PT2636741E - Indução do salto de exões em células eucarióticas - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO "INDUÇÃO DO SALTO DE EXÕES EM CÉLULAS EUCARIÓTICAS"
Considerando os avanços rápidos na pesquisa do genoma humano, os profissionais e o público esperam que o futuro próximo traga - para além da compreensão dos mecanismos de doença e diagnósticos sofisticados e credíveis -igualmente terapias para muitas doenças genéticas devastadoras .
Enquanto se espera que para algumas doenças (e.g., metabólicas) os novos conhecimentos originem terapias com moléculas pequenas, facilmente administráveis, é provável que, na maior parte dos casos, seja necessária uma ou outra forma de terapia génica, i.e. a correcção, adição ou substituição do produto do gene defectivo.
Nos últimos anos, a pesquisa e o desenvolvimento nesta área puseram em evidência várias dificuldades técnicas que têm de ser ultrapassadas, e.g., relacionadas com o tamanho grande de muitos genes envolvidos na doença genética (limitando a escolha de sistemas adequados para administrar o gene terapêutico), a acessibilidade do tecido em que o gene terapêutico deverá funcionar (requerendo o desenho de técnicas de direccionamento especificas, fisicamente através de injecção localizada ou biologica mente através do desenvolvimento de sistemas com afinidades específicas de tecido) e a segurança do sistema de administração para o doente. Estes problemas estão, até certo ponto, correlacionados e pode-se concluir de um modo geral que quanto mais pequeno for o agente terapêutico, mais fácil se tornará desenvolver sistemas de administração eficientes, direccionáveis e seguros. 0 presente invento aborda este problema ao induzir nas células o chamado salto de exões. 0 salto de exões resulta em mRNA maduro que não possui o exão saltado e, assim, quando o referido exão codifica aminoácidos pode conduzir à expressão de um produto alterado. A tecnologia para o salto de exões é normalmente dirigida para a utilização dos chamados "Oligonucleótidos Anti-sentido" ('Anti-sense Oligonucleotides', AONs). Muito deste trabalho é realizado no modelo de ratinho mdx da distrofia muscular de Duchenne (DMD) . 0 ratinho mdx, que é portador de uma mutação sem sentido no exão 23 do gene da distrofia, tem sido usado como modelo animal da distrofia muscular de Duchenne. Apesar da mutação mdx, que deverá impedir a síntese de uma proteína distrofina funcional, têm sido observadas raras fibras naturais positivas para distrofina em tecido de músculo mdx. Pensa-se que estas fibras positivas para distrofina tenham surgido de um mecanismo de salto de exões, aparentemente natural, devido a mutações somáticas ou através de "splicing" alternativo. AONs dirigidos, respectivamente para os locais de "splicing" 3' e 5' dos intrões 22 e 23 no pré-mRNA da distrofina, interferem com factores normalmente envolvidos na remoção do intrão 23, de forma que também o exão 23 é removido do mRNA (Wilton, 1999) . Num estudo semelhante, Dunckley et al., (1998) mostraram que o salto de exões usando AONs dirigidos contra os locais de "splicing" 3' e 5' pode ter resultados inesperados. Eles observaram que o salto não só do exão 23 como também dos exões 24-29 resulta num mRNA contendo a junção do exão 23 com o exão 30. Desconhece-se o mecanismo subjacente ao aparecimento da variante inesperada de "splicing" 22-30. Poderá ser devido ao facto de os locais de "splicing" possuírem sequências de consenso que conduzem à hibridação promíscua dos oligos usados para dirigir o salto de exões. A hibridação dos oligos com outros locais de "splicing", para além dos locais do exão a ser saltado, poderá facilmente interferir com a precisão do processo de "splicing". Por outro lado, a precisão poderá não existir devido ao facto de ser necessário usar dois oligos (para o local de "splicing" 5' e 3') . O pré-mRNA contendo um mas não o outro oligo poderá ser susceptível a variantes de "splicing" inesperadas. Para ultrapassar estes e outros problemas, a presente divulgação proporciona um método para direccionar o "splicing" de um pré-mRNA num sistema capaz de realizar uma operação de "splicing" compreendendo o contacto do referido pré-mRNA no referido sistema com um agente capaz de inibir especificamente um sinal de inclusão de exão de pelo menos um exão no referido pré-mRNA, o referido método ainda compreende "splicing" do referido pré-mRNA. A interferência com um sinal de inclusão de exão ("EIS") tem a vantagem de tais elementos estarem situados dentro do exão. Ao proporcionar um oligo anti-sentido no interior do exão a ser saltado, é possivel interferir com o sinal de inclusão do exão ocultando eficazmente o exão em relação ao aparelho de "splicing". A incapacidade do aparelho de "splicing" de reconhecer o exão a ser saltado conduz assim à exclusão do exão do mRNA final. A presente divulgação não interfere directamente com o processo enzimático da maquinaria de "splicing" (a junção dos exões) . Pensa-se que isto permite que o método seja mais robusto e reprodutível. Pensa-se que um EIS seja uma estrutura particular de um exão, que permite que o aceitador e o dador de "splicing" assuma uma conformação espacial particular. Neste conceito é a conformação espacial particular que permite à maquinaria de "splicing" reconhecer o exão. No entanto, a divulgação não está certamente limitado a este modelo. Encontrou-se que agentes capazes de se ligarem a um exão podem inibir um EIS. Os agentes podem especificamente contactar com o referido exão em qualquer ponto e ainda serem capazes de especificamente inibir o referido EIS. 0 referido mRNA pode ser útil por si só. Por exemplo, a produção de uma proteina indesejável pode ser, pelo menos em parte, reduzida através da inibição da inclusão de um exão necessário no mRNA. De preferência, um método do invento ainda compreende a tradução do mRNA produzido a partir do "splicing" do referido pré-mRNA. De preferência, o referido mRNA codifica uma proteina funcional. Numa realização preferida a referida proteina compreende dois ou mais dominios, em que pelo menos um dos referidos dominios é codificado pelo referido mRNA como resultado do salto de pelo menos parte de um exão no referido pré-mRNA. 0 salto de exões, tipicamente, não sendo necessariamente importante para proteínas na configuração selvagem, possui pelo menos dois domínios funcionais que desempenham uma função, em que os referidos domínios são gerados a partir de partes distintas da sequência de aminoácidos primária. Um exemplo pode ser factores de transcrição. Tipicamente, estes factores compreendem um domínio de ligação a DNA e um domínio que interage com outras proteínas na célula. 0 salto de um exão que codifica uma parte da sequência de aminoácidos primária situada entre estes dois domínios pode conduzir a uma proteína mais curta que possui a mesma função, pelo menos em parte. Assim, as mutações prejudiciais nesta região intermédia (por exemplo mutações de mudança de grelha de leitura ou de paragem) podem ser, em parte, reparadas através da indução do salto de exões para permitir a síntese de uma proteína funcional (parcialmente) mais curta. Usando um método do invento é igualmente possível induzir o salto parcial do exão. Nesta realização, o referido contacto resulta na activação de um local de "splicing" críptico no exão contactado. Esta realização alarga o potencial da manipulação do pré-mRNA conduzindo a uma proteína funcional. De preferência, o referido sistema compreende uma célula. De preferência, a referida célula é cultivada in vitro ou no organismo in vivo, tipicamente, ainda que não necessariamente, o referido organismo compreende um ser humano ou um murganho.
Numa realização preferida, a divulgação proporciona um método para reduzir, pelo menos em parte, a produção de uma proteína aberrante numa célula, a referida célula compreendendo pré-mRNA compreendendo exões codificadores da referida proteína, o método compreendendo a dotação da referida célula com um agente capaz de especificamente inibir um sinal de inclusão de exão de pelo menos um dos referidos exões, o método ainda compreendendo a permissão da tradução do mRNA produzido a partir de "splicing" do referido pré-mRNA.
Pode ser usado qualquer agente capaz de especificamente inibir um sinal de exclusão de exão da presente divulgação. De preferência, o referido agente compreende ácido nucleico ou um seu equivalente funcional. De preferência, mas não necessariamente, o referido ácido nucleico tem a forma de cadeia simples. Ácido nucleico peptídico e outras moléculas compreendendo as mesmas características do tipo de ligação do ácido nucleico, não necessariamente da quantidade, são equivalentes adequados. 0 ácido nucleico ou um equivalente pode compreender modificações para proporcionar uma funcionalidade adicional. Por exemplo, pode ser usado 2'-O-metil-oligo-ribonucleótidos. Estes ribonucleótidos são mais resistentes à acção de RNAses do que os oligonucleótidos convencionais.
Numa realização preferida do invento, o referido sinal de inclusão de exão sofre interferência por um ácido nucleico anti-sentido dirigido contra uma sequência de reconhecimento de exão ("ERS"). Estas sequências são relativamente ricas em purinas e podem ser distinguidas analisando a informação da sequência do exão a ser saltado (Tanaka et al., 1994 Mol Cell Biol.14: p. 1347-1354).
Pensa-se que as sequências de reconhecimento de exão ajudem à inclusão no mRNA dos chamados exões fracos (Achsel et al., 1996; J. Biochem. 12; p 53-60). Estes exões fracos compreendem, por exemplo, locais de "splicing" 5' e 3' que são menos eficazmente reconhecidos pela maquinaria de "splicing". Na presente divulgação, encontrou-se que o salto de exões pode também ser induzido nos chamados exões fortes, i.e. exões que normalmente são eficazmente reconhecidos pela maquinaria de "splicing" da célula. A partir de qualquer sequência determinada é (quase) sempre possivel prever se a sequência compreende exões putativos e determinar se estes exões são fortes ou fracos. Existem vários algoritmos para determinação da força de um exão. Um algoritmo útil pode ser encontrado no servidor NetGene2 que prevê locais de "splicing" (Brunak, et ai., 1991; J. Mol. Biol. 220: p. 49-65) . O salto de exões de acordo com o invento pode ser induzido em (quase) todos os exões, independentemente do referido exão ser um exão fraco ou exão forte e também independentemente do referido exão compreender uma ERS. Numa realização preferida, um exão que se pretende saltar é um exão forte. Numa outra realização preferida, um exão que se pretende saltar não compreende uma ERS.
Os métodos da divulgação podem ser usados de muitas formas. Numa realização, um método da divulgação é usado para, pelo menos em parte, baixar a produção de uma proteina aberrante. Tais proteínas podem, por exemplo, ser oncoproteinas ou proteínas virais. Em muitos tumores, não só a presença de uma oncoproteina, como também o seu nivel relativo de expressão foram associados ao fenótipo da célula tumoral. De forma semelhante, não só a presença das proteínas virais, como também a quantidade de proteina virai numa célula determina a virulência de um virus particular. Ainda, para a multiplicação eficiente e disseminação de um virus, a altura da expressão no ciclo replicativo e o equilíbrio na quantidade de determinadas proteínas virais numa célula determinam se os virus são eficazmente ou ineficazmente produzidos. Usando um método da divulgação é possivel baixar a quantidade de proteina aberrante numa célula, de forma que, por exemplo, uma célula tumoral se torne menos tumorigénica (metástica) e/ou uma célula infectada por um virus produza menos virus.
Numa realização preferida, um método da divulgação é usado para modificar a referida proteina aberrante numa proteina funcional. Numa realização a referida proteina funcional é capaz de realizar uma função de uma proteina normalmente presente numa célula mas ausente nas células a serem tratadas. Muito frequentemente, mesmo a restauração parcial da função resulta na melhoria significativa do desempenho da célula tratada. Devido a um melhor desempenho, tais células podem também ter uma vantagem selectiva relativamente às células não modificadas, ajudando assim à eficácia do tratamento.
Este aspecto da divulgação é particularmente adequado para a restauração da expressão dos genes defectivos. Isto é conseguido através do salto especifico dos exões pretendidos, ultrapassando ou corrigindo assim mutações prejudiciais (tipicamente mutações de codões de paragem ou mutações pontuais de mudança de grelha de leitura, deleções ou inserções de um ou vários exões, conduzindo à terminação da tradução).
Comparativamente com as estratégias de introdução de genes, a nova forma da terapia génica com modulação de "splicing" requer a administração de reagentes terapêuticos muito mais pequenos, tipicamente, 14 e 40 nucleótidos, mas não lhe estando limitados. Numa realização preferida, são usadas moléculas de 14-25 nucleótidos uma vez que estas moléculas são mais fáceis de produzir e entram na célula mais eficazmente. Os métodos do invento permitem muito maior flexibilidade no desenho subsequente de sistemas de administração eficazes e seguros. Uma vantagem adicional importante deste aspecto do invento é que restaura (pelo menos alguma) actividade do gene endógeno, o qual ainda possui a maior parte ou a totalidade do seu circuito regulador de genes, assegurando assim os niveis de expressão correctos e a sintese de isoformas especificas de tecido.
Este aspecto da divulgação pode, em principio, ser aplicado a qualquer doença genética ou predisposição genética para doença, em que o salto pretendido de exões específicos restaurará a grelha de leitura de tradução quando esta for interrompida pela mutação original, desde que a tradução de uma proteina ligeiramente mais curta internamente ainda seja total ou parcialmente funcional. As realizações preferidas para as quais este pedido pode ter valor terapêutico são: predisposição para segundas mutações em genes supressores de tumores, e.g., as envolvidas em cancro da mama, cancro do cólon, esclerose tuberosa, neurofibromatosa, etc., - em que a restauração (parcial) da actividade impedirá a manifestação de nulossomia pelo segundo lote de mutações e assim protegerá contra a tumorigénese. Uma outra realização preferida envolve a restauração (parcial) de produtos de genes defectivos que tenham um efeito directo na doença, e.g., hemofilia A (deficiência no factor de coagulação VIII), algumas formas de hipotiroidismo congénito (devido a deficiência na sintese de tiroglobulina) e distrofia muscular de Duchenne (DMD) , em que as deleções de mudança de grelha de leitura, duplicações e mutações de codões de paragem no gene da distrofina ligada a X causam degradação progressiva, grave, do músculo. DMD é tipicamente letal na fase tardia da adolescência ou no inicio da idade adulta, enquanto as deleções ou duplicações no mesmo gene causa a distrofia muscular de Becker (BMD) muito mais suave, compatível com uma esperança de vida entre 35-40 anos até à normal. Na realização, como aplicado a DMD, a presente divulgação permite que o salto de exões prolongue uma deleção existente (ou altere o produto mRNA de uma duplicação exis tente), em tantos exões adjacentes quanto os necessários para restaurar a grelha de leitura, e origine uma proteina internamente ligeiramente encurtada, mas ainda funcional. Com base nos sintomas clinicos muito mais suaves dos doentes BMD com o equivalente desta deleção induzida, a doença nos doentes DMD terá um curso muito mais suave após terapia com AON.
Muitas mutações diferentes no gene da distrofina podem conduzir a uma proteina disfuncional. (Para uma lista compreensiva ver http://www.dmd.nl, a base de dados internacionalmente aceite para DMD e alterações relacionadas.) 0 exão preciso a ser saltado, para gerar uma proteina distrofina funcional, varia de mutação para mutação. A Tabela 1 compreende uma lista não limitante de exões que podem ser saltados e apresenta para os referidos exões algumas das mutações mais frequentes no gene da distrofina que foram observados em seres humanos e que podem ser tratados com um método do invento. 0 salto do exão atrás referido conduz a uma proteina distrofina mutante, compreendendo pelo menos a funcionalidade de um mutante Becker. Assim, numa realização, a invenção proporciona um método em que o referido sinal de inclusão de exão está presente nos exões números 2, 8, 19, 29, 43, 44, 45, 46, 50, 51, 52 ou 53 do gene da distrofina humana. A ocorrência de determinadas variações de deleções/inserções é mais frequente do que outras. Na presente divulgação foi encontrado que através da indução do salto do exão 46 como um meio ou um método da divulgação, aproximadamente 7% dos doentes contendo a deleção DMD podem ser tratados, resultando nos referidos doentes possuírem fibras musculares positivas para a distrofina. Através da indução do salto do exão 51, aproximadamente 15% dos doentes contendo a deleção DMD podem ser tratados com um meio ou método da divulgação. Tal tratamento resultará no doente possuir pelo menos algumas fibras positivas para a distrofina. Assim, com o salto do exão 46 ou 51, usando um método da divulgação, aproximadamente 22% dos doentes contendo uma deleção no gene da distrofina podem ser tratados. Assim numa realização preferida da divulgação, o referido sinal de exclusão de exão está presente no exão 46 ou no exão 51. Numa realização particular preferida, o referido agente compreende uma sequência de ácido nucleico de acordo com hA0N#4, hA0N#6, hA0N8, hA0N#9, hAN#ll e/ou um ou mais de hAON#21-30 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do referido hAON#. Uma parte funcional, derivado e/ou análogo do referido hAON# compreende o mesmo tipo de actividade de salto de exão, num método da divulgação, não necessariamente a mesma quantidade.
Pode ser vantajoso induzir o salto de exão de mars de um exão no pré-mRNA. Por exemplo, considerando uma larga variedade de mutações e a natureza fixa dos comprimentos dos exões e sequências de aminoácidos flan-queantes de tais mutações, pode ocorrer a situação de ser necessário saltar mars de um exão para ser restaurada a função. Um exemplo preferido, mas não limitante, de tal caso na base de dados de deleções DMD é a deleção 46-50. os doentes compreendendo uma deleção 46-50 não produzem distrofina funcional. No entanto, distrofina pelo menos parcialmente funcional pode ser gerada através da indução do salto do exão 45 e do exão 51. Um outro exemplo preferido mas não limitante é os doentes compreendendo uma duplicação do exão 2. Através do fornecimento de um agente capaz de inibir um EIS do exão 2, é possível saltar parcialmente um ou ambos os exões, dando assim origem à proteína selvagem, a seguir à truncada ou à proteína com duplo salto de exões. Um outro exemplo preferido, mas não limitante, é o salto dos exões 45 a 50. Isto gera uma variante do tipo Becker em grelha. Esta variante tipo Becker pode ser gerada para curar qualquer mutação localizada nos exões 45, 46, 47, 48, 49 e/ou 50 ou combinação das mesmas. Num aspecto, a divulgação proporciona um método da divulgação compreendendo o fornecimento à referida célula de um novo agente capaz de inibir um sinal de inclusão de exão num outro exão do referido pré-mRNA. Certamente está totalmente dentro do âmbito do invento usar dois ou mais agentes para a indução de salto de exão no pré-mRNA de dois ou mais genes diferentes.
Num outro aspecto, a divulgação proporciona um método para a selecção de agentes adequados para a terapia de "splicing" e a sua validação como agentes específicos de salto de exões em experiências piloto. É proporcionado um método para determinar se um agente é capaz de inibir especificamente um sinal de inclusão de um exão, compre endendo o fornecimento do referido agente à célula tendo um pré-mRNA contendo o referido exão, cultura da referida célula para permitir a formação de um mRNA a partir do referido pré-mRNA e determinação da ausência do referido exão no referido mRNA. Numa realização preferida, o referido agente compreende ácido nucleico ou seu equivalente funcional, o referido ácido nucleico compreendendo complementaridade com uma parte do referido exão. Agentes capazes de induzir o salto especifico de exões podem ser identificados com um método da divulgação. É possivel incluir um rastreio prévio de agentes através da identificação prévia da capacidade do referido agente para se ligar, com uma afinidade relativamente elevada, ao exão contendo ácido nucleico, de preferência RNA. Para este fim, é proporcionado um método para determinar se um agente é capaz de especificamente inibir um sinal de inclusão de exão, compreendendo ainda a determinação prévia in vitro da afinidade de ligação relativa do referido ácido nucleico, ou seu equivalente funcional, para uma molécula de RNA compreendendo o referido exão.
Ainda num outro aspecto, é proporcionado um agente que é obtido através de um método do invento. Numa realização preferida o referido agente compreende ácido nucleico ou um seu equivalente funcional. De preferência, o referido agente, quando usado para induzir o salto de exão numa célula, é capaz de, pelo menos em parte, reduzir a quantidade de proteina aberrante na referida célula. Mais de preferência, o referido salto de exão resulta num mRNA codificador de uma proteína que é capaz de realizar uma função na referida célula. Numa realização particularmente preferida, o referido pré-mRNA deriva de um gene da distro-fina. De preferência, a referida proteína funcional compreende pelo menos a funcionalidade de uma proteína distrofina de um doente Becker. Numa realização particularmente preferida o referido agente compreende a sequência de ácido nucleico de hA0N#4, hA0N#6, hA0N8, hA0N#9, hAN#ll e/ou um ou mais de hAON#21-30 ou uma parte funcional, derivado e/ou análogo do referido hAON#. Uma parte funcional, derivado e/ou análogo do referido hAON# compreende o mesmo tipo de actividade de salto de exão, num método da divulgação, não necessariamente a mesma quantidade.
Estão descritas muitas formas de fornecer agentes às células. Particularmente, foram largamente desenvolvidos os métodos de fornecimento de ácido nucleico. Os familiarizados com a matéria sabem como determinar se um método de fornecimento é adequado para a realização do presente invento. Num exemplo não limitante, o referido método inclui a incorporação de um agente do invento em lipossomas, os referidos lipossomas sendo adicionados às células possuidoras de um pré-mRNA alvo. Os lipossomas são particularmente adequados para a introdução de ácidos nucleicos em células. Moléculas anti-sentido, capazes de induzir o salto de exões, podem ser produzidas numa célula, quando da introdução de ácido nucleico contendo uma unidade de transcrição, para produzir um RNA anti-sentido. São exemplos não limitantes de unidades de transcrição adequadas pequenos RNAs nucleares (SNRP) ou unidades de transcrição de tRNA. 0 invento ainda proporciona um veículo de entrega de ácido nucleico compreendendo um ácido nucleico ou seu equivalente funcional do invento capaz de inibir um sinal de inclusão de exão. Numa realização o referido veículo de administração é capaz de expressar o referido ácido nucleico do invento. Certamente, no caso, por exemplo, de serem usados como veículos vírus de cadeia simples, está totalmente dentro do âmbito do invento quando tal vírus compreende apenas sequência anti-sentido de um agente do invento. Numa outra realização de vírus de cadeia simples, os AONs do invento são codificados por unidades de transcrição de pequenos RNAs nucleares ou de tRNA em ácido nucleico virai encapsidado pelo vírus veículo. Um vírus de cadeia simples preferido é o vírus adeno-associado.
Ainda numa outra realização, a divulgação proporciona a utilização de um ácido nucleico ou veículo de entrega de ácido nucleico do invento para a preparação de um medicamento. Numa realização preferida, o referido medicamento é usado para o tratamento de uma doença hereditária. Mais de preferência, o referido medicamento é usado para o tratamento de Distrofia muscular de Duchenne.
Breve descrição dos desenhos
Figura 1. A deleção do exão 45 é uma das mutações DMD mais frequentes. Devido a esta deleção, o exão 44 é ligado ao exão 46, a grelha de leitura da tradução é interrompida e um codão de paragem é criado no exão 4 6 conduzindo a uma deficiência em distrofina. 0 nosso objectivo é induzir artificialmente o salto de mars um exão, o exão 46, de forma a restabelecer a grelha de leitura e restaurar a sintese de uma proteina distrofina ligeiramente mais curta mas funcional, conforme encontrada nos doentes com distrofia muscular de Becker muito menos afectados, possuidores de uma deleção dos exões 45 e 46.
Figura 2. 0 exão 46 possui uma região rica em purinas que se pensa possuir um papel potencial na regulação do seu "splicing" no pré-mRNA. Uma série de oligo-nucleótidos 2 ' O-metil-fosforotioato anti-sentido (AONs) sobreponiveis foi projectada para ser dirigida contra esta região rica em purinas no exão 46 da distrofina de ratinho. Os AONs diferem tanto em comprimento como em sequência. As modificações quimicas tornam os AONs resistentes às endonucleases e à RNaseH nas células do músculo. Para determinar a eficiência de transfecção nos nossos estudos in vitro, os AONs continham um grupo 5'fluoresceina que permitiu a identificação de células positivas para AON.
Figura 3. Para determinar a afinidade de ligação dos diferentes AONs para o RNA do exão alvo 46, realizámos ensaios de alteração da mobilidade em gel. Nesta figura, são apresentados os cinco mAONs (mA0N#4, 6, 8, 9 e 11) com maior afinidade para o RNA alvo. Quando da ligação dos AONs ao RNA, forma-se um complexo que apresenta uma mobilidade retardada em gel, como pode ser determinado pelo ensaio da alteração da mobilidade de bandas. A ligação dos AONs ao alvo foi específica de sequência. Um mAON ao acaso, i.e., não específico do exão 46, não gerou uma alteração da mobilidade de bandas.
Figura 4. Os AONs específicos de ratinho e de ser humano que apresentam afinidade de ligação mais elevada nos ensaios de alteração de mobilidade em gel foram usados para transfectar culturas de miotubos de ratinho e humanos. (A) A análise por RT-PCR mostrou um produto truncado, cujo tamanho correspondeu ao exão 45 directamente ligado ao exão 47, nas culturas de células de ratinho quando da transfecção com diferentes mA0Ns#4, 6, 9 e 11. Não se detectou salto do exão 46 após transfecção com um AON ao acaso. (B) A análise por RT-PCR em culturas de células de músculo humano derivado de um indivíduo não afectado (C) e de dois doentes DMD não relacionados (PI e P2) revelou produtos truncados quando da transfecção com hA0N#4 e hA0N#8. No controlo, este produto correspondeu ao exão 45 ligado ao exão 47, enquanto nos doentes o tamanho do fragmento correspondeu ao exão 44 ligado ao exão 47. Não foi detectado salto do exão 46 nas culturas de células não transfectadas ou após transfecção com um hAON ao acaso. As eficiências mais elevadas de salto do exão 46 foram obtidas com hAON#8.
Figura 5. Dados de sequências dos produtos de RT-PCR obtidos a partir do doente DL279.1 (correspondendo a PI na Figura 4), que confirmaram a deleção do exão 45 neste doente (painel superior) e o salto adicional do exão 46 após transfecção com hA0N#8 (painel inferior). 0 salto do exão 46 foi especifico e o exão 44 foi exactamente ligado ao exão 47 que restabelece a grelha de leitura da tradução.
Figura 6. Análise imuno-histoquimica da cultura de células do músculo do doente DL279.1 quando da transfecção com hA0N#8. As células foram expostas a dois anticorpos diferentes contra a distrofina, induzidos contra regiões diferentes da proteina situadas numa região proximal (ManDys-1, ex.-31-32) e distai (Dys-2, ex.77-79) relativamente ao exão alvo 46. 0 painel inferior mostra a ausência de uma proteina distrofina nos miotubos, enquanto o salto induzido por hA0N#8 do exão 46 claramente restaura a sintese de uma proteina distrofina conforme detectado por ambos os anticorpos (painel superior).
Figura 7. (A) A análise por RT-PCR de RNA isolado a partir de culturas de células de músculo controlo humano tratadas com hAON#23, #24, #27, #28 ou #29. Um produto truncado, com um tamanho correspondente ao exão 50 a 52 foi detectado nas células tratadas com hAON#23 e #28. A análise da sequência destes produtos confirmou o salto preciso do exão 51 (B) . Um outro produto de "splicing" aberrante foi obtido nas células tratadas com hAON#28 e #29. A análise de sequências revelou a utilização de um local de "splicing" criptico em grelha, dentro do exão 51, que é usado numa frequência baixa quando do tratamento com AON. O produto gerado, incluiu um exão 51 parcial que também tinha uma grelha de leitura restaurada, confirmando assim o seu valor terapêutico.
Figura 8. (A) Os ensaios de alteração da mobilidade em gel foram realizados para determinar a afinidade de ligação dos diferentes h29AON#s ao RNA alvo do exão 29. Quando comparado com RNA não hibridado (nenhum), h29AON#l, #2, #4, #6, #9, #10 e #11 geraram complexos com mobilidades em gel mais baixas, indicando a sua ligação ao RNA. Um AON ao acaso, derivado do exão 19 da distrofina não gerou um complexo. (B) A análise por RT-PCR de RNA isolado a partir de culturas de células de músculo humano controlo tratadas com h29AON#l, #2, #4, #6, #9, #10 ou #11 revelou um produto truncado do qual o tamanho correspondeu ao exão 28 ligado ao exão 30. Estes resultados indicam que o exão pode especificamente ser saltado usando AONs dirigidos contra sequências dentro (h29AON#l, #2, #4 ou #6) ou fora (h29AON#9, #10 ou #11), os prováveis ERS no exão 29. Foi observado um outro produto de "splicing" aberrante, o qual resulta do salto dos exões 28 e 29 (confirmado por sequenciação, dados não apresentados) . Se bem que este produto esteja presente em células não tratadas, sugerindo que este salto alternativo possa ocorrer naturalmente, foi estimulado pelo tratamento com AON. AON 19, derivado do exão 19 da distrofina, não incluiu o salto do exão 29. (C) O salto especifico do exão 29 foi confirmado pelos dados de sequenciação dos fragmentos de RT-PCR truncados. É aqui apresentada a sequência obtida a partir do produto do salto do exão 29 em células tratadas com h29AON#l.
Figura 9. A análise por RT-PCR do RNA isolado a partir de músculos gastrocnémios de ratinho, dois dias após injecção de 5, 10 ou 20 μρ de mAON#4, #6 ou #11. Os produtos truncados, com um tamanho correspondendo ao exão 45 ligado ao exão 47, foram detectados em todos os músculos tratados. As amostras -RT, -RNA, AD-1 e AD-2 foram analisadas como controlos negativos para as reacções de RT-PCR. (B) A análise das sequências dos produtos truncados gerados por mAON#4 e #6 (e #11, não apresentado) confirmou o salto preciso do exão 46.
EXEMPLOS
Exemplo 1
Uma vez que o exão 45 é um dos exões mais frequentemente deletados em DMD, inicialmente tivemos como objectivo a indução especifica do salto do exão 46 (Fig. 1) . Isto produzirá a distrofina mais curta funcional, encontrada em doentes BMD portadores de uma deleção dos exões 45 e 46. O sistema foi inicialmente estabelecido para modulação do "splicing" do pré-mRNA da distrofina do gene da distrofina de ratinho. Mais tarde, tivemos como alvo o gene da distrofina humana, com o objectivo de restaurar a grelha de leitura da tradução e a sintese de distrofina em células de músculo de doentes DMD afectados por uma deleção do exão 45.
Projecção de mAONs e hAONs
Projectámos uma série de AONs específicos de ratinho e do ser humano (mAONs e hAONs) dirigidos contra uma parte interna do exão 4 6 que possui um segmento de sequências ricas em purinas e colocou-se a hipótese de ter um papel regulador putativo no processo de "splicing" do exão 46 (Fig. 2). Para o teste inicial dos AONs nos ensaios de alteração da mobilidade em gel (ver abaixo), usámos oligonucleótidos de DNA não modificados (sintetizados pela EuroGentec, Bélgica). Para as experiências de transfecção em células de músculo, usámos oligo-ribonucleótidos 2'-0-metilfosforotioato (também sintetizados pela EuroGentec, Bélgica). Estes oligonucleótidos de RNA modificados são conhecidos por serem resistentes às endonucleases e à RNase H e por se ligarem a RNA com elevada afinidade. As sequências daqueles AONs que foram eventualmente eficazes e que foram aplicados às células do músculo in vitro estão apresentados abaixo. Os correspondentes AONs específicos de ratinho e do ser humano são altamente homólogos mas não totalmente idênticos. A listagem abaixo refere-se à forma desoxi usada nos testes, nos 2-0-metilribonucleótidos usados todos os Ts deverão ser lidos como Us.
mA0N#2: 5'GCAATGTTATCTGCTT mAON # 3: 5'GTTATCTGCTTCTTCC
mAON # 4: 5'CTGCTTCTTCCAGCC mAON # 5: 5'TCTGCTTCTTCCAGC mAON#6: 5'GTTATCTGCTTCTTCCAGCC mAON#7: 5'CTTTTAGCTGCTGCTC mAON # 8: 5'GTTGTTCTTTTAGCTGCTGC mAON#9: 5'TTAGCTGCTGCTCAT mAON #10: 5'TTTAGCTGCTGCTCATCTCC mAON #11: 5'CTGCTGCTCATCTCC
hAON#4: 5'CTGCTTCCTCCAACC hAON# 6: 5'GTTATCTGCTTCCTCCAACC hAON# 8: 5'GCTTTTCTTTTAGTTGCTGC hAON# 9: 5'TTAGTTGCTGCTCTT hAON#11: 5'TTGCTGCTCTTTTCC
Ensaios da alteração da mobilidade em gel A eficácia dos AONs foi determinada pela sua afinidade de ligação para a sequência alvo. Apesar dos progressos recentes nos programas de simulação computacional para a previsão do enrolamento de RNAs, é dificil especular quais dos AONs projectados serão capazes de se ligarem à sequência alvo com uma afinidade relativamente elevada. Assim, realizámos ensaios da alteração da mobilidade em gel (de acordo com protocolos descritos por Bruice et ai., 1997) . O fragmento de RNA alvo do exão 46 foi gerado por transcrição mediada por T7 a partir de um fragmento de PCR (amplificado a partir de mRNA de músculo murino ou humano, usando uma sequência iniciadora da cadeia codificadora que possui a sequência do promotor de T7) na presença de 32P-CTP. A afinidade de ligação dos AONs individuais (0,5 pmoles) aos fragmentos dos transcritos alvo foi determinada por hibridação a 37°C, durante 30 minutos, e subsequente electroforese em gel de poliacrilamida (8%). Realizámos estes ensaios para o rastreio de AONs específicos de ratinho e de ser humano (Fig. 3). Pelo menos 5 AONs diferentes específicos de ratinho (mAON#4, 6, 8, 9 e 11) e quatro correspondendo a AONs específicos do ser humano (hAON#4, 6, 8 e 9) geraram uma alteração da mobilidade, demonstrando a sua afinidade de ligação ao RNA alvo.
Transfecção de culturas de células de músculo
Os AONs específicos do exão 46, que mostraram a afinidade de ligação ao alvo mais elevada nos ensaios de alteração da mobilidade em gel, foram seleccionados para análise da sua eficácia na indução do salto em células do músculo in vitro. Em todas as experiências de transfecção, incluímos um AON não especifico como controlo negativo para o salto especifico do exão 46. Conforme mencionado, o sistema foi primeiro estabelecidos em células de músculo de ratinho. Usámos culturas em proliferação de mioblastos e de miotubos pós-mitóticos (expressando niveis mais elevados de distrofina) derivados da linha celular de músculo de ratinho C2C12. Para as experiências subsequentes em culturas celulares de músculo humano, usámos culturas primárias de células de músculo isoladas a partir de biopsias de músculo de um indivíduo não afectado e de dois doentes DMD não relacionados, portadores de uma deleção do exão 45. Estas culturas heterogéneas continham aproxima-damente 20-40% de células miogénicas. Os diferentes AONs (numa concentração de 1 μΜ) foram transfectados em células que usam o polimero catiónico PEI (MBI Fermentas) numa proporção de equivalentes de 3. Os AONs transfectados nestas experiências continham um grupo 5' fluoresceina que nos permitiu determinar as eficiências de transfecção através da contagem do número de núcleos fluorescentes. Tipicamente, mais de 60% das células mostrou internalização especifica nuclear dos AONs. Para facilitar a análise por RT-PCR, o RNA foi isolado 24 horas após-transfecção usando RNAzol B (CamPro Scientific, The Netherlands). RT-PCR e análise de sequências O RNA foi sujeito a transcrição reversa usando polimerase C. therm (Roche) e uma sequência iniciadora reversa especifica do exão 48. Para facilitar a detecção do salto do exão 46 da distrofina, o cDNA foi amplificado em dois ciclos de PCR, incluindo uma amplificação em ninho usando sequências iniciadoras nos exões 44 e 47 (para o sistema humano) ou exões 45 e 47 (para o sistema de ratinho). Nos mioblastos de ratinho e nas culturas celulares de miotubos, detectámos um produto truncado cujo tamanho corresponde ao exão 45 directamente ligado ao exão 47 (Fig. 4) . A análise subsequente de sequências confirmou o salto especifico do exão 46 a partir destes transcritos de distrofina murina. A eficiência do salto de exões foi diferente para os AONs individuais, com mA0N#4 e #11 mostrando as eficiências mais elevadas. Após estes resultados promissores, focámo-nos na indução de uma modulação semelhante do "splicing" da distrofina em culturas de células de músculo humanas. Assim, detectámos um produto truncado nas células de músculo controlo, correspondendo ao exão 45 ligado ao exão 47. É interessante que nas células de músculo derivadas de doentes foi detectado um fragmento mais pequeno que consistiu no exão 44 ligado ao exão 47. 0 salto especifico do exão 46 dos transcritos da distrofina humana foi confirmado pelos dados de sequenciação. Esta modulação do "splicing" do transcrito da distrofina murina e humana não foi observada nas culturas celulares não transfectadas nem nas culturas transfectadas com um AON não especifico.
Análise imuno-histoquímica
Pretendemos induzir o salto do exão 46 em células de músculo derivadas de doentes portadores de uma deleção do exão 45. Para restaurar a tradução e a sintese de uma proteina distrofina. Para detectar um produto distrofina quando da transfecção com hA0N#8, as culturas celulares de músculo derivadas de dois doentes foram sujeitas a imunocitoquimica usando dois anticorpos monoclonais diferentes contra a distrofina (Mandys-1 e Dys-2) induzidos contra dominios da proteina distrofina com uma localização proximal e distai, respectivamente, em relação à região alvo. A análise de fluorescência revelou a restauração da sintese de distrofina em culturas de células derivadas dos dois doentes (Fig. 5) . Aproximadamente pelo menos 80% das fibras coraram de forma positiva para a distrofina nas amostras tratadas.
Os nossos rsultados mostram, pela primeira vez, a restauração da sintese de distrofina a partir do gene DMD endógeno nas células do músculo derivadas de doentes DMD. Esta é a confirmação da exequibilidade da modulação dirigida do "splicing" de pré-mRNA do gene da distrofina para fins terapêuticos.
Exemplo: Salto dirigido do exão 51
Salto simultâneo dos exões da distrofina O salto dirigido do exão 51. Demonstrámos a exequibilidade da modulação mediada por AON do "splicing" do exão 46 da distrofina, em células de músculo de ratinho e humanas in vitro. Estes resultados sugeriram outros estudos para avaliar os AONs como agentes terapêuticos para DMD. Uma vez que as deleções causadoras de DMD estão agrupadas em dois pontos quentes de mutação, o salto dirigido de um exão particular pode restaurar a grelha de leitura em séries de doentes com diferentes mutações (ver
Tabela 1) . 0 exão 51 é um exão alvo interessante. 0 salto deste exão é terapeuticamente aplicável em doentes portadores de deleções que abrangem o exão 50, os exões 45-50, os exões 48-50, os exões 49-50, o exão 52 e os exões 52-63, o que constitui um total de 15% dos doentes da nossa base de dados de Leiden.
Projectámos uma série de dez AONs específicos humanos (hAON#21-30) dirigidos contra diferentes regiões ricas em purinas dentro do exão 51 da distrofina. Estes segmentos ricos em purinas sugeriram a presença de um elemento regulador de "splicing" de exões putativo, o qual pretendemos bloquear para induzir a eliminação daquele exão durante o processo de "splicing". Todas as experiências foram realizadas de acordo com os protocolos descritos para o salto do exão 46 (ver atrás). Os ensaios de alteração da mobilidade em gel foram realizados para identificar os hAONs com elevada afinidade de ligação para o RNA alvo. Seleccionámos os cinco hAONs que apresentaram maior afinidade. Estes AONs foram usados para transfectar culturas de células de músculo humano controlo de forma a testar da exequibilidade do exão 51 in vitro. O RNA foi isolado 24 horas após transfecção e o cDNA foi gerado usando uma sequência iniciadora reversa específica do exão 53 ou 65. A amplificação, por PCR, da região alvo foi realizada usando diferentes combinações de sequências iniciadoras flanqueantes do exão 51. O RT-PCR e a análise de sequências revelaram que conseguimos induzir o salto específico do exão 51 a partir do transcrito da distrofina humana. Subsequentemente, transfectámos dois hAONs (#23 e 29) que se observou serem capazes de induzir o salto do exão em seis culturas de células musculares diferentes, derivadas de doentes DMD portadores de uma das mutações atrás referidas. 0 salto do exão 51 nestas culturas foi confirmado por RT-PCR e análise de sequências (Fig. 7) . Mais importante, a análise imuno-histoquimica, usando múltiplos anticorpos induzidos contra diferentes partes da proteina distrofina, mostraram em todos os caso que, devido ao salto do exão 51, foi restaurada a sintese de uma proteina distrofina. hAONs específicos do exão 51:
hA0N#21: 5'CCACAGGTTGTGTCACCAG hAON#22: 5'TTTCCTTAGTAACCACAGGT hA0N#2 3: 5'TGGCATTTCTAGTTTGG hAON#24: 5'CCAGAGCAGGTACCTCCAACATC hAON#25: 5'GGTAAGTTCTGTCCAAGCCC hA0N#2 6: 5'TCACCCTCTGTGATTTTAT hA0N#2 7: 5'CCCTCTGTGATTTT hA0N#2 8: 5'TCACCCACCATCACCCT hA0N#2 9: 5'TGATATCCTCAAGGTCACCC hAON#30: 5'CTGCTTGATGATCATCTCGTT
Salto simultâneo de múltiplos exões da distrofina . 0 salto de um exão adicional, como seja o exão 46 ou o exão 51, restaura a grelha para uma série considerável de diferentes mutações DMD. A gama de mutações para as quais esta estratégia é aplicável pode ser aumentada pelo salto simultâneo de mais de um exão. Por exemplo, nos doentes DMD com uma deleção do exão 46 ao exão 50, apenas o salto de ambos os exões 45 e 51, que flanqueiam a deleção, permite restabelecer a grelha de leitura de tradução.
Exemplo: Salto de exões independente de ERS.
Uma mutação no exão 29 conduz ao salto deste exão em dois doentes com distrofia muscular de Becker (Ginjaar et al., 2000; EJHG, vol. 8, p.793-796). Estudámos a exequibilidade de dirigir o salto do exão 29 atingindo o local da mutação através de AONs. A mutação está situada num segmento rico em purinas que poderá estar associado a actividade ERS. Projectámos uma série de AONs (ver abaixo) dirigidos contra sequências dentro (h29AON#l a h29AON#6) e fora (h29AON#7 a h29AON#ll) das hipotéticas ERS. Os ensaios de alteração da mobilidade em géis foram realizados (como descrito) para identificar os AONs com maior afinidade para o RNA alvo (Fig. 8). Subsequentemente, h29AON#l, #2, #4, #6, #9, #10 e #11 foram usados para transfectar culturas de miotubos humanos controlo usando o reagente de transfecção PEI. O RNA foi isolado 24 hrs pós-transfecção e o cDNA foi gerado usando uma sequência iniciadora reversa especifica do exão 31. A amplificação por PCR da região alvo foi realizada usando diferentes combinações de sequências iniciadoras flanqueantes do exão 29. Este RT-PCR e subsequente análise de sequências (Fig. 8B, C) revelaram que fomos capazes de induzir o salto do exão 29 do transcrito da distrofina humana. No entanto, os AONs que facilitaram este salto foram dirigidos contra sequências dentro e fora dos hipotéticos ERS (h29AON#l, #2, #4, #6, #9, #10 e #11) . Estes resultados sugerem que o salto do exão 29 ocorre independentemente do exão 29 conter ou não um ERS e que assim a ligação dos AONs ao exão 29 muito provavelmente inactivaram um sinal de inclusão de exão em vez de uma ERS. Esta demonstração do salto de exões independente de ERS pode estender a aplicabilidade global desta terapia aos exões sem ERSs.
h29AON#l: 5'TATCCTCTGSSTGTCGCATC h29AON#2: 5'GGTTATCCTCTGAATGTCGC h29AON#3: 5'TCTGTTAGGGTCTGTGCC h29AON#4: 5'CCATCTGTTAGGGTCTGTG h29AON#5: 5'GTCTGTGCCAATATGCG h2 9AON# 6: 5'TCTGTGCCAATATGCGAATC
h29AON#7: 5'TGTCTCAAGTTCCTC h2 9AON# 8: 5'GAATTAAATGTCTCAAGTTC h2 9AON# 9: 5'TTAAATGTCTCAAGTTCC h29AON#10: 5'GTAGTTCCCTCCAACG h29AON#ll: 5'CATGTAGTTCCCTCC
Exemplo: salto do exão 46 induzido por AON in vivo em tecido de músculo murino.
Após os resultados promissores em células de músculo em cultura, testámos os diferentes AONs específicos do exão 46 da distrofina de ratinho in vivo através da sua injecção, ligado a polietilenimina (PEI), nos músculos gastrocnémios dos ratinhos controlos. Com mA0N#4, #6 e #11, que previamente se demonstrou serem eficazes in vitro em células de músculo de ratinho, fomos capazes de induzir o salto do exão 46 em tecido muscular in vivo conforme determinado por RT-PCR e análise de sequências (Fig. 9). 0 salto do exão 46 in vivo foi dependente da dose com elevadas eficiências (até 10%) após injecção de 20 μρ por músculo por dia durante dois dias sucessivos.
Referências
Achsel et ai., 1996; J. Biochem. 120 ; p.53-60.
Bruice T.W. and Lima, W.F. (1997) Biochemistry 36(16) : p. 5004-5019.
Brunak et ai., 1991; J. Mol. Biol. 220 ; p. 49-65 Dunckley et ai. (1998) Human molecular genetics 7 : p. 1083-1090.
Ginjaar et ai., 2000 ; EJHG, vol. 8, p.793-796
Mann et ai., 2001 ; PNAS vol. 98, p. 42-47
Tanaka et ai., 1994 Mol. Cell Biol. 14 : p. 1347-1354.
Wilton SD et ai., (1999) Neuromuscular disorders 9 : p. 330- 338 .
Detalhes e informação básica sobre a Distrofia Muscular de Duchenne e doenças relacionadas podem ser encontrados no local da internet http://www.dmd.nl
Aspectos e realizações da divulgação
Num primeiro aspecto é proporcionado um método para dirigir "splicing" de um pré-mRNA num sistema capaz de realizar uma operação de "splicing" compreendendo o contacto do referido pré-mRNA no referido sistema com um agente capaz de especificamente inibir um sinal de inclusão de exão de pelo menos um exão no referido pré-mRNA, o referido método ainda compreendendo a permissão do "splicing" do referido pré-mRNA.
Um método preferido, ainda compreende a permissão da tradução do mRNA produzido a partir de "splicing" do referido pré-mRNA. É preferido um método em que o referido mRNA codifica uma proteína funcional. É preferido um método em que a referida proteína compreende dois ou mais domínios, em que pelo menos um dos referidos domínios é codificado pelo referido mRNA como resultado do salto de pelo menos parte de um exão no referido pré-mRNA. É preferido um método em que o referido contacto resulta na activação de um local de "splicing" críptico num exão contactado.
Num segundo aspecto, é proporcionado um método para reduzir, pelo menos em parte, a produção de uma proteína aberrante numa célula, a referida célula compreendendo pré-mRNA compreendendo exões codificadores da referida proteína, o método compreendendo a dotação da referida célula com um agente capaz de especificamente inibir um sinal de inclusão de exão de pelo menos um dos referidos exões, o método ainda compreendendo a permissão da tradução de mRNA produzido a partir de "splicing" do referido pré-mRNA.
Os métodos do primeiro e do segundo aspecto são preferencialmente tais que o referido sinal de inclusão de exão compreende uma sequência de reconhecimento de exão.
Os métodos do primeiro e do segundo aspecto são preferencialmente tais que o referido sinal de inclusão de exão está presente num exão compreendendo um par dador/aceitador de "splicing" forte.
Os métodos do primeiro aspecto e do segundo aspecto são preferencialmente tais que a tradução resulta numa proteina distrofina mutante ou normal, mais de preferência em que a referida proteina distrofina mutante é equivalente a uma proteina distrofina de um doente Becker. Neste método preferido, o referido sinal de inclusão de exão está presente no exão número 2, 8, 43, 44, 45, 46, 50, 51, 52 ou 53.
Os métodos do primeiro aspecto e do segundo aspecto são preferencialmente tais que o referido agente compreende ácido nucleico ou um seu equivalente funcional. Mais de preferência, o referido ácido nucleico possui entre 15-25 nucleótidos ou um seu equivalente funcional.
Os métodos do primeiro aspecto e do segundo aspecto são preferencialmente tais que ainda compreendem dotação da referida célula com um outro agente capaz de inibir um sinal de inclusão de exão presente num outro exão do referido pré-mRNA.
Num terceiro aspecto, é proporcionado um método para determinar se um ácido nucleico ou seu equivalente funcional, possuindo complementaridade com uma parte de um exão, é capaz de especificamente inibir um sinal de inclusão de exão do referido exão, compreendendo dotação de uma célula tendo um pré-mRNA contendo o referido exão, com o referido ácido nucleico, cultura da referida célula para permitir a formação de um mRNA a partir do referido pré-mRNA e determinar se o referido exão está ausente do referido mRNA.
Um método preferido do terceiro aspecto ainda compreende determinação in vitro da afinidade de ligação relativa do referido ácido nucleico ou seu equivalente funcional para uma molécula de RNA compreendendo o referido exão.
Num quarto aspecto, é proporcionado um ácido nucleico ou seu equivalente funcional obtido através de um método do terceiro aspecto.
Num quinto aspecto, é proporcionado um veiculo de entrega de ácido nucleico compreendendo um ácido nucleico do quarto aspecto, ou a sua cadeia complementar.
Num sexto aspecto, é proporcionado um veiculo de entrega de ácido nucleico capaz de expressar um ácido nucleico do quarto aspecto.
Num sétimo aspecto, é proporcionado um uso de um ácido nucleico do quarto aspecto, ou de um veiculo de entrega de ácido nucleico do quinto ou sexto aspecto, para a preparação de um medicamento.
Num oitavo aspecto, é proporcionado um uso de um ácido nucleico do quarto aspecto, ou de um veiculo de entrega de ácido nucleico, do quinto ou sexto aspecto, para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença hereditária ou predisposição para uma doença.
Num nono aspecto, é proporcionado um uso de um ácido nucleico, ou de um seu equivalente, compreendendo uma qualidade inibidora do sinal de inclusão de exão para a preparação de um medicamento.
Num décimo aspecto, é proporcionado um animal não humano dotado com um ácido nucleico do quarto aspecto. De preferência, o animal não humano do décimo aspecto ainda compreende um ácido nucleico codificador de uma proteina humana ou um seu equivalente funcional. Ainda mais de preferência, este animal não humano também compreende uma mutação de silenciamento no gene codificador dum homólogo animal da referida proteina humana.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Academisch Ziekenhuis Leiden <120> Indução do salto de exões em células eucarióticas
<130> P6027580PCT <150> PCT/NL01/00697 <151> 2001-09-21 <150> EP 00203283.7 <151> 2000-09-21 <160> 41 <170> Patentln versão 3.1
<210> 1 <211> 16 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> AON especifico de murganho mAON#2 <400> 1 gcaatgttat ctgctt 16
<210> 2 <211> 16 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> AON específico de murganho mA0N#3 <400> 2 gttatctgct tcttcc 16
<210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> AON especifico de murganho mAON#4 <400> 3 ctgcttcttc cagcc 15
<210> 4 <211> 15 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <220> <223> AON especifico de murganho mAON#5 <400> 4 tctgcttctt ccagc 15
<210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> AON específico de murganho mAON#6 <400> 5 gttatctgct tcttccagcc 20
<210> 6 <211> 16 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> AON especifico de murganho mAON#7 <400> 6 cttttagctg ctgctc 16
<210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> AON específico de murganho mAON#8 <400> 7 gttgttcttt tagctgctgc 20
<210> 8 <211> 15 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> AON especifico de murganho mAON#9 <400> 8 ttagctgctg ctcat 15
<210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> AON especifico de murganho mAON#10 <400> 9 tttagctgct gctcatctcc 20
<210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> AON específico de murganho mAON#ll <400> 10 ctgctgctca tctcc 15
<210> 11 <211> 15 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> AON especifico de murganho hAON#4 <400> 11 ctgcttcctc caacc 15
<210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> AON específico de humano hAON#6 <400> 12 gttatctgct tcctccaacc 20
<210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> AON especifico de humano hAON#8 <400> 13 gcttttcttt tagttgctgc 20
<210> 14 <211> 15 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> AON especifico de humano hAON#9 <400> 14 ttagttgctg ctctt 15
<210> 15 <211> 15 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> AON específico de humano hAON#ll <400> 15 ttgctgctct tttcc 15
<210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> hA0N#21 especifico do exão 51 <400> 16 ccacaggttg tgtcaccag 19
<210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> hAON#22 específico do exão 51 <400> 17 tttccttagt aaccacaggt t 21
<210> 18 <211> 17 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> hAON#23 especifico do exão 51 <400> 18 tggcatttct agtttgg 17
<210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> hAON#24 especifico do exão 51 <400> 19 ccagagcagg tacctccaac ate 23
<210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> hAON#25 específico do exão 51 <400> 20 ggtaagttct gtccaagccc 20
<210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> hAON#26 especifico do exão 51 <400> 21 tcaccctctg tgattttat 19
<210> 22 <211> 14 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> hAON#27 específico do exão 51 <400> 22 ccctctgtga tttt 14
<210> 23 <211> 17 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> hAON#28 especifico do exão 51 <400> 23 tcacccacca tcaccct 17
<210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> hAON#29 especifico do exão 51 <400> 24 tgatatcctc aaggtcaccc 20
<210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> hAON#30 específico do exão 51 <400> 25 ctgcttgatg atcatctcgt t 21
<210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> AON especifico de humano h29AON#l <400> 26 tatcctctga atgtcgcatc 20
<210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> AON específico de humano h29AON#2 <400> 27 ggttatcctc tgaatgtcgc 20
<210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> AON especifico de humano h29AON#3 <400> 28 tctgttaggg tctgtgcc 18
<210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> AON especifico de humano h29AON#4 <400> 29 ccatctgtta gggtctgtg 19
<210> 30 <211> 17 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> AON específico de humano h29AON#5 <400> 30 gtctgtgcca atatgcg 17
<210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> AON especifico de humano h29AON#6 <400> 31 tctgtgccaa tatgcgaatc 20
<210> 32 <211> 15 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> AON específico de humano h29AON#7 <400> 32 tgtctcaagt tcctc 15
<210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> AON especifico de humano h29AON#8 <400> 33 gaattaaatg tctcaagttc 20
<210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> AON especifico de humano h29AON#9 <400> 34 ttaaatgtct caagttcc 18
<210> 35 <211> 16 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> AON específico de humano h29AON#10 <400> 35 gtagttccct ccaacg 16
<210> 36 <211> 15 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> AON especifico de humano h29AON#ll <400> 36 catgtagttc cctcc 15
<210> 37 <211> 34 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> produto de RT-PCR <400> 37 acaaatggta tcttaaggct agaagaacaa aaga 34 <220>
<210> 38 <211> 33 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> produto de RT-PCR <400> 38 acaaatggta tcttaagtta ctggtggaag agt 33
<210> 39 <211> 24 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> produto de PCR RT-PCR <400> 39 ctattggagc ctgcaacaat gcag 24
<210> 40 <211> 24 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> produto de RT-PCR <400> 40 gaggtgctag atgctgtaag gagg 24 <210> 41
<211> 30 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> produto de RT-PCR <400> 41 agaaaggaga aaaagttact ggcagaagag 30
Lisboa, 6 de junho de 2016
Claims (12)
- REIVINDICAÇÕES1. Um oligonucleótido anti-sentido dirigido contra o interior do exão 43 do pré-mRNA da distrofina humana gue facilita a ocultação do referido exão relativamente ao sistema de "splicing" e a exclusão do referido exão do mRNA final, em gue o referido anti-sentido não é um DNA ou um DNA fosforotioato consistindo na sequência nucle-otídica GCACTTTGCAATGCTGCTGTCTTCTTGCTTAT divulgada como SEQ ID N0:3 em EP1160318 ou um DNA ou um DNA f os f orotioato consistindo numa sequência nucleotidica complementar da sequência nucleotidica AGCAAGAAGACAGCAGCAUUGCAAAG divulgada como SEQ ID NO:1 em EP1160318.
- 2. Um oligonucleótido anti-sentido de acordo com a reivindicação 1, em que o oligonucleótido é capaz de se ligar ao exão 43 ou a parte dele.
- 3. Um oligonucleótido anti-sentido de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o referido oligonucleótido anti-sentido é capaz de interferir especificamente com uma sequência de reconhecimento de exão no exão 43.
- 4. Um oligonucleótido anti-sentido de acordo com a reivindicação 2 ou 3, em que a ligação ao interior do exão 43 é avaliada por ensaio de alteração da mobilidade em gel ou através da determinação da ausência do referido exão no referido mRNA.
- 5. Um oligonucleótido anti-sentido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o oligonucleótido induz o salto específico do exão 43 num pré-mRNA da distrofina quando o referido oligonucleótido anti-sentido está presente numa célula tendo um pré-mRNA da distrofina com o referido exão.
- 6. Um oligonucleótido anti-sentido de acordo com a reivindicação 5, em que o oligonucleótido induz a produção de uma proteína distrofina compreendendo pelo menos a funcionalidade de um mutante Becker quando o referido oligonucleótido está presente numa célula tendo um pré-mRNA da distrofina que contém o exão 43.
- 7. Um oligonucleótido anti-sentido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o oligonucleótido possui um comprimento de 14-40 nucleótidos.
- 8. Um oligonucleótido anti-sentido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o oligonucleótido é um 2'-O-metil-oligorribonucleótido ou um ácido peptidonucleico.
- 9. Um oligonucleótido anti-sentido de acordo com a reivindicação 8, em que o 2'-O-metil-oligorribonu-cleótido é um oligorribonucleótido 2'-O-metilfosforotioato.
- 10. Um veículo de entrega de ácido nucleico capaz de expressar um oligonucleótido anti-sentido como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, de preferência em que o referido veiculo de entrega de ácido nucleico compreende um virus de cadeia simples ou um virus adeno-associado.
- 11. Uso de um oligonucleótido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 um veiculo de entrega de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 10, para a produção de um medicamento para o tratamento de Distrofia Muscular de Duchenne num doente.
- 12. Uso de acordo com a reivindicação 11, em que o doente tratado possui pelo menos algumas fibras positivas para distrofina. Lisboa, 6 de junho de 2016
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