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Die vorliegende Erfindung betrifft ein isoliertes Antisense-Oligonucleotid, eine pharmazeutische Zusammensetzung sowie Verwendungen und Verfahren, in denen das isolierte Antisense-Oligonucleotid und die pharmazeutische Zusammensetzung zum Einsatz kommen.
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Die dilative Kardiomyopathie (DOM) ist eine krankhafte Erweiterung des Herzmuskels, insbesondere des linken Ventrikels. Durch einen systolischen Pumpfehler kommt es zum fortschreitenden Verlust der Auswurfleistung, die zum Teil mit einer lebensbedrohlichen Herzrhythmusstörung einhergeht. Die Prognose betroffener Patienten ist ungünstig. Die Fünfjahressterblichkeit liegt bei ungefähr 20%. Eine der Hauptursachen, die zur Entwicklung einer DOM führt, sind Mutationen im sogenannten Titin-Gen, das für ein Protein der Herz- und Skelettmuskulatur kodiert. Mehr als fünfzig solcher DCM-verursachenden Titin-Mutationen wurden mittlerweile identifiziert.
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Eine kausale Behandlung der DCM existiert momentan nicht. Betroffene Patienten erhalten eine symptomatische Therapie der Herzinsuffizienz und Herzrhythmusstörungen unter Verwendung von ACE-Hemmern und Betablockern.
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Vor diesem Hintergrund ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Verbindungen, Zusammensetzungen sowie Verfahren für die Behandlung von durch Mutationen im Titin-Gen entstandener DCM bereitzustellen, die auf einem kausaltherapeutischen Ansatz basieren.
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Diese Aufgabe wird durch ein isoliertes Antisense-Oligonucleotid (AO) gelöst, das eine Sequenz aufweist, die spezifisch hybridisierbar ist an eine mRNA-Splicing-Sequenz eines Exons der Prä-mRNA des Titin-Gens, und das in der Lage ist, ein Skipping dieses Exons zu induzieren.
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Das Prinzip des ”Exon-Skippings” ist im Stand der Technik bislang nur im Zusammenhang mit der Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) beschrieben. Exemplarisch wird auf die folgenden Dokumente aus dem Stand der Technik verwiesen:
Cirak et al. (2011), Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an open-label, phase 2, dose-escalation study, Lancet, Vol. 378, Seiten 595 bis 605,
EP 1 191 097 ,
EP 1 619 249 ,
WO 2006/000057 ,
EP 1 857 548 ,
WO 2010/048586 ,
US 2012/0041050 und
US 2012/0022134 . Bei der DMD wird ein für die Stabilität der Muskelmembran wichtiges Protein, das Dystrophin, gar nicht oder in funktionsgestörter Form gebildet, was früher oder später zum Untergang von Muskelfasern und Ersatz durch Fett- oder Bindegewebe führt. Verantwortlich sind Mutationen im Dystrophin-Gen. Durch die Verwendung spezifischer AOs sollen mutationstragende Exone des Dystrophin-Gens während der Transkription auf der Ebene der Prä-mRNA ”übersprungen” werden. Im Ergebnis entsteht ein kürzeres, aber funktionell intaktes Protein.
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Das Titin-Gen, das auch als Connectin-Gen bezeichnet wird, kodiert für ein etwa 3,6 Megadalton großes elastisches Protein, welches sich zu Filamenten zusammensetzt. Es besteht aus über 30.000 Aminosäuren und beinhaltet 320 Proteindomänen. Das humane Titin ist damit das größte bekannte menschliche Protein. Titin ist ein Teil des Sarkomers, der kleinsten funktionellen Einheit in der quergestreiften Muskulatur. Die Aufgabe des Titins im Sarkomer ist es, die Myosinköpfe zwischen den Aktinfilamenten zu zentrieren und den kontaktilen Apparat nach der Dehnung zurückzustellen.
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Erfindungsgemäß handelt es sich deshalb bei dem Titin-Gen um das eines Säugetieres, vorzugsweise um das humane Titin-Gen oder das einer Maus.
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Beim Menschen ist das Titin-Gen auf dem Chromosom 2, 179.1 bis 179.38 Mb, lokalisiert. Die Gen-ID lautet 7273 (Entrez). Die NCBI-Referenzsequenz lautet NG_011618.2.
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Bei der Maus ist das Titin-Gen auf dem Chromosom 2, 76.51 bis 76.64 Mb lokalisiert. Die Gen-ID lautet 22138. Die NCBI-Referenzsequenz lautet NC_000068.7.
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Erfindungsgemäß wird unter einer mRNA-Splicing-Sequenz eine solche Nucleotidsequenz verstanden, die in das mRNA-Splicing involviert ist, insbesondere Splice-Donor-Sequenzen, Splice-Akzeptor-Sequenzen oder Exonic-Splicing-Enhancer-Sequenzen. Als mRNA-Splicing-Sequenzen kommen ferner Splicing-Branch-Points und Exon-Erkennungssequenzen sowie Spice-Enhancer in Frage.
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Als Prä-mRNA oder auch Präkursor-mRNA wird eine nicht bzw. unvollständig prozessierte eukaryotische mRNA bezeichnet.
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”Skipping” bedeutet, das erfindungsgemäße AO verhindert durch die Hybridisierung an die mRNA-Splicing-Sequenz eines mutationstragenden Exons auf der Prä-mRNA, dass dieses Exon in die reife mRNA eingebaut wird. Das entsprechende Exon wird folglich ”geskippt”, d. h. übersprungen. Es entsteht eine verkürzte reife mRNA, die für ein verkürztes aber funktionelles Titin codiert.
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Eine spezifische Hybridisierung bedeutet, dass das erfindungsgemäße AO eine zu Bereichen der mRNA-Splicing-Sequenz des mutationstragenden Exons komplementäre Nucleotidsequenz aufweist. Die Hybridisierung kann demnach auch unter stringenten Bedingungen erfolgen und unterscheidet sich von unspezifischen Anlagerungen.
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Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird hiermit vollkommen gelöst.
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Das erfindungsgemäße AO bewirkt, wenn dieses in einen Organismus eingebracht wird, der an einer dilativen Kardiomyopathie leidet, die durch eine Mutation im Titin-Gen verursacht ist, dass das entsprechende mutationstragende Exon nicht in der reifen mRNA vorhanden ist. Die reife mRNA wird dann in ein funktionelles Titin-Protein ohne den mutationstragenden Abschnitt bzw. die mutationstragende Domäne translatiert. Wie die Erfinder in einem DCM-Mausmodell zeigen konnten, kann durch die Verabreichung des erfindungsgemäßen AO die Sarkomerstruktur wiederhergestellt werden.
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Nach einer erfindungsgemäßen Weiterentwicklung weist das isolierte AO eine Sequenz auf, die spezifisch hybridisierbar ist an die mRNA-Splicing-Sequenz des Exons 326 des Titin-Gens.
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Die Nummerierung der Exone des Titin-Gens ist in der wissenschaftlichen Literatur nicht einheitlich. Die Erfinder beziehen sich auf die Nummerierung, wie sie bspw. in Gerull et al. (2002), Mutations of TTN, encoding the giant muscle filament titin, cause familial dilated cause familial dilated cardiomyopathy, Nat. Genet. 30, Seiten 201 bis 204, verwendet wird. Nach der ESEMBL-Nomenklatur entspricht das Exon 326 des humanen Titin-Gens dem Transkript ENST00000342992 (SEQ ID Nr. 14), welches dort als Exon 275 bezeichnet wird, das Exon 326 des murinen Titin-Gens entspricht dem Transkript ENSMUST00000099981 (SEQ ID Nr. 15), welches dort als Exon 309 bezeichnet ist.
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Mit dieser Maßnahme wird ein solches AO bereitgestellt, mit dem ein solches Exon ”geskippt” werden kann, welches nach Erkenntnissen der Erfinder bei einer autosomal-dominanten DCM, die beispielsweise in einer großen australischen Familie festgestellt werden konnte, eine Leserastermutation verursacht. Konkret handelt es sich um die Trunkationsmutation c.43628insAT; vgl. Gerull et al. (2002; a. a. O.). Patienten, die von dieser Mutation betroffen sind, kann mit der bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung wirkungsvoll geholfen werden.
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Nach einer bevorzugten Weiterentwicklung weist das erfindungsgemäße isolierte AO eine Länge von ca. 5 bis 50, vorzugsweise von ca. 10 bis 40, weiter bevorzugt von ca. 15 bis 30, und höchst bevorzugt von ca. 19 bis ca. 22 Nucleotiden auf.
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Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass das isolierte AO ausreichend lang ist, um stabil an die mRNA-Splicing-Sequenz des mutationstragenden Exons binden und ein Skipping auslösen zu können. Der Splicingvorgang an dem mutationstragenden Exon und damit der Einbau in die reife mRNA wird somit verhindert. Die angegebenen Längenbereiche haben sich dabei nach Erkenntnissen der Erfinder als besonders vorteilhaft erwiesen.
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Nach einer erfindungsgemäß bevorzugten Weiterentwicklung, ist die mRNA-Splicing-Sequenz eine Exonic-Splicing-Enhancer(ESE)-Sequenz.
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Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass das erfindungsgemäße AO derart weitergebildet wird, dass es an die entscheidende mRNA-Splicing-Sequenz im Exon des Titin-Gens bindet, und somit ein Skipping des Exons initiiert.
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Nach einer bevorzugten Weiterentwicklung weist das erfindungsgemäße AO Morpholino-Oligonucleotide und/oder 2'-O-Methyl-Phosphorothioat-Oligonucleotide auf.
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Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die Lipophilie des erfindungsgemäßen AO erhöht wird. Das erfindungsgemäße AO wird damit besser in die betroffenen Zellen aufgenommen. Ferner wird durch den Austausch der natürlichen Nucleotide die Stabilität des erfindungsgemäßen AO erhöht. Die Halbwertszeit beträgt bei der Verwendung von Morpholino-Oligonucleotiden mehrere Stunden, bei der Verwendung von 2'-O-Methyl-Phosphothiorat-Oligonucleotiden mehrere Wochen. Die Morpholino-Technologie wird beispielsweise beschrieben in Sazani et al. (2011), Chemical and mechanistic toxicology evaluation of exon skipping phosphorodiamidate morpholino oligomers in mdx mice, Int. J. Toxicol. 30, Seiten 322 bis 333. Die 2'-O-Methyl-Phosphorothioat-Technologie wird beschrieben in Heemskerk et. Al (2010), Preclinical PK and PD Studies an 2'-O-Methyl-phosphorothioate RNA Antisense Oligonucleotides in the mdx Mouse Model. Mol. Ther. 18, Seiten 1210 bis 1217.
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Nach einer bevorzugten Ausgestaltung weist das erfindungsgemäße isolierte AO eine Nucleotidsequenz auf, die spezifisch an zumindest ca. 5, vorzugsweise zumindest ca. 10, weiter bevorzugt zumindest ca. 15, höchst bevorzugt zumindest ca. 19 kontinuierliche Nucleotide der Sequenz SEQ ID Nr. 1 und/oder 2 hybridisieren kann.
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Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass das erfindungsgemäße AO mit einer solchen Sequenz bereitgestellt wird, die an die ESE-Sequenz des Exon 326 des humanen (SEQ ID Nr. 1) bzw. des Titin-Gens der Maus (SEQ ID Nr. 2) hybridisieren kann, und es dadurch in der Lage ist, ein Skipping des Exons 326 zu induzieren.
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Nach einer bevorzugten Weiterentwicklung weist das erfindungsgemäße AO eine Nucleotidsequenz auf, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 3 bis 13.
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Hierbei ist von Vorteil, dass die das erfindungsgemäße AO Nucleotidsequenzen aufweist, die von den Erfindern erfolgreich getestete wurden. Die Sequenzen SEQ ID Nr. 3 bis 7 hybridisieren an ESE-Sequenzen des Exons 326 von Maus-Titin. Die Sequenzen SEQ ID Nr. 8 bis 13 hybridisieren an eine ESE-Sequenz des Exons 326 von humanem Titin, so dass die entsprechenden erfindungsgemäßen AO für eine Applikation in den Menschen geeignet sind.
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Nach einer bevorzugten Weiterentwicklung ist das vorstehend beschriebene isolierte AO zur Behandlung von dilativer Kardiomyopathie (DCM) ausgebildet.
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Durch diese Maßnahme wird eine Verbindung bereitgestellt, mit der eine kausaltherapeutische Behandlung der durch Mutationen im Titin entstandenen dilativen Kardiomyopathie möglich ist.
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Ein weiterer der Erfindung zugrunde liegender Gegenstand betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das erfindungsgemäße isolierte AO und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweist.
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Pharmazeutisch akzeptable Träger sind im Stand der Technik umfangreich beschrieben, beispielsweise in Kibbe et al. (2000), Handbook of Pharmaceutical Excipients, dritte Auflage, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press.
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Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung des erfindungsgemäßen isolierten AOs zur spezifischen Inhibition einer mRNA-Splicing-Sequenz, vorzugsweise einer ESE-Sequenz, eines mutationstragenden Exons der Prä-mRNA des Titin-Gens, vorzugsweise des Exons 326 des Titin-Gens, um ein Skipping des Exons zu induzieren.
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Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung des erfindungsgemäßen isolierten AOs oder der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von dilativer Kardiomyopathie (DCM).
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Induktion eines Skippings eines mutationstragenden Exons der Prä-mRNA des Titin-Gens, vorzugsweise des Exons 326 des Titin-Gens, das die Verabreichung des erfindungsgemäßen isolierten AOs oder der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung in eine biologische Zelle oder ein Lebewesen, bspw. eines Säugetiers oder eines Menschen, umfasst.
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung von dilativer Kardiomyopathie (DCM), das die Verabreichung des erfindungsgemäßen isolierten AOs oder der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung in ein von DCM betroffenes Lebewesen umfasst.
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Die Eigenschaften, Merkmale und Vorteile des erfindungsgemäßen isolierten AOs gelten für die erfindungsgemäßen Verwendungen und Verfahren gleichermaßen.
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Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
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Die Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, aus denen sich weitere Merkmale und Vorteile ergeben. Die Ausführungsbeispiele sind rein illustrativ und schränken die Reichweite der vorliegenden Erfindung nicht ein.
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In den beiliegenden Figuren ist Folgendes dargestellt:
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1 Entwicklung eines Antisense-Oligonucleotids (AO), welches zum Überspringen von Exon 326 führt;
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2 Behandlung von homozygoten Titin-Mausembryonen mit dem AO;
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3 Exon-Skipping in kultivierten Maus-Mausembryonen;
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4 Exon-Skipping im heterozygoten DCM-Mausmodell;
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5 Exon-Skipping am Menschen.
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Ausführungsbeispiele
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Beispiel 1 – Exon-326-Mutation
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Für eine große australische Familie ist eine autosomal-dominant vererbte dilative Kardiomyopathie (DCM) beschrieben. Durch Kopplungs- und Haplotyp-Analyse konnte eine heterozygote Insertionsmutation von zwei Basenpaaren im Exon 326 des Titin-Gens als molekular genetische Ursache der DCM identifiziert werden (TTN-Trunkationsmutation c.43628insAT; vgl. Gerull et al. (2002; a.a. O.)).
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Beispiel 2 – Mausmodell
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Es wurde eine Knock-In-Maus generiert, welche die humane 2 bp Insertionsmutation im Exon 326 in den Titin-Lokus integriert hat. Während die homozygoten Tiere bei der Embryonalentwicklung in utero versterben, entwickeln sich die heterozygoten Mäuse unter Ruhebedingungen zunächst normal und zeigen keinen kardialen Phänotyp. Die heterozygoten Mäuse entwickeln eine DCM unter dem Einfluss von kardialem Stress. Das Mausmodell ist beschrieben in Gramlich et al. (2009), Stressinduced dilated cardiomyopathy in a knock-in mouse model mimicking human titin-based disease, Journal of Molecular and Cellular Cardiology 47, Seiten 352–358.
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Beispiel 3 – Entwicklung von Antisense-Oligonucleotiden
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In der 1A ist die Strategie zur Entwicklung eines Antisense-Oligonucleotids dargestellt, welches zum Überspringen (”Skipping”) des mutationstragenden Exons 326 führt. Die Mutation im Exon 326 ist mit ”MUT” dargestellt. Die Exonic-Splicing-Enhancer-Sequenz ist mit ”ESE” dargestellt. Das erfindungsgemäße Antisense-Oligonucleotid (”AO”) lagert sich an die ESE des Exon 326 der Prä-mRNA und verhindert dadurch, dass das Exon 326 in der reifen mRNA vorliegt. Das Exon 326 wird ”geskippt”.
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In der nachfolgenden Tabelle 1 sind die von den Erfindern generierten Antisense-Oligonucleotide dargestellt, mit denen erfolgreich ein Skipping von Exon 326 des Titin-Gens der Maus (SEQ ID Nr. 3–7) und des Menschen (SEQ ID Nr. 8–13) realisiert werden konnte.
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Tab. 1: Antisense-Oligonucleotide zum Skipping von Exon 326 des Titin-Gens; H = human, M = Maus
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In der 1B wird exemplarisch die technische Machbarkeit des Exon-Skippings von Titin Exon 326 dargestellt. Murine Kardiomyozyten, sog. HL1 Zellen, wurden in 5 verschiedenen Ansätzen (1 bis 5) mit dem AO mit der Sequenz SEQ ID Nr. 3 transfiziert. 24 Stunden später wurde die mRNA isoliert und mittels RT-PCR das erfolgreiche Skipping nachgewiesen. ”C” steht für die Kontrolle und stellt das PCR-Produkt aus dem Ansatz ohne AO dar. Gleiche Resultate wurden für die anderen in Tabelle 1 genannten AOs erzielt.
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Beispiel 4 – Behandlung von homozygoten Titin-Mausembryonen
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Homozygote Titin-defiziente Embryonen versterben gewöhnlich am Gestationstag 9 aufgrund schwerer Schäden bei der Sarkomerformation und der Herzentwicklung.
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2 zeigt exemplarisch die konfokale Mikroskopie eines mit dem AO mit der Sequenz SEQ ID Nr. 3 behandelten homozygoten Mausembryos. Homozygote Titin-Mausembryonen wurden am Gestationstag 8.5 entnommen und in Kultur weitergeführt. Ein Teil der Mausembryonen wurde mit dem AO inkubiert. 24 Stunden später wurden die Mausembyonen funktionell, histologisch, immunhistologisch und elektronenmikroskopisch untersucht.
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Die Behandlung mit dem AO führte zur Normalisierung der Sarkomerstruktur, welche durch die Querstreifung der rot gefärbten Titinfilamente ersichtlich wird. Unbehandelte homozygote Mausembryonen zeigen keinerlei geordnete Sarkomerformation; die Herzen entwickeln keine kontraktile Funktion.
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Entsprechende Ergebnisse wurden für die Behandlung mit den AOs mit den Sequenzen SEQ ID Nr. 4 bis 7 erzielt.
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Beispiel 5 – Exon-Skipping in kultivierten Mausembryonen
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3 zeigt auf elektronenmikroskopischer Ebene die Wiederherstellung einer gerordneten Sarkomerstruktur bei homozygoten Titin-defizienten Mausembryonen durch die Behandlung mit den AOs; exemplarisch dargestellt ist die Behandlung mit dem AO mit der Sequenz SEQ ID Nr. 3. Homozygote Mausembryonen (”HOM”; ”KO” steht für ”knock-out”) wurden am Gestationstag 8.5 entnommen und einen weiteren Tag kultiviert (E8.5+1, ”E” steht für ”Embryonalstadium”).
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Embryonale Mausherzen fangen normalerweise am Gestationstag 9 an zu schlagen. Die homozygoten Mausembryonen haben jedoch keine geordnete Sarkomerstruktur und schlagen deshalb nur sehr rudimentaer. Die Behandlung mit dem erfindungsgemäßen AO führt zur Wiederherstellung der Sarkomerformation, was mit einer Kontraktion des Herzens einhergeht (”kontraktile Funktion”).
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Je geordneter sich die Aktin- und Myosinfilamente anordnen koennen, desto dicker wird die Filamentweite. Homozygote Mausherzen haben kaum Aktin/Myosin-Assembly, deshalb auch sehr dünne Filamente. Behandlung mit dem erfindungsgemäßen AO führt praktisch zu einer Normalisierung der Filamentdicke.
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Entsprechende Ergebnisse wurden auch für die Behandlung mit den AOs mit den Sequenzen SEQ ID Nr. 4 bis 7 erzielt.
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Die Versuche aus den Beispielen 4 und 5 zeigen, dass die eine Therapie mit den erfindungsgemäßen AOs am intakten Organismus möglich und äußerst effektiv ist.
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Beispiel 6 – Exon-Skipping im heterozvgoten DCM-Mausmodell
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Heterozygote Titin-Mäuse (HET) entwickeln sich gewöhnlich normal und zeigen keinen kardialen Phänotyp. Durch verschiedene kardiale Stressmodelle kann jedoch eine DOM im Mausmodell provoziert werden. So führt beispielsweise eine 14tägige Applikation von Angiotensin II zu einer ausgeprägten Herzinsuffizienz bei heterozvgoten Titin-defizienten Mäusen; vgl. Gramlich et al. (2009; a. a. O.).
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Um die Wirksamkeit der AO-Behandlung am adulten Tier zu testen, wurde zunächst die DOM durch Angiotensin II induziert. Ein Teil der Tiere erhielt parallel eine intravenöse Behandlung mit dem AO; hier exemplarisch dargestellt die Behandlung mit dem AO mit der Sequenz SEQ ID Nr. 3. Die Herzfunktion wurde regelmäßig mittels Echokardiographie überprüft. Das experimentelle Setup ist in der 4A illustriert.
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zeigt echokardiographischen Daten dieses Tierversuchs. Die Behandlung der Tiere mit dem AD verhindert die Entwicklung der DOM in heterozvgoten Titin-Mäusen, was sich in der Normalisierung der Pumpfunktion (Fraktionale Verkürzung) sowie des enddiastolischen Diameters niederschlägt (LVEDD).
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In ist die histologische Aufarbeitung des Herzen dargestellt. Während unbehandelte Tiere eine ausgeprägte myokardiale Fibrose entwickeln, wie in der Trichrom-Masson-Färbung gut sichtbar (links), ist diese bei den mit dem AO behandelten Tieren kaum zu sehen (rechts).
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Dieser Versuch zeigt, dass die AO-Therapie am adulten Mausmodell möglich und sehr effektiv ist und die Tiere durch die Behandlung nicht geschädigt werden.
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Beispiel 7 – Exon-Skipping am Menschen
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Um die Behandlung mit den erfindungsgemäßen AOs am Menschen testen zu können, wurden patientenspezifische induzierte pluripotente Stammzellen, sog. iPS Zellen, hergestellt und diese mit den AOs mit den Sequenzen SEQ ID 8 bis 13 transfiziert. 5 zeigt schematisch den Versuchsaufbau.
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Es wurde eine Hautbiopsie eines Patienten entnommen, der eine Mutation im Exon 326 des Titingens trägt. Der betroffene Patient leidet an einer schweren DCM mit ausgeprägter Herzinsuffizienz. Aus der Hautbiospie wurden Fibroblasten isoliert und kultiviert. Die Fibroblastenkultur wurde mit den sog. Yamanaka-Faktoren KLF4, SOX2, OCT4 und c-myc transfiziert. Dies bewirkt die Rückprogrammierung der Fibroblasten zu pluripotenten Stammzellen, den iPS Zellen. Die iPS Zellen können nun in alle untergeordneten Zelltypen differenziert werden.
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Die iPS Zellen wurden zu Kardiomyozyten differenziert, so dass nun eine patientenspezifische Kardiomyozytenlinie in Kultur zur Verfügung steht, welche die Titin-Mutation trägt. Die Zellen wurden mit den AOs mit den Sequenzen SEQ ID 8 bis 13 transfiziert und erfolgreiches Skipping mittels RT-PCR überprüft.
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Dieser Versuch zeigt, dass die AO-Therapie auch am Menschen möglich ist.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- EP 1191097 [0006]
- EP 1619249 [0006]
- WO 2006/000057 [0006]
- EP 1857548 [0006]
- WO 2010/048586 [0006]
- US 2012/0041050 [0006]
- US 2012/0022134 [0006]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- Cirak et al. (2011), Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an open-label, phase 2, dose-escalation study, Lancet, Vol. 378, Seiten 595 bis 605 [0006]
- Gerull et al. (2002), Mutations of TTN, encoding the giant muscle filament titin, cause familial dilated cause familial dilated cardiomyopathy, Nat. Genet. 30, Seiten 201 bis 204 [0018]
- Gerull et al. (2002; a. a. O.) [0019]
- Sazani et al. (2011), Chemical and mechanistic toxicology evaluation of exon skipping phosphorodiamidate morpholino oligomers in mdx mice, Int. J. Toxicol. 30, Seiten 322 bis 333 [0025]
- Kibbe et al. (2000), Handbook of Pharmaceutical Excipients, dritte Auflage, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press [0033]
- Gerull et al. (2002; a.a. O.) [0047]
- Gramlich et al. (2009), Stressinduced dilated cardiomyopathy in a knock-in mouse model mimicking human titin-based disease, Journal of Molecular and Cellular Cardiology 47, Seiten 352–358 [0048]
- Gramlich et al. (2009; a. a. O.) [0061]
