ES2567417T3

ES2567417T3 - Inducción de las omisiones de exón en las células eucariotas

Info

Publication number: ES2567417T3
Application number: ES12198517.0T
Authority: ES
Inventors: Garrit-Jan Boudewijn Van Ommen; Judith Christina Theodora Van Deutekom; Johannes Theodorus Den Dunnen
Original assignee: Leids Universitair Medisch Centrum LUMC
Current assignee: Leids Universitair Medisch Centrum LUMC
Priority date: 2000-09-21
Filing date: 2001-09-21
Publication date: 2016-04-22
Anticipated expiration: 2021-09-21
Also published as: EP2594642A1; EP2636742B1; DK2940139T3; JP2018052981A; AU2002211062B2; AU2011201325A1; ES2581285T3; US20030235845A1; LT2284264T; US20140350076A1; CA2423044C; EP2636742A1; DK2602322T3; EP2594640A1; WO2002024906A1; CY1119026T1; DK2594642T3; EP1619249B2; CY1109601T1; ATE409224T2

Abstract

Un oligonucleótido antisentido dirigido contra el interior del exón 53 de pre-mARN de distrofina humana, que facilita el enmascarado de dicho exón para el aparato de empalme y la exclusión de ducho exón de mARN final.

Description

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DESCRIPCION

Induccion de las omisiones de exon en las celulas eucariotas

Considerando los rapidos avances de la investigacion del genoma humano, los profesionales y la sociedad esperan que el futuro proximo nos traera - ademas de la comprension de mecanismos de enfermedad y diagnosticos afinados y confiables - tambien terapias para muchas enfermedades geneticas devastadoras.

Aunque se espera que para algunas enfermedades (por ejemplo, metabolicas) el avance en los conocimientos traera terapias de pequenas moleculas facilmente administrables, es probable que en la mayor parte de los casos sera por ultimo requerida una u otra forma de terapia genica, es decir la correccion, adicion o el reemplazo del producto genico defectuoso.

En los ultimos anos, la investigacion y el desarrollo en este campo ha destacado varias dificultades tecnicas que tienen que ser superadas, por ejemplo, lo relacionado con el gran tamano de muchos genes implicados en enfermedades geneticas (limitando la eleccion de sistemas convenientes para administrar el gen terapeutico), la accesibilidad del tejido en el cual el gen terapeutico debe funcionar (requiriendo el diseno de tecnicas de reconocimiento espedficas, ffsicamente por inyeccion restringida o biologicamente, desarrollando sistemas con afinidades espedficas de tejido) y la seguridad frente al paciente del sistema de administracion. Estos problemas estan hasta cierto punto interrelacionados y puede ser concluido de forma general que cuanto mas pequeno sea el agente terapeutico, mas facil sera desarrollar sistemas de administracion eficientes, dirigibles y seguros.

La presente invencion se refiere a este problema mediante la induccion de las llamadas omisiones de exon en las celulas. Las omisiones de exon dan como resultado un mARN maduro que no contiene el exon omitido y asf, cuando dicho exon codifica para aminoacidos puede conducir a la expresion de un producto modificado. La tecnologfa de omision de exon se dirige actualmente hacia el uso de los denominados 'oligonucleotidos antisentido' (ONA). La mayor parte de este trabajo se hace en el modelo de raton mdx para la distrofia muscular de Duchenne (DMD). El raton mdx, que lleva una mutacion sin sentido en el exon 23 del gen de la distrofina, ha sido usado como un modelo animal de la distrofia muscular de Duchenne (DMD). A pesar de la mutacion mdx, que debena impedir la smtesis de una protema de distrofina funcional, rara y que se da naturalmente, se han observado fibras con niveles positivos de distrofina en el tejido muscular mdx. Se piensa que estas fibras distrofina-positivas se han generado de un mecanismo de omision de exon aparentemente natural, debido a mutaciones somaticas o por empalme alternativo. Los ONA dirigidos, respectivamente, a los sitios de empalme 3' y 5' de los intrones 22 y 23 en pre-mARN de distrofina, se ha demostrado que interfieren con factores normalmente implicados en la eliminacion del intron 23 de modo que tambien el exon 23 fue eliminado del mARN (Wilton, 1999). En un estudio similar, Dunckley et al. (1998) mostraron que la omision de exon usando ONA dirigidos a los sitios de empalme 3' y 5' puede tener resultados inesperados. Ellos observaron la falta de no solo el exon 23 sino tambien de los exones 24-29 causando asf un mARN que contema una union del 30 exon - exon 22. No se conoce el mecanismo subyacente para la aparicion de la variante de empalme 22-30 inesperada. Podna ser debido a que los sitios de empalme contienen secuencias consenso que conducen a una hibridacion promiscua del oligo usado para dirigir la omision de exon. La hibridacion del oligo a otros sitios de empalme que los sitios del exon que se omite podna interferir facilmente por supuesto con la exactitud del proceso de empalme. Por otra parte, podna carecerse de exactitud debido a que tienen que ser usados los dos oligos (para el sitio de empalme 5' y 3'). El pre-mARN que contiene uno pero no el otro oligo podna tender a variantes de empalme inesperadas. Para superar estos y otros problemas la presente divulgacion proporciona un metodo para dirigir el empalme de un pre-mARN en un sistema capaz de realizar una operacion de empalme que comprende poner en contacto dicho pre-mARN en dicho sistema con un agente capaz de inhibir expresamente una senal de inclusion de exon de al menos un exon en dicho pre-mARN, comprendiendo ademas dicho metodo permitir el empalme de dicho pre-mARN. La interferencia con una senal de inclusion de exon (SIE) tiene la ventaja de que tales elementos se localizan dentro del exon. Proporcionando un oligo antisentido para el interior del exon que se omite, es posible interferir con la senal de inclusion de exon enmascarando asf con eficacia el exon del aparato de empalme. El fallo del aparato de empalme para reconocer al exon que falta conduce asf a la exclusion del exon del mARN final. La presente divulgacion no interfiere directamente con el proceso enzimatico de la maquinaria de empalme (la union de los exones). Se piensa que esto permite que el metodo sea mas robusto y fiable. Se piensa que una SIE es una estructura particular de un exon que permite empalmar al aceptador y al donador para asumir una conformacion espacial particular. En este concepto, es la conformacion espacial particular la que permite que la maquinaria de empalme reconozca el exon. Sin embargo, la divulgacion no se limita ciertamente a este modelo. Se ha encontrado que los agentes capaces de unirse a un exon pueden inhibir a una SIE. Pueden ponerse en contacto expresamente agentes con dicho exon en cualquier punto y ser capaces todavfa de inhibir expresamente dicha SIE. Dicho mARN puede ser util por sf mismo. Por ejemplo, la produccion de una protema no deseada puede ser, al menos en parte, reducida inhibiendo la inclusion de un exon requerido en el mARN. Preferentemente, un metodo de la invencion comprende ademas permitir la traduccion del mARN producido a partir del empalme de dicho pre-mARN. Preferentemente, dicho mARN codifica una protema funcional. En una realizacion preferida, dicha protema comprende dos o mas dominios, en la que al menos uno de dichos dominios es codificado por dicho mARN como resultado de omitir al menos parte de un exon en dicho pre-mARN. La omision del exon tfpicamente, aunque no sea necesariamente de importancia para las protemas en la configuracion tipo silvestre, teniendo al menos dos dominios funcionales que cada uno realiza una funcion, en el que dichos dominios se generan a partir de partes distintas de la secuencia de aminoacidos primaria. Un ejemplo es, por ejemplo, los

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factores de transcripcion. Tfpicamente, estos factores comprenden un dominio de union de ADN y un dominio que se relaciona con otras protemas en la celula. La omision de un exon que codifica una parte de la secuencia de aminoacidos primaria que esta entre estos dos dominios puede conducir a una protema mas corta que comprenda la misma funcion, al menos en parte. Asf, las mutaciones perjudiciales en esta region intermediaria (por ejemplo, mutaciones de cambio de marco o de terminacion) pueden ser, al menos en parte, reparadas induciendo la omision de exon para permitir la smtesis de la protema funcional mas corta (en parte). Usando un metodo de la invencion tambien es posible inducir la omision parcial del exon. En esta realizacion, dicha puesta en contacto causa la activacion de un sitio de empalme cnptico en un exon puesto en contacto. Esta realizacion aumenta el potencial para la manipulacion del pre-mARN conduciendo a una protema funcional. Preferentemente, dicho sistema comprende una celula. Preferentemente, dicha celula es cultivada in vitro o en el organismo in vivo, tfpicamente aunque no necesariamente dicho organismo comprende a un ser humano o a un raton.

En una realizacion preferida la divulgacion proporciona un metodo para al menos en parte disminuir la produccion de una protema aberrante en una celula,

comprendiendo dicha celula pre-mARN que comprende exones que codifican dicha protema, comprendiendo el metodo

proporcionar a dicha celula un agente capaz de inhibir espedficamente una senal de omision de un exon de al menos uno de dichos exones,

comprendiendo ademas el metodo permitir la traduccion de mARN producido del empalme de dicho pre-mARN.

Puede usarse para la presente divulgacion cualquier agente capaz de inhibir espedficamente una senal de exclusion de exon. Preferiblemente dicho agente comprende un acido nucleico o su equivalente funcional. Preferiblemente, pero no necesariamente, dicho acido nucleico esta en una forma de cadena sencilla. El acido nucleico peptfdico y otras moleculas que comprenden las mismas caractensticas de union del acido nucleico en tipo, no necesariamente en cantidad, son equivalentes adecuados. El acido nucleico o su equivalente puede comprender modificaciones que proporcionen una funcionalidad adicional. Por ejemplo, pueden usarse 2'-O-metil-oligo-ribonucleotidos. Estos ribonucleotidos son mas resistentes frente a la accion de RNAsa que los oligonucleotidos convencionales.

En una realizacion preferida de la invencion, dicha senal de inclusion del exon es interferida por un acido nucleico anti-sentido dirigido a una secuencia de reconocimiento de exon (SRE). Estas secuencias son relativamente ricas en purina y pueden ser distinguidas escudrinando la informacion de la secuencia del exon que se omite (Tanaka et al., 1994 Mol Cell Biol. 14: p. 1347-1354). Se piensa que las secuencias de reconocimiento de exon ayudan a la inclusion en el mARN de los llamados exones debiles (Achsel et al., 1996; J. Biochem. 120; p. 53-60). Estos exones debiles comprenden, por ejemplo, sitios de empalme 5' y/o 3' que son menos eficazmente reconocidos por la maquinaria de empalme. En la presente invencion se ha encontrado que la omision del exon tambien puede ser inducida en los llamados exones fuertes, es decir, exones que son normalmente reconocidos eficazmente por la maquinaria de empalme de la celula. A partir de cualquier secuencia dada es (casi) siempre posible predecir si la secuencia comprende supuestos exones y determinar si estos exones son fuertes o debiles. Existen varios algoritmos para determinar la fuerza de un exon. Un algoritmo util puede ser encontrado en el servidor de prediccion de sitios de empalme NetGene2 (Brunak, et al., 1991; J Mol Biol 220: p. 49-65). La omision del exon por los medios de la invencion puede ser inducida en (casi) todo exon, independiente de si dicho exon es un exon debil o un exon fuerte y tambien independientemente de si dicho exon comprende una SRE. En una realizacion preferida, un exon que es reconocido para la omision es un exon fuerte. En otra realizacion preferida, un exon reconocido para la omision no comprende a una SRE.

Los metodos de la invencion pueden ser usados desde muchos puntos de vista. En una realizacion, se usa un metodo de la divulgacion para disminuir, al menos en parte, la produccion de una protema aberrante. Tales protemas pueden ser, por ejemplo, onco-protemas o protemas virales. En muchos tumores no solo la presencia de una onco-protema sino tambien el nivel relativo de expresion han sido asociados al fenotipo de la celula tumoral. Del mismo modo, no solo la presencia de protemas virales sino tambien la cantidad de la protema viral en una celula determinan la virulencia de un virus particular. Ademas, para una multiplicacion eficiente y extendida de un virus el tiempo de respuesta de expresion en el ciclo vital y el balance en la cantidad de ciertas protemas virales en una celula determina si los virus son eficazmente o ineficazmente producidos. Utilizando un metodo de la divulgacion es posible reducir la cantidad de protema aberrante en una celula tal que, por ejemplo, una celula tumoral se hace menos tumorigenica (metastasica) y/o una celula infectada de un virus produce menos virus.

En una realizacion preferida, se usa un metodo de la divulgacion para modificar dicha protema aberrante en una protema funcional. En una realizacion, dicha protema funcional es capaz de realizar una funcion de una protema normalmente presente en una celula, pero ausente en las celulas que se tratan. Muy a menudo incluso la restauracion parcial de la funcion causa un comportamiento considerablemente mejor de la celula asf tratada. Debido al mejor comportamiento, tales celulas tambien pueden tener una ventaja selectiva respecto a celulas no modificadas ayudando asf a la efectividad del tratamiento.

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Este aspecto de la divulgacion es, en particular, adecuado para la restauracion de la expresion de genes defectuosos. Esto se consigue causando la omision espedfica de exones reconocidos, para asf evitar o corregir mutaciones deletereas (tipicamente mutaciones de terminacion o mutaciones de punto de desplazamiento de marco, deleciones de exon simple o multiple o inserciones que conducen a la terminacion de la traduccion).

Comparado con las estrategias de introduccion de genes, esta nueva forma de terapia genica de la modulacion del empalme requiere la administracion de reactivos terapeuticos mucho mas pequenos, tipicamente, pero no limitado a, 14-40 nucleotidos. En una realizacion preferida, son usadas moleculas de 14-25 nucleotidos ya que estas moleculas son mas faciles de producir y de entrar en la celula con mas eficacia. Los metodos de la invencion permiten mucho mas flexibilidad en el diseno subsecuente de sistemas de administracion eficaces y seguros. Una ventaja adicional importante de este aspecto de la invencion consiste en que restaura (al menos algo de) la actividad del gen endogeno, que todavfa posee la mayor parte o toda su circuitena genica reguladora, asegurando asf niveles de expresion apropiados y la smtesis de isoformas espedficas de tejido.

Este aspecto de la divulgacion puede ser, en principio, aplicado a cualquier enfermedad genetica o predisposicion genetica a la enfermedad, en la que la omision reconocida de exones espedficos restaurana el marco de lectura translacional cuando este haya sido interrumpido por la mutacion original, a condicion de que la traduccion de una protema interna ligeramente mas corta sea todavfa totalmente o parcialmente funcional. Las realizaciones preferidas para las cuales esta aplicacion puede tener valor terapeutico son: la predisposicion a segundas mutaciones de golpe en genes supresores de tumores, por ejemplo, las implicadas en el cancer de mama, cancer de colon, esclerosis tuberosa, neurofibromatosis etc., - donde la restauracion (parcial) de la actividad impedina la manifestacion de nulosomfa por segundas mutaciones de golpe y asf protegena contra la tumorigenesis. Otra realizacion preferida implica la restauracion (parcial) de productos genicos defectuosos que tienen un efecto directo que causa una enfermedad, por ejemplo, la hemofilia A (deficiencia del factor VIII de coagulacion, algunas formas de hipotiroidismo congenito (debido a la deficiencia de la smtesis de tiroglobulina) y la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), en la cual las deleciones de desplazamiento de marco, mutaciones de copias y de terminacion en el gen de distrofina ligado a X causan una degradacion del musculo severa y progresiva. La DMD es tfpicamente letal en la adolescencia tardfa o en la adultez temprana, mientras que las deleciones de no desplazamiento de marco o las copias en el mismo gen causan la distrofia muscular de Becker (DMB) de mucha menor intensidad, compatible con una esperanza de vida de entre 35-40 y normal. En la realizacion segun se aplica a DMD, la presente invencion permite la omision del exon para ampliar una delecion existente (o cambiar el producto de mARN de una copia existente) por tantos exones adyacentes como se requiera para restaurar el marco de lectura y generar una protema ligeramente acortada internamente, pero todavfa funcional. Basado en smtomas clmicos de mucha menor intensidad de pacientes con DMB con el equivalente de esta delecion inducida, la enfermedad en los pacientes con DMD tendna un curso de mucha menor intensidad despues de la terapia con ONA.

Muchas mutaciones diferentes en el gen de distrofina pueden conducir a una protema disfuncional. (Para un inventario completo vease
http://www.dmd.nl, la base de datos internacionalmente aceptada para la DMD y desordenes relacionados.) El exon preciso que se omite para generar una protema de distrofina funcional vana de mutacion a mutacion. La tabla 1 comprende una lista no restrictiva de exones que puede ser omitidos y enumera para los exones mencionados algunas mutaciones del gen de distrofina que se dan con mas frecuencia que han sido observadas en seres humanos y que pueden ser tratadas con un metodo de la invencion. La omision del exon mencionado conduce a un mutante de la protema de distrofina que comprende al menos la funcionalidad de un mutante de Becker. Asf, en una realizacion, la divulgacion proporciona un metodo en el que dicha senal de inclusion de exon esta presente en los numeros de exon 2, 8, 19, 29, 43, 44, 45, 46, 50, 51, 52 o 53 del gen de distrofina humano. La aparicion de ciertas variaciones de delecion/insercion es mas frecuente que otras. En la presente divulgacion fue encontrado que induciendo la omision del exon 46 con un medio o un metodo de la divulgacion aproximadamente pueden ser tratados el 7 % de pacientes que contienen la delecion de DMD, causando que dichos pacientes tengan fibras musculares positivas de distrofina. Induciendo la omision del exon 51, pueden ser tratados aproximadamente el 15 % de pacientes que contienen la delecion de DMD con un medio o metodo de la divulgacion. Tal tratamiento causara que el paciente tenga al menos algunas fibras positivas de distrofina. Asf, con la omision del exon 46 o 51 aproximadamente usando un metodo de la divulgacion aproximadamente pueden ser tratados el 22 % de los pacientes que contienen una delecion en el gen de distrofina. Asf, en una realizacion preferida de la divulgacion dicha senal de exclusion de exon esta presente en el exon 46 o el exon 51. En una realizacion preferida y particular dicho agente comprende una secuencia de acidos nucleicos segun hONA N° 4, hONA N° 6, hONA N° 8, hONA N° 9, ONA N° 11 y/o uno o varios de hONA N° 21-30 o una parte funcional, derivado y/o analogo de dicho hONA N°. Una parte funcional, derivada y/o analoga de dichos hONA N° comprenden la misma actividad de omision del exon en clase, en un metodo de la divulgacion, no necesariamente en cantidad.

Puede ser ventajoso inducir la omision del exon de mas de un exon en el pre-mARN. Por ejemplo, considerando la amplia variedad de mutaciones y la naturaleza fija de las longitudes del exon y la secuencia de aminoacidos flanqueante a tales mutaciones, puede darse la situacion de que para la restauracion de la funcion mas de un exon tenga que ser omitido. Un ejemplo, preferido pero no limitante, de tal caso en la base de datos de delecion de DMD es una delecion 46-50. Los pacientes que comprenden una delecion 46-50 no producen distrofina funcional. Sin embargo, puede ser generada una distrofina funcional, al menos parcialmente, induciendo la omision tanto del exon 45 como del exon 51. Otro ejemplo preferido pero no restrictivo es en pacientes que comprenden una copia del exon 2. Proporcionando un agente capaz de inhibir una SIE del exon 2, es posible omitir en parte uno o ambos exones

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dos, regenerando as^ la protema tipo silvestre, cerca de la protema omitido el exon dos truncado o doble. Otro ejemplo preferido pero no restrictivo es omitir los exones del 45 al 50. Esto genera una variante en marco tipo Becker. Esta variante tipo Becker puede ser generada para curar cualquier mutacion localizada en los exones 45, 46, 47, 48, 49, y/o 50 o sus combinaciones. En un aspecto la divulgacion proporciona por lo tanto un metodo de la divulgacion que comprende ademas proveer dicha celula con otro agente capaz de inhibir una senal de inclusion del exon en otro exon de dicho pre-mARN. Por supuesto, esta completamente dentro del ambito de la invencion usar a dos o mas agentes para la induccion de la omision del exon en pre-mARN de dos o mas genes diferentes.

En otro aspecto, la divulgacion proporciona un metodo para seleccionar a los agentes convenientes para la terapia de empalme y su validacion como agentes de omision de exon espedficos en experimentos pilotos. Se proporciona un metodo para determinar si un agente es capaz de inhibir expresamente una senal de inclusion del exon de un exon, que comprende proporcionar una celula que tiene un pre-mARN que contiene dicho exon, con dicho agente, cultivar dicha celula para permitir la formacion de un mARN a partir de dicho pre-mARN y determinar si dicho exon esta ausente en dicho mARN. En una realizacion preferida, dicho agente comprende el acido nucleico o su equivalente funcional, comprendiendo dicho acido nucleico la complementariedad a una parte de dicho exon. Los agentes capaces de inducir la omision del exon espedfica pueden ser identificados con un metodo de la divulgacion. Es posible incluir una prepantalla para agentes para la primera identificacion si dicho agente es capaz de unirse con una afinidad relativamente alta al acido nucleico que contiene el exon, preferentemente al ARN. Para este fin, se proporciona un metodo para determinar si un agente es capaz de inhibir expresamente una senal de inclusion del exon de un exon, que comprende ademas primero determinar in vitro la afinidad de union relativa de dicho acido nucleico o su equivalente funcional a una molecula de ARN que comprende dicho exon.

En otro aspecto mas, se proporciona un agente que es obtenible por un metodo de la invencion. En una realizacion preferida dicho agente comprende el acido nucleico o su equivalente funcional. Preferentemente dicho agente, cuando se usa para inducir la omision del exon en una celula, es capaz de al menos reducir en parte la cantidad de protema aberrante en dicha celula. Mas preferentemente, dicha omision del exon causa un mARN que codifica una protema que es capaz de realizar una funcion en dicha celula. En una realizacion, en particular preferida, dicho pre- mARN es derivado de un gen de distrofina. Preferentemente, dicha protema funcional comprende a una protema de distrofina mutante o normal. Preferentemente, dicha protema de distrofina mutante comprende al menos la funcionalidad de una protema de distrofina en un paciente de Becker. En una realizacion, en particular preferida, dicho agente comprende la secuencia de acidos nucleicos de hONA N° 4, hONA N° 6, hONA N° 8, hONA N° 9, hONA N° 11 y/o uno o varios de hONA N° 21-30 o una parte funcional, derivada y/o analoga de dicho hONA N°. Una parte funcional, derivada y/o analoga de dichos hONA N° comprende la misma actividad de omision de exon en clase, en un metodo de la divulgacion, no necesariamente en cantidad.

La tecnica describe muchos modos para administrar agentes a celulas. En particular, se han desarrollado extensamente metodos para administrar acidos nucleicos. El experto en la tecnica es muy capaz de determinar si un metodo de administracion es conveniente para realizar la presente invencion. En un ejemplo no restrictivo dicho metodo incluye la introduccion de un agente de la invencion en liposomas, siendo proporcionados dichos liposomas a celulas que comprenden un pre-mARN diana. Los liposomas son en particular adecuados para la administracion de acidos nucleicos a celulas. Las moleculas antisentido capaces de inducir la omision del exon pueden ser producidas en una celula bajo la administracion del acido nucleico que contiene una unidad de transcripcion que produce el ARN antisentido. Los ejemplos no restrictivos de unidades de transcripcion convenientes son ARN nuclear pequeno (SNRP) o unidades de transcripcion tARN. La invencion por lo tanto proporciona ademas un vehmulo de administracion de acidos nucleicos que comprende un acido nucleico o su equivalente funcional de la invencion capaz de inhibir una senal de inclusion de exon. En una realizacion, dicho vehmulo de administracion es capaz de expresar dicho acido nucleico de la invencion. Por supuesto, en el caso de que, por ejemplo, sean usados virus monocatenarios como vehmulo, esta completamente dentro del ambito de la invencion cuando tal virus comprende solo la secuencia antisentido de un agente de la invencion. En otra realizacion de ONA de virus monocatenarios de la divulgacion son codificados por ARN nuclear pequeno o unidades de transcripcion tARN en nucleico viral encapsulado por el virus como vehmulo. Un virus monocatenario preferido es el virus adeno-asociado.

En otra realizacion mas, la invencion proporciona el uso de un acido nucleico o un vehmulo de administracion de acidos nucleicos de la invencion para la preparacion de un medicamento. En una realizacion preferida dicho medicamento es usado para el tratamiento de una enfermedad heredada. Mas preferentemente, dicho medicamento es usado para el tratamiento de la Distrofia Muscular de Duchenne.

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1. La delecion del exon 45 es una de las mutaciones DMD mas frecuentes. Debido a esta delecion el exon 44 es empalmado al exon 46, el marco de lectura de translacion es interrumpido, y un codon de terminacion es creado en el exon 46 conduciendo a una deficiencia de distrofina. El objetivo de los inventores es inducir artificialmente la omision de un exon adicional, el exon 46, a fin de restablecer el marco de lectura y restaurar la smtesis de una protema de distrofina, ligeramente mas corta, pero en gran parte funcional, como se encuentra en los pacientes afectados de distrofia muscular de Becker de mucho de menor intensidad afectados por una delecion tanto de los exones 45 y 46.

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Figura 2. El exon 46 contiene una region rica en purina que se supone que tiene un papel potencial en la regulacion de su empalme en el pre-mARN. Una serie de oligo-ribonucleotidos antisentido (ONA) de 2'O-metil-fosforotioato sobrelapantes fue disenada dirigida a esta region rica en purina en el exon 46 de distrofina de raton. Los ONA difieren tanto en su longitud como en su secuencia. Las modificaciones qmmicas dan ONA resistentes a endonucleasas y RNAsaH dentro de las celulas musculares. Para determinar la eficacia de la transfeccion en los estudios in vitro de los inventores, los ONA conteman un grupo 5'fluoresceina que permitfa la identificacion de celulas ONA-positivas.

Figura 3. Para determinar la afinidad de union de los diferentes ONA al ARN del exon 46 diana, los inventores realizaron ensayos de cambio de movilidad de gel. En esta figura, son mostrados los cinco mONA (mONA N° 4, 6, 8, 9 y 11) con afinidad mas alta para el ARN diana. En la union de los ONA al ARN, se forma un complejo que muestra una movilidad de gel retrasada como puede ser determinado por el desplazamiento de la banda. La union de los ONA a la diana fue espedfica a la secuencia. Un mONA aleatorio, es decir, no espedfico para el exon 46, no genero un desplazamiento de la banda.

Figura 4. Los ONA espedficos de raton y humano que mostraron la afinidad de union mas alta en los ensayos de cambio de movilidad de gel fueron transfectados en cultivos de miotubo de raton y humano. (A) El analisis rT-PCR mostro un producto truncado, cuyo tamano correspondio al exon 45 directamente empalmado al exon 47, en los cultivos celulares de raton en la transfeccion con los diferentes mONA N°. 4, 6, 9, y 11. Ninguna omision del exon 46 fue detectada despues de la transfeccion con un ONA aleatorio. (B) El analisis rT-PCR en los cultivos de celula de musculo humano derivados de un individuo no afectado (C) y dos pacientes con DMD no relacionados (P1 y P2) revelo productos truncados en la transfeccion con hONA N° 4 y hONA N° 8. En el control este producto correspondio al exon 45 empalmado al exon 47, mientras que en los pacientes el tamano del fragmento correspondio al exon 44 empalmado al exon 47. No fue detectada ninguna omision del exon 46 en los cultivos de celula no transfectadas o despues de la transfeccion con hONA aleatorio. Las eficiencias mas altas de omision del exon 46 fueron obtenidas con hONA N° 8.

Figura 5. Datos de secuencia de los productos RT-PCR obtenidos de pacientes DL279.1 (correspondientes a P1 en la Figura 4), que confirmaron la delecion del exon 45 en este paciente (panel superior), y la omision adicional del exon 46 despues de la transfeccion con hONA N° 8 (panel inferior). La falta del exon 46 fue espedfica, y el exon 44 fue exactamente empalmado al exon 47 lo que restablece el marco de lectura de translacion.

Figura 6. Analisis inmunohistoqmmico del cultivo de celula de musculo del paciente DL279.1 bajo la transfeccion con hONA N° 8. Las celulas fueron sometidas a dos anticuerpos de distrofina diferentes generados contra diferentes regiones de la protema, localizadas proximas (ManDys-1, ex.-31-32) y distales (Dys-2, ex. 7779) del exon 46 diana. El panel inferior muestra la ausencia de una protema de distrofina en los miotubos, mientras que la omision inducida de hONA N° 8 del exon 46 restauro claramente la smtesis de una protema de distrofina como se detecta por ambos anticuerpos (panel superior).

Figura 7:

(A) Analisis RT-PCR del ARN aislado de cultivos de celula de musculo de control humanas tratadas con hONA N° 23, N° 24, N° 27, N° 28 o N° 29. Un producto truncado, con un tamano correspondiente al exon 50 empalmado al exon 52 fue detectado en celulas tratadas con hONA N° 23 y N° 28. El analisis de secuencia de estos productos confirmo la omision precisa del exon 51 (B). Un producto de empalme aberrante adicional fue obtenido en celulas tratadas con hONA N° 28 y N° 29. El analisis de secuencia revelo la utilizacion de un sitio de empalme cnptico en marco dentro del exon 51 que se usa en una frecuencia baja bajo el tratamiento de ONA. El producto generado, incluyo un exon 51 parcial que tambien tema un marco de lectura restaurado, confirmando asf ademas el valor terapeutico.

Figura 8

(A) Los ensayos de cambio de movilidad de gel fueron realizados para determinar la afinidad de union de los diferentes h29ONA N° para el ARN diana del exon 29. Cuando se comparaba al ARN no hibridado (ninguno), h29ONA N° 1, N° 2, N° 4, N° 6, N° 9, N° 10 y N° 11 generaban complejos con movilidades de gel inferiores, indicando su union al ARN. Un ONA aleatorio derivado del exon 19 de distrofina no genero un complejo. (B) El analisis RT-PCR del ARN aislado de cultivos de celula de musculo control humanos tratados con h29ONA N° 1, N° 2, N° 4, N° 6, N° 9, N° 10 o N° 11 revelo un producto truncado cuyo tamano correspondio al exon 28 empalmado al exon 30. Estos resultados indican que el exon 29 puede ser omitido expresamente usando los ONA dirigidos a secuencias dentro (h29ONA N° 1, N° 2, N° 4 o N° 6) o fuera (h29ONA N° 9, N° 10 o N° 11) de la SRE supuesta en el exon 29. Un producto de empalme aberrante adicional fue observado que resulto de omitir tanto el exon 28 como el exon 29 (confirmado por datos de secuencia no mostrados). Aunque este producto estuviera tambien presente en celulas no tratadas, sugiriendo que este acontecimiento de omision alternativo pueda ocurrir naturalmente, fue realzado por el tratamiento de ONA. El ONA 19, derivado del exon 19 de distrofina, no indujo la omision del exon 29 (C). La omision espedfica del exon 29 fue confirmada por datos de secuencia de los fragmentos RT-PCR truncados. Aqrn se muestra la secuencia obtenida del producto de omision del exon 29 en celulas tratadas con h29ONA N° 1.

Figura 9

(A) Analisis de RT-PCR del ARN aislado de musculos gemelos de la pierna de raton dos dfas despues de la inyeccion de 5, 10 o 20 Hg de mONA N° 4, N° 6 o N° 11. Los productos truncados, con un tamano correspondiente al exon 45 empalmado al exon 47, fueron detectados en todos los musculos tratados. Las muestras -RT, -ARN, AD- 5 1, y AD-2 fueron analizadas como controles negativos para las reacciones RT-PCR. (B) El analisis de secuencia de

los productos truncados generados por mONA N° 4 y N° 6 (y N° 11, no mostrado) confirmo la precisa omision del exon 46.

EJEMPLOS

Ejemplo de referencia 1

10 Ya que el exon 45 es uno de los exones que son delecionados con mas frecuencia en DMD, al principio los inventores se dirigieron a la induccion de la omision espedfica del exon 46 (Fig. 1). Esto producina una distrofina, en gran parte funcional, mas corta encontrada en pacientes con DMB que llevan una delecion de los exones 45 y 46. El sistema fue al principio establecido para la modulacion del empalme de pre-mARN de distrofina del gen de distrofina de raton. Mas tarde, los inventores aspiraron a trabajar con el gen de distrofina humano con la intencion de restaurar 15 el marco de lectura de translacion y la smtesis de distrofina en celulas de musculo de pacientes afectados con DMD por una delecion del exon 45.

Diseno de los rONA y hONA

Fue disenada una serie de ONA espedficos de raton y humano (rONA y hONA), dirigida a una parte interna del exon 46 que contiene una extension de secuencias ricas en purina y que se supone que tienen un supuesto papel 20 regulador en el proceso de empalme del exon 46 (Fig. 2). Para el rastreo inicial de los ONA en los ensayos de cambio de movilidad de gel (vease mas abajo), los inventores usaron oligonucleotidos de ADN no modificados (sintetizados por EuroGentec, Belgica). Para los experimentos de transfeccion real en celulas de musculo, los inventores usaron oligo-ribonucleotidos de 2'-O-metilo-fosforotioato (tambien sintetizado por EuroGentec, Belgica). Estos oligonucleotidos de ARN modificados son conocidos por ser resistentes a las endonucleasas y RNasaH, y por 25 unirse al ARN con afinidad alta. Las secuencias de aquellos ONA que fueron eficaces finalmente y que fueron aplicados en celulas de musculo in vitro son mostradas mas abajo. Los ONA correspondientes espedficos de raton y humano son muy homologos, pero no completamente identicos.

El listado de mas abajo se refiere a la forma desoxi usada para las pruebas, en los ribonucleotidos 2-O-metilo usados finalmente todas las T debenan ser lefdas como U.

30 mAON#2: 5' GCAATGTTATCTGCTT

mAON#3: 5' GTTATCTGCTTCTTCC

mAON#4: 5' CTGCTTCTTCCAGCC

mAON#5: 5' TCTGCTTCTTCCAGC

mAON#6: 5' GTTATCTGCTTCTTCCAGCC

35 mAON#7: 5' CTTTTAGCTGCTGCTC

mAON#8: 5' GTTGTTCTTTTAGCTGCTGC

mAON#9: 5' TTAGCTGCTGCTCAT

mAON#10: 5' TTTAGCTGCTGCTCATCTCC

mAON#11: 5' CTGCTGCTCATCTCC

40 hAON#4: 5' CTGCTTCCTCCAACC

hAON#6: 5' GTTATCTGCTTCCTCCAACC

hAON#8: 5' GCTTTTCTTTTAGTTGCTGC

hAON#9: 5' TTAGTTGCTGCTCTT

hAON#11: 5' TTGCTGCTCTTTTCC

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Ensayos de cambio de movilidad de gel

La eficacia de los ONA es determinada por su afinidad de union a la secuencia diana. No obstante, sin las recientes mejoras de los programas de simulacion informatica para la prediccion del plegado del ARN, es diffcil especular cual de los ONA disenados sena capaz de unirse a la secuencia diana con una afinidad relativamente alta. Por lo tanto, los inventores realizaron ensayos de cambio de movilidad de gel (segun los protocolos descritos por Bruice et al., 1997). El fragmento de ARN diana del exon 46 fue generado por la T7-transcripcion in vitro a partir de un fragmento de la PCR (amplificado a partir de mARN de musculo murino o humano utilizando un cebador sentido que contiene la secuencia del promotor T7) en presencia de 32P-CTP. La afinidad de union de los ONA individuales (0,5 pmol) para los fragmentos de transcripcion diana fue determinada por hibridacion a 37°C durante 30 minutos y la subsecuente electroforesis con gel de poliacrilamida (del 8 %). Los inventores realizaron estos ensayos para el rastreo de los ONA espedficos tanto de raton como de humano (Fig. 3). Al menos 5 ONA espedficos de raton diferentes (mONA N° 4, 6, 8, 9 y 11) y cuatro ONA espedficos de humano correspondientes (hONA N° 4, 6, 8 y 9) generaron un cambio de movilidad, demostrando su afinidad de union para el ARN diana.

Transfeccion en cultivos de celula de musculo

Fueron seleccionados los ONA espedficos del exon 46 que mostraron la afinidad de union diana mas alta en ensayos de cambio de movilidad de gel para el analisis de su eficacia en la induccion de la omision en celulas de musculo in vitro. En todos los experimentos de transfeccion, los inventores incluyeron un ONA no espedfico como un control negativo para la omision espedfica del exon 46. Como se menciona, el sistema se construyo primero en celulas de musculo de raton. Los inventores usaron tanto cultivos de mioblastos proliferantes como de miotubos pos- mitoticos (expresion de niveles mas altos de distrofina) derivados de la lmea celular de musculo de raton C2C12. Para los experimentos subsecuentes en cultivos de celula de musculo derivadas de humano, los inventores usaron cultivos de celula de musculo primarios aislados de biopsias de musculo de un individuo no afectado y dos pacientes con DMD no relacionados que llevaban una delecion del exon 45. Estos cultivos heterogeneos conteman aproximadamente el 20-40 % de celulas miogenicas. Fueron transfectados los diferentes ONA (a una concentracion de 1 HM) en las celulas usando el polfmero cationico PEI (MBI Fermentas) a una proporcion equivalente de 3. Los ONA transfectados en estos experimentos conteman un grupo 5'-fluoresceina lo que permitio a los inventores determinar las eficiencias de la transfeccion contando el numero de nucleos fluorescentes. Tfpicamente, mas del 60 % de celulas mostraron un consumo nuclear espedfico de los ONA. Para facilitar el analisis RT-PCR, el ARN fue aislado 24 horas despues de la transfeccion usando ARNzol B (CamPro Scientific, Pafses Bajos).

RT-PCR y analisis de secuencia

El ARN fue retro-transcrito usando la polimerasa de C. therm. (Roche) y un cebador inverso espedfico del exon 48. Para facilitar la deteccion de la omision del exon 46 de distrofina, el cDNA fue amplificado por dos rondas de la PCR, incluyendo una amplificacion anidada usando cebadores en los exones 44 y 47 (para el sistema humano), o los exones 45 y 47 (para el sistema de raton). En los cultivos de celulas de mioblasto y miotubo de raton, los inventores detectaron un producto truncado del cual el tamano correspondio al exon 45 directamente empalmado al exon 47 (Fig. 4). El analisis de secuencia subsecuente confirmo la omision espedfica del exon 46 de estos transcritos de distrofina de raton. La eficacia de la omision del exon fue diferente para los ONA individuales, mostrando mONA N° 4 y N° 11 las eficiencias mas altas. Siguiendo estos resultados prometedores, los inventores se concentraron en la induccion de una modulacion similar del empalme de distrofina en los cultivos de celula de musculo derivadas de humano. En consecuencia, los inventores detectaron un producto truncado en las celulas de musculo control, correspondiente al exon 45 empalmado al exon 47. De forma interesante, en las celulas de musculo derivadas del paciente fue detectado un fragmento mas corto que consistfa en el exon 44 empalmado al exon 47. La omision espedfica del exon 46 de las transcripciones de distrofina humanas fue confirmada por los datos de secuencia. Esta modulacion de empalme tanto del transcrito de distrofina de raton y humano no fue ni observada en los cultivos de celula no transfectadas, ni en los cultivos transfectados con un ONA no espedfico.

Analisis inmunohistoqmmico

Los inventores intentaron inducir la omision del exon 46 en celulas de musculo de pacientes que llevaban una delecion del exon 45, a fin de restaurar la traduccion y la smtesis de una protema de distrofina. Para detectar un producto de distrofina en la transfeccion con hONA N° 8, los dos cultivos de celula de musculo derivadas del paciente fueron sometidos a inmunocitoqmmica usando dos anticuerpos monoclonicos de distrofina diferentes (Mandys-1 y Dys2) generados contra los dominios de la protema de distrofina localizados cerca y lejos de la region diana respectivamente. El analisis fluorescente revelo la restauracion de la smtesis de distrofina en ambos cultivos de celula derivadas del paciente (Fig. 5). Aproximadamente al menos el 80 % de las fibras se tineron positivamente con distrofina en las muestras tratadas.

Los resultados de los inventores muestran, por primera vez, la restauracion de la smtesis de distrofina del gen de DMD endogeno en celulas de musculo de pacientes con DMD. Esto es una prueba del principio de viabilidad de la modulacion de reconocimiento del empalme de pre-mARN de distrofina con objetivos terapeuticos.

Ejemplo de referencia: La omision de reconocimiento del exon 51 Omision simultanea de exones de distrofina

La omision de reconocimiento del exon 51. Los inventores demostraron la viabilidad de la modulacion mediada por ONA del empalme del exon 46 de distrofina, en celulas de musculo de raton y humanas in vitro. Estas conclusiones 5 garantizaron otros estudios para evaluar los ONA como agentes terapeuticos para DMD. Ya que la mayor parte de las deleciones que causan DMD estan agrupadas en dos puntos calientes de mutacion, la omision de reconocimiento de un exon particular puede restaurar el marco de lectura en serie de pacientes con mutaciones diferentes (vease la tabla 1). El exon 51 es un interesante exon diana. La omision de este exon es terapeuticamente aplicable en pacientes que llevan deleciones que atraviesan el exon 50, los exones 45-50, exones 48-50, exones 4910 50, exon 52, y los exones 52-63, que incluye un total del 15 % de pacientes de la base de datos de los inventores de

Leiden.

Los inventores disenaron una serie de diez ONA espedficos humanos (hONA N° 21-30, vease mas abajo) dirigidos a diferentes regiones ricas en purina dentro del exon 51 de distrofina. Estas extensiones ricas en purina sugirieron la presencia de un supuesto elemento regulador del empalme del exon que los inventores pretendieron bloquear a fin 15 de inducir la eliminacion de tal exon durante el proceso de empalme. Todos los experimentos fueron realizados

segun los protocolos que se describen para omitir el exon 46 (vease mas arriba). Los ensayos de cambio de movilidad de gel fueron realizados para identificar a aquellos hONA con una afinidad de union alta para el ARN diana. Los inventores seleccionaron cinco hONA que mostraron la afinidad mas alta. Estos hONA fueron transfectados en cultivos de celula de musculo control humanas a fin de probar la viabilidad de la omision del exon 20 51 in vitro. El ARN fue aislado 24 horas despues de la transfeccion, y el cDNA fue generado usando un cebador

inverso espedfico del exon 53 o 65. La amplificacion PCR de la region diana fue realizada usando diferentes combinaciones del cebador flanqueante al exon 51. La RT-PCR y el analisis de secuencia revelaron que los inventores fueron capaces de inducir la omision espedfica del exon 51 de la transcripcion de distrofina humana. Posteriormente los inventores transfectaron dos hONA (N° 23 en 29) que se mostraron que eran capaces de inducir 25 la omision del exon en seis cultivos de celula de musculo diferentes derivados de pacientes con dMd que llevaban una de las mutaciones mencionadas anteriormente. La omision del exon 51 en estos cultivos fue confirmada por RT- PCR y analisis de secuencia (Fig. 7). Lo que es mas importante, el analisis inmunohistoqmmico, usando anticuerpos multiples generados contra diferentes partes de la protema de distrofina, mostro en todos los casos que, debido a la omision del exon 51, la smtesis de una protema de distrofina fue restaurada.

30 hONA espedficos del exon 51:

hAON#21: 5' CCACAGGTTGTGTCACCAG

hAON#22: 5' TTTCCTTAGTAACCACAGGTT

hAON#23: 5' TGGCATTTCTAGTTTGG

hAON#24: 5' CCAGAGCAGGTACCTCCAACATC

35 hAON#25: 5' GGTAAGTTCTGTCCAAGCCC

hAON#26: 5' TCACCCTCTGTGATTTTAT

hAON#27: 5' CCCTCTGTGATTTT

hAON#28: 5' TCACCCACCATCACCCT

hAON#29: 5' TGATATCCTCAAGGTCACCC

40 hAON#30: 5' CTGCTTGATGATCATCTCGTT

Omision simultanea de exones de distrofina multiples.

La omision de un exon adicional, tal como el exon 46 o el exon 51, restaura el marco de lectura para un numero considerable de diferentes mutaciones de DMD. El rango de mutaciones para las cuales esta estrategia es aplicable puede ser ampliado por la omision simultanea de mas de un exon. Por ejemplo, en pacientes con DMD con una 45 delecion del exon 46 al exon 50, solo la omision tanto de los exones flanqueantes de delecion 45 y 51 permite el reestablecimiento del marco de lectura de translacion.

Ejemplo de referencia: Omision del exon independiente de SRE.

Una mutacion en el exon 29 conduce a la omision de este exon en dos pacientes con distrofia muscular de Becker (Ginjaar et al., 2000; EJHG, volumen 8, p. 793-796). Los inventores estudiaron la viabilidad de dirigir la omision del 50 exon 29 por el reconocimiento del sitio de la mutacion por los ONA. La mutacion se localiza en una extension rica en purina que podna estar asociada a la actividad de SRE. Los inventores disenaron una serie de ONA (vease mas

abajo) dirigidos a secuencias ambas dentro (de h29ONA N° 1 a h29ONA N° 6) y fuera (de h29ONA N° 7 a h29ONA N° 11) de la supuesta SRE. Los ensayos de cambio de movilidad de gel fueron realizados (como se describe) para identificar a los ONA con afinidad mas alta para el ARN diana (Fig. 8). Posteriormente, fueron transfectados h29ONA N° 1, N° 2, N° 4, N° 6, N° 9, N° 10 y N° 11 en cultivos de miotubo humano control usando el reactivo de transfeccion 5 PEI. El ARN fue aislado 24 horas despues de la transfeccion, y el cDNA fue generado usando un cebador inverso espedfico del exon 31. La amplificacion PCR de la region diana fue realizada usando diferentes combinaciones de cebador flanqueante al exon 29. Esta RT-PCR y el analisis de secuencia subsecuente (Fig. 8 B, C) revelaron que los inventores eran capaces de inducir la omision del exon 29 del transcrito de distrofina humana. Sin embargo, los ONA que facilitaron esta omision fueron dirigidos a secuencias tanto dentro como fuera de las supuestas SRE (h29ONA 10 N° 1, N° 2, N° 4, N° 6, N° 9 y N° 11). Estos resultados sugieren que la omision del exon 29 ocurre independientemente de si el exon 29 contiene una SRE y que por lo tanto la union de los ONA al exon 29 inactivaba lo mas probablemente una senal de inclusion del exon que una SRE. Esta prueba de la omision del exon independiente de SRE puede ampliar la aplicabilidad global de esta terapia a exones sin las SRE.

h29AON#1: 5' TATCCTCTGAATGTCGCATC

15 h29AON#2: 5' GGTTATCCTCTGAATGTCGC

h29AON#3: 5' TCTGTTAGGGTCTGTGCC

h29AON#4: 5' CCATCTGTTAGGGTCTGTG

h29AON#5: 5' GTCTGTGCCAATATGCG

h29AON#6: 5' TCTGTGCCAATATGCGAATC

20 h29AON#7: 5' TGTCTCAAGTTCCTC

h29AON#8: 5' GAATTAAATGTCTCAAGTTC

h29AON#9: 5' TTAAATGTCTCAAGTTCC

h29AON#10: 5' GTAGTTCCCTCCAACG

h29AON#11: 5' CATGTAGTTCCCTCC

25 Ejemplo de referencia: Omision del exon 46 inducido por ONA in vivo en tejido de musculo murino.

Despues de los prometedores resultados en celulas de musculo cultivadas, los inventores probaron los diferentes ONA espedficos del exon 46 de distrofina de raton in vivo inyectandolos, unidos a polietilenimina (PEI), en los musculos gemelos de la pierna de ratones control. Con mONA N° 4, N° 6 y N° 11, previamente se mostro que eran eficaces en celulas de musculo de raton in vitro, los inventores fueron capaces de inducir la omision del exon 46 en 30 el tejido de musculo in vivo como se determina tanto por RT-PCR como por analisis de secuencia (Fig. 9). La omision del exon 46 in vivo era dependiente de la dosis siendo la eficiencia mas alta (hasta el 10 %) despues de la inyeccion de 20 Dg por musculo por dfa durante dos dfas subsecuentes.

Referencias

Achsel et al., 1996; J. Biochem. 120; p. 53-60.

35 Bruice T. W. y Lima, W. F. (1997) Biochemistry 36 (16): paginas 5004-5019.

Brunak et al, 1991; J Mol Biol 220: p. 49-65.

Dunckley, MG. et al. (1998) Human molecular genetics 7: paginas 1083-1090.

Ginjaar et al., 2000; EJHG, volumen 8, p. 793-796 Mann et al., 2001; PNAS, volumen 98, paginas 42-47 40 Tanaka et al, 1994 Mol Cell Biol. 14: p. 1347-1354.

Wilton SD et al. (1999) Neuromuscular disorders 9: paginas 330-338.

Los detalles y antecedentes de la Distrofia Muscular de Duchenne y las enfermedades relacionadas pueden ser encontrados en el sitio Web
http://www.dmd.nl

Tabla 1

Exon que se omite: Terapeutica para deleciones de DMD-(exones) Frecuencia en
http://www. dmd.nl (%)

2: 3-7
2

8: 3-7 4

: 4-7

: 5-7

: 6-7

43: 44 5

: 44-47

44: 35-43 8

: 45

: 45-54

45: 18-44 13

: 46-47

: 44

: 46-48

: 46-49

: 46-51

: 46-53

46: 45 7

50: 51 5

: 51-55

51: 50 15

: 45-50

: 48-50

: 49-50

: 52

: 52-63

52: 51 3

: 53

: 53-55

53: 45-52 9

: 48-52

: 49-52

: 50-52

: 52

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Aspectos y realizaciones de la divulgacion

En un primer aspecto se proporciona un metodo para dirigir el empalme de un de un pre-mARN en un sistema capaz de realizar una operacion de empalme que comprende contactar dicho pre-mARN en dicho sistema con un agente capaz de inhibir espedficamente una senal de inclusion de exon de al menos un exon en dicho pre-mARN, comprendiendo ademas dicho metodo permitir el empalme de dicho pre-mARN.

Un metodo preferido, ademas comprende permitir la traduccion de mARN producido del empalme de dicho pre- mARN.

Un metodo preferido es en donde dicho mARN codifica una protema funcional.

Un metodo preferido es en donde dicha protema comprende dos o mas dominios, en donde al menos uno de dichos dominios esta codificado por dicho mARN como resultado de la omision de al menos parte de un exon en dicho pre- mARN.

Un metodo preferido es en donde dicha puesta en contacto da como resultado la activacion de un sitio de empalme cnptico en un exon contactado.

En un segundo aspecto se proporciona un metodo para el menos en parte disminuir la produccion de una protema aberrante en una celula,

proporcionar a dicha celula un agente capaz de inhibir espedficamente una senal de inclusion de exon de al menos uno de dichos exones,

comprendiendo el metodo ademas permitir la traduccion de mARN producido del empalme de dicho pre-mARN.

Los metodos del primer y segundo aspecto son preferiblemente tales que dicha senal de inclusion de exon comprende una secuencia de reconocimiento de exon.

Los metodos del primer y segundo aspecto son preferiblemente tales que dicha senal de inclusion de exon esta presente en un exon que comprende un par dador/aceptor de empalme fuerte.

Los metodos del primer y segundo aspecto son preferiblemente tales que la traduccion da como resultado una protema de distrofina mutante o normal, mas preferiblemente en donde dicha protema de distrofina mutante es equivalente a una protema de distrofina de un paciente Becker. En este metodo preferido, dicha senal de inclusion de exon esta presente en el numero de exon 2, 8, 43, 44, 45, 46, 50, 51, 52 o 53.

Los metodos del primer y segundo aspecto son preferiblemente tales que dicho agente comprende acido nucleico o un equivalente funcional del mismo. Mas preferiblemente, dicho acido nucleico contiene entre 15-25 nucleotidos o un equivalente funcional del mismo.

Los metodos del primer y segundo aspecto son preferiblemente tales que ademas comprenden proporcionar a dicha celula otro agente capaz de inhibir una senal de inclusion de exon presente en otro exon de dicho pre-mARN.

En un tercer aspecto, se proporciona un metodo para determinar si un acido o un equivalente funcional del mismo, que comprende complementariedad a una parte de un exon, es capaz de inhibir espedficamente una senal de inclusion de dicho exon,

que comprende

proporcionar a una celula que tiene un pre-mARN que contiene dicho exon dicho acido nucleico, cultivas dicha celula para permitir la formacion de un mARN de dicho pre-mARN y determinar si dicho exon esta ausente de dicho mARN.

Un metodo preferido del tercer aspecto comprende ademas determinar in vitro la afinidad de union relativa de dicho acido nucleico o equivalente funcional del mismo a una molecula de ARN que comprende dicho exon.

En un cuarto aspecto, se proporciona un acido nucleico o un equivalente funcional del mismo obtenible por un metodo del tercer aspecto.

En un quinto aspecto, se proporciona un vehmulo de suministro de acido nucleico que comprende un acido nucleico del cuarto aspecto, o el complemento del mismo.

En un sexto aspecto, se proporciona un vehmulo de suministro de acido nucleico capaz de expresar un acido nucleico del cuarto aspecto.

En un septimo aspecto se proporciona el uso de un acido nucleico del cuarto aspecto o un vehmulo de suministro de acido nucleico del quinto o sexto aspecto, para la preparacion de un medicamento.

En un octavo aspecto, se proporciona un uso de un acido nucleico del cuarto aspecto o un vetnculo de suministro de acido nucleico del quinto o sexto aspecto, para la preparacion de un medicamento para el tratamiento de una 5 enfermedad hereditaria o predisposicion a una enfermedad.

En un noveno aspecto, se proporciona un uso de un acido nucleico o un equivalente del mismo, que comprende una senal de inclusion de exon que inhibe la calidad para la preparacion de un medicamento.

En un decimo aspecto, se proporciona un animal no humano con un acido nucleico del cuarto aspecto. Preferiblemente, el animal no humano del decimo aspecto comprende ademas un acido nucleico que codifica una 10 protema humana o un equivalente funcional de la misma. Incluso mas preferiblemente, este animal no humano

comprende ademas una mutacion silenciosa en el gen que codifica un animal homologo de dicha protema humana.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Listado de secuencias

<110> Academisch Ziekenhuis Leiden

<120> Induccion por omision de exon en celulas eucariotas

<130> P6027580EP2

<150> PCT/NL01/00697 <151>

<150> EP 00203283.7 <151>

<160> 36

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1 <211> 16 <212>ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> ONA mONA#2 espedfico de raton <400> 1

gcaatgttat ctgctt 16

<210> 2 <211> 16 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> ONA mONA#3 espedfico de raton <400> 2

gttatctgct tcttcc 16

<210> 3 <211> 15 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> ONA mONA#4 espedfico de raton <400> 3

ctgcttcttc cagcc 15

<210> 4 <211> 15 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> ONA mONA#5 espedfico de raton <400> 4

tctgcttctt ccagc 15

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<210>5 <211> 20 <212>ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> ONA mONA#6 espedfico de raton <400> 5

gttatctgct tcttccagcc 20

<210> 6 <211> 16 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> ONA mONA#7 espedfico de raton <400> 6

cttttagctg ctgctc 16

<210> 7 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> AON mAON#8 espedfico de raton <400> 7

gttgttcttt tagctgctgc 20

<210> 8 <211> 15 <212>ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> AON mAON#9 espedfico de raton <400> 8

ttagctgctg ctcat 15

<210> 9 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> AON mAON#10 espedfico de raton <400> 9

tttagctgct gctcatctcc 20

<210> 10 <211> 15 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<223> AON mAON#11 espedfico de raton

<400> 10

ctgctgctca tctcc 15

<210> 11 <211> 15 <212>ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> AON hAON#4 espedfico de humano <400> 11

ctgcttcctc caacc 15

<210> 12 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> AON hAON#6 espedfico de humano <400> 12

gttatctgct tcctccaacc 20

<210> 13 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> AON hAON#8 espedfico de humano <400> 13

gcttttcttt tagttgctgc 20

<210> 14 <211> 15 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> AON hAON#9 espedfico de humano

<400> 14

ttagttgctg ctctt 15

<210> 15 <211> 15 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> AON hAON#11 espedfico de humano <400> 15 ttgctgctct tttcc 15

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<210> 16 <211> 19 <212>ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> hONA#21 espedfico de exon 51 <400> 16

ccacaggttg tgtcaccag 19

<210> 17 <211> 21 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> hONA#22 espedfico de exon 51 <400> 17

tttccttagt aaccacaggt t 21

<210> 18 <211> 17 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> hONA#23 espedfico de exon 51 <400> 18

tggcatttct agtttgg 17

<210> 19 <211> 23 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> hONA#24 espedfico de exon 51 <400> 19

ccagagcagg tacctccaac atc 23

<210> 20 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> hONA#25 espedfico de exon 51 <400> 20

ggtaagttct gtccaagccc 20

<210> 21 <211> 19 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<223> hONA#26 espedfico de exon 51 <400> 21

tcaccctctg tgattttat 19

<210> 22 <211> 14 <212>ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> hONA#27 espedfico de exon 51

<400> 22

ccctctgtga tttt 14

<210> 23 <211> 17 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> hONA#28 espedfico de exon 51 <400> 23

tcacccacca tcaccct 17

<210> 24 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> hONA#29 espedfico de exon 51 <400> 24

tgatatcctc aaggtcaccc 20

<210> 25 <211> 21 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> hONA#30 espedfico de exon 51 <400> 25

ctgcttgatg atcatctcgt t 21

<210> 26 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> ONA h29ONA#1 espedfico humano <400> 26

tatcctctga atgtcgcatc 20

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<210> 27 <211> 20 <212>ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> ONA h29ONA#2 espedfico humano <400> 27

ggttatcctc tgaatgtcgc 20

<210> 28 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> ONA h29ONA#3 espedfico humano <400> 28

tctgttaggg tctgtgcc 18

<210> 29 <211> 19 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> ONA h29ONA#4 espedfico humano <400> 29

ccatctgtta gggtctgtg 19

<210> 30 <211> 17 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> ONA h29ONA#5 espedfico humano <400> 30

gtctgtgcca atatgcg 17

<210> 31 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> ONA h29ONA#6 espedfico humano <400> 31

tctgtgccaa tatgcgaatc 20

<210> 32 <211> 15 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<223> ONA h29ONA#7 espedfico humano

<400> 32

tgtctcaagt tcctc 15

<210> 33 <211> 20 <212>ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> ONA h29ONA#8 espedfico humano <400> 33

gaattaaatg tctcaagttc 20

<210> 34 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> AON h29AON#9 espedfico humano <400> 34

ttaaatgtct caagttcc 18

<210> 35 <211> 16 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> ONA h29 ONA #10 espedfico humano <400> 35

gtagttccct ccaacg 16

<210> 36 <211> 15 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> ONA h29 ONA #11 espedfico humano <400> 36 catgtagttc cctcc 15

Claims

5

10

15

20

25

30

REIVINDICACIONES

1. Un oligonucleotido antisentido dirigido contra el interior del exon 53 de pre-mARN de distrofina humana, que facilita el enmascarado de dicho exon para el aparato de empalme y la exclusion de ducho exon de mARN final.
2. Un oligonucleotido antisentido segun la reivindicacion 1, en el que dicho nucleotido es capaz de unirse al exon 53 o a una parte del mismo.
3. Un oligonucleotido antisentido segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en donde dicho oligonucleotido antisentido es capaz de interferir espedficamente con una secuencia de reconocimiento de exon en el exon 53.
4. Un oligonucleotido antisentido segun la reivindicacion 2 o 3, en donde la union al interior del exon 53 se ha de evaluar mediante un ensayo de desplazamiento de movilidad de gel o determinando si dicho exon esta ausente de dicho mARN.
5. Un oligonucleotido antisentido segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el oligonucleotido induce la omision espedfica de dicho exon 53 en un pre-mARN de distrofina cuando dicho oligonucleotido antisentido esta presente en una celula que tiene un pre-mARN de distrofina que contiene dicho exon.
6. Un oligonucleotido antisentido segun la reivindicacion 5, en donde el oligonucleotido induce la produccion de una protema de distrofina que comprende al menos la funcionalidad de un mutante Becker cuando dicho oligonucleotido antisentido esta presente en una celula que tiene un pre-mARN de distrofina que contiene el exon 53.
7. Un oligonucleotido antisentido segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el oligonucleotido tiene una longitud de 14-40 nucleotidos.
8. Un oligonucleotido antisentido segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el oligonucleotido es un oligo-ribonucleotido 2-O-metilo o un acido nucleico peptfdico.
9. Un oligonucleotido antisentido segun la reivindicacion 8, en donde el oligo-ribonucleotido 2-O-metilo es un oligo- ribonucleotido 2-O-metilo-fosforotioato.
10. Un vehfculo que suministra acido nucleico capaz de expresar un oligonucleotido antisentido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, preferiblemente en donde dicho vehfculo que suministra acido nucleico o un virus monocatenario o un virus adeno-asociado.
11. Uso de un oligonucleotido antisentido segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o un vehfculo que suministra acido nucleico segun la reivindicacion 10, para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de la Distrofia Muscular de Duchenne en un paciente.
12. Uso segun la reivindicacion 11, en donde el paciente tratado tiene al menos algunas fibras distrofina-positivas.