pCW178质粒DNA和1μg步骤二得到的pCW270与7.5μL Lipofectamine 2000转染试剂混合后，转染人胚肾细胞293FT，24小时后，得到转染后的人胚肾细胞293FT；

其余步骤按实施例1中所述方式操作，得到具有特异性突变的子代病毒。

本实施例5中对P1病毒感染AD293细胞后的子代病毒突变区域利用罗氏公司的454测序仪进行深度测序，测序结果如图4中所示。

实施例6

本实施例6与实施例1不同的是步骤一和步骤三的操作，其余步骤与实施例1相同。其中，步骤一操作如下：构建定点切割的双链核酸酶系统，具体如下：将AG230质粒经过BbsI酶切、纯化后，利用T4DNA ligase（NEB）连入经P069（5’-CAC CGC TGA AGC ACT GCA CGC CGT-3’）和P070（5’-AAA CAC GGCGTG CAG TGC TTC AGC-3’）两条合成引物退火后形成的双链插入序列，构建质粒pCW175；质粒pCW175经过无内毒素质粒大提试剂盒提取后备用；

步骤三的操作如下：将人胚肾细胞293FT接种于6孔细胞培养板上，接种密度为6×10⁵个细胞/孔，置于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养，接种20小时后，进行DNA转染，按照脂质体lipofectamine 2000（Invitrogen）使用说明，毎孔转染1.5μg步骤一得到的pCW175质粒DNA和1.5μg步骤二得到的pCW270与7.5μL Lipofectamine 2000转染试剂混合后，转染人胚肾细胞293FT，24小时后，得到转染后的人胚肾细胞293FT；

其余步骤按实施例1中所述方式操作，得到具有多种类型突变的子代病毒。

本实施例6中对P1病毒感染AD293细胞后的子代病毒突变区域利用罗氏公司的454测序仪进行深度测序，测序结果如图4中所示。

通过图4可知，病毒基因组在不同切割策略下，精确控制突变类型的能力不同，实施例1和实施例4的精确控制突变能力强，突变类型全部为精确插入XbaI位点的突变体，精确控制突变能力达到100%；而实施例5的2个单链切割的效果没有实施例1和实施例4的好，分析认为实施例5中采用的质粒pCW180和质粒pCW178的插入位点太相近的原因导致精确控制突变能力稍差，选择两个插入位点远一些的切割系统的精确控制突变能力会更好；而实施例6的改造方法的精确控制突变能力是最差的。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种特异性的DNA病毒基因组定点改造及筛选方法，其特征在于：是通过以下步骤实现的：

步骤一，构建定点切割的核酸酶系统：构建至少一个包含导向功能的分子和具有定点切割单链DNA活性的蛋白核酸酶系统Ⅰ，以及包含导向功能的分子和具有定点切割双链DNA活性的蛋白核酸酶系统Ⅱ；

步骤二，构建包含有特异性突变、缺失或插入序列的同源序列；

步骤三，将步骤一构建的蛋白核酸酶系统Ⅰ和步骤二构建的同源序列共同转染细胞，得到转染细胞，其中，控制细胞数量与表达核酸酶系统Ⅰ的质量之间的比例为1×10⁵:0.1-2μg，控制细胞数量与同源序列的质量之间的比例为1×10⁵:0.1-2μg；

步骤四，向经步骤三处理后的细胞培养板的每个孔中加入病毒液，吸附，然后吸去病毒液，再加入细胞维持液，培育至细胞病变，得到病变细胞Ⅰ；

步骤五，收集步骤四得到的病变细胞Ⅰ和/或上清，冻融或超声处理后，离心去除细胞碎片，所得上清即为子代病毒收获液P1；

步骤六，将步骤一中构建的蛋白核酸酶系统Ⅱ转染细胞，得到转染细胞，其中，控制细胞数量与蛋白核酸酶系统Ⅱ的质量之间的比例为1×10⁵:0.1-2μg；

步骤七、向经步骤六处理后的细胞培养板的每个孔中加入步骤五得到的子代病毒收获液P1，吸附，然后吸去病毒液，再加入细胞维持液，培育至细胞病变，得到病变细胞Ⅱ；

步骤八，收集步骤七得到的病变细胞Ⅱ和/或上清，冻融或超声处理后，离心去除细胞碎片，所得上清即为子代病毒收获液P2；

步骤九，从步骤八得到的子代病毒收获液P2中，挑取来源于单克隆的子代病毒，通过核酸测序鉴定，分离出纯化得具有特异性突变的子代病毒；完成DNA病毒基因组的特异性定点改造及筛选方法。

2.根据权利要求1所述的一种特异性的DNA病毒基因组定点改造及筛选方法，其特征在于：将上述步骤九得到的具有特异性突变的子代病毒，通过任选嗜斑法或有限稀释法之一，挑取来源于单克隆的子代病毒，通过核酸测序鉴定，获得改造后的目的重组病毒。

3.根据权利要求1或2所述的一种特异性的DNA病毒基因组定点改造及筛选方法，其特征在于：步骤一中构建的核酸酶系统是DNA形式、病毒载体形式、蛋白和RNA复合物形式、编码RNA形式或者非编码RNA形式之一。

4.根据权利要求3所述的一种特异性的DNA病毒基因组定点改造及筛选方法，其特征在于：步骤一中所述核酸酶系统Ⅰ是突变后的切割单链DNA的RNA导向核酸酶系统、切割单链的锌指核酸酶系统、或切割单链的转录激活因子样效应物核酸酶系统之一。

5.根据权利要求3所述的一种特异性的DNA病毒基因组定点改造及筛选方法，其特征在于：步骤一中所述核酸酶系统Ⅱ是切割双链DNA的RGN系统，或者成对的切割双链DNA的TALEN或ZFn系统之一。

6.根据权利要求1或2所述的一种特异性的DNA病毒基因组定点改造及筛选方法，其特征在于：步骤一中构建属于RGN系统的规律性重复短回文序列簇相关系统，即CRISPR/Cas系统，分别利用AG335和AG230质粒进行构建的过程如下：将质粒酶切、纯化后，再利用连接酶连入插入序列，构建获得编码CRISPR/Cas系统的新质粒。

7.根据权利要求1或2所述的一种特异性的DNA病毒基因组定点改造及筛选方法，其特征在于：步骤二中所述同源序列是两端与目标序列相同，大于50个碱基对或大于50个核苷酸，其间插入需要改造的目的序列，所述目的序列是线性、环状双链DNA或者是单链DNA，通过核酸合成或PCR以及工程菌扩增等基因工程的方法获得并纯化。

8.根据权利要求1或2所述的一种特异性的DNA病毒基因组定点改造及筛选方法，其特征在于：步骤三和步骤四的操作顺序颠倒，或者步骤三和步骤四的操作同时进行。

9.根据权利要求1或2所述的一种特异性的DNA病毒基因组定点改造及筛选方法，其特征在于：步骤六和步骤七的操作顺序颠倒，或者步骤六和步骤七的操作同时进行。

10.根据权利要求1或2所述的一种特异性的DNA病毒基因组定点改造及筛选方法，其特征在于：多次重复循环操作步骤一至步骤五；或者多次重复循环操作步骤六至步骤九，且每次重复的切割位点相同或者不同。

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