CN116710107A - 用于治疗或预防SNCA相关的神经退化性疾病的SNCA iRNA组成物及其使用方法 - Google Patents

用于治疗或预防SNCA相关的神经退化性疾病的SNCA iRNA组成物及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本公开内容是关于靶向SNCA基因的双股核糖核酸(dsRNAi)剂及其组成物，以及使用此类dsRNAi剂及组成物抑制SNCA基因的表达的方法、以及治疗患有SNCA相关神经退化性疾病或病症个体的方法，所述神经退化性疾病或病症是例如：帕金森病(PD)、多系统萎缩、路易氏体失智(LBD)以及其他突触核蛋白病。

Description

用于治疗或预防SNCA相关的神经退化性疾病的SNCA iRNA组 成物及其使用方法
[相关申请]
依据35U.S.C.119(e)，本申请是关于并主张于2020年10月1日递交的名称为「用于治疗或预防SNCA相关的神经退化性疾病的SNCA iRNA组成物及其使用方法」的美国临时专利申请第63/086,495号的优先权权益。前述专利申请的整体内容通过引用并入本文。
技术领域
广泛而言，本公开是关于靶向SNCA的RNAi剂及方法。
[序列表]
本申请含有序列表，其已经以ASCII格式提交电子版，并通过引用以其整体并入本文。所述ASCII副本于2021年9月28日创建，名为BN00007_0161_ALN_364WO_SL.txt，大小为687KB。
背景技术
SNCA基因是编码一种突触前神经元蛋白，即α突触核蛋白(本文中也称为alpha突触核蛋白或突触核蛋白α)，并且在遗传及神经病理学上与帕金森病(Parkinson’sdisease，PD)有关(Stefanis，L.Cold Spring Harb Porspect Med.2：a009399)。α突触核蛋白被视为以多种方式对PD发病机制产生影响，普遍认为，α突触核蛋白的异常可溶性寡聚构形(称为原纤维)是一种通过影响各种细胞内靶标(包括突触功能)以介导破坏细胞恒定性及神经元死亡的有毒物质。更有甚者，据信被分泌出的α突触核蛋白，对邻近细胞能产生包含聚集播种(seeding of aggregation)在内的有害影响，因此可能促成疾病传播。尽管α突触核蛋白于所有PD病例中牵涉的范围尚不清楚，靶向此蛋白调控异常时所产生的毒性，体现了一项具有潜在价值的治疗策略，该治疗策略不仅针对PD，也适用于被称为突触核蛋白病的其他神经退化性病况；由于α突触核蛋白的积累，此类神经退化性病况皆表现出常见神经病理学特征，称为路易氏体(Lewy bodies，LB)及路易氏突起(Lewy neurites，LN)。除了PD以外，此类记录在案或疑似SNCA相关的突触核蛋白病包括但不限于：多系统萎缩、路易体痴呆(Lewy body dementia，LBD)、纯自主神经功能衰竭(pure autonomic failure，PAF)、皮克病(Pick’s disease)、进行性核上性麻痹(progressive supranuclear palsy)、拳击性痴呆(dementia pugilistica)、与染色体17相关的帕金森综合征(parkinsonism linkedto chromosome 17)、Lytico-Bodig病、缠结性痴呆(tangle predominant dementia)、嗜银颗粒病(Argyrophilic grain disease)、神经节细胞胶质瘤(ganglioglioma)、神经节细胞瘤(gangliocytoma)、脑膜血管瘤病(meningioangiomatosis)、亚急性硬化性全脑炎(subacute sclerosing panencephalitis)、铅中毒性脑病(lead encephalopathy)、结节性硬化症(tuberous sclerosis)、Hallervorden-Spatz病、脂褐质沉积症(lipofuscinosis)、皮质基底节变性(corticobasal degeneration)、额颞叶痴呆(frontotemporal dementia)、额颞叶退化(frontotemporal lobar degeneration)、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、亨廷顿病(Huntington’s disease)、唐氏综合征(Down’s syndrome)、精神病(psychosis)、精神分裂症(schizophrenia)及克罗伊茨费尔特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease)。
在具有SNCA脑部病理的神经退化性病症中，PD与LBD是为两种最盛行的病症。PD是最常见的运动病症，其特征为僵硬、运动功能减退、震颤及姿势不稳。据信，PD影响全球约400万至600万人。LBD则占所有失智症的5至15％。除健忘及其他经常起伏的失智症状以外，LBD病患通常还会反复跌倒及产生幻视。
除了在α突触核蛋白病中所观察到的神经病理学变化以外，通常，α突触核蛋白量于受影响的大脑区域中会增加(Klucken et al.，2006)。
于伴有脑铁积累的神经退化中，α突触核蛋白的单体、四聚体及纤维状聚集体是路易氏体(LB)样神经元内包涵体、神经胶质包涵体及轴突球体的主要成分。路易氏体相关病理(Lewy-related pathology，LRP)主要是由α突触核蛋白组成，存在于大多数阿尔茨海默病者的尸体解剖中，并且，病患体内较高量的α突触核蛋白与认知能力下降有关(Twohig etal.(2019)Molecular Neurodegeneration)。SNCA基因中的体染色体显性突变，其中，包括A53T、A30P、E46K、H50Q(Zarranz et al.(2004)Ann.Neurol.55，164-173、Choi et al.(2004)FEBS Lett.576，363-368，及Tsigelny et al.(2015)ACS Chem.Neurosci.6，403-416)、A53T(Polymeropoulos et al.(1997)Science)，以及三倍复制(triplications)连同双倍复制(duplications)，均是于患有相关神经退化性疾病的家族中流传。上述情形是表明，除SNCA的致病突变以外，α突触核蛋白的增加亦能影响疾病结果。
SNCA突变在疾病发作中的角色尚不甚清楚，但证据表明，当正常α突触核蛋白超过一定量(Stefanis et al.(2012)Cold Spring #arb Perspect Med.)及/或其与细胞脂质及囊泡有异常地交互作用(于Kiechler et al.(2020)Front.Cell Dev.Biol中回顾)时，其固有毒性功能可获得增强。与此证据明显一致，相较于转基因过度表达子(transgenicover-expressors)，无SNCA小鼠并未表现出明显的神经病理或行为表型(Abeliovich etal.(2000)Neuron)。SNCA的转录后调控(posttranscriptional regulation)亦证明是经由内源性微小RNA(endogenous micro RNAs)结合至该基因的3’端而发生者(Junn et al.(2009)PNAS 106：13052-13057；Doxakis(2010)，JBC)。此外，对家族性SNCA点突变的研究尤其显示，于疾病发作延后的案例中，该基因的表达是受到抑制(Markopoulou et al.(1999)Ann Neurol.46(3)：374-81 and Kobayashi et al.(2003)Brain 126(Pt 1)：32-42)。同样地，Voutsinas et al.(2010)Hum Mutat.31(6)：685-91)亦发现，即便是野生型SNCA信使RNA(mRNA)的过度表达，亦为疾病发作的原因。以上资料表明，抑制总SNCA量可减少α突触核蛋白所引致的毒性。
并无改善突触核蛋白病(包括PD、多系统萎缩及路易体痴呆)病程进展的疗法，且治疗选择有限(例如仅为姑息治疗)。举例而言，当前对PD病患(通过替代大脑中活性多巴胺的损失)及AD病患(即胆碱酯酶抑制剂)仅有症状治疗。所有既存的α突触核蛋白病的治疗策略皆未针对固有疾病的病程。
因此，考虑到上述SNCA涉及数种神经退化性疾患(突触核蛋白病)，仍需要一种能够具选择性、有效地将SNCA基因静默化的药剂(例如消除或减少有毒α突触核蛋白种类的影响)，该药剂利用细胞自身的RNAi机组，其兼具高生物活性及生物体内的安定性，且能有效抑制靶标SNCA基因的表达。
发明内容
本公开提供了RNAi剂组成物，其影响经RNA诱导的静默化复合物(RNA-inducedsilencing complex，RISC)介导的突触核蛋白α(Synuclein alpha，SNCA)基因的RNA转录本的裂解。该SNCA基因可位于细胞内，例如个体(例如人)体内的细胞。本公开进一步提供使用本公开的RNAi剂组成物以抑制SNCA基因的表达，或治疗能受益于抑制或减少SNCA基因的表达的个体的方法，例如，患有或倾向于患有SNCA相关神经退化性疾病或病症者，诸如：PD、多系统萎缩、路易体痴呆(LBD)、纯自主神经功能衰竭(PAF)、皮克病、进行性核上性麻痹、拳击性痴呆、与17号染色体相关的帕金森综合征、Lytico-Bodig病、缠结性痴呆、嗜银颗粒病、神经节细胞胶质瘤、神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、亚急性硬化性全脑炎、铅中毒性脑病、结节性硬化症、Hallervorden-Spatz病、脂褐质沉积症、皮质基底节变性、额颞叶痴呆、额颞叶退化、阿尔茨海默病及亨廷顿病。
据此，一方面，本公开提供了一种双股核糖核酸(RNAi)剂，其是用于抑制SNCA的表达，其中，该dsRNA剂包括构成双股区域的正义股及反义股，并且其中，该正义股包含：包含与SEQ ID NO：1的核苷酸序列的一部分具有0或1个误配的至少15个接续核苷酸的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：1的核苷酸序列的一部分具有至少90％核苷酸序列同一性的核苷酸序列；而该反义股包含：包含与SEQ ID NO：2的核苷酸序列对应的部分具有0或1个误配的至少15个接续核苷酸的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：2的核苷酸序列的一部分具有至少90％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。
于另一方面，本公开提供了一种双股核糖核酸(RNAi)剂，其是用于抑制SNCA基因的表达，其中，该RNAi剂包含正义股及反义股，并且其中，该反义股是包含互补区域，该互补区域包含与表2、3、12或13中所列的任一反义序列相异不超过3个核苷酸(即，差异为3、2、1或0个核苷酸)的至少15个接续核苷酸。
可选择地，该正义股或反义股是接合至一个或多个亲脂性部分。
于某些态样中，该正义股是包含：包含与SEQ ID NO：1的核苷酸序列一部分具有0或1个误配的至少17个接续核苷酸的核苷酸序列；而该反义股包含：包含与SEQ ID NO：2的核苷酸序列对应的部分具有0或1个误配的至少17个接续核苷酸的核苷酸序列，从而使该正义股互补于该反义股中的至少17个接续核苷酸。
于一些态样中，该正义股是包含：包含与SEQ ID NO：1的核苷酸序列一部分具有0或1个误配的至少19个接续核苷酸的核苷酸序列；而该反义股包含：包含与SEQ ID NO：2的核苷酸序列对应的部分具有0或1个误配的至少19个接续核苷酸的核苷酸序列，从而使该正义股互补于该反义股中的至少19个接续核苷酸。
于态样中，该正义股是包含：包含与SEQ ID NO：1的核苷酸序列一部分具有0或1个误配的至少21个接续核苷酸的核苷酸序列；而该反义股包含：包含与SEQ ID NO：2的核苷酸序列对应的部分具有0或1个误配的至少21个接续核苷酸的核苷酸序列，从而使该正义股互补于该反义股中的至少21个接续核苷酸。
于某些态样中，该反义股包含互补区域，该互补区域是包含表2、3、12或13中所列的任一反义序列的至少15个接续核苷酸。于某些态样中，该反义股包括互补区域，该互补区域是包含与表2、3、12或13中所列的任一反义股序列相异不超过3个核苷酸(即，差异为3、2、1或0个核苷酸)的至少19个接续核苷酸。于某些态样中，该反义股包含互补区域，该互补区域包含与表2、3、12或13中所列的任一反义序列的至少19个接续核苷酸。于某些态样中，比对(比较)序列之间胸腺嘧啶-尿嘧啶(thymine-to-uracil)或尿嘧啶-胸腺嘧啶(uracil-to-thymine)的差异，不计为该比对(比较)序列之间的相异核苷酸。
于一些态样中，该剂包含可选择地经由连接子或载剂接合至一个或多个核苷酸位置(可选的内部核苷酸位置)的一个或多个亲脂性部分。于某些态样中，该亲脂性部分是接合至dsRNA剂的双股区域中的一个或多个位置。可选择地，该一个或多个亲脂性部分是至少接合至该正义股。于某些态样中，该一个或多个亲脂性部分是至少接合至该反义股。于态样中，该一个或多个亲脂性部分是与两股均接合。
于态样中，通过logKow量测，该亲脂性部分的亲脂性是超过0。
于一些态样中，通过该双股RNAi剂的血浆蛋白结合测定中的未结合部分量测，该双股RNAi剂的疏水性是超过0.2。可选择地，该血浆蛋白结合测定是使用人血清白蛋白的电泳迁移率变化测定。
本公开另一方面提供了一种双股RNAi剂，其是用于抑制SNCA基因的表达，其中，该dsRNA剂包含正义股及反义股，其中，该正义股包含与表2、3、12或13中所列的任一正义股序列相异不超过3个核苷酸(即，差异为3、2、1或0个核苷酸)的至少15个接续核苷酸；而其中，该反义股包含与表2、3、12或13中所列的任一反义股核苷酸序列相异不超过3个核苷酸的至少15个接续核苷酸。于某些态样中，该正义股包含表2、3、12或13中所列的任一正义股序列的至少15个接续核苷酸；而其中，该反义股包含表2、3、12或13中所列的任一反义股核苷酸序列的至少15个接续核苷酸。于某些态样中，该正义股包含表2、3、12或13中所列的任一正义股序列的至少19个接续核苷酸；而其中，该反义股包含来自表2、3、12或13中任一反义股核苷酸序列的表2、3、12或13中所列的任一反义股核苷酸序列的至少19个接续核苷酸(即，差异为3、2、1或0个核苷酸)。
本公开另一方面提供一种双股RNAi剂，其是用于抑制SNCA基因的表达，其中，该dsRNA剂包含正义股及反义股，其中，该正义股包含与SEQ ID NO：1、3、5或7中任一核苷酸序列相异不超过3个核苷酸(即，差异为3、2、1或0个核苷酸)的至少15个接续核苷酸，或与SEQID NO：1、3、5或7中任一者的完整核苷酸序列具有至少90％核苷酸序列同一性，例如90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的核苷酸序列；其中，以尿嘧啶取代SEQ ID NO：1、3、5或7中的任意胸腺嘧啶(当比较比对序列时)不计为导致与SEQ ID NO：1、3、5或7的任一核苷酸序列相异不超过3个核苷酸的差异(即，差异为3、2、1或0个核苷酸)，或与SEQ IDNO：1、3、5或7中任一者的完整核苷酸序列具有至少90％核苷酸序列同一性，例如90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的核苷酸序列，并且其中，该反义股包含与SEQ IDNO：2、4、6或8的任一核苷酸序列相异不超过3个核苷酸的至少15个接续核苷酸，或与SEQ IDNO：2、4、6或8中任一者的完整核苷酸序列具有至少90％核苷酸序列同一性，例如90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的核苷酸序列；其中，以尿嘧啶取代SEQ ID NO：2、4、6或8的核苷酸序列中的任一胸腺嘧啶(当比较比对序列时)，不计为导致与SEQ ID NO：2、4、6或8的任一核苷酸序列相异不超过3个核苷酸的差异(即，差异为3、2、1或0个核苷酸)，或与SEQ ID NO：2、4、6或8中任一者的完整核苷酸序列具有至少90％核苷酸序列同一性，例如90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的核苷酸序列，其中，该正义股及反义股的至少一者包含一个或多个亲脂性部分，其可选择地经由连接子或载剂接合至一个或多个内部核苷酸位置。
于一态样中，靶向SNCA的该双股RNAi剂包含正义股，其包含与来自表2、3、12或13的一者中的双链体正义核苷酸序列相异不超过3个核苷酸(即，差异为3、2、1或0个核苷酸)的至少15个接续核苷酸。
于一态样中，靶向SNCA的该双股RNAi剂包含反义股，其包含与来自表2、3、12或13的一者中的双链体反义核苷酸序列相异不超过3个核苷酸(即，差异为3、2、1或0个核苷酸)的至少15个接续核苷酸。
可选择地，该双股RNAi剂包含至少一个经修饰的核苷酸。于态样中，不超过五个该正义股的核苷酸及不超过五个该反义股的核苷酸是未修饰的核苷酸。
于某些态样中，该正义股实质上全部的核苷酸均是经修饰的核苷酸。可选择地，该正义股的全部核苷酸均是经修饰的核苷酸。
于一些态样中，该反义股实质上全部的核苷酸均是经修饰的核苷酸。可选择地，该反义股的全部核苷酸均是经修饰的核苷酸。
可选择地，该正义股的全部核苷酸及该反义股的全部核苷酸均是经修饰的核苷酸。
于一态样中，至少一种经修饰的核苷酸是去氧核苷酸、3’-端去氧-胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2’-O-甲基的修饰核苷酸、2’-氟修饰的核苷酸、2’-去氧修饰的核苷酸、锁定的核苷酸、未锁定的核苷酸、构形上受限的核苷酸、约束的乙基核苷酸、无碱基核苷酸、2’-胺基修饰的核苷酸、2’-O-烯丙基修饰的核苷酸、2’-C-烷基修饰的核苷酸、2’-羟基修饰的核苷酸、2’-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2’-O-烷基修饰的核苷酸、味啉基核苷酸、胺基磷酸酯、包含非天然碱基的核苷酸、四氢吡喃饰的核苷酸、1，5-无水己糖醇修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、包含5’-硫代磷酸酯基团的核苷酸、包含5’-甲基膦酸酯基团的核苷酸、包含5’-磷酸酯或5’-磷酸酯模拟物的核苷酸、包含磷酸乙烯酯的核苷酸、包含腺苷-二醇核酸(GNA)的核苷酸、包含胸苷-二醇核酸(GNA)的S异构物的核苷酸、包含2-羟甲基-四氢呋喃-5-磷酸酯的核苷酸、包含2’-去氧胸苷-3’-磷酸酯的核苷酸、包含2’-去氧鸟苷-3’-磷酸酯的核苷酸，以及连结至胆固醇基衍生物或十二烷酸双癸酰胺基团的末端核苷酸。
在相关态样中，该经修饰的核苷酸是2’-去氧-2’-氟修饰的核苷酸、2’-去氧-修饰的核苷酸、3’-端去氧-胸腺嘧啶核苷酸(dT)、锁定的核苷酸、无碱基核苷酸、2’-胺基修饰的核苷酸、2’-烷基修饰的核苷酸、味啉基核苷酸、胺基磷酸酯或包含非天然碱基的核苷酸。
于一态样中，该经修饰的核苷酸包括3’-端去氧-胸腺嘧啶核苷酸(dT)的短序列。
于另一态样中，该核苷酸上的修饰是2’-O-甲基、2’氟及GNA修饰。
于又一态样中，该双股RNAi剂包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间连结。可选择地，该双股RNAi剂包含6至8个(例如，6、7或8个)硫代磷酸酯核苷酸间连结。
于某些态样中，该互补区域的长度是至少17个核苷酸。可选择地，该互补区域的长度是19至23个核苷酸。可选择地，该互补区域的长度是19个核苷酸。
于一态样中，各股的长度是不超过30个核苷酸。
于另一态样中，至少一股包含至少1个核苷酸的3’突出。可选择地，至少一股包含至少2个核苷酸的3’突出。
于态样中，该双股区域的长度是15至30个核苷酸对。
可选择地，该双股区域的长度是17至23个核苷酸对。
于一些态样中，该双股区域的长度是17至25个核苷酸对。
于某些态样中，该双股区域的长度是23至27个核苷酸对。
于态样中，该双股区域的长度是19至21个核苷酸对。
于另一态样中，该双股区域的长度是21至23个核苷酸对。
于态样中，各股具有19至30个核苷酸。可选择地，各股具有19-23个核苷酸。于某些态样中，各股具有21至23个核苷酸。
于一些态样中，该双股RNAi剂还包含亲脂性配体，例如C16配体，其经由单价或分支的二价或三价连接子接合至该正义股的3’端。
于一态样中，该配体是
其中，B是核苷酸碱基或核苷酸碱基类似物，可选择地，其中，B是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
于其他态样中，该剂还包含靶向肝脏组织的靶向配体，例如，一种或多种GalNAc衍生物，可选择地经由连接子或载剂接合至该双股RNAi剂。
于又其他态样中，该剂还包含亲脂性配体，例如，C16配体，其经由单价或分支二价或三价连接子及靶向肝组织的靶向配体接合至该正义股的3’端，例如，一种或多种GalNAc衍生物经由单价或分支二价或三价连接子接合至该正义股的3’端。
于另一态样中，与SNCA互补的区域包含表2、3、12或13中的任一反义序列。
于其他态样中，与SNCA互补的区域是表2、3、12或13中任一反义序列的区域。于一些态样中，该内部核苷酸位置包括除了距离该股各端的末两个位置以外的所有位置
于相关的态样中，该内部位置包括除了距离该股各端的末三个位置以外的所有位置。可选择地，该内部位置不包括该正义股的裂解位点区域。
于一些态样中，该内部位置不包括自该正义股5’端算起的位置9至12。于某些态样中，该正义股的长度是21个核苷酸。
于其他态样中，该内部位置不包括自该正义股3’端算起的位置11至13。可选择地，该内部位置不包括该反义股的裂解位点区域。于某些态样中，该正义股的长度是21个核苷酸。
于一些态样中，该内部位置不包括自该反义股5’端算起的位置12至14。于某些态样中，该反义股的长度是23个核苷酸。
于另一态样中，该内部位置不包括自该正义股3’端算起的位置11至13，以及自该反义股5’端算起的位置12至14。于某些态样中，该正义股的长度是21个核苷酸，而该反义股的长度是23个核苷酸。
于另一态样中，该一个或多个亲脂性部分是接合至一个或多个下列内部位置：从各股的5’端算起，该正义股上的位置4至8及13至18，以及该反义股上的位置6至10及15至18。可选择地，该一个或多个亲脂性部分是接合至一个或多个下列内部位置：从各股5’端算起，该正义股上的位置5、6、7、15及17，以及该反义股上的位置15及17。于某些态样中，该正义股的长度是21个核苷酸，该反义股的长度是23个核苷酸。
可选择地，该亲脂性部分接合至该正义股的位置21、位置20、位置15、位置1、位置7、位置6或位置2，或该反义股的位置16处。
于某些态样中，该亲脂性部分接合至该正义股的位置21、位置20、位置15、位置1或位置7处。
于态样中，该亲脂性部分接合至该正义股的位置21、位置20或位置15处。
于一些态样中，该亲脂性部分接合至该正义股的位置20或位置15处。
于态样中，该亲脂性部分接合至该反义股的位置16处。
于某些态样中，该亲脂性部分是脂族、脂环族或多脂环族化合物。可选择地，该亲脂性部分是脂质、胆固醇、视黄酸、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾固酮、1，3-双-O(十六烷基)甘油、香叶氧基己醇、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1，3-丙二醇、十七烷基基团、棕榈酸、肉荳蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆酸、二甲氧基三苯甲基或啡
于一些态样中，该亲脂性部分含有饱和或不饱和的C4-C30烃链，以及任选的官能基，其选自羟基、胺、羧酸、磺酸酯、磷酸酯、硫醇、迭氮化物或炔。
于某些态样中，该亲脂性部分含有饱和或不饱和的C6-C18烃链。可选择地，该亲脂性部分含有饱和或不饱和的C16烃链。于一相关态样中，该亲脂性部分是经由载剂接合，该载剂替换该内部位置中的一个或多个核苷酸。于某些态样中，该载体是环状基团，其是吡咯啶基、吡唑啉基、吡唑啶基、咪唑啉基、咪唑啶基、哌啶基、哌基、[1，3]二氧戊环基、唑啶基、异唑啶基、味啉基、噻唑啶基、异噻唑啶基、喹啉基、嗒酮基、四氢呋喃基或十氢萘基；或是基于丝胺醇骨干或二乙醇胺骨干的非环状部分。
于态样中，该饱和或不饱和的C16烃链是接合至自该股5’端算起的位置6处。
于一些态样中，该亲脂性部分是经由连接子接合至该双股RNAi剂，该连接子含有醚、硫醚、脲、碳酸酯、胺、酰胺、顺丁烯二酰亚胺-硫醚、二硫化物、磷酸二酯、磺酰胺连结、键击反应产物或胺基甲酸酯。
于一态样中，该亲脂性部分接合至核碱基、糖部分或核苷间连结。
于另一态样中，该双股RNAi剂还包括位于该反义股5’端的磷酸酯或磷酸酯模拟物。于一态样中，该磷酸酯模拟物是5’-乙烯基磷酸酯(VP)。于另一态样中，该磷酸酯模拟物是5’-环丙基磷酸酯。
于某些态样中，该双链RNAi剂还包含靶向配体，其靶向介导递送至CNS组织的受体，例如亲水性配体。于某些态样中，该靶向配体是C16配体。
于一些态样中，该双链RNAi剂还包含靶向脑组织，例如纹状体的靶向配体。
于一些态样中，该双链RNAi剂还包含靶向肝组织，例如肝细胞的靶向配体。
于一态样中，该亲脂性部分或靶向配体经由生物可裂解的连接子连结子接合，该连接子是DNA、RNA、二硫化物、酰胺、半乳糖胺、葡萄糖胺、葡萄糖、半乳糖、甘露糖的官能化单醣或寡糖或其组合。
于相关态样中，该正义股的3’端是经由具有胺的环状基团的端帽保护，所述环状基团是吡咯啶基、吡唑啉基、吡唑啶基、咪唑啉基、咪唑啶基、哌啶基、哌基、[1，3]二氧戊环基、唑啶基、异唑啶基、味啉基、噻唑啶基、异噻唑啶基、喹啉基、嗒酮基、四氢呋喃基及十氢萘基。
于一态样中，该RNAi剂包含至少一种经修饰的核苷酸：2’-O-甲基修饰的核苷酸、2’-氟修饰的核苷酸、包含二醇核酸(GNA)的核苷酸或包含乙烯基磷酸酯的核苷酸。可选择地，该RNAi剂包含以下各修饰中的至少一者：2’-O-甲基修饰的核苷酸、2’-氟修饰的核苷酸、包含二醇核酸(GNA)的核苷酸及包含乙烯基磷酸酯的核苷酸。
于另一态样中，该RNAi剂包含如下表2或12中提供的经修饰核苷酸的模式，其中，可选择地，2’-C16、2’-O-甲基、GNA、硫代磷酸酯及2’-氟修饰的位置与所呈现的RNAi剂的个别核苷酸碱基序列无关。
于态样中，该dsRNA剂还包含：发生于反义股3’端第一个核苷酸间连结处的末端手性修饰，且具有Sp组态的连结磷原子；发生于反义股5’端第一个核苷酸间连结处的末端手性修饰，且具有Rp组态的连结磷原子；或发生于正义股5’端第一个核苷酸间连结处的末端手性修饰，且具有Rp组态或Sp组态的连结磷原子。
于一些态样中，该dsRNA剂还包含：发生于反义股3’端第一及第二个核苷酸间连结处的末端手性修饰，且具有Sp组态的连结磷原子；发生于反义股5’端第一个核苷酸间连结处的末端手性修饰，且具有Rp组态的连结磷原子；或发生于正义股5’端第一个核苷酸间连结处的末端手性修饰，且具有Rp或Sp组态的连结磷原子。
于某些态样中，该dsRNA剂还包括：发生于反义股3’端第一、第二及第三个核苷酸间连结处的末端手性修饰，且具有Sp组态的连结磷原子；发生于反义股5’端第一个核苷酸间连结处的末端手性修饰，且具有Rp组态的连结磷原子；或发生于正义股5’端第一个核苷酸间连结处的末端手性修饰，且具有Rp或Sp组态的连结磷原子。
于态样中，该dsRNA剂还包括：发生于反义股3’端第一及第二个核苷酸间连结处的末端手性修饰，且具有Sp组态的连结磷原子；发生于反义股3’端第三个核苷酸间连结处的末端手性修饰，且具有Rp组态的连结磷原子；发生于反义股5’端第一个核苷酸间连结处的末端手性修饰，且具有Rp组态的连结磷原子；或发生于正义股5’端第一个核苷酸连结处的末端手性修饰，且具有Rp或Sp组态的连结磷原子。
于一些态样中，该dsRNA剂还包括：发生于反义股3’端第一及第二个核苷酸间连结处的末端手性修饰，且具有Sp组态的连结磷原子；发生于反义股5’端第一及第二个核苷酸间连结处的末端手性修饰，且具有Rp组态的连结磷原子；或发生于正义股5’端第一个核苷酸间连结处的末端手性修饰，且具有Rp或Sp组态的连结磷原子。
于其他态样中，表2、9及12的各该双链体可被特别修饰，以提供本公开的另一双股iRNA剂。于一实例中，每条正义股的3’-端可通过去除3’-端L96配体并将三个3’-端核苷酸间的两个磷酸二酯核苷酸间连结与硫代磷酸酯核苷酸间连结交换来进行修饰。即，下式的正义序列的三个3’-端核苷酸(N)：
5’-N1-…-Nn-2Nn-1NnL96-3’
可替换为
5’-N1-…-Nn-2 sNn-1 sNn-3’。
意即，例如，对于AD-1549052，该正义序列：
asasgag(Chd)aaGfUfGfacaaauguuaL96
可替换为
asasgag(Chd)aaGfUfGfacaaaugususa
而反义序列保持不变，以提供本公开的另一双股iRNA剂。于其他实例中，下列各双链体中的正义股是依前述修饰的，以提供本公开的双链体：AD-596172、AD-596323、AD-596177、AD-596137、AD-596130、AD-596231、AD-595926、AD-596124、AD-596133、AD-595854、AD-596175、AD-596170、AD-596436、AD-596319、AD-596168、AD-596215、AD-596425、AD-595769、AD-596171、AD-596392、AD-596402、AD-596144、AD-596396、AD-596517、AD-596426、AD-596169、AD-596391、AD-596320、AD-596283、AD-596362、AD-596431、AD-596515、AD-596128、AD-596235、AD-596322、AD-596427、AD-596127、AD-595855、AD-596129及AD-595866。于其他实例中，以下各双链体中的正义股是依前述修饰的，以提供本公开的双链体：AD-596137.1、AD-596319.1、AD-596177.1、AD-596172.1、AD-596323.1、AD-596215.1、AD-596231.1、AD-596170.1、AD-596168.1、AD-596130.1、AD-595854.1、AD-595926.1、AD-596133.1、AD-596175.1、AD-596171.1、AD-595769.1、AD-596392.1、AD-596425.1、AD-596515.1、AD-596144.1、AD-596436.1、AD-596124.1、AD-596402.1、AD-596517.1、AD-596391.1、AD-596169.1、AD-596396.1、AD-596427.1、AD-596426.1、AD-595866.1、AD-596431.1、AD-596362.1、AD-596320.1、AD-595855.1、AD-596235.1、AD-596283.1、AD-596129.1、AD-596390.1、AD-596131.1、AD-58643.17、AD-596322.1、AD-596128.1及AD-596127.1。于其他实例中，以下各双链体中的正义股是依前述修饰的，以提供本公开的双链体：AD-595769.2、AD-595770.1、AD-595773.1、AD-595774.1、AD-595926.2、AD-595933.1、AD-595935.1、AD-595937.1、AD-595938.1、AD-596099.1、AD-596215.2、AD-596217.1、AD-596276.1、AD-596328.1、AD-596390.2、AD-596391.2、AD-596392.2、AD-596393.1、AD-596394.1、AD-596395.1、AD-596396.2、AD-596397.1、AD-596398.1、AD-596401.1、AD-596402.2、AD-596403.1、AD-596521.1、AD-596564.1、AD-689314.1、AD-689315.1、AD-689316.1、AD-689318.1、AD-689319.1、AD-689320.1、AD-689452.1、AD-689459.1、AD-689461.1、AD-689462.1、AD-689463.1、AD-689464.1、AD-689615.1、AD-689616.1、AD-689747.1、AD-689748.1、AD-689753.1、AD-689755.1、AD-689786.1、AD-689787.1、AD-689788.1、AD-689835.1、AD-689907.1、AD-689925.1、AD-689926.1、AD-689927.1、AD-689928.1、AD-689929.1、AD-689930.1、AD-689931.1、AD-689932.1、AD-689933.1、AD-689934.1、AD-689935.1、AD-689936.1、AD-689937.1、AD-689938.1、AD-689939.1、AD-690068.1、AD-690079.1、AD-690080.1、AD-690092.1、AD-691823.1、AD-691824.1、AD-691843.1、AD-691844.1、AD-691845.1、AD-691875.1、AD-691953.1及AD-691954.1。于其他实例中，以下各双链体中的正义股是依前述修饰的，以提供本公开的双链体：AD-1549052.1、AD-1549359.1、AD-1549054.1、AD-1571262.1、AD-1549333.1、AD-1549407.1、AD-1548854.1、AD-1549403.1、AD-1549283.1、AD-1549641.1、AD-1549267.1、AD-1548851.1、AD-1548869.1、AD-1549272.1、AD-1571164.1、AD-1549354.1、AD-1571188.1、AD-1549401.1、AD-1548886.1、AD-1571191.1、AD-1571193.1、AD-1548884.1、AD-1571187.1、AD-1549357.1、AD-1571194.1、AD-1549285.1、AD-1549266.1、AD-1549351.1、AD-1548870.1、AD-1549245.1、AD-1549334.1、AD-1549397.1、AD-1549290.1、AD-1549525.1、AD-1549406.1、AD-1549284.1、AD-1549439.1、AD-1549269.1、AD-1549518.1、AD-1549628.1、AD-1571199.1、AD-1549442.1、AD-1549596.1、AD-1549400.1、AD-1549280.1、AD-1549441.1、AD-1549556.1、AD-1571202.1、AD-1549271.1、AD-1549517.1、AD-1549293.1、AD-1549639.1、AD-1549443.1、AD-1571195.1、AD-1549595.1、AD-1549546.1、AD-1549246.1、AD-1571192.1、AD-1571165.1、AD-1549270.1、AD-1549521.1、AD-1549541.1、AD-1549552.1、AD-1549522.1、AD-1549545.1、AD-1549519.1、AD-1549630.1、AD-1549353.1、AD-1549544.1、AD-1549642.1、AD-1549438.1、AD-1549412.1、AD-1571198.1、AD-1571258.1、AD-1571201.1、AD-1549640.1、AD-1571266.1、AD-1571172.1、AD-1549527.1、AD-1549547.1、AD-1549037.1、AD-1571205.1、AD-1549053.1、AD-1571264.1、AD-1571186.1、AD-1571204.1、AD-1549555.1、AD-1548887.1、AD-1549426.1、AD-1548844.1、AD-1549520.1、AD-1549543.1、AD-1549548.1、AD-1571206.1、AD-1549210.1、AD-1571200.1、AD-1571207.1、AD-1549542.1、AD-1549211.1、AD-1571263.1、AD-1549391.1、AD-1549212.1、AD-1549268.1、AD-1549352.1、AD-1571261.1、AD-1549044.1、AD-1549554.1、AD-1548975.1、AD-1549432.1、AD-1549524.1、AD-1549643.1、AD-1571196.1、AD-1571203.1、AD-1549425.1、AD-1549264.1、AD-1549249.1、AD-1571257.1、AD-1549265.1、AD-1548843.1、AD-1548845.1、AD-1571256.1、AD-1571255.1、AD-1571174.1、AD-1571173.1、AD-1548876.1、AD-1549615.1、AD-1571166.1、AD-1571269.1、AD-1548976.1、AD-1549038.1、AD-1571167.1、AD-1571170.1、AD-1548888.1、AD-1571189.1、AD-1571259.1、AD-1549224.1、AD-1571208.1、AD-1549222.1、AD-1571268.1、AD-1571270.1、AD-1549217.1、AD-1571184.1、AD-1571271.1、AD-1571272.1、AD-1571190.1、AD-1549055.1、AD-1571169.1及AD-1571265.1。
本公开另一方面提供了含有本公开的dsRNA剂的细胞。
本公开一方面提供了用于抑制编码SNCA基因的表达的医药组成物，其包含本公开的dsRNA剂。
本公开另一方面提供了抑制细胞中SNCA基因的表达的方法，该方法涉及：(a)令该细胞与本公开的双股RNAi剂或本公开的医药组成物接触；及(b)将步骤(a)中产生的细胞维持足以令SNCA基因的mRNA转录本降解的时间，从而抑制该SNCA基因在该细胞中的表达。
于一态样中，该细胞是位于个体体内。可选择地，该个体是人。
于某些态样中，该个体是恒河猴、食蟹猴、小鼠或大鼠
于态样中，SNCA的表达是被抑制至少50％。
于某些态样中，该个体是符合SNCA相关疾病的至少一项诊断标准。
于某些态样中，该人类个体已被诊断患有或有SNCA相关的神经退化性疾病，举例而言，突触核蛋白病，例如PD、多系统萎缩、路易体痴呆(LBD)、纯自主神经功能衰竭(PAF)、皮克病、进行性核上性麻痹、拳击性痴呆、与17号染色体相关的帕金森综合征、Lytico-Bodig病、缠结性痴呆、嗜银颗粒病、神经节细胞胶质瘤、神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、亚急性硬化性全脑炎、铅中毒性脑病、结节性硬化症、Hallervorden-Spatz病、脂褐质沉积症、皮质基底节变性、额颞叶失智症、额颞叶退化、阿尔茨海默病、亨廷顿病、唐氏综合征、精神病、精神分裂症及克罗伊茨费尔特-雅各布病。
于某些态样中，该方法复涉及向该个体施用额外治疗剂或疗法。示例性额外治疗剂及疗法包含，例如：镇静剂、抗忧郁药(antidepressants)、氯硝西泮(clonazepam)、丙戊酸钠(sodium valproate)、鸦片剂(opiates)、抗癫痫药、胆碱酯酶抑制剂(cholinesteraseinhibitors)、美金刚(memantine)、苯二氮卓类(benzodiazepines)、左旋多巴(levodopa)、COMT抑制剂(例如，托卡朋(tolcapone)及恩他卡朋(entacapone))、多巴胺激动剂(例如，溴隐亭(bromocriptine)、培高利特(pergolide)、普拉克索(pramipexole)、罗匹尼罗(ropinirole)、哌贝地尔(piribedil)、卡麦角林(cabergoline)、阿朴吗啡(apomorphine)及麦角乙脲(lisuride))、MAO-B抑制剂(例如，沙芬酰胺(safinamide)、司来吉兰(selegiline)及雷沙吉兰(Fasagiline))、金刚烷胺(amantadine)、抗胆碱能药物(anticholinergic)、莫达非尼(modafinil)、匹马万色林(pimavanserin)、多虑平(doxepin)、雷沙吉兰(rasagiline)、抗精神病药(antipsychotic)、非典型精神药(例如胺磺必利(amisulpride)、奥氮平(olanzapine)、利培酮(risperidone)及氯氮平(clozapine))、利鲁唑(riluzole)、依达拉奉(edaravone)、深部脑刺激、非侵入性通气(non-invasive ventilation，NIV)治疗、侵入性通气物理治疗、职能治疗、言语治疗、饮食改变及吞咽技巧、喂食管、PEG管、益生菌及心理治疗。
于某些态样中，该双股RNAi剂以约0.01mg/kg至约50mg/kg的剂量给药。
于一些态样中，该双股RNAi剂是经鞘内施予至个体。
于一态样中，该方法降低脑(例如纹状体)或脊柱组织中SNCA基因的表达。可选择地，脑或脊柱组织是纹状体、皮质、小脑、颈椎、腰椎或胸椎。
于一些态样中，将该双股RNAi剂经皮下施予该个体。
于一态样中，该方法降低肝脏中SNCA基因的表达。
于其他态样中，该方法降低肝脏及脑中SNCA基因的表达。
本公开另一方面提供治疗被诊断患有SNCA相关神经退化性疾病的个体的方法，该方法涉及向个体施用治疗有效量的本公开dsRNA剂或医药组成物，从而治疗该个体。
于一态样中，该治疗是涉及改善该疾病的至少一种征候或症状。
于某些态样中，该治疗是包含预防该疾病的进展。
于态样中，SNCA相关疾病的特征在于帕金森病(PD)的症状，例如震颤、运动缓慢(运动迟缓)、肌肉僵硬、姿势及平衡受损、自发运动丧失、言语改变、书写改变；路易体痴呆的症状，如视觉、听觉、嗅觉或触觉幻觉，帕金森病的征候(帕金森综合征征候)，身体功能(自主神经系统)调节不良，如头晕、跌倒及排便问题，认知问题如意识模糊、注意力不集中、视觉空间问题及记忆力减退、睡眠困难，例如快速动眼(RFM)睡眠行为障碍(其中睡眠时肢体动作表达出梦境)、注意力波动，包括嗜睡、长时间发呆、白天长时间小睡或语无伦次、忧郁及冷漠，纯自主神经功能衰竭症状，例如姿态型低血压(当一个人起立时血压突然下降，导致其感到头晕目眩，以及需要坐下、蹲下或躺下以防止昏厥)，多系统萎缩症状，如运动缓慢、颤抖、僵直(僵硬)、笨拙或不协调、言语障碍、嘶哑、颤抖的声音、由于体位性低血压引起的昏厥或头晕、膀胱控制问题，例如突然想排尿或排空膀胱困难、手或四肢挛缩(关节周围肌肉或肌腱慢性缩短，导致关节无法自由运动)，比萨综合征(身体似乎向一侧倾斜的异常姿势)，颈项前屈(颈部向前弯曲，头部下垂)，不自主及无法控制叹息或喘气，以及睡眠困难，如快速动眼(RFM)睡眠行为障碍。
于某些态样中，SNCA相关疾病是突触核蛋白病，例如PD、多系统萎缩、路易体痴呆(LBD)、纯自主神经功能衰竭(PAF)、皮克病、进行性核上性麻痹、拳击性痴呆、与17号染色体相关的帕金森综合征、Lytico-Bodig病、缠结性痴呆、嗜银颗粒病、神经节细胞胶质瘤、神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、亚急性硬化性全脑炎、铅中毒性脑病、结节性硬化症、Hallervorden-Spatz病、脂褐质沉积症、皮质基底节变性、额颞叶痴呆、额颞叶退化、阿尔茨海默病及亨廷顿病。
本公开另一方面提供一种于符合至少一项SNCA相关神经退化性疾病诊断标准的个体中预防SNCA相关神经退化性疾病发展的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的本公开dsRNA剂或其医药组成物，从而防止于符合SNCA相关神经退化性疾病至少一项诊断标准的个体中SNCA相关神经退化性疾病的发展。
于某些态样中，该方法进一步包括向该个体施用适合于治疗或预防SNCA相关疾病或病症的额外药剂或疗法。
本公开另一方面提供一种抑制该个体中SNCA的表达的方法，该方法是涉及：向该个体施用治疗有效量本公开的双股RNAi剂或本公开的医药组成物，从而抑制SNCA在该个体中的表达。
本公开另一方面提供了治疗或预防该个体的疾患或SNCA相关神经退化性疾病或病症的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量本公开的双股RNAi剂或本公开的医药组成物，从而治疗或预防该个体的SNCA相关神经退化性疾病或病症。
本公开另一方面提供了用于抑制SNCA基因的表达的双股RNAi剂，其中，该双股RNAi剂包含与反义股互补的正义股，其中，该反义股包含与编码SNCA的mRNA的部分互补的区域，其中，各股长约14至约30个核苷酸，其中，该双股RNAi剂是由式(III)表示：
正义：5’np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq3’
反义：3’np′-Na′-(X′ X′ X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′ Z′ Z′)1-Na′-nq′5’ (III)
其中：
i、j、k及1各自独立为0或1；
p、p’、q及q’各自独立为0至6；
Na及Na’各自独立表示包含0至25个经修饰或未修饰的核苷酸或其组合的寡核苷酸序列，各序列包含至少两个经不同修饰的核苷酸；
Nb及Nb’各自独立表示一个寡核苷酸序列，其包含0至10个经修饰或未修饰的核苷酸或其组合；
np、np’、nq及nq’，可能存在或不存在，各自独立表示突出端核苷酸；
XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’及Z’Z’Z’各自独立表示三个接续核苷酸上的三个相同修饰的一个模体；
Nb上的修饰是不同于Y上的修饰，及Nb’上的修饰是不同于Y’上的修饰；以及
其中，该正义股是与至少一个配体接合。
于一态样中，i是0；j是0；i是1；j是1；i及j均是0；或i及j均是1。
于另一态样中，k是0；1是0；k是1；1是1；k及1均是0；或k及1均是1。
于某些态样中，XXX与X’X’X’互补，YYY与Y’Y’Y’互补，并且ZZZ与Z’Z’Z’互补。
于另一态样中，YYY模体出现于正义股的裂解位点处或其附近。
于其他态样中，Y’Y’Y’模体出现于反义股的5’端的11、12及13位置。可选择地，Y’是2’-O-甲基。
于一些态样中，式(III)是由式(IIIa)表示：
正义：5’np-Na-Y Y Y-Na-nq3’
反义：3’np′-Na′-Y′Y′Y′-Na′-nq′5’ (IIIa)。
于另一态样中，式(III)是由式(IIIb)表示：
正义：5’np-Na-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq3’
反义：3’np′-Na′-Y′ Y′ Y′-Nb′-Z′ Z′ Z′-Na′-nq′5’ (IIIb)
其中，Nb及Nb’各自独立表示含有1-5个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
于另一态样中，式(III)是由式(IIIc)表示：
正义：5’np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Na-nq3’
反义：3’np′-Na′-X′ X′ X′-Nb′-Y′ Y′ Y′-Na′-nq′5’(IIIc)
其中，Nb及Nb’各自独立表示含有1-5个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
于某些态样中，式(III)是由式(IIId)表示：
正义：5’np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq3’
反义：3’np′-Na′-X′ X′ X′-Nb′-Y′ Y′ Y′-Nb′-Z′ Z′ Z′-Na′-nq′5’ (IIId)
其中，Nb及Nb’各自独立表示含有1至5个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列，而Na及Na’各自独立表示含有2至10个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
于另一态样中，该双股区域的长度是15至30个核苷酸对。可选择地，双股区域的长度是17至23个核苷酸对。
于某些态样中，该双股区域的长度是17至25个核苷酸对。可选择地，该双股区域的长度是23至27个核苷酸对。
于一些态样中，该双股区域的长度是19至21个核苷酸对。可选择地，该双股区域长度是21至23个核苷酸对。
于某些态样中，各股具有15至30个核苷酸。可选择地，各股具有19至30个核苷酸。可选择地，各股具有19至23个核苷酸。
于某些态样中，该双股区域长度是19至21个核苷酸对，且各股具有19至23个核苷酸。
在另一态样中，该RNAi剂的核苷酸是经修饰为LNA、乙二醇核酸(GNA)、HNA、CeNA、2′-甲氧基乙基、2′-O-烷基、2′-O-烯丙基、2′-C-烯丙基、2′-氟、2′-去氧或2’-羟基及其组合。可选择地，对核苷酸的修饰包含2’-O-甲基、2’-氟或GNA及其组合。于一相关态样中，对核苷酸的修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰。
于一态样中，该RNAi剂包含配体，该配体是或是包含一个或多个亲脂性部分，如C16部分，其是通过二价或三价分支连接子附接。
于其他态样中，该剂还包含靶向肝组织的靶向配体，如一种或多种GalNAc衍生物。
于又其他态样中，该剂还包含亲脂性配体如C16配体，其是经由单价或分支的二价或三价连接子接合至正义股的3’端及靶向肝组织的靶向配体，例如，一种或多种GalNAc衍生物经由单价或分支的二价或三价连接子接合至正义股的3’端。
于某些态样中，该配体是附接至正义股的3′端。
于一些态样中，该RNAi剂还包含至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连结。于相关态样中，硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连结是位于一股的3’端。可选择地，该股是反义股。于另一态样中，该股是正义股。于相关态样中，硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连结是位于一股的5’端。可选择地，该股是反义股。于另一态样中，该股是正义股。
于另一态样中，硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连结是位于一股的5’及3’端。可选择地，该股是反义股。于另一态样中，该股是正义股。
于其他态样中，位于RNAi剂双链体反义股5′端位置1的碱基对是A：U碱基对。
于某些态样中，Y核苷酸含有2′-氟修饰。
于一些态样中，Y′核苷酸含有2′-O-甲基修饰。
于某些态样中，p’＞0。可选择地，p’＝2。
于一些态样中，q’＝0、p＝0、q＝0以及p’突出端核苷酸是互补于靶标mRNA。
于某些态样中，q’＝0、p＝0、q＝0以及p’突出端核苷酸是非互补于靶标mRNA。
于一态样中，该RNAi剂的正义股具有总共21个核苷酸且反义股具有总共23个核苷酸。
于另一态样中，至少一个np’经由硫代磷酸酯连结接合至相邻核苷酸。可选择地，所有np’均经由硫代磷酸酯连结接合至相邻核苷酸。
于某些态样中，本公开的SNCA RNAi剂是表2、3、12或13所列的一者。于一些态样中，正义股的全部核苷酸及反义股的全部核苷酸是包含修饰。
本公开另一方面提供了用于抑制细胞中SNCA基因的表达的双股RNAi剂，其中，该双股RNAi剂包含与反义股互补的正义股，其中，该反义股包含与编码SNCA基因的mRNA部分互补的区域，其中，各股长度是约14至约30个核苷酸，其中，该双股RNAi剂是由式(III)表示：
正义：5’np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq3’
反义：3’np′-Na′-(X′ X′ X′)k-Nb′-Y′ Y′ Y′-Nb′-(Z′ Z′ Z′)1-Na′-nq′5’(III)
其中，
i、j、k及l各自独立为0或1；
p、p’、q及q’各自独立为0至6；
Na及Na’各自独立表示包含0至25个经修饰或未修饰的核苷酸或其组合的寡核苷酸序列，各序列包含至少两个经不同修饰的核苷酸；
Nb及Nb’各自独立表示一个寡核苷酸序列，其包含0至10个经修饰或未修饰的核苷酸或其组合；
np、np’、nq及nq’，可能存在或不存在，各自独立表示突出端核苷酸；
XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’及Z’Z’Z’各自独立表示三个接续核苷酸上的三个相同修饰的一个模体，并且其中，该修饰是2′-O-甲基或是2′-氟修饰；
Nb上的修饰是不同于Y上的修饰，及Nb’上的修饰是不同于Y’上的修饰；以及
其中，正义股是与至少一个配体接合，可选择地，其中，该配体是一种或多种亲脂性配体如C16配体，或是一种或多种GalNAc衍生物。
本公开另一方面提供了用于抑制细胞中SNCA基因的表达的双股RNAi剂，其中，该双股RNAi剂包含与反义股互补的正义股，其中，该反义股包含与编码SNCA的mRNA部分互补的区域，其中，各股长度是约14至约30个核苷酸，其中，该双股RNAi剂是由式(III)表示：
正义：5’np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq3’
反义：3’np′-Na′-(X′ X′ X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′ Z′ Z′)1-Na′-nq′5’ (III)
其中：
i、j、k及1各自独立为0或1；
np、nq及nq’各自可能存在或不存在，各自独立表示突出端核苷酸；
p、q及q′各自独立为0至6；
np’＞0且至少一个np’是经硫代磷酸酯连结接合至相邻的核苷酸；
Na及Na’各自独立表示包含0至25个经修饰或未修饰的核苷酸或其组合的寡核苷酸序列，各序列包含至少两个经不同修饰的核苷酸；
Nb及Nb’各自独立表示一个寡核苷酸序列，其包含0至10个经修饰或未修饰的核苷酸或其组合；
XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’及Z’Z’Z’各自独立表示三个接续核苷酸上的三个相同修饰的一个模体，并且其中，该修饰是2′-O-甲基、乙二醇核酸(GNA)或是2′-氟修饰；
Nb上的修饰是不同于Y上的修饰，及Nb’上的修饰是不同于Y’上的修饰；以及
其中，正义股是与至少一个配体接合，可选择地，其中，该配体是一种或多种亲脂性配体如C16配体，或是一种或多种GalNAc衍生物。
本公开另一方面提供了一种抑制细胞中SNCA基因的表达的双股RNAi剂，其中，该双股RNAi剂包含与反义股互补的正义股，其中，该反义股包含与编码SNCA的mRNA(SEQ IDNO：1，或与SEQ ID NO：1整个核苷酸序列具有至少90％核苷酸序列同一性的核苷酸序列，例如90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性)部分互补的区域，其中，各股长度是约14至约30个核苷酸，其中，该双股RNAi剂是由式(III)表示：
正义：5’np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq3’
反义：3’np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′ Z′ Z′)1-Na′-nq′5’ (III)
其中：
i、j、k及l各自独立为0或1；
np、nq及nq’各自可能存在或不存在，各自独立表示突出端核苷酸；
p、q及q’各自独立为0至6；
np’＞0且至少一个np’是经硫代磷酸酯连结接合至相邻核苷酸；
Na及Na’各自独立表示包含0至25个经修饰或未经修饰核苷酸或其组合的寡核苷酸序列，各序列包含至少两个经不同修饰的核苷酸；
Nb及Nb’各自独立表示包含0至10个经修饰或未经修饰核苷酸或其组合的寡核苷酸序列；
XXX、YYY、ZZZ、X′ X′ X、Y′ Y′ Y′及Z′ Z′ Z′各自独立表示三个接续核苷酸上三个相同修饰的一个模体，其中，该修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰；
Nb上的修饰是不同于Y上的修饰，及Nb’上的修饰是不同于Y’上的修饰；以及
其中，正义股是与至少一个配体接合，可选择地，其中，该配体是一种或多种亲脂性配体如C16配体，或是一种或多种GalNAc衍生物。
本公开另一方面提供了用于抑制细胞中SNCA基因的表达的双股RNAi剂，其中，该双股RNAi剂包含与反义股互补的正义股，其中，该反义股包含与编码SNCA的mRNA(SEQ IDNO：1，或与SEQ ID NO：1整个核苷酸序列具有至少90％核苷酸序列同一性的核苷酸序列，例如90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性)部分互补的区域，其中，各股长度是约14至约30个核苷酸，其中，该双股RNAi剂是由式(III)表示：
正义：5’np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq3’
反义：3’np′-Na′-(X′ X′ X′)k-Nb′-Y′ Y′ Y′-Nb′-(Z′ Z′ Z′)1-Na′-nq′5’(III)
其中：
i、j、k及l各自独立为0或1；
np、nq及nq’各自可能存在或不存在，各自独立表示突出端核苷酸；
p、q及q’各自独立为0至6；
np’＞0且至少一个np’是经硫代磷酸酯连结接合至相邻核苷酸；
Na及Na’各自独立表示包含0至25个经修饰或未经修饰核苷酸或其组合的寡核苷酸序列，各序列包含至少两个经不同修饰的核苷酸；
Nb及Nb’各自独立表示包含0至10个经修饰或未经修饰核苷酸或其组合的寡核苷酸序列；
XXX、YYY、ZZZ、X′ X′ X、Y′ Y′ Y′及Z′ Z′ Z′各自独立表示三个接续核苷酸上三个相同修饰的一个模体，其中，该修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰；
Nb上的修饰是不同于Y上的修饰，Nb’上的修饰是不同于Y’上的修饰；及
其中，正义股包含至少一个硫代磷酸酯连结；及
其中，正义股是与至少一个配体接合，可选择地，其中，该配体是一种或多种亲脂性配体如C16配体，或是一种或多种GalNAc衍生物。
本公开另一方面提供了用于抑制细胞中SNCA基因的表达的双股RNAi剂，其中，该双股RNAi剂包含与反义股互补的正义股，其中，该反义股包含与编码SNCA的mRNA(SEQ IDNO：1，或与SEQ ID NO：1整个核苷酸序列具有至少90％核苷酸序列同一性的核苷酸序列，例如90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性)部分互补的区域，其中，各股长度是约14至约30个核苷酸，其中，该双股RNAi剂是由式(III)表示：
正义：5’np-Na-Y Y Y-Na-nq3’
反义：3’np′-Na′-Y′ Y′ Y′-Na′-nq′5’ (IIIa)
其中：
np、nq及nq’各自可能存在或不存在，各自独立表示一个突出端核苷酸；
p、q是q’各自独立为0至6；
np’＞0且至少一个np’是经硫代磷酸酯连结接合至相邻的核苷酸；
Na及Na’各自独立表示包含0至25个经修饰或未经修饰核苷酸或其组合的寡核苷酸序列，各序列包含至少两个经不同修饰的核苷酸；
YYY及Y’Y’Y’各自独立表示三个接续核苷酸上三个相同修饰的一个模体，其中，该修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰；
其中，该正义股包含至少一个硫代磷酸酯连结；及
其中，该正义股是与至少一个配体接合，可选择地，其中，该配体是一种或多种亲脂性配体如C16配体，或是一种或多种GalNAc衍生物。
本公开另一方面提供双股核糖核酸(RNAi)剂，其是用于抑制SNCA基因的表达，其中，该靶向SNCA的双股RNAi剂包含正义股及反义股而形成双股区域，其中，该正义股包含与SEQ ID NO：1、3、5及7中任一核苷酸序列相异不超过3个核苷酸(即，差异为3、2、1或0个核苷酸)的至少15个接续核苷酸，或与SEQ ID NO：1、3、5或7中任一者的完整核苷酸序列具有至少90％核苷酸序列同一性，例如：90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的核苷酸序列；以及该反义股包含与SEQ ID NO：2、4、6及8中任一核苷酸序列相异不超过3个核苷酸(即，差异为3、2、1或0个核苷酸)的至少15个接续核苷酸，或与SEQ ID NO：2、4、6和8中任一者的完整核苷酸序列具有至少90％核苷酸序列同一性，例如90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的核苷酸序列；其中，在SEQ ID NO：1至8所提供的序列中的任一胸腺嘧啶被尿嘧啶所取代(当比较比对序列时)不计为导致与SEQ ID NO：1至8所提供核苷酸序列的任一者相异不超过3个核苷酸的差异，其中，正义股实质上所有核苷酸都包含2’-O-甲基修饰、GNA或2’-氟修饰，并且其中，正义股在5’端包含两个硫代磷酸酯核苷酸间连结；其中，反义股实质上所有核苷酸皆包含选自由2’-O-甲基修饰及2’-氟修饰组成的群组的修饰，并且其中，反义股包含5’端的两个硫代磷酸酯核苷酸间连结及3’端的两个硫代磷酸酯核苷酸间连结，并且其中，正义股接合至一或多个亲脂性，例如C16配体，可选择地，还包含肝脏靶向配体，举例而言，包含一或多种GalNAc衍生物的配体。
本公开另一方面提供了一种用于抑制SNCA基因的表达的双股RNAi剂，其中，该双股RNAi剂是靶向包含形成双股区域的正义股及反义股的SNCA，其中，该正义股包含与SEQID Ns：1、3、5及7中任一核苷酸序列相异不超过3个核苷酸(即，差异为3、2、1或0个核苷酸)的至少15个接续核苷酸，或与SEQ ID NO：1、3、5或7中任一者的完整核苷酸序列具有至少90％核苷酸序列同一性，例如：90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的核苷酸序列；以及该反义股包含与SEQ ID NO：2、4、6及8中任一核苷酸序列相异不超过3个核苷酸(即，差异为3、2、1或0个核苷酸)的至少15个接续核苷酸，或与SEQ ID NO：2、4、6及8中任一者的完整核苷酸序列具有至少90％核苷酸序列同一性，例如90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的核苷酸序列，其中，在SEQ ID NO：1至8所提供的序列中的任一胸腺嘧啶被尿嘧啶所取代(当比较比对序列时)不计为导致与SEQ ID NO：1至8所提供核苷酸序列的任一者相异不超过3个核苷酸的差异，其中，该正义股包含至少一个3’端去氧胸腺嘧啶核苷酸(dT)，其中，该反义股包含至少一个3’端去氧胸腺嘧啶核苷酸(dT)。
于一态样中，正义股所有核苷酸与反义股所有核苷酸均是经修饰的核苷酸。
于另一态样中，各股是具有19至30个核苷酸。
于某些态样中，该RNAi剂的反义股包含在5’区前9个核苷酸位置内的双链体的至少一个热去安定化修饰或其前体。可选择地，该双链体的热去安定化修饰是一种或多种
及
其中，B是核碱基。
本公开另一方面提供了含有本公开的双股RNAi剂的细胞。
本公开的另一方面提供了一种用于抑制SNCA基因的表达的医药组成物，其包括本公开的双股RNAi剂。
于一态样中，该双股RNAi剂是与无缓冲溶液一起给药。可选择地，该无缓冲溶液是生理食盐水或水。
于另一态样中，该双股RNAi剂与缓冲溶液一起给药。可选择地，该缓冲溶液包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐或其任何组合。于另一态样中，该缓冲溶液为磷酸盐缓冲生理食盐水(PBS)。
本公开另一方面提供了一种医药组成物，其包括本公开的双股RNAi剂及脂质制剂。
于一态样中，该脂质制剂包括脂质奈米颗粒(LNP)。
本公开另一方面提供了用于实行本公开方法的试剂盒，该试剂盒包括：a)本公开的双股RNAi剂，及b)使用说明，以及c)可选择地，一种装置，是用于施予个体该双股RNAi剂。
本公开另一方面提供了抑制SNCA基因的表达的双股核糖核酸(RNAi)剂，其中，该RNAi剂具有正义股及反义股，以及其中，该反义股包括一互补区域，该区域包括与表2、3、12或13的任一反义股核碱基序列相异不超过3个核苷酸(即，差异3、2、1或0个核苷酸)的至少15个接续核苷酸，例如，至少15个核苷酸(即，差异为3、2、1或0个核苷酸)、至少19个核苷酸(即，差异为3、2、1或0个核苷酸)。于一态样中，该RNAi剂包含以下修饰中的一或多者：2’-O-甲基修饰的核苷酸、2’-氟修饰的核苷酸、2’-C-烷基修饰的核苷酸、包含乙二醇核酸(GNA)的核苷酸、硫代磷酸酯(PS)及乙烯基膦酸酯(VP)。可选择地，该RNAi剂包含以下各修饰中的至少一者：2’-O-甲基修饰的核苷酸、2’-氟修饰的核苷酸、2’-C-烷基修饰的核苷酸、包含乙二醇核酸(GNA)的核苷酸、硫代磷酸酯及乙烯基膦酸酯(VP)。
于另一态样中，该RNAi剂包含四个或更多个PS修饰，可选择地，是六至十个PS修饰，可选择地，是八个PS修饰。
于额外态样中，该RNAi剂的各正义股及反义股均具有5’端及3’端，且该RNAi剂包含八个PS修饰，是位于各RNAi剂正义与反义股相应的3’与5’端的倒数第二个及最后一个核苷酸间连结处。
于另一态样中，该RNAi剂的各正义股及反义股皆包含5’端及3’端，且该RNAi剂仅包含一个包含GNA的核苷酸。可选择地，该包含GNA的核苷酸是位于反义股上自反义股5’端算起的第七个核碱基残基处。
于额外态样中，该RNAi剂的各正义股及反义股皆包含5’端及3’端，且该RNAi剂包含一至四个2’-C-烷基修饰的核苷酸。可选择地，该2’-C-烷基修饰的核苷酸是2’-C16-修饰的核苷酸。可选择地，该RNAi剂包含单个2’-C-烷基，例如C16修饰的核苷酸。可选择地，单个2’-C-烷基，例如C16修饰的核苷酸是位于正义股上，自正义股5’端算起的第六个核碱基位置处。
于另一态样中，该RNAi剂的各正义股及反义股皆包含5’端及3’端，且该RNAi剂包含两个或更多个2’-氟修饰的核苷酸。可选择地，该RNAi剂的各正义股及反义股包含两个或更多个2’-氟修饰的核苷酸。可选择地，该2’-氟修饰的核苷酸是位于正义股上自该正义股5’端算起的核碱基位置7、9、10及11处，以及反义股上自该反义股5’端算起的核碱基位置2、14及16处。
于额外态样中，该RNAi剂的各正义股及反义股皆包含5’端及3’端，且该RNAi剂包含一或多个VP修饰。可选择地，该RNAi剂于反义股5’端包含单个VP修饰。
于另一态样中，该RNAi剂的各正义股及反义股均包含括5’端与3’端，且该RNAi剂包含两个或更多个2’-O-甲基修饰的核苷酸。可选择地，该RNAi剂于所有核碱基位置包含2’-O-甲基修饰的核苷酸，其未经2’-氟、2’-C-烷基或乙二醇核酸(GNA)修饰。可选择地，该两个或更多个2’-O-甲基修饰的核苷酸是位于正义股上，从正义股5’端算起的位置1、2、3、4、5、8、12、13、14、15、16、17、18、19、20及21处，以及位于反义股上，从反义股5’端算起的位置1、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、15、17、18、19、20、21、22及23处。
[定义]
为了更容易地理解本发明，首先定义某些术语。此外，应注意，无论何时，当应用参数的数值或数值范围，该等数值及处于该等所引用的数值中间的范围亦作为本发明的一部分。
本文中使用的冠词「一」指代该冠词的语法宾语的一者或超过一者(亦即，至少一者)。举例而言，「一元件」意指一个元件或超过一个元件如，复数个元件。
本文中使用的术语「包括」意指「包括但不限于」，且与后者可互换地使用。
除非语境中明确排除，否则本文中使用的术语「或」意指「及/或」，且与后者可互换地使用。
本文中使用的术语「约」意指处于该技术领域中的公差范围内。例如，「约」可理解为与均值偏离2标准差。于某些态样中，约意指±10％。于某些态样中，约意指±5％。当「约」存在于一系列数字或范围之前时，理解为「约」可修饰该一系列数字或范围中的每一个。
处于数目或一系列数目前面的术语「至少」理解为包含与该术语「至少」相邻的数目，以及后面的全部数目或逻辑上可包含的整数，如从语境中明显可知者。例如，核酸分子中的核苷酸的数目须为整数。例如，「21个核苷酸的核酸分子的至少18个核苷酸」意指18、19、20或21个核苷酸具有所指的特性。当「至少」存在于一系列数目或范围之前时，理解为「至少」可修饰该一系列数目或范围中的每一个。
在本文中，如同从语境中逻辑上推知者，「不超过」或「少于」是理解为与该用语相邻的数值及逻辑上更低的数值或整数，到零为止。例如，具有「不超过2个核苷酸」的突出端的双链体，是具有2、1或0个核苷酸的突出端。当「不超过」出现于一系列数目或范围前面，「不超过」是理解为可修饰该系列或范围中的每一个数目。在本文中，范围包括上限及下限两者。
如本文所用，侦检方法可包含判定存在的分析物质的量低于该方法的检测等级。
如所指示的标的位点与正义或反义股的核苷酸序列矛盾，以所指示序列为准。
如化学结构与化学名称矛盾，以化学结构为准。
术语「SNCA 」、「α突触核蛋白」、「突触核蛋白α」或「α突触核蛋白」是指代与神经退化性疾病(称为「突触核蛋白病」)相关的基因，以及由该基因编码的蛋白质。人类SNCA基因区域涵盖大约114kb。SNCA转录本包含13个外显子，并且已有15种所产生的mRNA异构体已经识别或经其他方式被预测出。SNCA的核苷酸与胺基酸序列可见于，例如，GenBank登录号NM_007308.3中(智人SNCA，SEQ ID NO：1，反向互补，SEQ ID NO：2)；GenBank登录号XM_005555421(食蟹猕猴SNCA，SEQ ID NO：3，反向互补，SEQ ID NO：4)；GenBank登录号NM_009221(小鼠SNCA，SEQ ID NO：5，反向互补，SEQ ID NO：6)；GenBank登录号NM_019169.2(褐家鼠SNCA，SEQ ID NO：7，反向互补，SEQ ID NO：8)；及GenBank登录号XM_535656.7(犬SNCA，SEQ ID NO：1806，反向互补，SEQ ID NO：3600)。
在本文中，术语「SNCA」亦指代SNCA基因的变体，其包括所提供的天然存在序列的变体，例如，异构体1转录本NM_000345.4(SEQ ID NO：1809)，其编码多肽NP_000336.1；异构体2转录本NM_001146054.2(SEQ ID NO：1807)，其编码多肽NP_001139526.1；异构体3转录本NM_001146055.2(SEQ ID NO：1808)，其编码多肽NP_001139527.1；如上所述的异构体4转录本NM_007308.3(SEQ ID NO：1)，其编码多肽NP_009292.1；异构体5转录本NM_001375285.1(SEQ ID NO：1810)，其编码多肽NP_001362214.1；异构体6转录本NM_001375286.1(SEQ ID NO：1811)，其编码多肽NP_001362215.1；异构体7转录本NM_001375287.1(SEQ ID NO：1812)，其编码多肽NP_001362216.1；异构体8转录本NM_001375288.1(SEQ ID NO：1813)，其编码多肽NP_001362217.1；异构体9转录本NM_001375290.1(SEQ ID NO：1814)，其编码多肽NP_001362219.1；以及预期的异构体X1转录本XM_011532203.1(SEQ ID NO：1815)，其编码多肽XP_011530505.1预期的异构体X2转录本XM_011532204.3(SEQ ID NO：1816)，其编码多肽XP_011530506.1；预期的异构体X3转录本XM_011532205.2(SEQ ID NO：1817)，其编码多肽XP_011530507.1；预期的异构体X4转录本XM_011532206.1(SEQ ID NO：1818)，其编码多肽XP_011530508.1；预期的异构体X5转录本XM_011532207.1(SEQ ID NO：1819)，其编码多肽XP_011530509.1；及预期的异构体X8转录本XM_017008563.1(SEQ ID NO：1820)，其编码多肽XP_016864052.1(与各前述登录号相关联的独特序列以在本申请的申请日可用的形式通过引用并入本文)。SNCA序列的其他实例可见于公开可用的资料库，例如GenBank、OMIM、UniProt、NCBI dbSNP(参见例如www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6622)，以及Macaca基因组项目网站(macaque.genomics.org.cn/page/species/index.jsp)。关于SNCA的其他资讯，举例而言，可在www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6622上找到。截至提交本申请之日，前述各GenBank登录号及基因资料库编号的内容是通过引用其整体并入本文。
UniProt中描述了α突触核蛋白的三种蛋白质异构体。最长的α突触核蛋白异构体是大约14kDa的蛋白质(UniProt异构体1，140个胺基酸的P37840)。UniProt中其他α突触核蛋白异构体包括：异构体2-4，112个胺基酸的P37840-2；及异构体2-5，126个胺基酸的P37840-3。140个胺基酸的α突触核蛋白是由5个外显子对编码，映射到染色体位点4q21.3-q22。α突触核蛋白具有由不完整的KXKEGV模体、极度疏水的NAC结构域与高度酸性的C端结构域所组成的N端区域。在生理条件下，SNCA被认为是一种内在无序的单体或螺旋折迭的四聚体。α突触核蛋白是占脑细胞细胞质中所有蛋白质的1％，主要是于新皮质、海马、黑质、丘脑与小脑中表达。α突触核蛋白亦在心脏、骨骼肌及胰腺中以较少量表达。尽管SNCA功能尚不清楚，但证据显示它在维持适度供应突触前末梢突触小泡方面发挥重要作用。α突触核蛋白是透过调节抑制p53表达及反式活化促凋亡基因，参与多巴胺释放与转运的调节、微管相关蛋白tau的纤维化以及非多巴胺能神经元中神经保护表型的调节，致使凋亡蛋白酶-3活化。α突触核蛋白诱发神经退化性疾病(如帕金森病、路易体痴呆与多系统萎缩)的主要机制似乎是α突触核蛋白量升高而导致α突触核蛋白原纤维聚集。
在本文中，「靶标序列」是指于SNCA基因转录期间所形成的mRNA分子核苷酸序列的接续部分，包含作为初级转录产物的RNA加工产物的mRNA。于一态样中，该序列靶标部分的长度至少足以用作RNAi导引裂解的受质，该裂解是位在于SNCA基因转录期间所形成的mRNA分子核苷酸序列的部分处或其附近。于一态样中，该靶标序列是位于SNCA基因的蛋白质编码区内。于另一态样中，该靶标序列是位于SNCA基因的3’UTR内。
该靶标序列可为约9至36个核苷酸的长度，例如约15至30个核苷酸的长度。举例而言，该靶标序列可为约15至30个核苷酸、15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23，或21至22个核苷酸的长度。于一些态样中，该靶标序列是约19至约30个核苷酸的长度。于其他态样中，该靶标序列是约19至约25个核苷酸的长度。于其他态样中，该靶标序列是约19至约23个核苷酸的长度。于一些态样中，该靶标序列是约21至约23个核苷酸的长度。落于上述范围与长度中间的范围与长度，亦是本公开的一部分。
在本文中，术语「包含序列的股」是指寡核苷酸，其包含通过使用标准核苷酸命名法所指代的序列描述的核苷酸链。
「G」、「C」、「A」、「T」与「U」各自通常代表含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸苷及尿嘧啶作为碱基的核苷酸，分别处于经修饰或未经修饰核苷酸的情况。然而，应当理解，术语「核糖核苷酸」或「核苷酸」亦可以指如下文进一步详述的经修饰核苷酸，或代用替换部分(参见如表1)。习知技艺人士非常清楚鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸苷与尿嘧啶可被其他部分替换，而不会显著改变包含带有此类替换部分的核苷酸的寡核苷酸碱基配对特性。例如，但不限于，包含肌苷作为其碱基的核苷酸可与包含腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸进行碱基配对。因此，包含尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可于本公开中所揭示的dsRNA的核苷酸序列中，被包含例如肌苷的核苷酸替换。在另一个实例中，寡核苷酸中任意位置的腺嘌呤与胞嘧啶可分别替换为鸟嘌呤和尿嘧啶，以形成与标的mRNA的G-U摆动碱基配对(Wobble basepairing)。含有此类置换部分的序列适用本公开中的组成物及方法。
术语「iRNA」、「RNAi剂」、「iRNA剂」、「RNA干扰剂」在本文中可互换使用，是指包含本文所定义的该术语的RNA，以及经RNA诱导的静默复合物(RISC)途径介导的RNA转录本靶向裂解的剂。RNA干扰(RNAi)是导引mRNA的序列特异性降解的过程。RNAi调节，举例而言，是抑制SNCA在细胞中的表达，例如，个体内的细胞，如哺乳动物个体内的细胞。
于一态样中，本公开的RNAi剂包含与靶RNA序列，如SNCA靶mRNA序列相互作用以导引靶RNA裂解的单股RNAi。不欲受缚于理论，咸信，被引入细胞的长双股RNA通过被称为切丁酶(Dicer)的第III型核酸内切酶的作用，而分解为包括正义股及反义股的双股短干扰RNA(siRNA)(Sharp et al.(2001)Genes Dev.15：485)。切丁酶，是一种核糖核酸III样酶，将此类dsRNA加工为19-23个碱基对的短干扰RNA，其具有特征性的2个碱基3’突出端(Bernstein，et al.，(2001)Nature 409：363)。然后将此类siRNA并入RNA诱导的静默复合体(RISC)中，其中，一或多个解旋酶解开siRNA双链体，使互补反义股能够引导靶标识别(Nykanen，et al.，(2001)Cell 107：309)。在与适当的靶标mRNA结合后，RISC中的一或多种内切核酸酶裂解靶标以诱发静默化(Elbashir，et al.，(2001)Genes Dev.15：188)。因此，一方面，本公开涉及于细胞内产生的单股RNA(ssRNA)(siRNA双链体的反义股)，其促进RISC复合物形成以实现靶基因如SNCA基因的静默化。据此，术语「siRNA」在本文中也用于指代如上所述的RNAi。
于另一态样中，该RNAi剂可为单股RNA，其是引入细胞或有机体内以抑制靶标mRNA。单股RNAi剂结合至RISC核酸内切酶Argonaute2，其随后裂解靶标mRNA。该单股siRNA通常是15至30个核苷酸且经过化学修饰。单股RNA的设计及测试是揭示于美国专利第8，101，348号及Lima et al.，(2012)Cell 150：883-894中，其各自的整体内容是通过引用而并入本文。本文中揭示的任意反义核苷酸序列可用作本文中揭示的单股siRNA或用作经Lima et al.，(2012)Cell 150：883-894中揭示的方法化学修饰者。
于另一态样中，用于本公开的组成物及方法中的「RNAi剂」是双股RNA，且于本文中指代为「双股RNAi剂」、「双股RNA(dsRNA)分子」、「dsRNA剂」或「dsRNA」。术语「dsRNA」指代核糖核酸分子的复合体，其具有包含两个反平行且实质上互补的核酸股的双螺旋结构，称为具有相对于靶标RNA即SNCA基因的「正义」取向及「反义」取向。于本公开的一些态样中，双股RNA(dsRNA)透过转录后基因静默机制而触发靶标RNA如mRNA的降解，本文中，该机制指代为RNA干扰或RNAi。
通常，dsRNA分子可包括核糖核苷酸，但如本文中所详述，一股或两股亦可包括一个或多个非核糖核苷酸，如去氧核糖核苷酸、经修饰的核苷酸。此外，如本说明书中所用，「RNAi剂」可包括具有化学修饰的核糖核苷酸；RNAi剂可包括位于多个核苷酸处的实质性修饰。
在本文中，术语「经修饰的核苷酸」指代独立地具有经修饰的糖部分、经修饰的核苷酸间连结、或经修饰的核碱基的核苷酸。因此，术语「经修饰的核苷酸」涵盖例如官能基或原子到核苷酸间连结、糖部分或核碱基的置换、添加或移除。适用于本公开的剂中的修饰包括本文中所揭露或所属领域中已知的所有类型的修饰。对于本说明书及权利要求书的目的，任何此类修饰，如在siRNA类型分子中所用者，为「RNAi剂」所涵盖。
于本公开的某些态样中，去氧核苷酸-作为天然存在形式的核苷酸而为人所知-若存在于RNAi剂当中，可视为构成经修饰的核苷酸。
该双链体区域可为允许所欲的靶标RNA透过RTSC途径而发生特异性降解的任意的长度，且可为约9至36个碱基对的长度范围，如约15至30个碱基对的长度，例如，约9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、或36个碱基对的长度，诸如约15至30、15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、25至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23、或21至22个碱基对的长度。上文引述的范围及长度之间的范围及长度亦视为本发明的一部分。
形成该双链体结构的两股可为一个较大RNA分子的不同部分，或它们可为独立的RNA分子。若该两股是一个较大分子的部分，且因此通过介于一股的3’端与形成该双链体结构的相对另一股5’端间的未中断核苷酸链而接合，则该接合RNA链是称为「发夹环圈」。发夹环圈可包含至少一个未配对核苷酸。于一些态样中，该发夹环圈可包含至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少20、至少23或更多个未配对的核苷酸或未被引导至dsRNA靶标位点的核苷酸。于一些态样中，发夹环圈可为10个或更少个核苷酸。于一些态样中，发夹环圈可为8个或更少个未配对的核苷酸。于一些态样中，发夹环圈可为4至10个未配对的核苷酸。于一些态样中，发夹环圈可为4至8个核苷酸。
于某些态样中，双股寡聚化合物的两股可彼此接合。两股可于两端或仅于一端彼此接合。于一端接合是意指第一股5’端接合至第二股3’端，或第一股3’端接合至第二股5’端。当两股于两端彼此接合时，第一股5’端接合至第二股3’端，且第一股的3’端接合至第二股5’端。两股可通过寡核苷酸连接子彼此接合，该连接子包括但不限于，(N)n；其中，N是独立为经修饰或未修饰的核苷酸，且n是3至23。于一些态样中，n是3至10，例如，3、4、5、6、7、8、9或10。于一些态样中，该寡核苷酸连接子是选自由GNRA、(G)4、(U)4及(dT)4所组成的群组，其中，N是经修饰或未修饰的核苷酸，并且R是经修饰或未修饰的嘌呤核苷酸。该连结子中的一些核苷酸可涉入与该连结子中其他核苷酸的碱基配对交互作动中。两股亦可通过非核苷连结子例如本文所揭示的连结子彼此接合。本领域技术人员将知悉，本文所揭示的任意寡核苷酸化学修饰或变异可用于寡核苷酸连结子中。
发夹或哑铃型寡聚化合物将具有等于或至少14、15、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸对的双链体区域。该双链体区域可等于或少于200、100或50的长度。于一些态样中，该双链体区域的范围是15至30、17至23、19至23以及19至21个核苷酸对的长度。
发夹寡聚化合物可具有单股突出或末端未配对区，于一些态样中，位于3’端，并且于一些态样中位于发夹的反义侧上。于一些态样中，该突出是1至4个且通常2至3个核苷酸的长度。本文中，可诱导RNA干扰的发夹寡聚化合物亦指代为「shRNA」。
若dsRNA的两个实质上互补的股由独立的RNA分子构成，则那些分子不必但可以共价接合。若两股通过除介于一股的3’端与形成双链体结构的相对另一股的5’端间的未中断核苷酸链以外的手段共价接合，则该接合结构是指代为「连接子」。RNA股可具有相同或相异数目的核苷酸。碱基对的最大数目是dsRNA的最短链中的核苷酸数减去双链体中存在的任意突出。RNAi除了包含双链体结构外，亦可包含一个或多个核苷酸突出。
于一个态样中，本发明的RNAi剂是dsRNA，其每一股是24至30个核苷酸的长度，其与靶标RNA序列例如SNCA靶标mRNA序列相互作用以引导该靶标RNA的裂解。不欲受缚于理论，被引入细胞内的长双股RNA通过被称为切丁酶的第III型核酸内切酶的作用而分解为siRNA(Sharp et al.(2001)Genes Dev.15：485)。切丁酶，亦称核酸酶III样酶，将daRNA加工为19至23个碱基对的短干扰RNA，该短干扰RNA的特征是具有两个碱基的3’突出端(Bernstein，et al.，(2001)Nature 409：363)。随后，siRNA被并入RNA诱导的静默复合体(RTSC)内，于该处，一或多种解旋酶令siRNA螺旋解卷曲，使得互补物反义股能够引导靶标识别(Nykanen，et al.，(2001)Cell 107：309)。当结合至适宜的靶标mRNA时，RISC内的一种或多种核酸内切酶裂解该靶标以诱发静默化(Elbashir，et al.，(2001)Genes Dev.15：188)。
于一个态样中，本发明的RNAi剂是dsRNA剂，其每一股是包含19至23个核苷酸，其与SNCA RNA序列产生交互作用以导引该靶标RNA的裂解。不欲受缚于理论，经引入细胞内的长双股RNA通过被称为切丁酶的第III型核酸内切酶的作用而分解为siRNA(Sharp et al.(2001)Genies Dev.15：485)。切丁酶，亦称核酸酶ITI样酶，将daRNA加工为19至23个碱基对的短干扰RNA，该短干扰RNA的特征是具有两个碱基的3’突出端(Bernstein，et al.，(2001)Nature 409：363)。随后，siRNA被并入RNA诱导的静默复合物(RISC)内，于该处，一或多种解旋酶令siRNA螺旋解卷曲，使得互补反义股能够引导靶标识别(Nykanen，et al.，(2001)Cell 107：309)。当结合至适宜的靶标mRNA时，RISC内的一或多种核酸内切酶裂解该靶标以诱发静默化(Elbashir，et al.，(2001)Genes Dev.15：188)。于一个态样中，本发明的RNAi剂是24至30个核苷酸的dsRNA，其与SNCA RNA序列发生交互作用以导引靶标RNA的裂解。
如本文中所用，术语「核苷酸突出」指代从RNAi剂例如dsRNA的双链体结构凸出的至少一个未配对的核苷酸。举例而言，当dsRNA的一股的3’端延伸超过另一股的5’端，或与的相反，则存在核苷酸突出。dsRNA可包含具有至少一个核苷酸的突出；或者突出可包含至少两个核苷酸、至少三个核苷酸、至少四个核苷酸、至少五个核苷酸或更多个。核苷酸突出可包含核苷酸/核苷类似物或由其组成，其中该核苷酸/核苷类似物包括去氧核苷酸/核苷。该(等)突出可位于正义股上、反义股上或其任意组合上。此外，突出的核苷酸可存在于dsRNA的反义股或正义股的5’端、3’端或两端。
于dsRNA剂的一个态样中，至少一股包含至少1个核苷酸的3’突出。于另一态样中，至少一股包含具有至少2个核苷酸，例如2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸的3’突出。于其他态样中，RNAi剂的至少一股包含具有至少1个核苷酸的5’突出。于某些态样中，至少一股包含具有至少2个核苷酸，例如2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸的5’突出。于又其他态样中，RNAi剂的一股的3’及5’端包含具有至少1个核苷酸的突出。
于一态样中，该dsRNA的反义股具有突出于3’端、5’端、两端或两端皆无的1至10个核苷酸，例如0至3、1至3、2至4、2至5、4至10、5至10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个核苷酸。于一态样中，dsRNA的正义股具有突出于3’端、5’端、两端或两端皆无的1至10个核苷酸，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个核苷酸。于另一态样中，该突出中的一个或多个核苷酸被替换为核苷硫代磷酸酯。
于某些态样中，位于正义股或反义股或两者上的该突出可包括长于10个核苷酸的延伸长度，如，1至30个核苷酸、2至30个核苷酸、10至30个核苷酸或10至15个核苷酸的长度。于某些态样中，延伸的突出位于双链的的正义股上。于某些态样中，延伸的突出存在于双链体的正义股的3’端上。于某些态样中，延伸的突出存在于双链体的正义股的5’端上。于某些态样中，延伸的突出位于双链体的反义股上。于某些态样中，延伸的突出存在于双链体的反义股的3’端上。于某些态样中，延伸的突出存在于双链体的反义股的5’端上。于某些态样中，突出中的一个或多个核苷酸被替换为核苷硫代磷酸酯。于某些态样中，突出包括自身互补的部分，使得该突出能够形成在生理学条件下安定的发夹结构。
如本文中所用，关于dsRNA的术语「平」或「平端」意指，在dsRNA的给定端无未配对的核苷酸或核苷酸类似物，亦即，无核苷酸突出。dsRNA的一端或两端可为平端。若dsRNA的两端皆是平者，该dsRNA称为平端者。明了起见，「平端者」dsRNA是两端皆是平者的dsRNA，亦即，于分子的任一端皆无核苷酸突出。最常见的此类分子将于其整个长度上是双股。
术语「反义股」或「导引股」指iRNA剂的股，例如dsRNA，其包括与靶标序列，例如SNCA mRNA实质上互补的区域。
如本文中所用，术语「互补的区域」指代反义股上的与本文中定义的序列，例如，靶标序列，如SNCA核苷酸序列基本上互补的区域。若互补的区域与靶标序列不完全互补，则误配可存在于分子的中间区域或末端区域。通常，最能被容忍的误配存在于末端区域内，例如，RNAi剂的5’末端或3’末端的5、4、3或2个核苷酸内。
于一些态样中，本发明的双股RNA剂包括位于反义股中的核苷酸误配。
于一些态样中，本发明的双股RNA剂的反义股包括不超过4个与靶标mRNA的误配，例如，反义股包括4、3、2、1或0个与靶标mRNA的误配。于一些态样中，本发明的双股RNA剂的反义股包括不超过4个与正义股的误配，例如，反义股包括4、3、2、1或0个与正义股的误配。于一些态样中，本发明的双股RNA剂包括位于正义股中的核苷酸误配。于一些态样中，本发明的双股RNA剂的正义股包括不超过4个与反义股的误配，例如，正义股包括4、3、2、1或0个与反义股的误配。于一些态样中，核苷酸误配位于例如自iRNA的3’端计数的5、4、3个核苷酸内。于另一态样中，核苷酸误配是，例如，位于iRNA剂的3’-末端核苷酸中。于一些态样中，误配不处于种子区域中。
因此，本文中所揭示的RNAi剂可含有一个或多个与靶标序列的误配。于一个态样中，本文中所揭示的RNAi剂含有不超过3个误配(亦即，3、2、1或0个误配)。于一个态样中，本文中所揭示的RNAi剂含有不超过2个误配。于一个态样中，本文中所揭示的RNAi剂含有不超过1个误配。于一个态样中，本文中所揭示的RNAi剂含有0个误配。于某些态样中，如果RNAi剂的反义股含有与靶标序列的误配，则该误配可任选地被限定在从互补区域的5’端或3’端计数的最末5个核苷酸内。例如，于此类态样中，对于23个核苷酸的RNAi剂，与SNCA基因互补区域的股通常不含位于中心13个核苷酸处的任意误配。本文中揭示的方法或该领域中已知的方法可用以判定，含有与靶标序列的误配的RNAi剂在抑制SNCA基因的表达中是否有效。虑及具有误配的RNAi剂在抑制SNCA基因的表达中的效力是重要者，尤其是若已知SNCA基因中的特定互补区域于群体内具有多型性序列变异。
如本文中所用，术语「正义股」或「随从股」指代RNAi剂的股，其包括与如本文中定义的术语的反义股的区域实质上互补的区域。
如本文中所用，「实质上全部核苷酸经修饰者」是大多数但并非全部经修饰，且可包括不超过5、4、3、2或1个未经修饰的核苷酸。
如本文中所用，术语「裂解区域」指代位于紧邻裂解位点处的区域。裂解位点是靶标上的裂解出现处的位点。于一些态样中，裂解区域包含位于裂解位点任一端且紧邻该裂解位点的三个碱基。于一些态样中，裂解区域包含位于裂解位点任一端且紧邻该裂解位点的两个碱基。于一些态样中，裂解位点特别出现于反义股的通过核苷酸10及11连结的位点，且裂解区域包含核苷酸11、12、13。
如本文中所用且除非明确排除，否则当术语「互补」用来揭示关于第二核苷酸序列的第一核苷酸序列时，指代包含该第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在某些条件下与包含该第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交且形成双链体结构的能力，如具熟练技术的人士所理解者。例如，此类条件可为严格条件，其中，严格条件可包含：400mM NaCl、40mM PIPES pH 6.4、1mM EDTA、50℃或70℃下12至16小时随后洗涤(参见，例如，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Sambrook，et al.(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press)。可施加其他条件，诸如生理学相关条件如可在有机体内部遭遇者。熟习技术者将能够根据该杂交核苷酸的最终应用，判定最适合测试两个序列互补性的条件组。
如本文中所述的RNAi剂，例如dsRNA内的互补序列，包括包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一个或两个核苷酸序列的整体长度上的碱基配对。此类序列可指代为彼此「完全互补」。惟，本文中，若第一序列指代为与第二序列「实质上互补」，则当杂交形成多达30个碱基对的双链体时，两个序列可为完全互补，或它们可形成一个或多个但通常不超过5、4、3或2个误配碱基对，同时保留在最适于其最终应用的条件下杂交的能力，如对经由RISC途径的基因的表达的抑制。惟，若两个寡核苷酸设计为当杂交时形成一个或多个单股突出，则此类突出不应视为关于判定其互补性的误配。举例而言，包含一个长度为21个核苷酸的寡核苷酸及另一个长度为23个核苷酸的寡核苷酸的dsRNA，其中该较长的核苷酸包含一个与该较短的核苷酸完全互补的21个核苷酸的序列，对于本文所揭示的目的，仍可指代为「完全互补」。
如本文中所用，「互补」序列亦可包括非Watson-Crick碱基对或从非天然核苷酸及经修饰的核苷酸形成的碱基对，或完全由其形成，只要对其杂交能力的上述需求得以满足即可。此类非Watson-Crick碱基对包括但不限于，G：U Wobble碱基配对或Hoogstein碱基配对。
本文中，术语「互补」、「完全互补」及「实质上互补」可关于dsRNA的正义股与反义股间，或RNAi剂的反义股与靶标序列间的碱基配对而使用，如可从其用途的语境中理解者。
如本文中所用，与信使RNA(mRNA)或靶标序列的「至少一部分实质上互补」的多核苷酸指代与感兴趣的mRNA或靶标序列(例如，编码SNCA的mRNA)。举例而言，如果该序列与编码SNCA的mRNA的非中断部分实质上互补，则该多核苷酸与SNCA mRNA的至少一部分互补。
据此，于一些态样中，本文所揭露的反义股多核苷酸与靶标SNCA序列完全互补。
于某些态样中，本文所揭露的反义股多核苷酸与靶标SNCA序列实质上互补并包含一接续核苷酸序列，该序列在其整个长度上与SNCA的SEQ ID NO：1、3、5或7的核苷酸序列，或SEQ ID NO：1、3、5或7的片段的等效区域至少约80％互补，诸如约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％互补。
于其他态样中，本文所揭露的反义多核苷酸与靶标SNCA序列实质上互补并包含一接续核苷酸序列，该序列于其整个长度上与表2、3、12或13中的任一正义股核苷酸序列，或与表2、3、12或13中任一正义股核苷酸序列的片段至少约80％互补，诸如约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％互补。
于一态样中，本公开的RNAi剂包含与反义多核苷酸实质上互补的正义股，该反义股核苷酸又与靶标SNCA序列相同，并且其中，正义股多核苷酸包含一接续核苷酸序列，该核苷酸序列在其整个长度上与SEQ ID NO：2、4、6或8中任一者的核苷酸序列或SEQ ID NO：2、4、6或8中任一者的片段的等效区域至少约80％互补，诸如约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％互补。
于一些态样中，本公开的iRNA包含与反义多核苷酸实质上互补的正义股，反之，反义多核苷酸又与标的SNCA序列互补，而且其中，正义股多核苷酸包含一接续核苷酸序列，该接续核苷酸序列在其整个长度上与表2、3、12或13中任一反义股核苷酸序列，或表2、3、12或13中任一反义股核苷酸片段为至少约80％互补，诸如约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％互补。
于一些态样中，双股iRNA剂的双股区域是等于或至少为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个核苷酸对的长度。
于一些态样中，双股iRNA剂的反义股是等于或至少为14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度。
于一些态样中，双股iRNA剂的正义股是等于或至少为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度。
于一态样中，双股iRNA剂的正义股及反义股是各为15至30个核苷酸的长度。
于一项实施例中，双股iRNA剂的正义股及反义股是各为19至25个核苷酸的长度。
于一项实施例中，双股iRNA剂的正义股及反义股是各为21至23个核苷酸的长度。
于一项实施例中，iRNA剂的正义股是21个核苷酸的长度，而反义股是23个核苷酸的长度，其中，两股形成21个接续碱基对的双股区域，其于3’端具有2个核苷酸长的单股突出端。
于一些态样中，于一些态样中，各股大部分核苷酸是核糖核苷酸，但如本文中所详述，每股或两股尚可包含一或多个非核糖核苷酸，例如，去氧核糖核苷酸或经修饰核苷酸。「iRNA」可包含具有化学修饰的核糖核苷酸。此类修饰可包含此揭或本领域已知的所有类型的修饰。出于本说明书及申请权利范围的目的，于iRNA分子中使用的任何此类修饰皆含括于「iRNA」中。
于本公开一方面，用于本公开的方法及组成物中的剂是单股反义核酸分子，其经由反义抑制机制抑制靶标mRNA。单股反义RNA分子是与该靶标mRNA内的序列互补。单股反义寡核苷酸可通过与mRNA进行碱基配对，并物理性地阻碍转译机制而以化学计量方式抑制转译，参见Dias，N.et al.，(2002)Mol Cancer Ther 1：347-355。单股反义RNA分子可为约15至约30个核苷酸的长度，并且具有与靶标序列互补的序列。举例而言，单股反义RNA分子可包含来自本文所揭的反义序列中任一者的至少约15、16、17、18、19、20或更多个接续核苷酸。
于一态样中，是以SNCA mRNA量的减少以评估SNCA基因的表达的至少一部分抑制，该SNCA mRNA是从第一个细胞或细胞群中单离检测。该SNCA mRNA是于该细胞或细胞群中被转录，且该细胞或细胞群已经治疗，使得与相同于第一个细胞或细胞组群但未经如是治疗的第二细胞或细胞群(对照细胞)相比，SNCA基因的表达得以受到抑制。抑制的程度可表示如下：
在本文中，术语「令RNAi剂与细胞接触」例如dsRNA，包括通过任意可能的手段接触细胞。令RNAi剂与细胞接触包含于体外令RNAi剂与细胞接触，或于体内令RNAi剂与细胞接触。接触可为直接或间接进行。因此，举例而言，该RNAi剂可通过执行该方法令其与细胞进行物理接触，或者，可将该RNAi剂置于允许或造成其后续与细胞接触的境地。
例如，可通过将RNAi剂与细胞一起培养，从而在体外接触细胞。体内接触细胞则可例如通过将RNAi剂注射至细胞所在的组织中或其附近，或通过将该RNAi剂注射到另一区域，例如中枢神经系统(CNS)，可选择地，经由鞘内、玻璃体内或其他注射，或注射至血流或皮下空间，使得该剂随后到达欲接触细胞所在的组织。举例而言，该RNAi剂可包含或偶联至配体，如下面详揭的亲脂性部分，例如在通过引用并入本文的PCT/US2019/031170中，其在感兴趣的部位如CNS导引或以其他方式安定该RNAi剂。于一些态样中，该RNAi剂可含有或偶联至配体，例如下述的一或多种GalNAc衍生物，其在感兴趣的部位(如肝)导引或以其他方式安定该RNAi剂。于其他态样中，该RNAi剂可包含或偶联至一或多个亲脂部分及一或多种GalNAc衍生物。亦可能结合体外及体内接触方式。例如，细胞亦能于体外与RNAi剂接触并随后移植至个体内。
于一态样中，使细胞与RNAi剂接触包括通过促进或影响至细胞内的摄取或吸收，以「引入」或「递送」该RNAi剂至细胞内。RNAi剂的吸收或摄取可经独立扩散或活性细胞进程而进行，或通过辅助剂或装置进行。将RNAi剂引入细胞可于体外或体内进行。例如，对于体内的引入，是可将RNAi剂注射至组织部位或经全身性给药。于体外引入细胞则包含所属领域中习知的手段，例如电穿孔及脂质转染。其他途径揭示于下文中，或为所属领域中已知者。
术语「亲脂体」或「亲脂性部分」泛指对脂质具有亲和力的任何化合物或化学部分。一种表征亲脂性部分的亲脂性的方法是透过辛醇-水分配系数logKow进行，其中，Kow为平衡状态下，两相系统中化学物质浓度在辛醇相中与在水相中的比。辛醇-水分配系数是实验室量测的物质特性。惟，其亦可通过使用归因于化学物质结构组分的系数加以预测，该等系数是使用第一原理或经验方法计算(参见，例如，Tetko et al.，J.Chem.Inf.Comput.Sci.41：1407-21(2001)，其整体内容通过引用并入本文。其提供物质倾向于非水性或油性环境而非水(即其亲水/亲油平衡)的热力学量测。原则上，当logKow超过0时，该化学物质是具有亲脂性。通常，该亲脂性部分具有超过1、超过1.5、超过2、超过3、超过4、超过5或超过10的logKow。例如，6-胺基己醇的logKow预测约为0.7。使用相同方法，胆固醇N-(己-6-醇)胺基甲酸酯的logKow是预测为10.7。
分子的亲脂性可随它携带的官能基而改变。例如，在亲脂性部分的末端添加羟基或胺基可增减该亲脂性部分的分配系数(例如，logKow)值。
另选地，与一或多个亲脂性部分接合的双股RNAi剂的疏水性可通过其蛋白质结合特性加以量测。例如，于某些态样中，双股RNAi剂血浆蛋白结合检定中的未结合部分可确定为与双股RNAi剂的相对疏水性呈正相关，而相对疏水性可与双股RNAi剂的静默化活性呈正相关。
于一态样中，所测定的血浆蛋白结合检定是使用人血清白蛋白的电泳迁移率变化试验(EMSA)。该结合检定的示例性方案详细说明于例如PCT/US2019/031170中。双股RNAi剂的疏水性，通过该结合检定中的未结合siRNA的分率测量，是超过0.15、超过0.2、超过0.25、超过0.3、超过0.35、超过0.4、超过0.45、或超过0.5，以增强siRNA的体内递送。
据此，将亲脂性部分接合至双股RNAi剂的内部位置，为增强的siRNA体内递送提供了最佳疏水性。
术语「脂质奈米颗粒」或「LNP」是指包括脂质层的囊泡，该脂质层包封药物活性分子，例如核酸分子，如RNAi剂或来自转录后RNAi剂的质体。LNP是揭示于例如美国专利第6,858,225号、第6,815,432号、第8,158,601号与第8,058,069号中，该等专利的整体内容通过引用并入本文。
如本文中所使用，「个体」为动物如哺乳动物，包括灵长类(例如人、非人灵长类动物，例如猴及黑猩猩)或非灵长类(例如大鼠或小鼠)。于一较佳态样中，个体为人，例如正在进行对于将获益于SNCA表达的降低的疾病、病症或病况的治疗或评估的人；处于可能受益于SNCA表达的降低的疾病、病症或病况风险下的人；患有将获益于SNCA表达的降低的疾病、病症或病况的人；或如本文所揭示，正在接受对于将获益于SNCA表达的降低的疾病、病症或病况的治疗的人。
如本文中所使用，术语「治疗」或「疗法」是指有益或希冀的结果，包括但不限于减轻或改善与SNCA基因的表达或SNCA蛋白产生相关的一或多种征候或症状，例如SNCA相关神经退化性疾病，举例而言，突触核蛋白病，诸如PD、多系统萎缩、路易体痴呆(LBD)、纯自主神经功能衰竭(PAF)、皮克病、进行性核上性麻痹、拳击性痴呆、与17号染色体相关的帕金森综合征、Lytico-Bodig病、缠结性痴呆、嗜银颗粒病、神经节细胞胶质瘤、神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、亚急性硬化性全脑炎、铅中毒性脑病、结节性硬化症、Hallervorden-Spatz病、脂褐质沉积症、皮质基底节变性、额颞叶痴呆、额颞叶退化、阿尔茨海默病、亨廷顿病、唐氏综合征、精神病、精神分裂症及克罗伊茨费尔特-雅各布病；在患有此类神经退化性疾病的个体中，在神经元功能异常或死亡增加的区域中SNCA的表达或活性降低。「治疗」亦可意味与不进行治疗的预期存活相比，存活期延长。
在个体、疾病标志物或症状中SNCA的量的语境中，术语「较低」意指该量于统计学上显著降低。该降低可为例如，至少10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。于某些态样中，降低是至少20％。于某些态样中，降低是疾病标志物如蛋白质或基因表达量降低至少50％。在个体中SNCA的量的语境中，「较低」是可选地降低至对不具此病症的个体而言，于正常范围内可接受的量。于某些态样中，「较低」是患病个体中标志物的量、或症状与个体正常范围内可接受程度之间的差异减少，举例而言，在患帕金森病、未患帕金森病的个体，或症状落于正常范围内的个体中，运动速度(运动迟缓)、调节姿势与平衡能力降低的程度。
如本文所用，当将「预防」或「防止」用于指代将受益于SNCA基因的表达减少或SNCA蛋白产出减少的疾病或病症，例如，在由于如遗传因素或年龄而易患SNCA相关病症的个体中，其中该个体尚不符合SNCA相关病症的诊断标准。在本文中，预防可理解为向尚未符合SNCA相关病症诊断标准的个体投予药剂，以延缓或减低该个体产生SNCA相关病症的可能性。由于该剂是药剂，应理解给药通常是在卫生保健专业人员的指导下进行，该卫生保健专业人员能将尚不符合SNCA相关病症诊断标准的个体鉴定为易患SNCA相关病症。
术语「突触核蛋白病」是指一组神经退化性疾病，其特征为α突触核蛋白的纤维状聚集体倾向选择性地累积于神经元与神经胶质细胞群的细胞质中。因此，突触核蛋白病是一类与SNCA相关的神经退化性疾病与病症，其包含帕金森病(PD)、路易体痴呆(LBD)、纯自主神经功能衰竭(PAF)与多系统萎缩(MSA)以及其他神经退化性疾病。临床上，突触核蛋白病的特征是运动、认知、行为与自主神经功能的慢性与渐进性下降，其取决于大脑中病变的分布。由于临床上互相重叠，有时鉴别诊断非常困难。帕金森综合征是PD的主要症状，但它与LBD及MSA中的帕金森综合征可能无法区分。自主神经功能障碍为PAF之一独立发现，亦可能出现于PD与LBD中，但通常在MSA中更显著且出现得更早。LBD可能为与PD相同的疾病，但其具有广泛的皮质病理状态，导致失智、认知波动与有特殊性的视幻觉。
发生突触核蛋白病(例如PD、LBD等)的可能性降低，例如与具有相同风险因素且未接受本文所述治疗的人群相比，当具有一种或多种PD或LBD(或其他突触核蛋白病)风险因素的个体未能进展为PD或LBD(或其他突触核蛋白病)、或发生严重程度较低的PD或LBD(或其他突触核蛋白病)；未发生SNCA相关疾病如PD或LBD(或其他突触核蛋白病)，或发生PD或LBD(或其他突触核蛋白病)的时间延迟数月或数年，是认为是有效的预防。预防可能需要投予多于一剂的iRNA剂。提供适当方式以识别处于发生任意前述SNCA相关病症风险中的个体，本文提供的iRNA剂可用作预防SNCA相关疾病的药剂，或于预防该疾病的方法中使用。本文讨论了各种SNCA相关疾病的危险因子。
如本文所用，术语「帕金森病」或「PD」是指影响运动的进展性神经系统疾病。PD的主要病理特征为大脑基底神经节中的细胞死亡(在生命结束时影响黑质致密部中高达70％多巴胺分泌神经元)及路易氏体(SNCA编码的α突触核蛋白的累积)存在于许多剩余神经元中。症状为逐渐开始，有时仅有一只手不明显震颤、僵硬或运动减缓。其他早期症状包括缺乏面部表情、行走时手臂缺乏运动及说话时口齿不清。帕金森病的症状会随着时间推移而恶化。PD平均发病年龄为60岁，发病越晚症状越严重。临床特征包括但不限于更严重的震颤、运动减慢(运动迟缓)、肌肉僵硬、姿势与平衡障碍、自主运动丧失、言语改变，最终出现失智、幻觉并需要乘坐轮椅。
在本文中，术语「路易体痴呆(LBD)」是指一种进展性失智症，其由α突触核蛋白于罹病脑神经元内聚集(称为路易氏体与路易氏神经突起)，而导致思考、推理与独立功能下降。α突触核蛋白的聚集导致受影响的神经元功能欠佳并最终导致死亡。其症状包括视觉、听觉、嗅觉或触觉幻觉症状，帕金森病的征象(帕金森征候)、身体功能(自主神经系统)调节不良，如头晕、跌倒与肠道问题，认知问题如意识模糊、注意力不集中、视觉-空间问题与记忆力减退，睡眠困难，如快速动眼期(REM)睡眠行为异常(睡觉时身体实际演出做梦内容)、注意力波动包括嗜睡、长时间发呆、白天长时间小睡，或语无伦次、忧郁及冷漠。
于一态样中，与SNCA相关的疾病或病症(突触核蛋白病)是帕金森病、路易体痴呆、多系统萎缩(MSA)及纯自主神经功能衰竭(PAF)中的一者。
在本文中，「治疗有效量」旨在包含当给药至患有SNCA相关疾病的个体时，足以实现疾病治疗的RNAi剂的量(例如通过减轻、改善、或维持现有疾病或该疾病一种或多种症状)。「治疗有效量」可能因RNAi剂、该剂的给药方式、疾病及其严重程度，以及病史、年龄、体重、家族史、基因组成、既有或伴随治疗的类型(如果有)而异，及待治疗对象的其他个别特征而异。
在本文中，「预防有效量」旨在包含当给药至患有SNCA相关病症的个体时，足以预防或改善该疾病或该疾病一种或多种症状的RNAi剂的量。改善疾病是包括减缓疾病进程或减低后续所发展的疾病严重程度。「预防有效量」可能因RNAi剂、其给药方式、疾病风险程度以及病史、年龄、体重、家族史、基因组成、既存或伴随治疗的类型(如果有)，以及待治疗病患的其他个别特征而异。
「治疗有效量」或「预防有效量」亦包含以适用于任意治疗的合理效益/风险比率下，产生一些所欲的局部或全身性作用的RNAi剂的量。于本公开的方法中采用的RNAi剂可以足以产生用于此类治疗的合理效益/风险比率的量给药。
本文中使用的术语「药学可接受」是指在合理的医学判断范围内，适用于与人类个体与动物个体的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症的该等化合物、材料、组成物或剂型，与其合理效益/风险比率相称。
在本文中，术语「药学可接受的载剂」是指药学可接受的材料、组成物或媒介，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(如润滑剂、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌，或硬脂酸)或溶剂封装材料，其牵涉将受测化合物从一个器官或身体部分携带或运送至另一个器官或身体部分。就与制剂其他成分相容且不损害所治疗的个体而言，每一载剂必须为「可接受」者。可用作药学可接受载剂的材料的一些示例包括：(1)醣类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉、马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、醋酸纤维素等；(4)黄蓍胶粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，如镁态、十二烷基硫酸钠、滑石等；(8)可可脂、栓蜡等赋形剂；(9)油类，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油、大豆油等；(10)二醇类，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇等；(12)油酸乙酯、月桂酸乙酯等酯类；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁、氢氧化铝等；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等张生理食盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯或聚酐；(22)增积剂，如多肽和胺基酸。(23)血清组分，如血清白蛋白、HDL及LDL；(22)于药物制剂中采用的其他无毒相容物质。
在本文中，术语「样本」包含从个体分离的类似液体、细胞或组织的集合，以及存在于个体体内的液体、细胞或组织。生物性液体的实例包含血液、血清与浆液、血浆、脑脊液、眼液、淋巴液、尿液、唾液及其类似者。组织样本可包含来自组织、器官或局部区域的样本。例如，样本可来自特定器官、器官部分或该等器官内的液体或细胞。于某些态样中，样本可能来自大脑(例如，全脑或脑的某些部分，例如纹状体，或脑中某些类型的细胞，例如神经元与神经胶质细胞(星形胶质细胞、寡树突胶细胞、微胶细胞)。于其他态样中，「源自个体的样本」是指源自个体的肝脏组织(或其亚组分)者。于一些态样中，「源自个体的样本」是指从个体抽取的血液或源自个体的血浆或血清。于又一些态样中，「源自个体的样本」是指源自个体的脑组织(或其亚组分)或视网膜组织(或其亚组分)者。
应理解，尽管表2或12中的序列被描述为经修饰或经接合的序列，但本公开的RNAi剂的RNA，例如本公开的dsRNA，可包含表2、3、12或13中所列的任一序列，其未经修饰、未经接合、或经不同于本文所述的方式修饰或接合。即，表2或12中提供的经修饰序列不需要L96配体或任何配体。亲脂性配体可包含于本申请中提供的任意位置中。
附图说明
图1显示所选定的靶向SNCA的RNAi剂对于人SNCA-AAV过度表达小鼠中SNCA量的影响。为判别RNAi化合物在小鼠体内的RNA功效，首先藉AAV转导全长的人SNCA。于AAV给药后7天，提供以下选定的双链体：靶向人SNCA AD-464778、AD-464782、AD-464694、AD-464634、AD-464779的3’UTR的双链体；以及靶向SNCA AD-464590、AD-464313、AD-464314、AD-464585、AD-464586、AD-464592及AD-464229编码序列的双链体。将资料标准化为经PBS处理的样本。
图2显示两个选定的靶向SNCA的RNAi双链体的各自序列及修饰模式的示意图：AD-464634正义(SEQ ID NO：924)及反义(SEQ ID NO：1016)股，以及AD-464314正义(SEQ IDNO：915)及反义(SEQ ID NO：1007)股。两个双链体均于反义股上以乙烯基磷酸酯基团修饰，于正义股上以三触角GalNAc部分修饰(从而促进肝脏递送)。所指示的残基亦经2’氟或2’-O-甲基修饰，且硫代磷酸酯核苷间连结是包含于最终及倒数第二个连结处(反义股的3’及5’端，正义股仅5’端)，如图所示。
图3显示于优化huSNCA AAV转化小鼠中RNAi剂的体内活性时所获得的人SNCA的减弱结果(AAV培养于2e10病毒颗粒/小鼠产生可靠数据)。在以huSNCA 3’-UTR靶向AD-464634双链体及huSNCA编码序列靶向AD-464314双链体治疗的小鼠中，在第7日及第14日的时间点皆观察到人SNCA的稳定减弱。两种受测双链体皆观察到剂量反应，特别是于第14日的时间点。即便于第14日时间点亦观察到强烈的huSNCA的减弱，该两种双链体皆经确定为适于进一步的体内先驱发展研究。
图4显示在huSNCA AAV转导的小鼠(分别以2e10或2e11病毒颗粒转导的huSNCAAAV)的肝组织中所观察到的人SNCA的表达量，其中，是于第7、14及21日量测huSNCA量。
图5显示当施予大鼠SNCA-AAV转导的小鼠时，小鼠/大鼠交叉反应性双链体在体内抑制大鼠SNCA。所选定的RNAi剂包括AD-476344、AD-475666、AD-476306、AD-476061、AD-464814、AD-475728及AD-4644229。将资料标准化为经PBS处理的样本。
图6显示于表14的热点游走中测得的SNCA的减弱量，与用于排序表14中双链体的经计算1nM拟合值之间所观察到的强相关性。
由以下详细描述进一步阐明本发明。
具体实施方式
本公开提供了RNAi组成物，其影响SNCA基因的RNA转录本的RNA诱导的静默复合物(RISC)介导的裂解。SNCA基因可位于细胞内，例如个体体内如人体内的细胞。本公开进一步提供使用所揭RNAi组成物以抑制SNCA基因的表达、或用于治疗患有将获益于抑制或减少SNCA基因的表达的疾病的个体的方法，举例而言，SNCA相关疾病，如突触核蛋白病，诸如PD、多系统萎缩、路易体痴呆(LBD)、纯自主神经功能衰竭(PAF)、皮克病、进行性核上性麻痹、拳击性痴呆、与17号染色体相关的帕金森综合征、Lytico-Bodig病、缠结性痴呆、嗜银颗粒病、神经节细胞胶质瘤、神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、亚急性硬化性全脑炎、铅中毒性脑病、结节性硬化症、Hallervorden-Spatz病、脂褐质沉积症、皮质基底节变性、额颞叶痴呆、额颞叶退化、阿尔茨海默病、亨廷顿病、唐氏综合征、精神病、精神分裂症及克罗伊茨费尔特-雅各布病。
本公开的RNAi剂包含具有长度约30个核苷酸或更短区域的RNA股(反义股)，例如，15至30、15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23或21至22个核苷酸的长度，该区域是与SNCA基因的mRNA转录本的至少一部分实质上互补。于某些态样中，本公开的该RNAi剂包含具有约21至23个核苷酸的长度的区域的RNA股(反义股)，该区域与SNCA基因的mRNA转录本至少一部分实质上互补。
于某些态样中，本公开的RNAi剂包括RNA股(反义股)，其可包含更长的长度，例如多达66个核苷酸，例如36至66、26至36、25至36、31至60、22至43、27至53个核苷酸的长度，且具有至少19个接续核苷酸区域，该区域与SNCA基因的mRNA转录本至少一部分实质互补。此等具有较长反义股的RNAi剂可选地包含长度为20至60个核苷酸的第二RNA股(正义股)，其中，该正义股及反义股形成18-30个接续核苷酸的双链体。
此等RNAi剂的用途是能于哺乳动物中靶向降解SNCA基因的mRNA。是以，包含此等RNAi剂的方法及组成物可用于治疗将会受益于SNCA蛋白等级或活性降低的个体，举例而言，患有SNCA相关神经退化性疾病的个体，如突触核蛋白病，诸如PD、多系统萎缩、路易体痴呆(LBD)、纯自主神经功能衰竭(PAF)、皮克病、进行性核上性麻痹、拳击性痴呆、与17号染色体相关的帕金森综合征、Lytico-Bodig病、缠结性痴呆、嗜银颗粒病、神经节细胞胶质瘤、神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、亚急性硬化性全脑炎、铅中毒性脑病、结节性硬化症、Hallervorden-Spatz病、脂褐质沉积症、皮质基底节变性、额颞叶痴呆、额颞叶退化、阿尔茨海默病、亨廷顿病、唐氏综合征、精神病、精神分裂症及克罗伊茨费尔特-雅各布病。
神经元内α突触核蛋白的积累被描述导致路易氏体、圆形嗜酸性透明10-20pm大包涵体、或路易氏神经突起、以及拉长的线状失养轴突与树突的形成。在PD大脑中，路易氏体及路易氏神经突起的沉积主要限于连接纹状体与黑质的神经元。此类细胞对于运动与姿势功能的执行至关重要，并解释了PD症状的性质。在LBD大脑中，于中脑及皮质区域均发现路易氏体及路易氏神经突的广泛沉积。
α突触核蛋白为一种主要存在于神经元内的蛋白质。于神经元内，α突触核蛋白主要位于突触前，因此推测其于突触活性的调节中扮演一角色。已经识别出α突触核蛋白的三种主要异构体，其中，最长及最常见的形式包含140个胺基酸。
氧化压力与许多以错误折迭的α突触核蛋白的病理性积累为特征的神经退化性疾病有关。各种活性氧可诱导细胞膜或脂蛋白等脂质的过氧化，并导致多元不饱和脂肪酸生成高活性醛(Yori taka et al.，1996)。
在约50％的LBD病例中可见指向阿尔茨海默病(AD)的脑部病理，即淀粉样斑块与神经原纤维缠结。目前尚不清楚平行病理的存在是否意味着两种不同的疾病，或仅代表每种疾病的一个变体。有时，有共同病理的病例被描述为具有路易氏体变异的AD(Hansen etal.，1990)。
研究亦指出SNCA在AD与唐氏综合征中的作用，因为在此类病症中，α突触核蛋白业已证明在缘脑区域积累(Crews et al.，2009)。
罕见显性遗传形式的PD及LBD可由SNCA基因的点突变或重复而导致。致病突变A30P及A53T(Kruger et al.，1998)(Polymeropoulos et al.，1998)与基因重复(Chartier-Harlin et al.，2004)已经描述为导致家族性PD，而另一种α突触核蛋白突变，E46K(Zarranz et al.，2004)以及α突触核蛋白基因的三倍重复(Singleton et al.，2003)已经报导会导致PD或LBD。
α突触核蛋白突变的致病后果仅部分被了解。惟，体外研究资料显示A30P与A53T突变增加聚集率(Conway et al.，2000)。大量不同组成的α突触核蛋白种类(单体、二聚体、寡聚体，包括初原纤维)均参与该聚集过程，所有彼等均可能具有不同的毒性。目前尚不清楚哪些种类的分子在大脑中产生毒性作用。惟，研究显示α突触核蛋白的寡聚形式特别具有神经毒性。经观察，导致遗传性帕金森病的某些α突触核蛋白突变(A30P与A53T)导致寡聚率增加，为寡聚体的作用提供了额外证据。
不完全了解α突触核蛋白聚集级联如何肇始。可能是单体α突触核蛋白构形的改变引发二聚体与三聚体形成，在此类中等大小物质于路易氏体中作为不溶性原纤维沉积之前，彼等继续形成更高的可溶性寡聚体，包括初原纤维。亦可想象，一旦α突触核蛋白寡聚体形成，便可结合新单体及/或更小的α突触核蛋白多聚体，从而加速原纤维形成过程。此类播种效应亦可能发生于细胞外空间，因为一些证据显示在患病大脑中，α突触核蛋白病理是可能从一个神经元传播至另一个神经元。
以下详细描述揭露如何制备及使用含有RNAi剂的组成物以抑制SNCA基因的表达，以及用于治疗患有能受益于抑制或减少该基因的表达的疾病与病症的个体的组成物及方法。
I.本公开的RNAi剂
本文描述了抑制SNCA基因的表达的RNAi剂。于一态样中，该RNAi剂包括用于抑制SNCA基因于细胞诸如个体体内细胞的表达的双股核糖核酸(dsRNA)分子，该个体是如哺乳动物，例如具有下列疾病的人，诸如：SNCA相关神经退化性疾病，如突触核蛋白病，诸如PD、多系统萎缩、路易体痴呆(LBD)、纯自主神经功能衰竭(PAF)、皮克病、进行性核上性麻痹、拳击性痴呆、与17号染色体相关的帕金森综合征、Lytico-Bodig病、缠结性痴呆、嗜银颗粒病、神经节细胞胶质瘤、神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、亚急性硬化性全脑炎、铅中毒性脑病、结节性硬化症、Hallervorden-Spatz病、脂褐质沉积症、皮质基底节变性、额颞叶痴呆、额颞叶退化、阿尔茨海默病、亨廷顿病、唐氏综合征、精神病、精神分裂症及克罗伊茨费尔特-雅各布病。该dsRNA包括具有互补区域的反义股，该互补区与在SNCA基因的表达中形成的mRNA的至少一部分互补。于态样中，该互补区域长度是约15至30个核苷酸或更短。在与表达SNCA基因的细胞接触时，该RNAi剂抑制SNCA基因(例如，人类基因、灵长类基因、非灵长类基因)的表达至少50％，如通过诸如PCR或基于分支DNA(bDNA)的方式测定者，或基于蛋白质的方法如免疫荧光分析，例如使用西方墨点或流式细胞技术。
dsRNA包括两个RNA股，在该dsRNA将被使用的条件下，该两股互补并杂交而形成双链体结构。dsRNA的一股(反义股)包含互补区域，该互补区域与靶标序列实质上互补且通常完全互补。靶标序列可源于SNCA基因的表达过程中形成的mRNA序列。另一股(正义股)包含一个与反义股互补的区域，使两条股于适宜的条件下杂交并形成双链体结构。如本文中他处所揭示及所属领域中已知者，dsRNA的互补序列亦可以作为单个核酸分子的自互补区域而涵盖，而非作为独立的寡核苷酸。
一般而言，该双链体结构是15至30个碱基对的长度，例如15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23或21至22个碱基对的长度。于某些较佳态样中，双链体结构是18至25个碱基对的长度，例如18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至25、21至24、21至23、21至22、22至25、22至24、22至23、23至25、23至24或24至25个碱基对的长度，例如，19至21个碱基对的长度。上文引述的范围及长度之间的范围及长度亦视为本公开的一部分。
类似地，与靶标序列互补的区域是15至30个核苷酸的长度，如15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23或21至22个核苷酸的长度，例如，19至23个核苷酸的长度或21至23个核苷酸的长度。上文引述的范围及长度之间的范围及长度亦视为本公开的一部分。
于一些态样中，该dsRNA为15至23个核苷酸的长度，或24至30个核苷酸的长度(可选择地，25至30个核苷酸的长度)。一般而言，该dsRNA长至足以作为切丁酶的受质。举例而言，所属领域中习知，长度超过约21至23个核苷酸的dsRNA可用作切丁酶的受质。本领域技术人员亦应理解，作为裂解靶标的RNA区域最通常是较大RNA分子的一部分，一般为mRNA分子。在相关的情况下，则mRNA靶标的「一部分」为mRNA靶标的接续序列，其长度足以令其作为RNAi引导的裂解(即经由RISC途径裂解)的受质。
所属领域技术人士亦应知悉，双链体区域是dsRNA的主要功能部分，例如，双链体区域是约15至36个碱基对，如：15至36、15至35、15至34、15至33、15至32、15至31、15至30、15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23、或21至22个碱基对，例如，19至21个碱基对。因此，于一态样中，若它经加工为功能性双链体，例如15至30个碱基对，以靶向所欲的RNA进行裂解，具有大于30个碱基对的双链体区域的RNA分子或RNA分子复合物是dsRNA。因此，本领域技术人员将认知，于一态样中，miRNA是dsRNA。于另一态样中，dsRNA并非天然存在的miRNA。于另一态样中，用于靶向SNCA表达的RNAi剂并非透过裂解较大的dsRNA在靶标细胞内生成。
本文所述的dsRNA还可包括一或多个例如1、2、3或4个核苷酸的单股核苷酸突出端。核苷酸突出端可包含核苷酸/核苷类似物或由其组成，包括去氧核苷酸/核苷。该突出端可位于正义股上、反义股上或其任意组合上。此外，该突出端的核苷酸可存在于dsRNA的反义股或正义股的5’端、3’端或两端。于某些态样中，更长、延伸的突出端是可能者。
dsRNA可以通过下文进一步讨论的该技术领域习知的标准技术合成，例如通过使用自动化DNA合成仪，诸如可自如Biosearch、Appl ied Biosystems，Inc.商购获得。
本公开的iRNA化合物可使用两步的过程制备。首先，双股RNA分子的个别股是分开制备。随后，将该等组分股黏合。该siRNA化合物的个别股可使用溶液相有机合成、固相有机合成或其两者制备。有机合成提供的优点是可轻易制备包含非天然或经修饰的核苷酸的寡核苷酸股。本公开的单股寡核苷酸可使用溶液相有机合成、固相有机合成或两者制备。
可通过多种方法生产siRNA，例如批次性。示例性方法包括：有机合成及RNA裂解，例如体外裂解。
siRNA可通过独立地合成单股RNA分子或双股RNA分子的每一股作成，然后可黏合组分股。
大型生物反应器，例如，来自Pharmacia Biotec AB(Uppsala Sweden)的OligoPilot II，可用来产生大量的给定siRNA的特定RNA股。OligoPilot II反应器可使用仅1.5莫耳过量的亚膦酰胺核苷酸有效地偶联核苷酸。为了作成RNA股，使用了核糖核苷酸酰亚胺化物。单体加成的标准周期可用来合成siRNA的21至23个核苷酸的股。通常，独立地作成两个互补的股随后黏合，例如，在从固体支撑物释放并去保护之后。
有机合成可用来生产分立的siRNA种类。可精确界定该种类与SNCA基因的互补性。举例而言，该种类可与包含多型性如单核苷酸多型性的区域互补。此外，可精确界定多型性的位置。于一些态样中，多型性是位于内部区域，例如距离一或两个末端的至少4、5、7或9个核苷酸处。
于一态样中，所生成的RNA经小心地纯化以移除末端。举例而言，使用切丁酶或可比的RNAse III的活性，于体外将iRNA裂解为siRNA。例如，dsiRNA可于来自果蝇的体外抽出物中培养，或使用经纯化的组分，如经纯化的RNAse或RISC(RNA诱导的静默复合体)进行培养。详见，例如，Ketting et al.Genes Dev 2001 Oct 15；15(20)：2654-9及HammondScience 2001 Aug 10；293(5532)：1146-50。
dsiRNA裂解通常产生复数个siRNA种类，各种类具体为来源dsiRNA分子的21至23nt片段。举例而言，可存在siRNA，其是包含与来源dsiRNA分子的重叠区域及相邻区域互补的序列。
无论合成方法为何，该siRNA制剂均可于适用于配制的溶液(例如，水溶液或有机溶液)中制备。例如，siRNA制剂可沉淀并重新溶解于纯双蒸馏水中，接着冻干。随后可将干燥的siRNA重新悬浮于适用于预期配制过程的溶液中。
一方面，本公开的dsRNA包括至少两个核苷酸序列：正义序列及反义序列。对SNCA的正义股序列可选自表2、3、12或13中提供的序列所组成的群组，而该正义股的反义股的对应核苷酸序列可选自表2、3、12或13中提供的序列所组成的群组。于此方面，该两个序列的一者与该两个序列的另一者互补，且其中一个序列与在SNCA基因的表达中生成的mRNA序列实质上互补。如是，于此方面，对SNCA，dsRNA将包括两个寡核苷酸，其中一个寡核苷酸在表2、3、12或13中揭示为为正义股(随从股)，并且第二寡核苷酸是于表2、3、12或13中揭示的正义股的对应反义股(导引股)。
于一态样中，该dsRNA的实质互补序列包含于独立的寡核苷酸上。于另一态样中，该dsRNA的实质互补序列包含于单个寡核苷酸上。
应理解，虽然本文提供的序列是揭示为经修饰或经接合的序列，但本公开的RNAi剂的RNA，如本公开的dsRNA，可包含表2、3、12或13所列的任一序列，其是未修饰、未接合或经不同于本文所述的修饰或接合。一或多个亲脂性配体或一或多个GalNAc配体可包含于本申请所提供的RNAi剂的任意位置中。
本领域中习知技艺人士应知悉，具有约20至23个碱基对，如21个碱基对的双链体结构dsRNA已经称为在诱导RNA干扰中尤其有效(Elbashir et al.，(2001)EMBO J.，20：6877-6888)。惟，其他人已发现，更短或更长的RNA双链体结构亦可为有效者(Chu and Rana(2007)RNA 14：1714-1719；Kim et al.(2005)Nat Biotech 23：222-226)。于上文揭示的态样中，藉本文中提供的寡核苷酸序列的性质，本文所揭的dsRNA可包括至少一个长度为最少21个核苷酸的股。可合理地预期，仅在一端或两端减去几个核苷酸的较短双链体可能具备与上述dsRNA类似的效果。因此，具有本文提供序列的一者的至少15、16、17、18、19、20或更多个接续核苷酸序列的dsRNA，包括源自使用本文实施例所示Be(2)-C细胞体外测定、浓度10nM的RNA剂以及PCR测定的完整序列dsRNA，抑制SNCA基因的表达的能力相异不超过10、15、20、25或30％，是预期处于本公开范围内。
一种针对抑制SNCA的基准测定牵涉将人类Be(2)-C细胞与此揭的dsRNA剂接触，其中，相较于合适的对照组(例如，未与靶向SNCA的dsRNA接触的细胞)，如果于经接触的细胞中观察到SNCA转录本或蛋白质至少减低5％、至少减低10％、至少减低15％、至少减低20％、至少减低25％、至少减低30％、至少减低35％、至少减低40％、至少减低45％、至少减低至少50％、至少减低55％、至少减低60％、至少减低65％、至少减低70％、至少减低75％、至少减低80％、至少减低85％、至少减低90％、至少减低95％、至少减低97％、至少减低98％、至少减低99％或更多，则可经确认为足够或有效的SNCA抑制。可选择地，本公开的dsRNA剂是以10nM浓度给药，且如本文实施例(如下述实施例2)中所揭的PCR进行测定。
此外，本文所揭的RNA识别SNCA转录本中对RISC介导的裂解敏感的位点。如是，本公开进一步提出位于此位点内的RNAi剂。如本文中所用，若该RNAi剂促进该特定位点内任意处的转录本的裂解，则称该RNAi剂靶向RNA转录本的特定位点。此RNAi剂通常将包括来自本文所提供的一个序列的至少约15个接续核苷酸，可选择地至少19个核苷酸，该序列与取自与SNCA基因中所选序列相邻的区域的额外核苷酸序列偶联。
本文中所揭示的RNAi剂可含有一个或多个与靶标序列的误配。于一个态样中，本文中所揭示的RNAi剂含有不超过3个误配(亦即，3、2、1或0个误配)。于一个态样中，本文中所揭示的RNAi剂含有不超过2个误配。于一个态样中，本文中所揭示的RNAi剂含有不超过1个误配。于一个态样中，本文中所揭示的RNAi剂含有0个误配。于某些态样中，如果RNAi剂的反义股含有与靶标序列的误配，则该误配可任选地被限定于自互补区域的5’端或3’端计数的最末5个核苷酸内。例如，于此类态样中，对于23个核苷酸的RNAi剂，与SNCA基因区域互补的股通常不含位于中心13个核苷酸处的任意误配。本文中揭示的方法或该领域中已知的方法可用于确定，含有与靶标序列误配的RNAi剂是否有效抑制SNCA基因的表达。虑及具有误配的RNAi剂于抑制SNCA基因的表达方面的功效是重要者，尤其若已知SNCA基因中的特定互补区域在群体内具有多型性序列变异。
II.本公开经修饰的RNAi剂
于一态样中，本公开的RNAi剂的RNA如dsRNA是未修饰者，且不包含例如所属领域中已知及本文所揭的化学修饰或接合。于较佳态样中，本公开的RNAi剂(例如dsRNA)的RNA经化学修饰以增强其安定性或其他有益的特性。于本公开的某些态样中，本公开的RNAi剂的实质上全部核苷酸是经修饰。于本公开的其他态样中，本公开的RNAi剂的全部核苷酸是经修饰。本公开的其「实质上全部核苷酸是经修饰者」的RNAi剂大多数并非全部经修饰，且可包括不超过5、4、3、2或1个未经修饰的核苷酸。于本公开的又其他态样中，本公开的RNAi剂可包括不超过5、4、3、2或1个经修饰的核苷酸。
本公开提出的核酸可通过该领域中良好建构的方法合成或修饰，该方法例如彼等于《现代核酸化学技术》(「Current protocols in nucleic acid chemistry」，Beaucage，S.L.et al.(Edrs.)，John Wiley&Sons，Inc.，New York，NY，USA)中揭示者，该文献通过引用并入本文。修饰包括，举例而言，末端修饰，例如，5’端修饰(磷酰化、接合、反向连结)或3’端修饰(接合、DNA核苷酸、反向连结等)；碱基修饰，例如，替换为安定化碱基、去安定化碱基、或与同伴的拓展物进行碱基配对的碱基，移除碱基(无碱基的核苷酸)，或接合碱基；糖修饰(例如，在2’-位置或4’-位置)或糖的取代；或骨干修饰，包括磷酸二酯类连结的修饰或取代。可用于本文所述态样中的RNAi剂的具体示例包括，但不限于，含有经修饰的骨干或不含天然核苷酸间连结的RNA。具有经修饰的骨干的RNA除此的外亦包括彼等在骨干中不具有磷原子者。对于本说明书的目的，且如该领域中有时参照者，在其核苷酸间骨干中不具有磷原子的经修饰的RNA亦可视为寡核苷酸。于一些态样中，经修饰的RNAi剂于其核苷酸间骨干中具有磷原子。
经修饰的RNA骨干包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基磷酸三酯、包括3’-亚烷基膦酸酯及手性膦酸酯的甲基与其他烷基膦酸酯；次膦酸酯、包括3’-胺基胺基磷酸酯及胺基烷基胺基磷酸酯的胺基磷酸酯、硫羰基胺基磷酸酯，硫羰基烷基磷酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯、及具有正常3’-5’连结的硼磷酸酯、此等的2’-5’连结类似物、以及彼等具有反向极性者，其中相邻核苷单元对于3’-5’至5’-3’连结，或于2’-5’至5’-2’连结。尚包括各种盐类例如钠盐、混合盐及游离酸形式。
教示制备上述含磷连结的代表性美国专利包括但不限于：美国专利第3,687,808号；第4,469,863号；第4,476,301号；第5,023,243号；第5,177,195号；第5,188,897号；第5,264,423；第5,276,019号；第5,278,302号；第5,286,717号；第5,321,131号；第5,399,676号；第5,405,939号；第5,453,496号；第5,455,233号；第5,466,677号；第5,476,925号；第5,519,126号；第5,536,821号；第5,541,316号；第5,550,111号；第5,563,253号；第5,571,799号；第5,587,361号；第5,625,050号；第6,028,188号；第6,124,445号；第6,160,109号；第6,169,170号；第6,172,209号；第6,239,265号；第6,277,603号；第6,326,199号；第6,346,614号；第6,444,423号；第6,531,590号；第6,534,639；第6,608,035号；第6,683,167号；第6,858,715号；第6,867,294；第6,878,805；第7,015,315号；第7,041,816号；第7,273,933号；第7,321,029号；以及美国再公告专利第RE39464号，各专利的整体内容通过引用并入本文。
其内部不包括磷原子的经修饰的RNA骨干具有由短链烷基或环烷基核苷间连结、混合杂原子及烷基或环烷基核苷间连结、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间连结形成的骨干。此等是包括彼等具有味啉基连结者(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨干；硫化物、亚砜及砜骨干；甲酰基及硫代甲酰基骨干；亚甲基甲酰基及硫代甲酰基骨干；含烯烃骨干；胺基磺酸酯骨干；亚甲基亚胺基及亚甲基肼基骨干；磺酸酯及磺酰胺骨干；酰胺骨干；以及其他具有混合的N、O、S与CH2组分部分者。
教示制备上述寡核苷的代表性美国专利包括但不限于：美国专利第5,034,506号；第5,166,315号；第5,185,444号；第5,214,134号；第5,216,141号；第5,235,033号；第5,64,562号；第5,264,564号；第5,405,938号；第5,434,257号；第5,466,677号；第5,470,967号；第5,489,677号；第5,541,307号；第5,561,225号；第5,596,086号；第5,602,240号；第5,608,046号；第5,610,289号；第5,618,704号；第5,623,070号；第5,663,312号；第5,633,360号；第5,677,437号；及第5,677,439号，其各自的整体内容通过引用并入本文。
于其他态样中，适宜的RNA模拟物考虑用于RNAi剂中，其中核苷酸单元的糖及核苷间连结两者，即骨干是经置换为新颖的基团。碱基单位维持与适宜的核酸靶标化合物杂交。一种此类寡聚化合物，已经证明具有优异杂交特性的RNA模拟物，被称为肽核酸(PNA)。于PNA化合物中，RNA的糖骨干替换为含酰胺的骨干，特别是含胺乙基甘胺酸的骨干取代。核碱基得以保留并直接或间接与骨干的酰胺部分的氮杂氮原子结合。教示PNA化合物制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利第5，539，082号；第5，714，331号；及第5，719，262号，其各自的整体内容通过引用并入本文。适用于本公开的RNAi剂中的额外的PNA化合物揭示于如Nielsen et al.，Science，1991，254，1497-1500中。
本公开中一些态样包括具有硫代磷酸酯骨干的RNA及具有杂原子骨干的寡核苷，尤其是--CH2--NH--CH2-，--CH2--N(CH3)--O--CH2--[已知作为亚甲基(甲基亚胺基)或MMI骨干]、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--以及--N(CH3)--CH2--CH2--[其中天然磷酸二酯骨干表示为-O--P--O--CH2--]，以及上文引用的美国专利第5,489,677号，及上文引用的美国专利第5,602,240号的酰胺骨干。在一些态样中，本文提出的RNA具有上文引用的US5,034,506的味啉基骨干结构。
经修饰的RNA亦可包含一或多个经取代的糖部分。本文提出的RNAi剂例如dsRNA，可包括位于在2’位置的下述的一者：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中该烷基、烯基和炔基可为经取代或未经取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基及炔基。示例性的适宜修饰包括O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2).nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、以及O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n及m为1至约10。于其他态样中，dsRNAs包括位于2’位置的下述的一者：C1至C10低级烷基、经取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、胺基烷基胺基、聚烷基胺基、经取代的硅烷基、RNA裂解基团、保护基团、嵌入剂、用于改善RNAi剂的药物动力学特性的基团、或用于改善RNAi剂的药效动力学的基团，以及具有类似特性的其他取代基。于一些态样中，该修饰包括2’甲氧基乙氧基(2’-O--CH2CH2OCH3，亦称为2’-O-(2-methoxyethyl)或2’-MOE)修饰包括2’甲氧基乙氧基(2’-O--CH2CH2OCH3，也称为2’-O-(2-甲氧基乙基)或2’-MOE)(Martin et al.，Helv.Chim.Acta，1995，78：486-504)即，烷氧基-烷氧基。另一示例性修饰为2’-二甲胺基氧乙氧基，即0(CH2)2ON(CH3)2基团，亦称为2’DMAOE，如下文实施例中所述；以及2’-二甲胺基乙氧基乙氧基(所属领域中亦称为2’-O-二甲胺基乙氧基乙基或2’-DMAEOE)，即2’-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2。其他示例性修饰包括：5’-Me-2’-F核苷酸、5’-Me-2’-OMe核苷酸、5’-Me-2’-去氧核苷酸(于此三组中，均是R及S异构体两者)；2’-烷氧基烷基；以及2’-NMA(N-甲基乙酰胺)。
其他修饰包括2’-甲氧基(2’-OCH3)、2’-胺基丙氧基(2’-OCH2CH2CH2NH2)、2’-O-十六烷基及2’-氟(2’-F)。类似的修饰亦可于RNAi剂的RNA上的其他位置进行，尤其是3’端核苷酸上的糖的3’位置或2’-5’连接的dsRNA中以及5’端核苷酸的5’位置。RNAi剂亦可具有替代呋喃戊糖基糖的糖模拟物如环丁基部分。教示制备此类修饰的糖结构的代表性美国专利包括但不限于：美国专利第4,981,957号；第5,118,800号；第5,319,080号；第5,359,044号；第5,393,878号；第5,446,137号；第5,466,786号；第5,514,785号；第5,519,134号；第5,567,811号；第5,576,427号；5,591,722号；第5,597,909号；第5,610,300号；第5,627,053号；第5,639,873号；5,646,265号；5,658,873号；第5,670,633；以及第5,700,920号，此等中的某些为本申请所共有。前述者各自的整体内容通过引用并入本文。
本公开的RNAi剂还可包括核碱基(于所属领域中一般简称为「碱基」)修饰或取代。如本文所用，「未修饰」或「天然」核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)及鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与尿嘧啶(U)。经修饰的核碱基包括其他合成与天然核碱基，如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)；5-羟甲基胞嘧啶；黄嘌呤；次黄嘌呤；2-胺基腺嘌呤；腺嘌呤与鸟嘌呤的6-甲基及其他烷基衍生物；腺嘌呤与鸟嘌呤的2-丙基及其他烷基衍生物；2-硫尿嘧啶，2-硫胸腺嘧啶、2-硫胞嘧啶；5-卤尿嘧啶及胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶及胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶及胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；8-卤、8-胺基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基及其他8-取代的腺嘌呤及鸟嘌呤；5-卤，尤其是5-溴、5-三氟甲基及其他5-取代的尿嘧啶与胞嘧啶；7-甲基鸟嘌呤及7-甲基腺嘌呤；8-氮杂鸟嘌呤及8-氮杂腺嘌呤；7-去氮鸟嘌呤及7-去氮杂腺嘌呤；以及3-去氮鸟嘌呤及3-去氮腺嘌呤。进一步的核碱基包括彼等揭示于美国专利第3,687,808号者；彼等揭露于《生物化学、生物技术及医药中的经修饰的核苷酸》(Modified Nucleosides in Biochemistry，Biotechnology and Medicine，Herdewijn，P.ed.Wiley-VCH，2008)中者；彼等揭露于《聚合物科学及工程的简明百科》(TheConcise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering，pages 858-859，Kroschwitz，J.L，ed.John Wiley&Sons，1990)中者；此等由Englisch et al.，(1991)Angewandte Chemie,International Fdi tion，30：613揭露者；以及彼等由《dsRNA研究及应用》第15章第289至302页(Sanghvi，Y S.，Chapter 15，dsRNA Research and Applications，pages 289-302，Crooke，S.T.and Lebleu，B.，Ed.，CRC Press，1993)揭露者。此等核碱基中的某些尤其可用于增加本公开提出的寡聚化合物的结合亲和性。此等包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶及N-2、N-6及O-6取代的嘌呤，包括2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙基尿嘧啶及5-丙基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已经显示将核酸双螺旋安定性增加0.6至1.2℃(Sanghvi，Y.S.，Crooke，S.T.and Lebleu，B.，Eds.，dsRNA Research and Applications，CRC Press，Boca Raton，1993，pp.276-278)且是示例性碱基取代，尤其是当与2’-O-甲氧基乙基糖修饰合用时尤甚。
教示制备某些上述经修饰的核碱基及其他经修饰的核碱基的代表性美国专利，包括但不限于：上述的美国专利第3,687,808号；第4,845,205号；第5,130,30号；第5,134,066号；第5,175,273号；第5,367,066号；第5,432,272号；第5,457,187号；第5,459,255号；第5,484,908号；第5,502,177号；第5,525,711号；第5,552,540号；第5,587,469号；第5,594,121号；第5,596,091号；第5,614,617号；第5,681,941号；第5,750,692；第6,015,886号；第6,147,200号；第6,166,197号；第6,222,025号；第6,235,887号；第6,380,368号；第6,528,640号；第6,639,062号；第6,617,438号；第7,045,610号；第7,427,672号；及第7,495,088号，其各自的整体内容是通过引用并入本文。
本公开的RNAi剂亦可经修饰，以包含一或多个锁定的核酸(LNA)。锁定的核酸是具有经修饰的核糖部分的核苷酸，其中，该核糖部分包含连结2’与4’碳的外接桥。此一结构有效地将核糖「锁定」为3’环内结构的构形。已证明将锁定的核酸加入至siRNA中可提高血清中siRNA的安定性，并减少其脱靶效应(Elmen，J.et al.，(2005)Nucleic Acids Research33(1)：439-447；Mook，OR.et al.，(2007)Mol Canc Ther 6(3)：833-843；Grunwel ler，A.et al.，(2003)Nucleic Acids Research 31(12)：3185-3193)。
本公开的RNAi剂可经修饰，以包括一或多个双环糖部分。「双环糖」是通过两个原子桥接而修饰的呋喃糖基环。「双环核苷」(「BNA」)是具有包含连接糖环的两个碳原子的桥的糖部分的核苷，从而形成双环系统。于某些态样中，桥连结糖环的4’-碳与2’-碳。因此，本公开的剂可包括一或多个锁定的核酸(LNA)。锁定的核酸是具有经修饰的核糖部分的核苷酸，其中该核糖部分包含连结2’与4’碳的外接桥。换句话说，LNA是包含双环糖部分的核苷酸，其中，该双环糖部分包含4’-CH2-O-2’桥。此一结构有效地将核糖「锁定」为3’环内结构的构形。业已证明将锁定的核酸加入至siRNA中可提高血清中siRNA的安定性，并减少其脱靶效应(Elmen，J.et al.，(2005)Nucleic Acids Research 33(1)：439-447；Mook，OR.etal.，(2007)Mol Canc Ther 6(3)：833-843；Grunweller，A.et al.，(2003)Nucleic AcidsResearch 31(12)：3185-3193)。用于本公开的多核苷酸的双环核苷的示例包括但不限于，包含位于4’及2’核糖基环原子间的桥的核苷。于某些态样中，本公开的反义多核苷酸剂包括一或多个包含4’至2’桥的双环核苷。此类4’至2’桥接至双环核苷的示例包括但不限于4’-(CH2)-O-2’(LNA)；4’-(CH2)-S-2’；4’-(CH2)2-O-2’(ENA)；4’-CH(CH3)-O-2’(亦称为「受约束的乙基」或「cEt」)及4’-CH(CH2OCH3)-O-2’(及其类似物；参见，例如美国专利第7，399，845号)；4’-C(CH3)(CH3)-O-2’(及其类似物；参见例如美国专利第8，278，283号)；4′-CH2-N(OCH3)-2′(及其类似物；参见例如美国专利第8，278，425号)；4′-CH2-O-N(CH3)-2′(参见，例如美国专利公开第2004/0171570号)；4’-CH2-N(R)-O-2’，其中R是H、C1-C12烷基或保护基团(参见，例如美国专利第7，427，672号)；4′-CH2-C(H)(CH3)-2′(参见，例如，Chattopadhyaya etal.，J.Org.Chem.，2009，74，118-134)；以及4′-CH2-C(＝CH2)-2′(及其类似物；参见，例如美国专利第8，278，426号)。前述者各自的整体内容通过引用并入本文。
教示锁定的核酸核苷酸制备的其他代表性美国专利及美国专利公开包括但不限于以下：美国专利第6,268,490号、第6,525,191号、第6,670,461号、第6,770,748号、第6,794,499号、第6,998,484号、第7,053,207号、第7,034,133号、第7,084,125号、第7,399,845号、第7,427,672号、第7,569,686号、第7,741,457号、第8,022,193号、第8,030,467号、第8,278,425号、第8,278,426号、第8,278,283号、US 2008/0039618及US 2009/0012281，其各自的整体内容通过引用并入本文。
前述双环核苷的任意者可制备为具有一或多种立体化学糖组态，包括，举例而言，α L-呋喃核糖及β-D-呋喃核糖(参见WO 99/14226)。
本公开的RNAi剂亦可经修饰，以包括一或多个受约束的乙基核苷酸。如本文中所使用，「受约束的乙基核苷酸」或「cEt」是包含双环糖部分的锁定核酸，其中该双环糖部分包含4’-CH(CH3)-O-2’桥。于一态样中，该受约束的乙基核苷酸呈S构形，本文中称的为「S-cEt」。
本公开的RNAi剂亦可包括一或多个「构形上受限的核苷酸」(「CRN」)。CRN是核苷酸类似物，其带有连接核糖的C2’与C4’碳或核糖的C3’与C5’碳的连接子。CRN将该核糖环锁定为安定的构形且增加其与mRNA的杂交亲和力。连接子的长度足以将氧置于安定性与亲和力的最佳位置，从而减少核糖环褶皱。
教示上述CRN制备的代表性专利公开包括但不限于US 2013/0190383及WO 2013/036868，其各自的整体内容通过引用并入本文。
于一些态样中，本公开的RNAi剂包含一或多个作为UNA(未锁定核酸)核苷酸的单体。UNA是未锁定的非环核酸，其中，该糖的任意键已经移除，而形成未锁定的「糖」残基。于一示例中，UNA亦涵盖C1’-C4’间键已被移除的单体(即C1’和C4’碳间的碳-氧-碳共价键)。于另一示例中，糖的C2’-C3’键(即C2’和C3’碳间的碳-碳共价键)已被移除(参见Nuc.AcidsSymp.Series，52，133-134(2008)以及Fluiter et al.，Mol.Biosyst.，2009，10，1039，通过引用并入本文)。
教示UNA制备的代表性美国专利公开包括但不限于US8,314,227；及美国专利公开第2013/0096289号；第2013/0011922号；及2011/0313020号，其各自的整体内容通过引用并入本文。
对RNA分子末端的潜在安定化修饰可包括N-(乙酰胺基己酰基)-4-羟基脯胺醇(Hyp-C6-NHAc)、N-(己酰基-4-羟基脯胺醇(Hyp-C6)、N-(乙酰基-4-羟基脯胺醇)(Hyp-NHAc)，胸苷-2’-O-去氧胸苷(乙醚)，N-(胺基己酰基)-4-羟脯胺醇(Hyp-C6-胺基)，2-二十二烷酰基-尿苷-3″-磷酸酯、反向碱基dT(idT)等。此类修饰的揭示可见于WO 2011/005861中。
本公开的RNAi剂的其他修饰包括5’磷酸酯或5’磷酸酯模拟物，例如位于RNAi剂反义股上的5’端磷酸酯或磷酸酯模拟物。合适的磷酸盐模拟物揭露于例如US 2012/0157511中，其整体内容通过引用并入本文。
A.本公开的包含模体的经修饰RNAi剂
于本公开某些方面，本公开的双股RNAi剂包括具有如WO 2013/075035中所揭示的化学修饰的剂，其整体内容通过引用并入本文。如本文及WO 2013/075035中所示，通过将三个接续核苷酸上的三个一致修饰的一或多个模体引入RNAi剂的正义股及反义股中，尤其是在裂解位点或其邻近处，可获得优异的结果。于一些态样中，该RNAi剂的正义股及反义股可以其他方式完全修饰。此等模体的引入中断该正义股或反义股的修饰模式(若存在)。该RNAi剂可任选地与亲脂性配体如C16配体接合，例如于正义股上接合。该RNAi剂可任选地经(S)-乙二醇核酸(GNA)修饰，例如于反义股的一或多个残基上修饰。所得的RNAi剂展现优异的基因静默活性。
据此，本公开提供能在体内抑制靶标基因(即SNCA基因)的表达的双股RNAi剂。该RNAi剂包含正义股及反义股。RNAi剂的每一股可为15至30个核苷酸的长度。例如，每一股可为16至30个核苷酸的长度、17至30个核苷酸的长度、25至30个核苷酸的长度、27至30个核苷酸的长度、17至23个核苷酸的长度、17至21个核苷酸的长度、17至19个核苷酸的长度、19至25个核苷酸的长度、19至23个核苷酸的长度、19至21个核苷酸的长度、21至25个核苷酸的长度、或21至23核苷酸的长度。于某些态样中，每一股是19至23个核苷酸的长度。
该正义股及反义股典型地形成双链体双股RNA(「dsRNA」)，本文中亦称的为「RNAi剂」。RNAi剂的双链体区域可为15至30个核苷酸对的长度。例如，该双链体区域可为16至30个核苷酸对的长度、17至30个核苷酸对的长度、27至30个核苷酸对的长度、17至23个核苷酸对的长度、17至21个核苷酸对的长度、17至19个核苷酸对的长度、19至25个核苷酸对的长度、19至23个核苷酸对的长度、19至21个核苷酸对的长度、21至25个核苷酸对的长度、或21至23个核苷酸对的长度。于另一示例中，该双链体区域是选自15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26及27个核苷酸的长度。于较佳的态样中，该双链体区域是19至21个核苷酸对的长度。
于一态样中，该RNAi剂可包含位于一股或两股的3’端、5’端或两端的一或多个突出区域或封端基团。该突出可为1至6个核苷酸的长度，例如2至6个核苷酸的长度、1-5个核苷酸的长度、2至5个核苷酸的长度、1至4个核苷酸的长度、2至4个核苷酸的长度、1至3个核苷酸的长度、2至3个核苷酸的长度、或1至2个核苷酸的长度。于较佳的态样中，该核苷酸突出区域为2个核苷酸的长度。该突出可为一股长于另一股的结果，亦可为相同长度的两股错开的结果。该突出可与靶标mRNA形成误配，亦可与靶标基因序列互补，或可为其他序列。第一股及第二股亦可连接通过如额外的碱基接合而形成发夹，或通过其他非碱基连接子而接合。
于一态样中，RNAi剂的突出区域中的核苷酸可各自独立为经修饰或未修饰的核苷酸，包括但不限于2’-糖修饰，例如2’-F、2’-O-甲基、胸苷(T)及其任意的组合。
举例而言，TT可为任一股上任一端的突出序列。该突出可与靶标mRNA形成误配，亦可与靶标基因序列互补，亦可为其他序列。
位于该RNAi剂的正义股、反义股或两股的5’或3’突出可经磷酸化。于一些态样中，该突出区域含有两个核苷酸，且在该两个核苷酸之间具有硫代磷酸酯，其中，该两个核苷酸可为相同或相异。于一态样中，该突出存在于正义股、反义股或两股的3’端。于一态样中，此一3’突存在于反义股中。于一态样中，此一3’突出存在于正义股中。
该RNAi剂可仅含有一个突出，其可强化该RNAi的干扰活性而不影响其整体安定性。例如，单股突出可位于正义股3’端，亦可位于反义股3’端。该RNAi亦可具有平端，位于反义股5’端(或正义股3’端)，反之亦然。一般而言，该RNAi的反义股具有位于3’端的核苷酸突出，且5’端是平端。尽管不欲束缚于理论，但位于反义股5’端的不对称钝端及反义股3’端的突出有助于将导引股载入RISC过程中。
于一态样中，该RNAi剂是19个核苷酸的长度、两端皆为平端，其中，正义股5’端位置7、8、9处的三个接续核苷酸上含有至少一个具三个2’-F修饰的模体。反义股5’端位置11、12、13处的三个接续核苷酸上含有至少一个具三个2’-O-甲基修饰的模体。
于另一态样中，该RNAi剂是20个核苷酸的长度、两端皆为平端，其中正义股5’端位置8、9、10处的三个接续核苷酸上含有至少一个具三个2’-F修饰的模体。反义股5’端位置11、12、13处的三个接续核苷酸上含有至少一个具三个2’-O-甲基修饰的模体。
于又一态样中，该RNAi剂是21个核苷酸的长度、两端皆为平端，其中，正义股5’端位置9、10、11处的三个接续核苷酸上含有至少一个具三个2’-F修饰的模体。反义股5’端位置11、12、13处的三个接续核苷酸上含有至少一个具三个2’-O-甲基修饰的模体。
于一态样中，该RNAi剂包括具21个核苷酸的正义股及具23个核苷酸的反义股，其中，正义股5’端位置9、10、11处的三个接续核苷酸上含有至少一个具三个2’-F修饰的模体；反义股5’端位置11、12、13处的三个接续核苷酸上含有至少一个具三个2’-O-甲基修饰的模体，其中，该RNAi剂的一端是平端，另一端包括2个核苷酸突出。任选地，该2个核苷酸突出位于反义股的3’端。当该2个核苷酸突出位于反义股的3’端，末端三个核苷酸之间可能有两个硫代磷酸酯核苷酸间连结，其中，该三个核苷酸中的两个为突出核苷酸，而第三个核苷酸是突出核苷酸旁的配对核苷酸。于一态样中，该RNAi剂在正义股5’端及反义股5’端的末端三个核苷酸之间尚具有两个硫代磷酸酯核苷酸间连结。于一态样中，该RNAi剂的正义股及反义股中每一个核苷酸，包含作为模体一部分的核苷酸，均是经修饰的核苷酸。于一态样中，各残基是独立地经2’-O-甲基或3’-氟以例如交替模体方式修饰。任选地，该RNAi剂还包含配体(如亲脂性配体、可选地是C16配体)。
于一态样中，该RNAi剂包含正义股及反义股，其中，该正义股的长度为25至30个核苷酸残基，其中，自第一股5’端核苷酸(位置1)算起，位置1至23处包含至少8个核糖核苷酸；反义股长度为36至66个核苷酸残基，且自3’末端核苷酸算起，在与正义股位置1至23配对以形成双链体的位置中包含至少8个核糖核苷酸；其中，至少反义股的3’端核苷酸未与正义股配对，且至多6个接续的3’端核苷酸未与正义股配对，从而形成1至6个核苷酸的3’单股突出；其中，反义股5’端包含10至30个未与正义股配对的接续核苷酸，从而形成10至30个核苷酸的单股5’突出；其中，当将正义股及反义股对齐以实现最大互补程度时，至少该正义股的5’端与3’端核苷酸与反义股的核苷酸进行碱基配对，从而在正义股与反义股间形成实质上的双链体区域；反义股沿着至少19个反义股长度的核糖核苷酸与靶标RNA充分互补，以当将该双股核酸引入哺乳动物细胞时，减少靶标基因的表达；其中，正义股包含至少一个位于三个接续核苷酸上的三个2’-F修饰的模体，其中，该等模体的至少一者出现于裂解位点或其邻近处。反义股含有至少一个位于或靠近裂解位点的三个接续核苷酸上的三个2’-O-甲基修饰的模体。
于一态样中，该RNAi剂包含正义股及反义股，其中，该RNAi剂包含具有至少25且至多29个核苷酸的长度的第一股，及至多30个核苷酸的长度、且具有至少一个位于自5’端算起位置11、12、13处的三个接续核苷酸上的三个2’-O-甲基修饰的模体的第二股；其中，该第一股的3’端及该第二股的5’端形成平端，且该第二股的3’端比第一股长1至4个核苷酸，其中，该双链体区域的长度是至少25个核苷酸，且该第二股沿着第二股长度的至少19个核苷酸是与靶标mRNA充分互补，以在当该RNAi剂被引入哺乳动物细胞时，降低靶标基因的表达；并且其中，该RNAi剂的切丁酶裂解优先得到包含该第二股的3’端的siRNA，从而降低哺乳动物体内靶标基因的表达。可选择地，该RNAi剂还包含配体。
于一态样中，该RNAi剂的正义股包含至少一个位于三个接续核苷酸上的三个一致修饰的模体，其中，该等模体的一者出现于正义股的裂解位点处。
于一态样中，该RNAi剂的反义股亦可含有至少一个位于三个接续核苷酸上的三个一致修饰的模体，其中，该等模体的一者出现于该反义股的该裂解位点或其邻近处。
对于具有17至23核苷酸长度的双链体区域的RNAi剂，反义股的裂解位点典型是位于5’端起的位置10、11、12附近。因此，该等三个一致修饰的模体可出现于反义股的位置9、10、11；10、11、12；11、12、13；12、13、14；或13、14、15处，自该反义股5’端的第1个核苷酸开始计数，或者在双链体区域内自该反义股5’端的第一对核苷酸开始计数。反义股的裂解位点亦可根据RNAi双链体区域内自5’端起计数的长度而改变。
该RNAi剂的该正义股可含有至少一个位于该股裂解位点处的三个接续核苷酸上的三个一致修饰的模体；且反义股可具有至少一个位于该股裂解位点或其邻近处的三个接续核苷酸上的三个一致修饰的模体。当正义股及反义股形成dsRNA双链体时，正义股及反义股可经对齐，使得位于正义股上的三个核苷酸中的一个模体与反义股上的三个核苷酸中的一个模体至少有一个核苷酸重叠，即，该正义股模体的三个核苷酸中的至少一者、与反义股模体的三个核苷酸中的至少一者进行碱基配对。另选地，至少两个核苷酸可重叠，或全部三个核苷酸皆可重叠。
于一态样中，该RNAi剂的该正义股可包含超过一个位于三个接续核苷酸上的三个一致修饰的模体。第一个模体可出现于该股的裂解位点或其邻近处，且其他模体可为侧翼修饰。在本文中，术语「侧翼修饰」是指于出现于该股另一部位的模体，该模体与位于相同股的裂解位点或其邻近处的模体隔开。侧翼修饰与第一模体相邻、或被至少一或多个核苷酸与第一模体隔开。当该等模体彼此紧邻时，则该等模体的化学性质彼此截然不同；当该等模体由一或多个核苷酸隔开时，则其化学性质可为相同或相异。可能存在两个或更多个侧翼修饰。例如，当存在两个侧翼修饰时，每一侧翼修饰可出现在相对于第一模体的一端，该模体位于或靠近裂解位点，或在前导模体的任一侧。
与该正义股相似，该RNAi剂的该反义股可含有超过一个位于三个接续核苷酸上的三个一致修饰的模体，其至少一者出现于该股的裂解位点或其邻近处。该反义股亦可含有一或多个侧翼修饰，其排列类似于可能存在于正义股上的侧翼修饰。
于一态样中，该RNAi剂的该正义股或该反义股的侧翼修饰典型地不包括位于该股的3’端、5’端或两端的前一个或前两个末端核苷酸。
于另一态样中，RNAi剂的正义股或反义股的侧翼修饰典型地不包括位于该双链体区域内该股的3’端、5’端或两端之前一个或前两个配对核苷酸。
当该RNAi剂的正义股及反义股各自含有至少一个侧翼修饰时，该侧翼修饰可落于该双链体区域的同一端，且具有一个、两个或三个核苷酸的重叠。
当该RNAi剂的正义股及反义股各自含有至少两个侧翼修饰时，该正义股及反义股可经对齐，使得每个来自一股的两个修饰落于该股双链体区域的一端，且具有一个、两个或三个核苷酸的重叠；每个来自一股的两个修饰落于双链体区域的另一端，且具有一个、两个或三个核苷酸的重叠；一股的两个修饰分别落于该前导模体的两端，且在该双链体区域内具有一个、两个或三个核苷酸的重叠。
于一态样中，该RNAi剂包含与靶标的误配、双链体内的误配、或其组合。误配可发生于突出区域内或双链体区域内。可根据碱基促解离或熔融的倾向(例如，基于特定配对的结合或解离的自由能，最简单途径是基于个别配对检查该等配对，但亦可使用次邻近分析或类似分析)将碱基对排名。就促进解离而言：A:U优于G:C；G:U优于G:C；且I:C优于G:C(I＝肌苷)。误配例如，非规范或规范配对以外者(如本文中他处所揭)是优于规范(A:T、A:U、G:C)配对；并且包含通用碱基的配对是优于规范配对。
于一态样中，该RNAi剂包含，位于该双链体区域内的反义股中自5’端起的前1、2、3、4或5个碱基对中至少一者，其是独立地选自A:U、G:U、I:C组成的群组及误配对，例如，非规范配对或除规范配对以外者，或包含通用碱基的配对，以促使反义股于该双链体5’端的解离。
于一态样中，位于该双链体区域内的反义股中自5’端算起位置1的核苷酸是选自A、dA、dU、U、dT组成的群组。另选地，位于该双链体区域内的反义股自5’端算起的前1、2或3个碱基对中至少一者是AU碱基对。例如，位于该双链体区域内的反义股自5’端算起的第一个碱基对是AU碱基对。
于另一态样中，位于正义股3’端的核苷酸为去氧胸腺嘧啶(dT)。于另一态样中，位于反义股3’端的核苷酸为去氧胸腺嘧啶(dT)。于一态样中，于正义股或反义股3’端上存在去氧胸腺嘧啶核苷酸的短序列，例如两个dT核苷酸。
于一态样中，正义股序列可由式(I)表示：
5’np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq3’ (I)
其中：
i及j各自独立为0或1；
p及q各自独立地为0至6；
Na各自独立表示包含0至25个经修饰的寡核苷酸序列，每一序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
Nb各自独立表示包含0至10个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列；
np及nq各自独立表示突出核苷酸；
其中，Nb与Y不具有相同修饰；以及
XXX、YYY与ZZZ各自独立表示三个接续核苷酸上三个相同修饰的一个模体。可选择地，YYY均为2’-F修饰的核苷酸。
于一态样中，Na或Nb包含交替模式的修饰。
于一态样中，YYY模体出现于正义股的裂解位点或其邻近处。例如，当该RNAi剂具有长度为17至23个核苷酸的双链体区域时，该YYY模体可出现于正义股的裂解位点或其邻近处(如，可出现于位置6、7、8；7、8、9；8、9、10；9、10、11；10、11、12或11、12、13处)，自5’端第1个核苷酸开始计数；或可选择地，自5’端的双链体区域内第1对核苷酸开始计数。
于一态样中，i为1且j为0，或i为0且j为1，或i与j均为1。正义股可因此由下式表示：
5’np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3’ (Ib)；
5’np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq3’ (Ic)；或
5’np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3’ (Id)。
当正义股由式(Ib)表示时，Nb表示包含0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
Na可各自独立表示包含2至20、2至15或2至10个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
当正义股如式(Ic)表示时，Nb表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。Na可以各自独立表示包含2至20、2至15或2至10个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
当正义股如式(Id)表示时，Nb各自独立表示包含0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。可选择地，Nb为0、1、2、3、4、5或6。Na可各自独立表示包含2至20、2至15或2至10个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
X、Y与Z各自可彼此自相同或相异。
于其他态样，i为0，j为0，并且正义股可由下式表示：
5’np-Na-YYY-Na-nq3’ (Ia)。
当该正义股由式(Ia)表示时，Na可各自独立表示包含2至20、2至15或2至10个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
于一态样中，反义股RNAi序列可由式(II)表示：
5’nq’-Na′-(Z’ Z′ Z′)k-Nb′-Y′ Y′ Y′-Nb′-(X′ X′ X′)1-N′a-np′3’ (II)
其中：
k及l各自独立为0或1；
p’与q’各自独立为0至6；
Na′各自独立表示包含0至25个经修饰的寡核苷酸序列，每一序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
Nb’各自独立表示包含0至10个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列；
np′及nq′各自独立表示突出核苷酸；
其中，Nb’与Y’不具有相同修饰；以及
X’X’X’、Y’Y’Y’与Z’Z’Z’各自独立表示三个接续核苷酸上三个相同修饰的一个模体。
于一态样中，Na’或Nb’包括交替模式的修饰。
Y’Y’Y’模体出现于反义股的裂解位点或其邻近处。例如，当该RNAi剂具有长度为17至23个核苷酸的双链体区域时，该Y’Y’Y’模体可出现于反义股的位置9、10、11；10、11、12；11、12、13；12、13、14处；或13、14、15处，自5’端第1个核苷酸开始计数；或可选择地，自5’端双链体区域内第一对核苷酸开始计数。可选择地，该Y’Y’Y’模体出现于位置11、12、13处。
于一态样中，Y’Y’Y’模体皆为2’-OMe修饰的核苷酸。
于一态样中，k为1且l为0，或k为0且l为1，或k与l均为1。
反义股可因此由下式表示：
5’nq’-Na′-Z′ Z′ Z′-Nb′-Y′ Y′ Y′-Na′-np’3’ (IIb)；
5’nq’-Na′-Y′ Y′ Y′-Nb′-X′ X′ X′-np’3’ (IIc)；或
5’nq’-Na′-Z′ Z′ Z′-Nb′-Y′ Y′ Y′-Nb′-X′ X′ X′-Na′-np’3’ (IId)。
当反义股由式(IIb)表示时，Nb’表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。Na’各自独立表示包含2至20、2至15或2至10个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
当反义股如式(IIc)表示时，Nb’表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。Na’各自独立表示包含2至20、2至15或2至10个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
当反义股如式(IId)表示时，Nb’各自独立表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。Na’各自独立表示包含2至20、2至15或2至10个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。可选择地，Nb是0、1、2、3、4、5或6。
于其他态样中，k是0且1是0，且反义股可由下式表示：
5’np’-Na’-Y’Y’Y’-Na’-nq’3’ (Ia)。
当反义股如式(IIa)表示时，Na’各自独立表示包含2至20、2至15或2至10个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
X’、Y’与Z’各自可为彼此相同或相异。
正义股及反义股的每一核苷酸可独立地LNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-羟基或2’-氟修饰。例如，正义股及反义股的每一核苷酸皆独立地经2’-O-甲基或2’-氟修饰。具体地，X、Y、Z、X’、Y’和Z’可各自表示2’-O-甲基修饰或2’-氟修饰。
于一态样中，当双链体区域是21nt时，该RNAi剂的正义股可含有出现于该股的位置9、10及11处的YYY模体，自5’端第1个核苷酸开始计数，或可选择地，在双链体区域内自5’端第一对核苷酸开始计数；Y表示2’-F修饰。正义股可额外包含XXX模体或ZZZ模体作为位于双链体区域的相反端的侧翼修饰；XXX及ZZZ各自独立表示2’-OMe修饰或2’-F修饰。
于一态样中，反义股可含有出现于该股的位置11、12、13处的Y’Y’Y’模体，自5’端第一个核苷酸开始计数，或可选择地，在双链体区域内自5’端第一对核苷酸开始计数；Y’表示2’-O-甲基修饰。反义股可额外含有X’X’X’模体或Z’Z’Z’模体作为位于双链体区域的相反端的侧翼修饰；X’X’X’与Z’Z’Z’各自独立表示2’-OMe修饰或2’-F修饰。
由上述式(Ia)、(Ib)、(Ic)及(Id)中任一者表示的正义股分别与由式(IIa)、(IIb)、(IIc)及(Iid)中任一者表示的反义股形成双链体。
据此，用于本公开的方法中的RNAi剂可包含正义股及反义股，每股具有14至30个核苷酸，该RNAi双链体如式(III)表示：
正义：5’np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq3’
反义：3’np’-Na’-(X’ X′ X′)k-Nb’-Y′Y′Y′-Nb’-(Z′Z′Z′)1-Na’-nq’5’
(III)
其中：
i、j、k及1各自独立为0或1；
p、p’、q及q’各自独立为0至6；
Na及Na’各自独立表示包含0至25个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列，每一序列包含至少两个经不同修饰的核苷酸；
Nb及Nb’各自独立表示包含0至10个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列；
其中，
np’、np、nq’及nq可各自存在或不存在，各自独立表示突出核苷酸；并且
XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’与Z’Z’Z’各自独立表示位于三个接续核苷酸上的三个相同修饰的一个模体。
于一态样中，i是0且j是0；或i是1且j是0；或i是0且j是1；或i与j均是0；或i与j均是1。于另一态样中，k是0且l是0；或k是1且l是0；k是0且l是1；或k与l均是0；或k与l均是1。
形成RNAi双链体的正义股及反义股的示例性组合，包括下述各式：
5’np-Na-Y Y Y-Na-nq3’
3’np’-Na’-Y′ Y′ Y′-Na’nq’5’
(IIIa)
5’np-Na-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq3’
3’np’-Na’-Y′ Y′ Y′-Nb’-Z′ Z′ Z′-Na’nq’5’
(IIIb)
5’np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Na-nq3’
3’np’-Na’-X′ X′ X′-Nb’-Y′ Y′ Y′-Na’-nq’5’
(IIIc)
5’np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq3’
3’np’-Na’-X′ X′ X′-Nb’-Y′ Y′ Y′-Nb’-Z′ Z′ Z′-Na-nq’5’
(IIId)
当该RNAi剂如式(IIIa)表示时，Na各自独立表示包含2至20、2至15或2至10个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
当该RNAi剂如式(IITb)表示时，Nb各自独立表示包含1至10、1至7、1至5或1至4个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。Na各自独立表示包含2至20、2至15或2至10个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
当该RNAi剂如式(IIIc)表示时，Nb、Nb’各自独立表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。Na各自独立表示包含2至20、2至15或2至10个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
当该RNAi剂如式(IIId)表示时，Nb、Nb’各自独立表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。Na、Na’各自独立地表示包含2至20、2至15或2至10个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。Na、Na’、Nb及Nb’各自独立包含交替模式的修饰。
于一态样中，当该RNAi剂如式(IIId)表示时，Na修饰是2’-O-甲基或2’-氟修饰。于另一态样中，当该RNAi剂由式(IIId)表示时，Na修饰是2’-O-甲基或2’-氟修饰且np’＞0，并且至少一个np’经硫代磷酸酯连结相邻核苷酸。于又一态样中，当该RNAi剂由式(IIId)表示，Na修饰是2’-O-甲基或2’-氟修饰，np’＞0，并且至少一个np’经硫代磷酸酯连结相邻核苷酸，并且正义股透过二价或三价分支连接子(如下所述)接合至一或多个C16(或相关)部分。于另一态样中，当该RNAi剂由式(IIId)表示时，Na修饰为2’-O-甲基或2’-氟修饰，np’＞0，并且至少一个np’经硫代磷酸酯连结相邻核苷酸，并且正义股包含至少一个硫代磷酸酯连结，以及可选地，正义股透过二价或三价分支连接子接合至一或多个亲脂性例如C16(或相关)部分。
于一态样中，当RNAi剂由式(IIIa)表示时，Na修饰是2，-O-甲基或2′-氟修饰，np’>0，并且至少一个np’经由硫代磷酸酯连结相邻核苷酸；正义股包含至少一个硫代磷酸酯连结，以及正义股透过二价或三价分支连接子接合至一或多个亲脂性如C16(或相关)部分。
于一态样中，该RNAi剂含有至少两个由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)表示的双链体的多聚体，其中，双链体通过连接子连结。连接子可为可裂解或不可裂解者。可选择地，多聚体还包含配体。双链体可各自靶向相同基因或两个相异基因；或双链体可各自靶向相同基因的两个相异的靶标位点。
于一态样中，该RNAi剂是含有三个、四个、五个、六个或更多个由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)表示的双链体的多聚体，其中，该等双链体通过连接子连结。连接子可为可裂解或不可裂解者。可选择地，该多聚体还包含配体。双链体可各自靶向相同基因或两个相异基因；或双链体可各自靶向相同基因的两个相异的靶标位点。
于一态样中，由式(III)、(IIIa)、(IITb)、(IIIc)及(IIId)表示的两种RNAi剂是于5’端与3’端的一或两者彼此连接，且任选地与配体接合。该等剂能各自靶向相同基因或两个相异基因；或者该等剂能各自靶向相同基因的两个相异的靶标位点。
多项出版物揭示可用于本公开的方法中的多聚RNAi剂。此类出版物包括WO2007/091269、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887及WO2011/031520；及US 7858769，其各自的整体通过引用而并入本文。
于某些态样中，本公开的组成物及方法包括如本文所揭示的RNAi剂的乙烯基膦酸酯(VP)修饰。于示例性态样中，本公开的乙烯基膦酸酯具有以下结构：
本公开的乙烯基膦酸酯可附接至本公开的dsRNA的反义股或正义股。于某些较佳态样中，本公开的乙烯基膦酸酯附接至dsRNA的反义股，可选择地至dsRNA的反义股的5’端。
本公开的组成物及方法亦虑及乙烯基磷酸酯修饰。示例性乙烯基磷酸酯结构是：
B.热去安定化修饰
于某些态样中，dsRNA分子可通过在反义股种子区域内(即反义股5’端位置2-9处)结合热去安定化修饰来优化RNA干扰，以减少或抑制脱靶基因静默。已经发现，具有反义股的dsRNA于该反义股前9个核苷酸位置(从5’端算起)包含至少一个双链体的热去安定化修饰，具有降低的脱靶基因静默活性。据此，于一些态样中，反义股在反义股的5’端起前9个核苷酸位置内包含至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个或更多个)双链体的热去安定化修饰。于一些态样中，双链体的一或多个热去安定化修饰是位于反义股5’端起的位置2-9处或可选择地于位置4-8处。于又一些态样中，双链体的热去安定化修饰是位于反义股5’端起的位置6、7或8处。于再一些态样中，双链体的热去安定化修饰是位于反义股5’端起的位置7处。术语「热去安定化修饰」包括将导致dsRNA具有较低总体熔融温度(Tm)(可选地，Tm比不具有此类修饰的dsRNA的Tm低1、2、3或4度)的修饰。于一些态样中，双链体的热去安定化修饰是位于反义股5’端起的位置2、3、4、5或9处。
热去安定化修饰可包括但不限于无碱基修饰；与相反股中相反核苷酸误配；以及糖修饰诸如2’-去氧修饰或非环核苷酸，例如未锁定的核酸(UNA)或乙二醇核酸(GNA)。
示例性的无碱基修饰包括但不限于下列：
其中，R＝H、Me、Et或OMe；R’＝H、Me、Et或OMe；R”＝H、Me、Et或OMe
其中，B是经修饰或未修饰的核碱基。
示例性的糖修饰包括但不限于下列：
其中，B是经修饰或未修饰的核碱基。
于一些态样中，双链体的热去安定化修饰是选自由下列所组成的群组：
及
其中，B是经修饰或未修饰的核碱基，每个结构上的星号表示R、S或外消旋体。
术语「非环核苷酸」是指具有非环核糖的任意核苷酸，例如，其中核糖碳间的任意键(例如，C1’-C2’、C2’-C3’、C3’-C4’、C4’-O4’或C1’-O4’)是不存在或核糖碳或氧的至少一者(例如C1’、C2’、C3’、C4’或O4’)独立或组合地不存在于核苷酸中。于一些态样中，非环核苷酸是其中，B是经修饰或未修饰的核碱基，R1与R2独立地为H、卤素、OR3或烷基；及R3是H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)。术语「UNA」是指未锁定的非环核酸，其中糖的任意键已移除，形成未锁定的「糖」残基。于一示例中，UNA亦涵盖C1’-C4’间的键(即C1’与C4’碳之间的碳-氧-碳共价键)被移除的单体。于另一示例中，糖的C2’-C3’键(即C2’与C3’碳之间的碳-碳共价键)被移除(参见Mikhai lov et.al.，Tetrahedron Letters，26(17)：2059(1985)；以及Fluiter et a1.，Mol.Biosyst.，10：1039(2009)，其均通过引用而以其整体并入本文)。非环衍生物提供更大的骨干灵活性，而不影响Watson-Crick配对。非环核苷酸可经由2’-5’或3’-5’连结接合。
术语「GNA」是指代乙二醇核酸，其是类似于DNA或RNA的聚合物，但其「骨干」的组成不同，GNA是由藉磷酸二酯连结接合的重复甘油单元所构成：
双链体的热去安定化修饰可为热去安定化核苷酸与dsRNA双链体内相反股的相对核苷酸间的误配(即，非互补碱基对)。示例性误配碱基对包括G:G、G:A、G:U、G:T、A:A、A:C、C:C、C:U、C:T、U:U、T:T、U:T或其组合。所属领域已知的其他误配碱基配对亦适用于本发明。误配可出现于天然存在的核苷酸间或经修饰的核苷酸间，即误配碱基配对可出现于来自各核苷酸的核糖上独立修饰的相应核苷酸的核碱基之间。于某些态样中，dsRNA分子于误配配对中包含至少一个核碱基，其是2’-去氧核碱基；例如，该2-去氧核碱基是位于正义股中。
于一些态样中，反义股种子区域内双链体的热去安定化修饰包括核苷酸，该核苷酸受损的W-C H-连结至靶标mRNA上的互补碱基，例如：
无碱基的核苷酸、非环核苷酸修饰(包括UNA与GNA)及误配修饰的更多示例已详细揭示于WO 2011/133876中，该专利通过引用而以其整体并入本文。
热去安定化修饰亦可包括通用碱基及磷酸盐修饰，该通用碱基与相对碱基形成氢键的能力被降低或消除。
于一些态样中，双链体的热去安定化修饰包括具有非规范碱基的核苷酸，例如，但不限于与相反股中的碱基形成氢键的能力受损或完全丧失的核碱基修饰。如WO 2010/0011895中所揭示，已评估此等核碱基修饰对dsRNA双链体的中心区域的去安定化，该专利通过引用而以其整体并入本文。示例性核碱基修饰为：
于一些态样中，反义股的种子区域内的双链体的热去安定化修饰包括一或多个与靶标mRNA上碱基互补的α核苷酸，诸如：
其中，R是H、OH、OCH3、F、NH2、NHMe、NMe2或O-烷基。
相较于天然磷酸二酯连结，已知可降低dsRNA双链体热安定性的示例性磷酸酯修饰为：
R基团的烷基可为C1-C6烷基。R基团的具体烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、戊基及己基。
所属领域技术人士理解，鉴于核碱基的功能角色定义了本公开的RNAi剂的特异度，而核碱基修饰可以本文所揭的多种方式进行，例如，将去安定化的修饰引入到RNAi剂中出于本公开的目的，举例而言，为了相对于脱靶效应增强对靶效应，通常，本公开可用的修饰范围及存于RNAi剂上的修饰，对于非核碱基修饰往往大得多，例如，对多核糖核苷酸的糖基或磷酸骨干的修饰。本公开的其他部分更详细揭示此类修饰，且明确虑及本公开的RNAi剂，其具有天然核碱基或经修饰的核碱基，一如上文或本文别处所揭者。
除了包含热去安定化修饰的反义股的外，dsRNA亦可包含一或多个热安定化定修饰。举例而言，dsRNA可包含至少两个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)热安定化修饰。无限制地，该安定化修饰皆可存在于一股中。于一些态样中，正义股与反义股两者皆包含至少两个安定化修饰。该安定化修饰可出现于正义股或反义股的任何核苷酸上。例如，该安定化修饰可出现于正义股或反义股上的每一个核苷酸；每一安定化修饰可交替出现于正义股或反义股上；或正义股或反义股包含交替模式中的安定化修饰。正义股上该安定化修饰的交替模式可能与反义股相同或相异，并且正义股上该安定化修饰的交替模式相对于反义股上该安定化修饰的交替模式可以具有位移。
于一些态样中，该反义股包含至少两个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)安定化修饰。无限制地，反义股的安定化修饰可存在于任意位置。于一些态样中，反义股包含自5’端算起的位置2、6、8、9、14与16处的安定化修饰。于一些其他态样中，反义股包含自5’端算起的位置2、6、14与16处的安定化修饰。于又一些态样中，反义股包含自5’端算起的位置2、14与16处的安定化修饰。
于一些态样中，该反义股包含与去安定化修饰相邻的至少一个安定化修饰。例如，安定化修饰可位于去安定化修饰的5’端或3’端的核苷酸，即，在距去安定化修饰位置的-1或+1处。于一些态样中，反义股包含安定化修饰，其是位于去安定化修饰的5’端与3’端中的每一处，即，距去安定化修饰的-1与+1位置处。
于一些态样中，该反义股包含至少两个安定化修饰，是位于去安定化修饰的3’端，即，位于距去安定化修饰的+1与+2位置处。
于一些态样中，该正义股包含至少两个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)安定化修饰。无限制地，该安定化修饰可存在于任意位置处。于一些态样中，正义股包含自5’端算起的位置7、10与11处的安定化修饰。于一些态样中，正义股包含自5’端算起的位置7、9、10与11处的安定化修饰。于一些态样中，正义股包含安定化修饰，其是位于与反义股自5’端算起的位置11、12与15处对应或互补处。于一些其他态样中，正义股包含安定化修饰，其是位于与反义股自5’端算起的位置11、12、13与15处对应或互补处。于一些态样中，正义股包含两个、三个或四个安定化定修饰的嵌段。
于一些态样中，正义股不包含与反义股中双链体的热去安定化修饰相反或互补位置处的安定化修饰。
示例性的热安定化修饰包括但不限于2’-氟修饰。其他热安定化修饰包括但不限于LNA。
于一些态样中，本公开的该dsRNA包含至少四个(例如，四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多)2’-氟核苷酸。无限制地，2’-氟核苷酸皆可存在于一股中。于一些态样中，正义股与反义股两者均包含至少二个2’-氟核苷酸。2’-氟修饰可出现于正义股或反义股的任意核苷酸上。例如，2’-氟修饰可出现于正义股或反义股上每一核苷酸上；每一2’-氟修饰可交替出现于正义股或反义股上；或正义股或反义股包含两个2’-氟修饰的交替模式。正义股上2’-氟修饰的交替模式可与反义股相同或相异，并且正义股上2’-氟修饰的交替模式相对于反义股上2’-氟修饰的交替模式可具有位移。
于一些态样中，该反义股包含至少两个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多)2’-氟核苷酸。无限制地，反义股中的2’-氟修饰可存在于任意位置处。于一些态样中，反义股包含自5’端算起的位置2、6、8、9、14与16处的2’-氟核苷酸。于一些其他态样中，反义股包含自5’端算起的位置2、6、14与16处的2’-氟核苷酸。于又一些其他态样中，反义股包含自5’端算起的位置2、14与16处的2’-氟核苷酸。
于一些态样中，该反义股包含与去安定化修饰相邻的至少一个2’-氟核苷酸。例如，2’-氟核苷酸可位于去安定化修饰的5’端或3’端核苷酸，即，位于距该去安定化修饰的-1或+1位置处。于一些态样中，该反义股包含2’-氟核苷酸，其是位于去安定化修饰的5’端与3’端的每一处，即，位于距去安定化修饰的-1与+1位置处。
于一些态样中，该反义股在去安定化修饰的3’端，即在去安定化修饰的位置+1与+2处包含至少两个2’-氟核苷酸。
于一些态样中，该正义股包含至少两个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)2’-氟核苷酸。无限制地，正义股的2’-氟修饰可存在于任意位置处。于一些态样中，正义股包含自5’端算起的位置7、10与11处的2’-氟核苷酸。于一些其他态样中，正义股包含自5’端算起的位置7、9、10与11处的2’-氟核苷酸。于一些态样中，正义股在与反义股自5’端算起的位置11、12与15处相对或互补的位置包含2’-氟核苷酸。于一些其他态样中，正义股在与反义股自5’端算起的位置11、12、13与15处相对或互补的位置包含2’-氟核苷酸。于一些态样中，正义股包含两个、三个或四个2’-氟核苷酸嵌段。
于一些态样中，该正义股在与反义股双链体的热去安定化修饰相反或互补的位置处不包含2’-氟核苷酸。
于一些态样中，本公开的dsRNA分子包含21个核苷酸(nt)的正义股及23个核苷酸(nt)的反义股，其中，反义股含有至少一种热去安定化核苷酸，其出现于反义股种子区域中(即反义股5’端位置2至9处)；其中，dsRNA一端是平端，而另一端包含2nt突出，并且其中，dsRNA可选地进一步具有下列特征的至少一者(例如，一者、二者、三者、四者、五者、六者或全部七者)：(i)反义股包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)反义股包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间连结；(iii)正义股与配体接合；(iv)正义股包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)正义股包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间连结；(vi)dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；以及(vii)dsRNA包含位于反义股5’端的平端。可选择地，该2nt突出是位于反义股的3’端。
于一些态样中，本公开的dsRNA分子包含正义股及反义股，其中：正义股为25至30个核苷酸残基的长度，其中，该正义股自5’端核苷酸(位置1)算起的位置1至23包含至少8个核糖核苷酸；反义股为36至66个核苷酸残基的长度，且自3’端核苷酸算起，在与正义股位置1至23配对而形成双链体的位置中，包含至少8个核糖核苷酸；其中，至少反义股的3’端核苷酸未与正义股配对，且至多6个接续的3’端核苷酸未与正义股配对，从而形成具有1至6个核苷酸的3’单股突出端；其中，反义股的5’端包含10至30个未与正义股配对的接续核苷酸，从而形成10至30个核苷酸的5’单股突出端；其中，当将该正义股与反义股对齐以实现最大互补程度时，至少该正义股的5’端与3’端核苷酸与反义股核苷酸进行碱基配对，从而在该正义股与反义股间形成实质上的双链体区域；反义股在沿着反义股长度的至少19个核苷酸上与靶标RNA充分互补，以当将所述双股核酸引入哺乳动物细胞时降低靶标基因的表达；其中，反义股含有至少一个热去安定化核苷酸，其中，至少一个热去安定化核苷酸是位于反义股的种子区域内(即反义股5’端位置2-9处)。举例而言，热去安定化核苷酸出现于与正义股5’端位置14至17处相反或互补的位置间，并且其中，dsRNA可选择地进一步具有下列特征的至少一者(例如，一者、二者、三者、四者、五者、六者或全部七者)：(i)反义股包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)反义股包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间连结；(iii)正义股与配体接合；(iv)正义股包括2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)正义股包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间连结；(vi)dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；以及(vii)dsRNA包含长度为12至30对核苷酸的双链体区域。
于一些态样中，本公开的dsRNA分子包含正义股及反义股，其中所述dsRNA分子包含长度为至少25个且至多为29个核苷酸的正义股、及长度为至多30个核苷酸的反义股，其中，正义股包含经修饰的核苷酸，其于5’端起位置11处易受酶降解；其中，所述正义股3’端与所述反义股5’端形成平端，且所述反义股3’端比正义股长1至4个核苷酸，其中，双链体区域的长度至少为25个核苷酸，且当将所述dsRNA分子引入哺乳动物细胞内时，所述反义股沿着该反义股的至少19个核苷酸与靶标mRNA充分互补，以减低靶标基因的表达，并且其中，所述dsRNA的切丁酶裂解优先导致包含所述反义股的所述3’端的siRNA，从而减低该靶标基因于哺乳动物中的表达，其中，反义股含有至少一个热去安定化核苷酸，其中，该至少一个热去安定化核苷酸是位于反义股的种子区域内(即反义股5’端的位置2至9处)，并且其中，dsRNA可选地进一步具有以下特征的至少一者(例如，一者、二者、三者、四者、五者、六者或全部七者)：(i)反义股包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)反义股包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间连结；(iii)正义股与配体接合；(iv)正义股包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)正义股包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间连结；(vi)dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；以及(vii)dsRNA具有长度为12至29对核苷酸的双链体区域。
于一些态样中，dsRNA分子的正义股及反义股中的每一个核苷酸可经修饰。各个核苷酸可通过相同或相异的修饰而经修饰，该修饰可以包括非连接磷酸氧中的一或两者、或连接磷酸氧中的一或多者的一或多个变更；核糖成分的变更，例如核糖上2′羟基的变更；以「去磷」连接子对磷酸部分进行整体置换；修饰或置换天然存在的碱基；以及核糖-磷酸酯骨干的置换或修饰。
由于核酸是子单元的聚合物，多数修饰是发生于核酸内重复的位置，例如碱基、磷酸酯部分、或磷酸酯部分的非键接0的修饰。于某些情况下，修饰出现于核酸中所有对象位置，但多数情况下并非如此。举例而言，修饰可仅出现于3’或5’端位置，可仅出现于末端区域，例如末端核苷酸位置、或一股的最末2、3、4、5或10个核苷酸内。修饰可出现于双股区域、单股区域或两者区域内。修饰可仅出现于RNA双股区域或可仅出现于RNA单股区域内。例如，在非键接O位置的硫代磷酸酯修饰可仅出现于一或两端，可仅出现于末端区域，例如末端核苷酸位置或一股的最末2、3、4、5、或10个核苷酸内，或可出现于双股与单股区域内，尤其是在末端处。一个或多个5’末端可被磷酸化。
下述是可能者，例如，为了增强安定性，在突出端中包含特定碱基，或者于单股突出端(如于5’或3’突出端或两者)中包含经修饰的核苷酸或核苷酸替代物。例如，于突出端中包含嘌呤核苷酸可为所欲者。于一些态样中，3’或5’突出端中的全部或部分碱基可经修饰，如本文所揭的修饰。修饰可包括诸如在核糖的2’位置，使用所属领域已知的修饰进行修饰，举例而言，使用去氧核糖核苷酸、2’-去氧-2’-氟(2’-F)或2’-O-甲基修饰而非核碱基的核糖，以及磷酸酯基团中的修饰如硫代磷酸酯修饰。突出端无需与靶标序列同源。
于一些态样中，正义股与反义股的每一残基独立地经LNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-去氧或2’-氟修饰。该股可包含不止一个修饰。于一些态样中，正义股与反义股的每一残基皆独立地经2’-O-甲基或2’-氟修饰。应理解，此等修饰是除了存于反义股中双链体的至少一个热去安定化修饰以外者。
该正义股与该反义股上典型地存在至少两个相异的修饰。彼等两个修饰可为2’-去氧、2’-O-甲基或2’-氟修饰、非环核苷酸或其他修饰。于一些态样中，该正义股与反义股各自包含选自2’-O-甲基或2’-去氧的两个不同修饰的核苷酸。于一些态样中，该正义股与反义股的每一残基皆独立地经2’-O-甲基核苷酸、2’-去氧核苷酸、2’-去氧-2’-氟核苷酸、2’-ON-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)核苷酸、2’-O-二甲胺基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)核苷酸、2’-O-胺基丙基(2’-O-AP)核苷酸或2’-ara-F核苷酸修饰。再次应理解，此等修饰是除了存于反义股中双链体的至少一个热去安定化修饰以外者。
于一些态样中，本公开的dsRNA分子包含交替模式的修饰，尤其于B1、B2、B3、B1’、B2’、B3’及B4’区域中。如本文中所使用，术语「交替模体」或「备选模式」是指具有一或多个经修饰的模体，每一修饰出现于一股的交替核苷酸上。交替核苷酸可指每隔一个或每隔三交替一个核苷酸，或是类似的模式。举例而言，若A、B与C分别表示一种类型的对于核苷酸的修饰，则交替模体可为「ABABABABABAB...」、「AABBAABBAABB...」、「AABAABAABAAB...」、「AAABAAABAAAB...」、「AAABBBAAABBB...」或「ABCABCABCABC……」等。
交替模体中所含的修饰类型可为相同或相异。例如，若A、B、C、D各自代表一种核苷酸的修饰，则交替模体，即每隔一个的核苷酸的修饰可为相同，但正义股或反义股中可各自选自交替模体中的若干修饰的可能性，如「ABABAB...」、「ACACAC...」、「BDBDBD...」或「CDCDCD...」等。
于一些态样中，本公开的dsRNA分子包含正义股上交替模体的修饰模饰相对于反义股上交替模体的修饰模式位移。此位移可使正义股上的核苷酸的修饰基团与反义股上的不同修饰基团相互对应，反之亦然。举例而言，当正义股与反义股于dsRNA双链体中配对时，在该双链体区域内，正义股中的交替模体可始于该股的5’-3’的「ABABAB」，而反义股中的交替模体可始于该股的3’-5’的「BABABA」。作为另一示例，在该双链体区域内，正义股中的交替模体可始于该股的5’-3’的「AABBAABB」，而反义股中的交替模体可始于该股的3’-5’的「BBAABBAA」，因此正义股与反义股间的修饰模式存在完整或部分位移。
本公开的dsRNA分子尚可包含至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连结。该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连结修饰可出现于正义股或反义股或两者，且位于该股任意位置的任意核苷酸上。举例而言，核苷酸间连结修饰可出现于正义股或反义股的每个核苷酸上；每一核苷酸间连结修饰可以交替模式出现于正义股或反义股上；或正义股或反义股包含交替模式的两种核苷酸间连结修饰。正义股上的核苷酸间连结修饰的交替模式可与反义股相同或相异，且正义股上的核苷酸间连结修饰的交替模式相对于反义股上的核苷酸间连结修饰的交替模式可具有位移。
于一些态样中，该dsRNA分子包含位于突出区域的硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连结修饰。举例而言，突出区域包含两个核苷酸，且于此两个核苷酸之间具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连结。核苷酸间连结亦可作成将突出的核苷酸与双链体区域内的末端配对核苷酸加以连接。例如，至少有2个、3个、4个或全部突出的核苷酸可以通过硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连结接合，并且可选择地，可有额外的硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连结将突出端核苷酸与突出端核苷酸旁的成对核苷酸相连接。例如，末端的三个核苷酸间可能存在至少两个硫代磷酸酯核苷酸间连结，其中该三个核苷酸中的两者为突出核苷酸，且第三个是突出核苷酸旁边的成对核苷酸。可选择地，此三个末端核苷酸可位于反义股的3’端。
于一些态样中，该dsRNA分子的正义股包含通过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个磷酸核苷酸间连结分隔的1至10个具有2至10个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连结的嵌段，其中，该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连结的一者是位于寡核苷酸序列中的任意位置，且所述正义股与包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯及磷酸酯核苷酸间连结的任意组合的反义股配对，或与包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯连结的反义股配对。
于一些态样中，该dsRNA分子的反义股包含通过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个磷酸酯核苷酸间连结分隔的两个具有两个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连结的嵌段，其中，该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连结的一者是位于寡核苷酸序列的任意位置，且所述反义股与包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯及磷酸酯核苷酸间连结的任意组合的正义股配对，或与包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯连结的反义股配对。
于一些态样中，该dsRNA分子的反义股包含通过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个磷酸酯核苷酸间连结分隔的两个具有三个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连结的嵌段，其中，该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连结的一者是位于寡核苷酸序列中的任意位置，且所述反义股与包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯及磷酸酯核苷酸间连结的任意组合的正义股配对，或与包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯或磷酸酯连结的反义股配对。
于一些态样中，该dsRNA分子的反义股包含通过由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个磷酸核苷酸间连结分隔的两个具有四个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连结的嵌段，其中，该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连结的一者是位于寡核苷酸序列中的任意位置，且所述反义股与包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和磷酸酯核苷酸间连结的任意组合的正义股配对，或与包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯或磷酸酯连结的反义股配对。
于一些态样中，该dsRNA分子的反义股包含通过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个磷酸酯核苷酸间连结分隔的两个具有五个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连结的嵌段，其中，该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连结的一是位于寡核苷酸序列的任意位置，且所述反义股与包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯及磷酸酯核苷酸间连结的任意组合的正义股配对，或与包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯或磷酸酯连结的反义股配对。
于一些态样中，该dsRNA分子的反义股包含由1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个磷酸酯核苷酸间连结分隔的两个具有六个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连结的嵌段，其中，该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连结的一者是位于寡核苷酸序列的任意位置，且所述反义股与包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯及磷酸酯核苷酸间连结的任意组合的正义股配对，或与包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯或磷酸酯连结的反义股配对。
于一些态样中，该dsRNA分子的反义股包含由1、2、3、4、5、6、7或8个磷酸酯核苷酸间连结分隔的两个具有七个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连结的嵌段，其中，该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连结的一者是位于寡核苷酸序列中的任意位置，且所述反义股与包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯及磷酸酯核苷酸间连结的任意组合的正义股配对，或与包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯或磷酸酯连结的反义股配对。
于一些态样中，该dsRNA分子的反义股包含由1、2、3、4、5或6个磷酸酯核苷酸间连结分隔的两个具有八个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连结的嵌段，其中，该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连结的一者是位于寡核苷酸序列中的任意位置，且所述反义股与包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯及磷酸酯核苷酸间连结的任意组合的正义股配对，或与包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯或磷酸酯连结的反义股配对。
于一些态样中，该dsRNA分子的反义股包含由1、2、3或4个磷酸酯核苷酸间连结分隔的两个具有九个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连结的嵌段，其中，该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连结的一者是位于寡核苷酸序列中的任意位置，且所述反义股与包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯及磷酸酯核苷酸间连结的任意组合的正义股配对，或与包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯或磷酸酯连结的反义股配对。
于一些态样中，本公开的dsRNA分子还包含位于正义股或反义股的末端位置1至10内的一或多个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连结修饰。例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸可通过正义股或反义股的一端或两端的硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连结接合。
于一些态样中，本公开的dsRNA分子还包含位于正义股或反义股各自的双链体内部区域位置1至10内的一或多个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连结修饰。例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸可通过硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连结接合于自正义股5’端算起的双链体区域位置8至16处；可选择地，该dsRNA分子还包含一或多个位于末端位置1至10内的硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连结修饰。
于一些态样中，本公开的dsRNA分子还包含位于正义股(由5’端算起)的位置1至5内的一至五个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连结修饰，及位置18至23内的一至五个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连结修饰，以及位于反义股(由5’端算起)的位置1与2处的一至五个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连结修饰，及位置18至23内的一至五个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连结修饰。
于一些态样中，本公开的dsRNA分子还包含位于正义股(由5’端算起)的位置1至5内的一个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，及位置18至23内的一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连结修饰，以及位于反义股(由5’端算起)的位置1与2处的一个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，及位置18至23内的两个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连结修饰。
于一些态样中，本公开的dsRNA分子还包含位于正义股(由5’端算起)的位置1至5内两个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，及位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，以及位于反义股(由5’端算起)的位置1与2处的一个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，及位置18至23内的两个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰。
于一些态样中，本公开的dsRNA分子还包含位于正义股(由5’端算起)的位置1至5内的两个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，及位置18至23内两个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，以及位于反义股(由5’端算起)的位置1与2处的一个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，及位置18至23内的两个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰。
于一些态样中，本公开的dsRNA分子还包含位于正义股(由5’端算起)的位置1至5内的两个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，及位置18至23内的两个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，以及位于反义股(由5’端算起)的位于1与2处的一个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，及位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰。
于一些态样中，本公开的dsRNA分子还包含位于正义股(由5’端算起)的位置1至5内的一个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，及位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，以及位于反义股(由5’端算起)的位置1与2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，及位置18至23内的两个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰。
于一些态样中，本公开的dsRNA分子还包含位于正义股(由5’端算起)的位置1至5内的一个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，及位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，以及位于反义股(由5’端算起)的位置1与2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，及位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰。
于一些态样中，本公开的dsRNA分子还包含位于正义股(由5’端算起)的位置1至5内的一个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，以及位于反义股(由5’端算起)的位置1与2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，及位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰。
于一些态样中，本公开的dsRNA分子还包含位于正义股(由5’端算起)的位置1至5内的两个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，以及位于反义股(由5’端算起)的位置1与2处的一个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，及位置18至23内的两个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰。
于一些态样中，本公开的dsRNA分子还包含位于正义股(由5’端算起)的位置1至5内的两个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，及位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，以及位于反义股(由5’端算起)的位置1与2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，及位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰。
于一些态样中，本公开的dsRNA分子还包含位于正义股(由5’端算起)的位置1至5内的两个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，及位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，以及位于反义股(由5’端算起)的位置1与2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，及位置18至23内的两个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰。
于一些态样中，本公开的dsRNA分子还包含位于正义股(由5’端算起)的位置1至5内的两个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，及位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，以及位于反义股(由5’端算起)的位置1与2处的一个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，及位置18至23内的两个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰。
于一些态样中，本公开的dsRNA分子还包含位于正义股(由5’端算起)的位置1与2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，及位置20与21处的两个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，以及位于反义股(由5’端算起)的位置1处的一个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，及位置21处的一个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰。
于一些态样中，本公开的dsRNA分子还包含位于正义股(由5’端算起)的位置1处的一个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，及位置21处的一个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，以及位于反义股(由5’端算起)的位置1与2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，及位置20与21处的两个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰。
于一些态样中，本公开的dsRNA分子还包含位于正义股(由5’端算起)的位置1与2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，及位置21至22内的两个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，以及位于反义股(由5’端算起)的位置1处的一个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，及位置21处的一个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰。
于一些态样中，本公开的dsRNA分子还包含位于正义股(由5’端算起)的位置1处的一个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，及位置21处的一个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，以及位于反义股(由5’端算起)的位置1与2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，及位置21与22处的两个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰。
于一些态样中，本公开的dsRNA分子还包括正义股(由5’端算起)的位置1与2处两个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰、及位置22与23处两个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，以及位于反义股(由5’端算起)的位置1处的一个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰、及位置21处的一个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰。
于一些态样中，本公开的dsRNA分子还包含正义股(自5’端算起)的位置1处的一个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰、及位置21处的一个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰，以及位于反义股(由5’端算起)的位置1与2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰、及位置22与23处的两个硫代磷酸酯核苷酸间连结修饰。
于一些态样中，本公开的化合物包含骨干手性中心的模式。于一些态样中，常见骨干手性中心模式包含至少5个Sp组态的核苷酸间连结。于一些态样中，常见骨干手性中心模式包含至少6个Sp组态的核苷酸间连结。于一些态样中，常见骨干手性中心模式包含至少7个Sp型组态的核苷酸间连结。于一些态样中，常见骨干手性中心模式包含至少8个Sp型组态的核苷酸间连结。于一些态样中，常见骨干手性中心模式包含至少9个Sp型组态的核苷酸间连结。于一些态样中，常见骨干手性中心模式包含至少10个Sp型组态的核苷酸间连结。于一些态样中，常见骨干手性中心模式包含至少11个Sp型组态的核苷酸间连结。于一些态样中，常见骨干手性中心模式包含至少12个Sp型组态的核苷酸间连结。于一些态样中，常见骨干手性中心模式包含至少13个Sp型组态的核苷酸间连结。于一些态样中，常见骨干手性中心模式包含至少14个Sp型组态的核苷酸间连结。于一些态样中，常见骨干手性中心模式包含至少15个Sp型组态的核苷酸间连结。于一些态样中，常见骨干手性中心模式包含至少16个Sp型组态的核苷酸间连结。于一些态样中，常见骨干手性中心模式包含至少17个Sp型组态的核苷酸间连结。于一些态样中，常见骨干手性中心模式包含至少18个Sp型组态的核苷酸间连结。于一些态样中，常见骨干手性中心模式包含至少19个Sp型组态的核苷酸间连结。于一些态样中，常见骨干手性中心模式包含不超过8个Rp型组态的核苷酸间连结。于一些态样中，常见骨干手性中心模式包含不超过7个Rp型组态的核苷酸间连结。于一些态样中，常见骨干手性中心模式包含不超过6个Rp型组态的核苷酸间连结。于一些态样中，常见骨干手性中心模式包含不超过5个Rp型组态的核苷酸间连结。于一些态样中，常见骨干手性中心模式包含不超过4个Rp型组态的核苷酸间连结。于一些态样中，常见骨干手性中心模式包含不超过3个Rp型组态的核苷酸间连结。于一些态样中，常见骨干手性中心模式包含不超过2个Rp型组态的核苷酸间连结。于一些态样中，常见骨干手性中心模式包含不超过1个Rp型组态的核苷酸间连结。于一些态样中，常见骨架手性中心模式包含不超过8个非手性核苷酸间连结(作为非限制性示例，磷酸二酯)。于一些态样中，常见骨架手性中心模式包含不超过7个非手性核苷酸间连结。于一些态样中，常见骨架手性中心模式包含不超过6个非手性核苷酸间连结。于一些态样中，常见骨架手性中心模式包含不超过5个非手性核苷酸间连结。于一些态样中，常见骨架手性中心模式包含不超过4个非手性核苷酸间连结。于一些态样中，常见骨架手性中心模式包含不超过3个非手性核苷酸间连结。于一些态样中，常见骨架手性中心模式包含不超过2个非手性核苷酸间连结。于一些态样中，常见骨架手性中心模式包含不超过1个非手性核苷酸间连结。于一些态样中，常见骨架手性中心模式包括至少10个Sp组态的核苷酸间连结，以及不超过8个非手性核苷酸间连结。于一些态样中，常见骨架手性中心模式包括至少11个Sp组态的核苷酸间连结，以及不超过7个非手性核苷酸间连结。于一些态样中，常见骨架手性中心模式包括至少12个Sp组态的核苷酸间连结，以及不超过6个非手性核苷酸间连结。于一些态样中，常见骨架手性中心模式包括至少13个Sp组态的核苷酸间连结，以及不超过6个非手性核苷酸间连结。于一些态样中，常见骨架手性中心模式包括至少14个Sp组态的核苷酸间连结，以及不超过5个非手性核苷酸间连结。于一些态样中，常见骨架手性中心模式包括至少15个Sp组态的核苷酸间连结，以及不超过4个非手性核苷酸间连结。于一些态样中，Sp组态的核苷酸间连结可选择地是接续或非接续者。于一些态样中，Rp组态的核苷酸间连结可选择地是接续或非接续者。于一些态样中，非手性核苷酸间连结可选择地是接续或非接续者。
于一些态样中，本公开的化合物包含是立体化学嵌段的嵌段。于一些态样中，嵌段是Rp嵌段，其中该嵌段的各核苷酸间连结均为Rp。于一些态样中，5’嵌段是Rp嵌段。于一些态样中，3’嵌段是Rp嵌段。于一些态样中，嵌段是Sp嵌段，其中该嵌段的各核苷酸间连结均为Sp。于一些态样中，5’嵌段是Sp嵌段。于一些态样中，3’嵌段是Sp嵌段。于一些态样中，所提供的寡核苷酸包含Rp与Sp嵌段两者。于一些态样中，所提供的寡核苷酸包含一或多个Rp嵌段但不包含Sp嵌段。于一些态样中，所提供的寡核苷酸包含一或多个Sp嵌段但不包含Rp嵌段。于一些态样中，所提供的寡核苷酸包含一或多个PO嵌段，其中各核苷酸间连结是天然磷酸酯连结。
于一些态样中，本公开化合物包含5’-嵌段，其是Sp嵌段，其中各糖部分包含2’-F修饰。于一些态样中，5’-嵌段是Sp嵌段，其中，各核苷酸间连结是经修饰的核苷酸间连结，且各糖部分包括2’-F修饰。于一些态样中，5’-嵌段是Sp嵌段，其中，各核苷酸间连结是硫代磷酸酯连结，且各糖部分包含2’-F修饰。于一些态样中，5’-嵌段包含4个或更多核苷单元。于一些态样中，5’-嵌段包含5个或更多核苷单元。于一些态样中，5’-嵌段包含6个或更多核苷单元。于一些态样中，5’-嵌段包含7个或更多核苷单元。于一些态样中，3’-嵌段是Sp嵌段，其中，各糖部分包含2’-F修饰。于一些态样中，3’-嵌段是Sp嵌段，其中，各核苷酸间连结是经修饰的核苷酸间连结，且各糖部分包含2’-F修饰。于一些态样中，3’-嵌段是Sp嵌段，其中，各核苷酸间连结是硫代磷酸酯连结，且各糖部分包含2’-F修饰。于一些态样中，3’-嵌段包含4个或更多核苷单元。于一些态样中，3’-嵌段包含5个或更多核苷单元。于一些态样中，一个3’-嵌段包含6个或更多核苷单元。在一些态样中，一个3’-嵌段包含7个或更多核苷单元。
于一些态样中，本公开的化合物包含位于一区域内的一类核苷或寡核苷酸，其后接特定类型的核苷酸间连结，例如，天然磷酸酯连结、经修饰的核苷酸间连结、Rp手性核苷酸间连结、Sp手性核苷酸间连结等。于一些态样中，A之后是Sp。于一些态样中，A之后是Rp。于一些态样中，A之后是天然磷酸酯连结(PO)。于一些态样中，U之后是Sp。于一些态样中，U之后是Rp。于一些态样中，U之后是天然磷酸酯连结(PO)。于一些态样中，C之后是Sp。于一些态样中，C之后是Rp。于一些态样中，C之后是天然磷酸酯连结(PO)。于一些态样中，G之后是Sp。于一些态样中，G之后是Rp。于一些态样中，G之后是天然磷酸酯连结(PO)。于一些态样中，C与U之后是Sp。于一些态样中，C与U之后是Rp。于一些态样中，C与U之后天然磷酸酯连结(PO)。于一些态样中，A与G之后是Sp。于一些态样中，A与G之后是Rp。
于一些态样中，该反义股包含核苷酸位置21与22之间及核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间连结，其中，反义股包含位于反义股种子区域内(例如，位于反义股5’端位置2至9处)的双链体的至少一种热去安定化修饰，以及其中，dsRNA任选地进一步具有以下特征的至少一者(例如，一者、两者、三者、四者、五者、六者、七者或全部八者)：(i)反义股包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)反义股包含3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间连结；(iii)正义股与配体接合；(iv)正义股包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)正义股包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间连结；(vi)dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；(vii)dsRNA包含长度为12至40对核苷酸的双链体区域；以及(viii)dsRNA具有位于反义股5’端的平端。
于一些态样中，该反义股包含核苷酸位置1与2之间、核苷酸位置2与3之间、核苷酸位置21与22之间以及核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间连结，其中，反义股包含位于反义股种子区域内(例如，位于反义股5’端位置2至9处)的双链体的至少一种热去安定化修饰，以及其中，dsRNA任选地进一步具有以下特征的至少一者(例如，一者、两者、三者、四者、五者、六者、七者或全部八者)：(i)反义股包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)正义股与配体接合；(iii)正义股含有2、3、4或5个2’-氟修饰；(iv)正义股包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间连结；(v)dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；(vi)dsRNA包含长度为12至40对核苷酸的双链体区域；(vii)dsRNA包含长度为12至40对核苷酸的双链体区域；以及(viii)dsRNA具有位于反义股5’端的平端。
于一些态样中，该正义股包含核苷酸位置1与2之间及核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间连结，其中，反义股包含位于反义股种子区域内(例如，位于反义股5’端位置2至9处)的双链体的至少一种热去安定化修饰，以及其中，dsRNA任选地进一步具有以下特征的至少一者(例如，一者、两者、三者、四者、五者、六者、七者或全部八者)：(i)反义股含有2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)反义股含有1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间连结；(iii)正义股与配体结合；(iv)正义股含有2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)正义股含有3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间连结；(vi)dsRNA含有至少四个2’-氟修饰；(vii)the dsRNA包含长度为12至40对核苷酸的双链体区域；以及(viii)dsRNA具有位于反义股5’端的平端。
于一些态样中，该正义股包含核苷酸位置1与2之间及核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间连结；反义股包含核苷酸位置1与2之间、核苷酸位置2与3之间、核苷酸位置21与22之间及核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间连结；其中，反义股含有位于反义股种子区域(例如，位于反义股5’端位置2至9处)的双链体的至少一个热去安定化修饰，以及其中，dsRNA任选地进一步具有以下特征的至少一者(例如，一者、两者、三者、四者、五者、六者或全部七者)：(i)反义股包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)正义股与配体接合；(iii)正义股包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(iv)包含3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间连结；(v)dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；(vi)dsRNA包含长度为12至40对核苷酸的双链体区域；以及(vii)dsRNA具有位于反义股5’端的平端。
于一些态样中，本公开的dsRNA分子包含与靶标的误配、与双链体的误配，或其组合。误配可发生于突出区域或双链体区域内。可根据碱基促解离或熔融的倾向(例如，基于特定配对的结合或解离的自由能，最简单途径是基于个别配对检查该等配对，但亦可使用次邻近分析或类似分析)将碱基对排名。就促解离而言：A:U优于G:C；G:U优于G:C；并且I:C优于G:C(I＝肌苷)。误配例如非规范配对或规范配对以外者(如本文中他处所揭)是优于规范(A:T、A:U、G:C)配对；并且包含通用碱基的配对是优于规范配对。
于一些态样中，本公开的dsRNA分子包含，双链体区域内的反义股中自5’端算起的第1、2、3、4或5对碱基的至少一者可为独立选自下列所组成的群组：A:U、G:U、I:C及误配(例如非规范或规范性配对以外、包含通用碱基的配对)，以促使反义股于双链体5’端的分离。
于一些态样中，位于该双链体区域内的反义股中自5’端算起位置1的核苷酸是选自由A、dA、dU、U及dT组成的群组。另选地，位于双链体区域内的反义股中自5’端算起的第1、2、或3个对碱基的至少一者为AU碱基对。例如，位于该双链体区域内的反义股中自5’端算起的第1对碱基对为AU碱基对。
已发现将4’-修饰或5’-修饰的核苷酸引入单股或双股任意位置处的二核苷酸的磷酸二酯(PO)、硫代磷酸酯(PS)或二硫代磷酸酯(PS2)连结的3’端，可对核苷酸间连结发挥立体效应，从而保护或安定它免受核酸酶的影响。
于一些态样中，将5’修饰的核苷引入单股或双股siRNA任意位置处的二核苷酸3’端。举例而言，可将5’-烷基化核苷引入单股或双股siRNA任意位置处的二核苷酸3’端。位于核糖5’位置处的烷基可为外消旋或手性纯R或S异构体。示例性5’-烷基化核苷为5’-甲基核苷。该5’-甲基可为外消旋或手性纯R或S异构体。
于一些态样中，将4’修饰的核苷引入单股或双股siRNA的任意位置处的二核苷酸3’端。举例而言，可将4’-烷基化核苷引入单股或双股siRNA任意位置处的二核苷酸3’。伅于核糖4’位置处的烷基可为外消旋或手性纯R或S异构体。示例性4’-烷基化核苷为4’-甲基核苷。4’-甲基可为外消旋或手性纯R或S异构体。或者，可以将4’-O-烷基化核苷引入单股或双股siRMA任意位置处的二核苷酸3’端。核糖的4’-O-烷基可为外消旋或手性纯R或S异构体。示例性4’-O-烷基化核苷为4’-O-甲基核苷。4’-o-甲基可为外消旋或手性纯R或S异构体。
于一些态样中，将5’-烷基化核苷引入dsRNA的正义股或反义股任意位置处，此类修饰维持或改进dsRNA的效力。5’-烷基可为外消旋或手性纯R或S异构体。示例性5’-烷基化核苷为5’-甲基核苷。5’-甲基可为外消旋或手性纯R或S异构体。
于一些态样中，将4’-烷基化核苷引入dsRNA的正义股或反义股任意位置处，且此类修饰维持或改进了dsRNA的效力。4’-烷基可为外消旋或手性纯R或S异构体。示例性4’-烷基化核苷为4’-甲基核苷。4’-甲基可为外消旋或手性纯R或S异构体。
于一些态样中，将4’-O-烷基化核苷引入dsRNA的正义股或反义股的任意位置处，且此类修饰维持或改进了dsRNA的效力。5’-烷基可为外消旋或手性纯R或S异构体。示例性4’-O-烷基化核苷为4’-O-甲基核苷。4’-O-甲基可为外消旋或手性纯R或S异构体。
于一些态样中，本公开的dsRNA分子可包含2’-5’连结(与2’-H、2’-OH及2’-Ome以及与P＝O或P＝S连结)。举例而言，2’-5’连接修饰可用于促进核酸酶抗性或抑制正义股与反义股结合，或用于正义股5’端以避免正义股受到RISC活化。
于另一态样中，本公开的dsRNA分子可包含L糖(例如，L核糖、具有2’-H、2’-OH及2’-OMe的L-阿拉伯糖)。举例而言，此等L糖修饰可用于促进核酸酶抗性或抑制正义股与反义股结合，或可用于正义股5’端以避免正义股受到RISC活化。
多项出版物揭示可用于本公开的dsRNA中的多聚体siRNA。此类出版物包括WO2007/091269、US 7858769、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887及WO2011/031520，其各自通过引用其整体并入本文。
如下文中更详细揭示，含有一或多个碳水化合物部分与RNAi剂接合的RNAi剂可优化该RNAi剂的一或多种特性。许多情况下，碳水化合物部分将附接至该RNAi剂的经修饰子单元。例如，dsRNA剂的一或多个核糖核苷酸子单元的核糖可替换为另一部分，例如附接有碳水化合物配体的非碳水化合物(可选地为环状)载剂。其中，子单元核糖经如此置换的核糖核苷酸子单元，在本文中称为核糖置换修饰子单元(RRMS)。环状载剂可为碳环系统，即所有环原子均为原子；或是杂环系统，即一或多个环原子可为杂原子例如氮、氧、硫。环状载剂可为是单环系统，或可含两个或更多个环如稠环。环状载剂可为完全饱的环系统，亦可含有一或多个双键。
配体可经载剂附接至多核苷酸。该载剂包括(i)至少一个「骨干附接点」，可选地两个「主干附接点」及(ii)至少一个「系带附接点」。如本文中所使用的「骨干附接点」是指代官能基团如羟基，或一般而言，是指是键，可用于且适于将载剂并入核糖核酸的骨干，例如磷酸酯或经修饰磷酸酯，例如含硫骨干中。于一些态样中，「系带附接点」(TAP)是指环状载剂的构成环原子，例如碳原子或杂原子(不同于提供骨干附接点的原子)，其连接选定部分。该部分可为如碳水化合物，例如单醣、双醣、三醣、四醣、寡糖及多醣。可选择地，所选择部分通过插入的系带连接至环状载剂。因此一般而言，环状载剂包括官能基团例如胺基，或提供适于并入或系住另一化学实体(如构成环的配体)的键。
该RNAi剂可经由载剂与配体接合，其中，该载剂可为环状基团或非环状基团。可选择地，该环状基团选自吡咯啶基、吡唑啉基、吡唑啶基、咪唑啉基、咪唑啶基、哌啶基、哌基、[1，3]二氧戊环基、唑啶基、异唑啶基、味啉基、噻唑啶基、异噻唑啶基、喹啉基、嗒酮基、四氢呋喃基或十氢萘基。可选择地，该非环状基团选自丝胺醇骨干及二乙醇胺骨干。
于某些特定态样中，用于本公开的方法的该RNAi剂是选自由表2、3、12或13中的剂所组成的群组。此等剂可还包含配体，诸如一或多个亲脂性部分、一或多个GalNAc衍生物，或一或多个亲脂性部分及一或多个GalNAc衍生物两者。
III.iRNAs与配体接合
本公开的iRNA的RNA另一修饰牵涉将一或多个配体、部分或接合物以化学接合至iRNA，此等配体、部分或接合物增强iRNA活性、细胞分布或细胞摄取，例如进入细胞。此等部分包括但不限于脂质部分如胆固醇部分(Letsinger et al.，Proc.Natl.Acid.Sci.USA，1989，86：6553-6556)、胆酸(Manoharan et al.，Biorg.Med.Chem.Let.，1994，4：1053-1060)、硫醚，例如绿柱石-S-三苯甲基硫醇(Manoharan et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660：306-309；Manoharan et al.，Biorg.Med.Chem.Let.，1993，3：2765-2770)、硫代胆固醇(Oberhauser et al.，Nucl.Acids Res.，1992，20：533-538)、脂肪链如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras et al.，ENBO J，1991，10：1111-1118；Kabanov et al.，FEBSLett.，1990，259：327-330；Svinarchuk et al.，Biochimie，1993，75：49-54)磷脂，例如二-十六烷基-rac-甘油或1，2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-磷酸三乙铵(Manoharan et al.，Tetrahedron Lett.，1995，36：3651-3654；Shea et al.，Nucl.Acids Res.，1990，18：3777-3783)、聚胺或聚乙二醇链(Manoharan et al.，Nucleosides&Nucleotides,1995，14：969-973)，或金刚烷乙酸(Manoharan et al.，Tetrahedron Lett.，1995，36：3651-3654)、棕榈酰基部分(Mishra et al.，Biochim.Biophys.Acta，1995，1264：229-237)、或十八烷基胺或己基胺基-羰基氧胆固醇部分(Crooke et al.，J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996，277：923-937)。
于某些态样中，配体改变了其所并入的iRNA剂的分布、靶向或寿命。于一些态样中，相较于没有此类配体者，配体提供对选定靶标例如分子、细胞或细胞类型、腔室例如细胞或器官腔室、组织、器官或身体区域增强的亲和力。典型配体不会参与双链体核酸中的双股配对。
配体可包括天然存在物质，例如蛋白质(如人血清白蛋白(HSA))、低密度脂蛋白(LDL)或球蛋白；碳水化合物(如葡聚醣、支链淀粉、几丁质、壳聚醣、菊糖、环糊精或透明质酸)；或脂质。配体也可为重组或合成分子，例如合成聚合物，如合成聚胺基酸。聚胺基酸的示例包括聚离胺酸(PLL)、聚L天冬胺酸、聚L-麸胺酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(L-乳酸交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PFG)、聚乙烯醇(PVA)、聚胺酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚磷嗪。聚胺的示例包括：聚乙烯亚胺、聚离胺酸(PLL)、精胺、亚精胺、聚胺、假肽-聚胺、拟肽聚胺、树枝状聚胺、精胺酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、聚胺的四级盐或α螺旋肽。
配体亦可包括靶向基团，例如细胞或组织靶向剂，例如凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白质，例如接合至特定细胞类型如肾细胞的抗体。靶向基团可为促甲状腺素、促黑素、凝集素、糖蛋白、界面活性蛋白A、黏蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺、多价甘露糖、多价岩藻糖、糖基化聚胺基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、双磷酸盐、聚麸胺酸盐、聚天冬胺酸盐、脂质、胆固醇、类固醇、胆汁酸、叶酸、维生素B12、生物素、或RGD肽或RGD肽模拟物。于某些态样中，配体是多价半乳糖，例如N-乙酰基-半乳糖胺。
配体的其他示例包括染料、嵌入剂(例如，吖啶类)、交联剂(例如补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉类(TPPC4、texaphyrin、Sapphyrin)、多环芳烃(例如，啡、二氢啡)、人工核酸内切酶(例如，EDTA)、亲脂性分子(例如，胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾固酮、1，3-双-O(十六烷基)甘油、香叶氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1，3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉荳蔻酸、03-(油酰基)石胆酸、03-(油酰基)胆酸、二甲氧基三苯甲基、或啡)；以及肽接合物(例如，触角足肽、Tat肽)、烷基化剂、磷酸盐、胺基、巯基、PEG(例如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚胺基、烷基、经取代的烷基、放射性标记物、酶、半抗原(例如，生物素)、转运/吸收促进剂(例如，阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成核糖核酸酶(例如，咪唑、双咪唑、组织胺、咪唑团簇、吖啶-咪唑复合物、四氮杂大环的Eu3+复合物)、二硝基苯基、HRP或AP。
配体可为蛋白质，例如糖蛋白，或肽，例如对共配体具有特异性亲和力的分子，或抗体例如结合至特定细胞类型如癌细胞、内皮细胞或骨细胞的抗体。配体亦可包括激素及激素受体。其还可包括非肽类物质，例如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素、辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基半乳糖胺、N-乙酰基葡糖胺、多价甘露糖或多价岩藻糖。配体可为诸如脂多醣、p38 MAP激酶的活化剂或NF-κB的活化剂。
配体可为例如药物的物质，其可通过扰乱细胞的细胞骨架例如破坏细胞的微管、微丝或中间丝，而增加iRNA剂进入细胞的摄取。药物可为如紫杉醇(taxon)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、细胞松弛素(cytochalasin)、诺考达唑(nocodazole)、促进微丝聚合剂(japlakinolide)、微丝解聚剂(latrunculin A)、毒伞素(phalloidin)、红海海绵抗菌素(swinholide A)、indanocine或myoservin。
于一些态样中，附接至本文所述的iRNA的配体是用作药物动力学调节剂(PK调节剂)。PK调节剂包括亲脂性物质、胆汁酸、类固醇、磷脂类似物、肽、蛋白质结合剂、PEG、维生素等。示例的PK调节剂包括但不限于，胆固醇、脂肪酸、胆酸、石胆酸、二烷基甘油酯、二酰基甘油酯、磷脂、鞘脂、萘普生、布洛芬(ibuprofen)、维生素E、生物素等。包含大量硫代磷酸酯连结的寡核苷酸亦已知结合至血清蛋白，因此，在主链中包含多个硫代磷酸酯连结(如约5个碱基、10个碱基、15个碱基或20个碱基的寡核苷酸)的短寡核苷酸亦适合作为本公开中的配体(例如，作为PK调节配体)。此外，于本文所揭态样中，结合血清组分(例如，血清蛋白)的适体亦适合作为PK调节性配体使用。
本公开的配体复合的iRNA可通过使用带有附属反应性官能基团的寡核苷酸加以合成，例如该等衍生自将连接分子附着于寡核苷酸上者(揭示于下)。该反应性寡核苷酸可直接与商购的配体、合成为带有任意的多种保护基团的配体、或其上具有连接部分的配体进行反应。
于本公开的接合物中使用的寡核苷酸可通过习知的固相合成技术便利且常规性地合成。用于此类合成的设备可由多个供应商贩售，包括，如Applied(Foster City，Calif)。可额外地或替代性地采用所属领域已知用于此类合成的任意其他手段。使用类似技术来制备其他寡核苷酸如硫代磷酸酯及烷基化衍生物，亦是已知者。
于本公开的接合配体的寡核苷酸、及带有配体-分子序列特异性连接的核苷中，该寡核苷酸及寡核苷可于合适的DNA合成仪上组装，其是利用标准核苷酸或核苷前驱物、或已带有结合部分的核苷酸或核苷接合物前驱物、或已带有配体分子的配体-核苷酸或核苷-接合物前驱物，或带有非核苷配体的结构单元。
当使用已带有连接部分的核苷酸接合物前驱物时，典型地是完成序列特异性连接核苷的合成，随后将该配体分子与该连接部分反应，以形成与配体接合的寡核苷酸。于一些态样中，本公开的寡核苷酸或经连接的核苷是通过自动合成器合成，其使用除了可商购及常规用于寡核苷酸合成的标准亚磷酰胺及非标准亚磷酰胺以外，衍生自配体-核苷接合物的亚磷酰胺。
A.脂质接合物
于某些态样中，配体或接合物是脂质或基于脂质的分子。此类脂质或基于脂质的分子典型上可结合血清蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)。HSA结合配体允许该接合物分配于靶标组织，如身体的非肾靶标组织。例如，靶标组织可为肝脏，包括肝脏的实质细胞。可以结合HSA的其他分子亦可用作配体。举例而言，可使用萘普生或阿司匹林。脂质或基于脂质的配体可(a)增加对于接合物降解的抗性，(b)增加对靶标细胞或细胞膜的靶向或递送，或(c)可用于调节与血清蛋白例如HSA的结合。
基于脂质的配体可用于调节，例如，控制(如抑制)接合物与靶标组织的结合。举例而言，与HSA结合性更强的脂质或基于脂质的配体，将不太可能靶向肾脏，并因此不太可能从体内清除。与HSA结合强度较弱的脂质或基于脂质的配体可用于将接合物靶向肾脏。
于某些态样中，基于脂质的配体结合HSA。例如，该配体可以足够的亲和力结合HSA，从而增强分布接合物至非肾组织。惟，亲和力的通常不够强，以致于无法逆转HSA与配体的结合。
于某些态样中，基于脂质的配体与HSA的结合性较弱或根本不结合，从而增强接合物至肾脏的分布。亦可使用靶向肾细胞的其他部分以替换该基于脂质的配体，或与该基于脂质的配体同时使用。
于另一方面，该配体是被靶标细胞例如增殖细胞摄取的部分，例如维生素。此等特别适用于治疗以非所欲细胞的增殖为特征的疾病，如恶性或非恶性类型细胞诸如癌细胞。示例性维生素包括维生素A、维生素E及维生素K。其他示例性维生素包括B族维生素，如叶酸、维生素B12、核黄素、生物素、吡哆醛、或其他被癌细胞摄取的维生素或营养素。亦包括HSA及低密度脂蛋白(LDL)。
B.细胞渗透剂
于另一方面，配体是细胞渗透剂，例如螺旋细胞渗透剂。于部分态样中，该剂是两亲性的。示例性剂是肽，例如tat或触角足肽。若该剂为肽，则可对其进行修饰，包括肽基模拟物、转化异构体、非肽或假肽键以及D-胺基酸的使用。螺旋剂通常为α螺旋剂，且可具有亲脂相和疏脂相。
配体可为肽或肽模拟物。肽模拟物(本文中亦称为寡肽模拟物)是能折迭为类似于天然肽的经定义的三维结构的分子。肽及肽模拟物与iRNA剂的附接可影响iRNA药物动力学分布，例如，通过增强细胞识别及吸收而影响。肽或肽模拟物部分可为约5至50个胺基酸的长度，例如，约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个胺基酸的长度。
肽或肽模拟物可为，举例而言，细胞渗透肽、阳离子肽、两亲性肽或疏水性肽(例如，主要由Tyr、Trp或Phe构成)。肽部分可为树枝状肽、受约束的肽或交联的肽。于另一个选择中，肽部分可包括疏水性膜易位序列(MTS)。示例性的含有MTS的疏水性肽是具有下述胺基酸序列的RFGF：AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO：9)。含疏水性MTS的RFGF类似物(例如，胺基酸序列AALLPVLLAAP(SEQ ID NO：10))亦可为靶向部分。肽部分可为「递送性」肽，其可携带包括肽、寡核苷酸、及蛋白质在内的大极性分子跨越细胞膜。举例而言，业已发现，来自HIV Tat蛋白(GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO：11))及果蝇触角足蛋白(RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQID NO：12))的序列能够作为递送肽。肽或肽模拟物可由DNA的随机序列编码，例如，从噬菌体呈现库或一珠一化合物(OBOC)组合库鉴定的肽(Lam et al.，Nature，354：82-84，1991)。典型地，经由并入单体单元而与dsRNA剂相连的肽或肽模拟物是细胞靶向肽，例如精胺酸-甘胺酸-天冬胺酸(RGD)-肽或RGD模拟物。肽部分长度范围可为约5个胺基酸至约40个胺基酸内。该等肽部分可具有结构性修饰，例如以增加安定性或以导引构形特性。可利用下文所述的任意结构性修饰。
用于本公开的组成物及方法的RGD肽可为线性或环状，且可经修饰如糖基化或甲基化，以促成其对特定组织的靶向。含RGD的肽及肽模拟物可包括D-胺基酸及合成RGD模拟物。除了RGD以外，亦可使用其他部分靶向整合素配体。此一配体较佳的接合物靶向PECAM-1或VEGF。
RGD肽部分可用于靶向特定细胞类型，例如，肿瘤细胞诸如内皮肿瘤细胞或乳腺癌肿瘤细胞(Zitzmann et al.，Cancer Res.，62：5139-43，2002)。RGD肽可促成dsRNA剂靶向各种其他组织的肿瘤，包括肺、肾、脾或肝(Aoki et al.，Cancer Gene Therapy 8：783-787，2001)。典型地，RGD肽促成iRNA剂靶向肾脏。RGD肽可为线性或环状，且可经修饰如糖基化或甲基化，以促成其对特定组织的靶向。举例而言，经糖基化的RGD肽可将iRNA剂递送至表达αVβ3的肿瘤细胞(Haubner et al.，Jour.Nucl.Med.，42：326-336，2001)。
「细胞渗透肽」能够渗透细胞，例如，微生物细胞诸如细菌或真菌细胞，或哺乳动物细胞诸如人类细胞。微生物细胞渗透肽可为，举例而言，α螺旋线性肽(例如LL-37或CeropinP1)、含有二硫键的肽(例如，α-防御素、β-防御素或细菌菌素)，或仅含一或两个主要胺基酸的肽(例如，PR-39或牛源抗菌肽(indolicidin))。细胞渗透肽亦包括核定位讯号(NLS)。举例而言，细胞渗透肽可为双向两亲性肽如MPG，其是衍生自HIV-1 gp41的融合肽结构域及SV40的大T抗原的NLS(Simeoni et al.，Nucl.Acids Res.31：2717-2724，2003)。
C.碳水化合物接合物
于本公开组成物的一些态样中，iRNA还包含碳水化合物。附接有碳水化合物的iRNA有利于核酸的体内递送，且组成物是适用于体内治疗性用途，如本文中所揭。如本文中所使用，「碳水化合物」是指一种化合物，其由一或多个具有至少6个碳原子的单醣单元(可为直链、支炼或环状)，以及与键结至各碳原子的氧、氮或硫原子；或是具有碳水化合物部分作为其一部分的化合物，该碳水化合物部分由一或多个单醣单元，每个单醣单元具有至少六个碳原子(可以是直链、支炼或环状)，以及键结至各碳原子的氧、氮或硫原子所构成。代表性碳水化合物包括醣类(包含约4、5、6、7、8或9个单醣单元的单醣、二醣、三醣及寡醣)，以及多醣如淀粉、糖原、纤维素及多醣胶。具体单醣包括C5及其以上(如，C5、C6、C7或C8)的醣；其包括具有两个或三个单醣单元(如，C5、C6、C7或C8)的二醣及三醣。
于某些态样中，碳水化合物接合物包含单醣。
于某些态样中，单醣是N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。包含一种或多种N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)衍生物的GalNAc接合物，是揭示于例如US 8,106,022中，该专利的整体内容通过引用并入本文。于一些态样中，GalNAc接合物是作为令iRNA靶向特定细胞的配体。于一些态样中，GalNAc接合物令iRNA靶向肝细胞，例如，通过作为肝脏细胞(例如，肝细胞)的去唾液酸糖蛋白受体的配体。
于一些态样中，碳水化合物接合物包含一个或多个GalNAc衍生物。GalNAc衍生物可经由连接子例如二价或三价分支连接子附接。于一些态样中，GalNAc接合物附接至正义股3’端。于一些态样中，GalNAc接合物经由连接子例如本文所揭的连结子附接至iRNA剂(例如，附接至正义股3’端)。于一些态样中，GalNAc接合物附接至正义股5’端。于一些态样中，GalNAc接合物经由连接子如本文所揭的连接子附接至iRNA剂(例如，附接至正义股5’端)。
于本公开某些态样中，GalNAc或GalNAc衍生物是经由单价连接子附接至本公开的iRNA剂。于一些态样中，GalNAc或GalNAc衍生物是经由二价连接子附接至本公开的iRNA剂。于本公开又一态样中，GalNAc或GalNAc衍生物是经由三价连接子附接至本公开的iRNA剂。于本公开其他态样中，GalNAc或GalNAc衍生物是经由四价连接子附接至本公开的iRNA剂。
于某些态样中，本公开的双股RNAi剂包含一个附接至iRNA的GalNAc或GalNAc衍生物。于某些态样中，本公开的双股RNAi剂包含复数个(例如，2、3、4、5或6个)GalNAc或GalNAc衍生物，其透过复数个单价连接子各自独立地附接至该双股RNAi剂的复数个核苷酸上。
于一些态样中，举例而言，当本公开的iRNA剂的两股均是一个更大分子的一部分，且是通过位于一股的3’端与另一股的5’端间的不间断核苷酸链连接而形成包含复数个未配对核苷酸的发夹环圈时，该发夹环圈内的各未配对核苷酸可独立地包含经单价连接子附接的GalNAc或GalNAc衍生物。该发夹环圈亦可由双链体的一股中的延伸突出端形成。
于一些态样中，举例而言，当本公开的iRNA剂的两股均是一个更大分子的一部分，且通过位于一股的3’端与另一股5’端间的不间断核苷酸链连接而形成包含复数个未配对核苷酸的发夹环圈时，该发夹环圈内各未配对核苷酸可独立地包含经单价连接子附接的GalNAc或GalNAc衍生物。该发夹环圈亦可由双链体的一股中的延伸突出端形成。
于一些态样中，GalNAc接合物是
于一些态样中，RNAi剂经由下图所示的连接子附接至碳水化合物接合物上，其中，X是O或S
于一些态样中，RNAi剂是附接至表1中定义的L96，如下所示：
于某些态样中，用于本公开的组成物及方法中的碳水化合物接合物是选自下列所组成的群组：
其中，Y是0或S，且n是3至6(式XXIV)；
其中，Y是O或S，且n是3至6(式XXV)；
其中，X是O或S(式XXVII)；
在某些态样中，用于本公开的组成物及方法的碳水化合物接合物是单醣。在某些态样中，该单醣是N-乙酰半乳糖胺，诸如
用于本文所述态样的另一代表性碳水化合物接合物包括但不限于，
当X或Y的一者是寡核苷酸时，另一者是氢。
于一些态样中，合适的配体是W02019/055633中揭露的配体，该专利的整体内容通过引用并入本文。于一态样中，该配体包含以下结构：
于某些态样中，本公开的RNAi剂可包含GalNAc配体，即便此类GalNAc配体当下被预测为对本公开的较佳鞘内/CNS递送途径的价值有限。
于本发明某些态样中，GalNAc或GalNAc衍生物经由单价连接子附接至本发明的iRNA剂。于一些态样中，GalNAc或GalNAc衍生物经由二价连接子附接至本发明的iRNA剂。于本发明又一些态样中，GalNAc或GalNAc衍生物经由三价连接子附接至本发明的iRNA剂。于本发明其他态样中，GalNAc或GalNAc衍生物经由四价连接子附接至本发明的iRNA剂。
于某些态样中，本发明的双股RNAi剂包含一个附接至该iRNA剂的GalNAc或GalNAc衍生物，例如，附接至dsRNA剂的正义股的5’末端，或如本文所揭的双靶向RNAi剂的一或两个正义股的5’末端。于某些态样中，本发明的双股RNAi剂含复数个(例如，2、3、4、5或6个)GalNAc或GalNAc衍生物，其透过复数个单价连接子而各自独立地附接至该双股RNAi剂的复数个核苷酸。
于一些态样中，举例而言，当本发明的iRNA剂的两股皆是一个更大分子的一部分，且是通过位于一股的3’末端与另一股的5’末端间的不间断核苷酸链连接，而形成包含复数个未配对核苷酸的发夹环圈时，该发夹环圈内的各未配对核苷酸可独立包含经由单价连接子所附接的GalNAc或GalNAc衍生物。
于一些态样中，碳水化合物接合物还包含如上文所揭的一或多个其他配体，例如，但不限于PK调节子或细胞渗透肽。
适用于本发明的额外的碳水化合物复合物及连接子，包括彼等于WO 2014/179620及WO 2014/179627号中所揭示者，其各自的整体内容通过引用而并入本文。
D.连接子
于一些态样中，本文中揭示的接合物或配体可使用多种连接子附接至iRNA寡核苷酸，该连接子可为可裂解者或不可裂解者。
术语「连接子」或「连接基团」是指将化合物的两个部分连接在一起，例如，将化合物的两个部分共价附接的有机部分。连接子典型地是包含直接键结或原子如氧或硫，单元如NR8、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH或原子的链，例如但不限于：经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的烯基、经取代或未经取代的炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、杂环基烷基、杂环基烯基、杂环基炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烯基、烷基杂芳基炔基、烯基杂芳基烷基、烯基杂芳基烯基、烯基杂芳基炔基、炔基杂芳基烷基、炔基杂芳基烯基、炔基杂芳基炔基、烷基杂环基烷基、烷基杂环基烯基、烷基杂环基炔基、烯基杂环基烷基、烯基杂环基烯基、烯基杂环基炔基、炔基杂环基烷基、炔基杂环基烯基、炔基杂环基炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基杂芳基、烯基杂芳基、炔基杂芳基，其一个或多个亚甲基可由0、S、S(O)、SO2、N(R8)、C(O)、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的杂芳基、经取代或未经取代的杂环基中继或终止；其中R8是氢、酰基、脂族或经取代的脂族。于某些态样中，连接子是约1至24个原子、2至24个原子、3至24个原子、4至24个原子、5至24个原子、6至24个原子、6至18个原子、7至18个原子、8至18个原子、7至17个原子、8至17个原子、6至16个原子、7至16个原子、或8至16个原子。
可裂解的连接基团在细胞外足够安定，但当进入靶标细胞时裂解以释放被该连接子保持在一起的两个部分。于较佳的态样中，该可裂解的连接基团于靶标细胞内，或于第一参照条件(其可为例如经选择以模拟或呈现细胞内的条件)下的裂解，相较在个体血液中或于第二参照条件(其可为例如经选择以模拟或呈现见于血液或血清中的条件)下的裂解快至少约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或更高、或至少约100倍。
可裂解的连接基团是对于裂解剂如pH、氧化还原电位或可降解分子的存在为敏感者。一般而言，与在血清或血液中相比，裂解剂在细胞内更为普遍或具有更高量或活性。此类降解剂的示例包括：氧化还原剂，其是选择用于特定的受质或其不具有受质特异性，包括，举例而言，氧化或还原酶或还原剂如存在于细胞内的硫醇，其可以通过还原降解氧化还原可裂解的连接基团；酯酶；内切酶或可创建酸性环境的剂，如导致pH为5或更低的彼等；可通过作为通用酸、肽酶(其可为受质特异性者)及磷酸酶作动而水解或降解酸可裂解的连接基团的酶。
可裂解的连接基团如二硫键可能对于pH敏感。人血清的pH为7.4，而细胞内平均pH略低，为7.1至7.3的范围。胞内体具有酸性更强的pH，为5.5至6.0的范围；而溶酶体甚至具有酸性更强的pH，约为5.0。一些连接子具有可裂解的连接基团，该连接基团在较佳的pH裂解，从而在细胞内将阳离子脂质从该配体释放出来，或将该阳离子脂质释放入所欲的细胞腔室内。
连接子可包括可通过特定酶裂解的可裂解的连接基团。并入连接子的可裂解的连接基团的类型可取决于待作为靶标的细胞。举例而言，肝脏靶向配体可透过包括酯基的连接子而接合至连接子。肝细胞富含酯酶，因此连接子在肝细胞中将比在不富含酯酶的细胞类型内更有效地被裂解。其他富含酯酶的细胞类型包括肺、肾皮质及睪丸的细胞。
当靶向细胞类型是富含肽酶者如肝细胞及滑膜细胞时，可使用含有肽键的连接子。
通常，可通过测试降解剂(或条件)裂解备选连接基团的能力而评估该备选的可裂解连接基团的适用性。亦所欲者是亦测试该备选可裂解连接基团在血液中或当与其他非靶标组织接触时的抵抗裂解的能力。因此，可测定第一条件与第二条件间的裂解相对敏感性，其中，该第一条件是选择为靶标细胞内的裂解标志物，且该第二条件是选择为其它组织或生物流体如血液或血清中的裂解标志物。该等评估可在无细胞的系统内、细胞内、细胞培养物内、器官或组织培养物内、或在整个动物体内进行。可能有用者是，在无细胞或培养条件下作成初始评估，并通过在整体动物体内的进一步评估而证实的。于较佳的态样中，可用的备选化合物在细胞内(或在选择以模拟细胞内条件的体外条件下)的裂解比在血液或血清中(或在选择以模拟细胞外条件的体外条件下)快至少约2倍、4倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或约100倍。
i.氧化还原可裂解的连接基团
于某些态样中，可裂解的连接基团是氧化还原可裂解的连接基团，其当还原或氧化时被裂解。可经还原裂解的连接基团的示例是二硫连接基团(-S-S-)。为确定备选可裂解连接基团是否是合适的「可还原裂解的连接基团」或例如是否适用于与特定iRNA部分及特定靶向剂合用，可查看本文中揭示的方法。举例而言，可通过以二硫苏糖醇(DTT)或使用所属领域中已知试剂的还原剂培养来评估备选者，该培养是模拟于细胞中如靶标细胞中会观察到的裂解速率。该等备选物亦可在经选择以模拟血液或血清条件的条件下评估的。于一态样中，备选化合物于血液中被裂解至多约10％。于其他态样中，可用的备选化合物于细胞内(或在选择以模拟细胞内条件的体外条件下)的降解比在血液或血清中(或在选择以模拟细胞外条件的体外条件下)快至少约2倍、4倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或约100倍。备选化合物的裂解速率可使用标准酶动力学分析在经选择以模拟细胞内介质的条件下测定，并将其与在经选择以模拟细胞外介质的条件下所测者比较。
ii.基于磷酸酯的可裂解连接基团
于某些态样中，可裂解的连接子包含基于磷酸酯的可裂解连接基团。基于磷酸酯的可裂解连接基团通过降解或水解该磷酸酯基团的剂而裂解。在细胞内裂解磷酸酯基团的剂的示例是酶如细胞内的磷酸酶。磷酸酯是连接基团的示例是-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S。较佳的态样是-O-P(O)(oH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、-O-P(S)(H)-S-。较佳的态样是-O-P(O)(0H)-O-。此等备选者可使用与上述的彼等类似的方法评估。
iii.酸可裂解的连接基团
于某些态样中，可裂解的连接子包含酸可裂解的连接基团。酸可裂解的连接基团是在酸性条件下被裂解的连接基团。于较佳的态样中，酸可裂解的连接基团是在pH为约6.5或更低(例如，约6.0、5.75、5.5、5.25、5.0或更低)的酸性环境中被裂解，或被剂如可用作通用酸的酶裂解。于细胞内，特异性低pH胞器如胞内体及溶酶体，可提供用于酸可裂解的连接基团的裂解环境。酸可裂解的连接基团的示例包括但不限于腙类、酯类、及胺基酸的酯类。酸可裂解的连接基团可具有通式-C＝NN-、C(O)O、或-OC(O)。较佳的态样是，当附接至酯的氧(烷氧基)的碳是芳基时，经取代的烷基、或四级烷基如二甲基戊基或第三丁基。此等备选者可使用与上述的彼等类似的方法评估。
iv.基于酯的可裂解连接基团
于某些态样中，可裂解的连接子包含基于酯的可裂解连接基团。基于酯的可裂解连接基团由酶诸如酯酶或酰胺酶在细胞内裂解。基于酯的可裂解连接基团的示例包括但不限于伸烷基、伸烯基及伸炔基的酯类。酯可裂解的连接基团可具有通式-C(O)O-或-OC(O)-。此等备选者可使用与上述的彼等类似的方法评估。
v.基于胜肽的可裂解连接基团
于又一态样中，可裂解的连接子包含基于胜肽的可裂解连接基团。基于胜肽的可裂解连接基团由酶诸如肽酶及蛋白酶在细胞内裂解。基于胜肽的可裂解基团在胺基酸间形成以获得寡肽(例如，二肽、三肽等)及多肽的肽键。基于胜肽的可裂解基团不包括酰胺基团(-C(O)NH-)。酰胺基团可在任意伸烷基、伸烯基或伸炔基之间形成。肽键在胺基酸间形成以获得胜肽及蛋白质的特异类型的酰胺键。基于胜肽的裂解基团通常限定为在胺基酸间形成而获得胜肽及蛋白质的肽键(亦即，酰胺键)，且不包括该完整酰胺官能基。基于胜肽的可裂解连接基团具有通式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-，其中RA与RB是两个相邻胺基酸的R基团。此等备选者可使用与上述的彼等类似的方法评估。
于一些态样中，本发明的iRNA透过连接子接合至碳水化合物。本发明的组成物及方法的具有连接子的iRNA碳水化合物接合体的非限制性示例包括，但不限于，
及
其中，X或Y的一者是寡核苷酸，且另一者是氢。
于某些态样中，于本发明的组成物及方法，配体是一或多个经由二价或三价分支连接子附接的GalNAc(N-乙酰基半乳糖胺)衍生物。
于某些态样中，本发明的dsRNA附接至选自式(XLV)至(XLVI)中任一者所示结构所组成的群组的二价或三价分支连接子：
其中，
q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B及q5C于每次出现时独立表示0至20，其中，该重复单元可为相同或相异；
P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B、T5C于每次出现时独立地不存在或是CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH或CH2O；
Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5C于每次出现时是独立为不存在或是伸烷基、经取代的伸烷基(其中，一个或多个亚甲基可通过O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R’)＝C(R”)、C≡C或C(O)的一者或多者中断或终止)；
R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5C于每次出现时独立地不存在或是NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CO、CH＝N-O、 或杂环基；
L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B及L5C表示配体；即，于每次出现时各自独立为单醣(如GalNAc)、二糖、三糖、四糖、寡糖或多醣；且Ra是H或胺基酸侧链。三价接合GalNAc衍生物尤其可与RNAi合用，以用于抑制靶基因的表达，例如式(XLTX)的彼等：
式XLIX
其中，L5A、L5B及L5C表示单醣，如GalNAc衍生物。
接合GalNAc衍生物的适宜的二价及三价分支连接子的示例包括但不限于上文作为式II、VII、XI、X、及XIII而引用的结构。
教示RNA接合物制备的代表性美国专利包括但不限于：美国专利号第4,828,979号、第4,948,882号、第5,218,105号、第5,525,465号、第5,541,313号、第5,545,730号、第5,552,538号、第5,578,717，5,580,731号、第5,591,584号、第5,109,124号、第5,118,802号、第5,138,045号、第5,414,077号、第5,486,603号、第5,512,439号、第5,578,718号、第5,608,046号、第4,587,044号、第4,605,735号、第4,667,025号、第4,762,779号、第4,789,737号、第4,824,941号、第4,835,263号、第4,876,335号、第4,904,582号、第4,958,013号、第5,082,830号、第5,112,963号、第5,214,136号、第5,082,830号、第5,112,963号、第5,214,136号、第5,245,022号、第5,254,469号、第5,258,506号、第5,262,536号、第5,272,250号、第5,292,873号、第5,317,098号、第5,371,241，5,391,723号、第5,416,203、5,451,463号、第5,510,475号、第5,512,667号、第5,514,785号、第5,565,552号、第5,567,810号、第5,574,142号、第5,585,481号、第5,587,371号、第5,595,726号、第5,597,696号、第5,599,923号、第5,599,928号、第5,688,941号、第6,294,664号、第6,320,017号、第6,576,752号、第6,783,931号、第6,900,297号、第7,037,646号以及第8,106,022号，其各自的整体内容通过引用并入本文。
不必要给定化合物的所有位置进行均匀修饰，且事实上，超过一种前述修饰可并入单个化合物中或甚至并入iRNA的单个核苷处。本发明亦包括作为嵌合化合物的iRNA化合物。
于本发明的语境中，「嵌合」iRNA化合物或「嵌合体」是iRNA化合物，可选择地dsRNA剂，其含有两个或更多个化学上截然不同的区域，各自由至少一个单体单元构成，亦即，在dsRNA化合物的情形中，该单体单元是核苷酸。此等iRNA典型含有至少一个区域，其中，该RNA经修饰以赋予该iRNA增加的对核酸酶降解的抗性、增加的细胞摄取、或增加的与靶标核酸的亲和性。iRNA的附加区域可用作能裂解RNA：DNA杂交体或RNA：RNA杂交体的酶的受质。举例而言，RNase H是细胞的核酸内切酶，其裂解RNA：DNA双螺旋的RNA股。因此，RNase H的启动导致RNA靶标的裂解，从而极大地提升对基因表达的iRNA抑制的效率。因此，当使用嵌合dsRNA时，使用较短的iRNA往往可获得与使用杂交至相同靶标区域的硫代磷酸酯去氧dsRNA相当的结果。RNA靶标的裂解可通过凝胶电泳常规侦检的，且若需要，可将凝胶电泳与该领域中已知的相关核酸杂交技术合用。
于某些例子中，iRNA的RNA可通过非配体基团予以修饰。大量非配体分子已经接合至iRNA以提升iRNA的活性、细胞分布或细胞摄取，且执行此类接合的过程可见于科学文献中。此类非配体部分包括脂质部分，如胆固醇(Kubo，T.et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.，2007，365(1)：54-61；Letsinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86：6553)、胆酸(Manoharan et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1994，4：1053)、硫醚例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan etal.，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660：306；Manoharan et al.，Bioorg.Med.Chem.Let.，1993，3：2765)、硫代胆固醇(Oberhauser et al.，Nucl.Acids Res.，1992，20：533)、脂肪链例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras et al.，EMBO J.，1991，10：111；Kabanov et al.，FEBS Lett.，1990，259：327；Svinarchuk et al.，Biochimie，1993，75：49)、磷脂质例如二-十六烷基-rac-甘油或1，2-二-O-十六烷基-Fac-甘油-3-磷酸三乙铵(Manoharan et al.，Tetrahedron Lett.，1995，36：3651；Shea et al.，Nucl.Acids Res.，1990，18：3777)、聚胺或聚乙二醇链(Manoharan et al.，Nucleosides&Nucleotides，1995，14：969)、或金刚烷乙酸(Manoharan et al.，Tetrahedron Lett.，1995，36：3651)、棕榈酰基部分(Mishra et al.，Biochim.Biophys.Acta，1995，1264：229)、或十八烷基胺或己基胺-羰氧基胆固醇部分(Crooke et al.，Pharmacol.Exp.Ther.，1996，277：923)。教示此类RNA接合物的制备的代表性美国专利列述于上文中。典型的接合策略涉及于该序列的一或多个位置承载胺基连接子的RNA的合成。胺基随后与使用合适的偶联剂或活化剂接合的分子反应。接合反应可使用仍连结至固体支撑物的RNA执行，或于RNA于溶液相中裂解后执行。通过HPLC进行的RNA接合物的纯化典型提供纯接合物。
IV.SNCA减弱的体内测试
提供多种α突触核蛋白PD动物模型(Gómez-Benito et al.Front Pharmacol.11：356)。许多PD噬齿动物模型是依赖脑内或全身性投予α突触核蛋白预形成原纤维(PFF)、或含有路易氏体及α突触蛋白核的脑抽取物，此等抽取物是来自PD病患或表现出α突触核蛋白病理的转殖基因小鼠。与评估SNCA RNAi剂更相关是已经建立PD的遗传模型。过度表达SNCA基因的重组腺相关病毒载体(rAAV)业已用于模拟PD：利用rAAV的野生型α突触核蛋白或PD相关的突变体(A53T或A30P a突触核蛋白)的过度表达被描述为导致黑质致密部(SNc)的多巴胺能神经元逐渐丧失，是纹状体中的多巴胺末端缺失(Koprich et al.MolNeurodegener.5：43；Koprich et al.PLoS One.6：e17698；Oliveras-Salvá et al.MolNeurodegener.8：44；Bourdenx et al.Acta Neuropa thol Commun.3：46；Caudal etal.Exp Neurol.273：243-52；Lu et al.Biochem Biophys Res Commun.464：988-993；Ipet al.Biochem Biophys Res Commun.464：988-993)，以及纹状体多巴胺含量的减少(Koprich et al.PLoS One.6：e17698；Ip et al.)。惟，采用rAAV模型所实施的神经退化程度在不同研究中有所不同。业已经测试了几种血清型、启动子、α突触核蛋白种类、剂量及注射后时间进程，所有该等因素皆会影响所得的帕金森综合征表型。
亦产生几种表达E46Kα突触核蛋白的转殖基因小鼠品是(Emmer et al.J BiolChem.286：35104-18；Nuber et al.Neuron.100：75-90.e5)，而E46K人类α突触核蛋白已经于小鼠中使用病毒载体过度表达。于rAAV-α突触核蛋白模型中，黑质纹状体系统中pα突触核蛋白内含物的存在，是伴随黑质多巴胺能神经元显著丧失、以及纹状体中酪胺酸羟化酶免疫反应性的降低。野生型或A53T人类α突触核蛋白的过度表达会随时间推移而致使SN中多巴胺能神经元逐渐丧失(Oliveras-Salvá et al.Mol Neurodogener.8：44)。
一些研究显示，rAAV-α突触核蛋白的表达会导致运动功能改变，例如阿扑吗啡或苯丙胺诱发的旋转增加、登阶测试缺失或滚筒测试中之前爪不对称性增加(Kirik et al.JNeurosci.22：2780-91；Decressac et al.Brain.134(Pt 8)：2302-11；Koprich etal.PLoS One.6：e17698；Decressac et al.Neurobiol Dis.45：939-53；Gaugler etal.Acta Neuropathol.123：653-69；Gombash et al.PLoS One.8：e81426；Oliveras-Salváet al.Mol Neurodegener.8：44；Bourdenx et al.Acta Neuropathol Commun.3：46；Caudal et al.Exp Neurol.273：243-52；Ip et al.Biochem Biophys Res Commun.464：988-993)。此类运动缺陷出现在动物体内注射后数周，合并多巴胺能神经元显著丧失。
此类模型已经用于开发与评估旨在减少α突触核蛋白聚集，以及预防由α突触核蛋白诱发的神经退化的潜在疗法(Decressac et al.Proc Natl Acad Sci USA.110：E1817-26；Xilouri et al.Autophagy.9：2166-8；Rocha et al.Neurobiol Dis.82：495-503)，并可进一步用于证明本文提供的RNAi剂在体内的功效。该等模型可包含如人类或大鼠SNCA的组合型或诱发型表达，例如过度表达，在一些情况下包括致病的突变。本文所使用的过度表达模型的示例包括AAV诱导的全长智人SNCA转录本Hs00240906_ml与3’UTR的表达，以及AAV诱导的全长褐家鼠(Rattus norvegicus)SNCA转录本NM_019169.2与3’UTR的表达。
V.本公开的RNAi剂的递送
可通过多种方式，将本公开的RNAi剂递送至细胞内例如个体体内细胞，诸如人类个体(如有此需要的个体，诸如患有SNCA相关病症的个体，例如PD、多系统萎缩、路易体痴呆(LBD)等)。举例而言，可通过令细胞与本揭的露RNAi剂于体外或体内接触而执行递送。亦可藉向个体投予包含RNAi剂如dsRNA的组成物而直接实行。或者，体内递送可藉投予一或多种编码及诱导该RNAi剂表达的载体而间接执行。此等选择于下文中进一步检讨。
通常，递送核酸分子的任意方法(体外或体内)可适用于与本公开的RNAi剂合用(参见，例如，Akhtar S.and Julian RI.，(1992)Trends Cell.Biol.2(5)：139-144及W094/02595，通过引用其整体并入本文)。对于体内递送，为递送RNAi剂而虑及的因素包括如所递送的剂的生物学安定性、非特异性作用的预防、以及所递送的剂于目标组织中的蓄积。RNAi剂的非特异性作用可通过局部给药而最小化，举例而言，透过直接注射或植入组织内，或局部性给予制剂。局部性给药至治疗部位，将该剂的局部浓度最大化，限制该剂与可能受其伤害或可能其降解的全身性组织的接触，且允许以较低的总剂量给予该RNAi剂。若干研究业已显示，当局部施用RNAi剂时，基因产物得以被成功地减弱。例如，通过玻璃体内注射，对食蟹猴进VEGF dsRNA的眼内递送(Tolentino，MJ.et al.，(2004)Retina 24：132-138)，以及通过视网膜下注射对小鼠进行眼内递送(Reich，SJ.et al.(2003)Mol.Vis.9：210-216)，两者亦皆显示防止老年性黄斑部退化实验模型中的新血管生成。此外，于小鼠体内进行dsRNA的直接肿瘤内注射能减低肿瘤体积(Pille，J.et al.(2005)Mol.Ther.11：267-274)并延长荷肿瘤小鼠的存活期(Kim，WJ.et al.，(2006)Mol.Ther.14：343-350；Li，S.et al.，(2007)Mol.Ther.15：515-523)。RNA干扰亦已显示成功通过直接注射进行局部递送(Dorn，G.etal.，(2004)Nucleic Acids 32：e49；Tan，PH.et al.(2005)Gene Ther.12：59-66；Makimura，H.et a.l(2002)BMC Neurosci.3：18；Shishkina，GT.，et al.(2004)Neuroscience 129：521-528；Thakker，ER.，et al.(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101：17270-17275；Akaneya，Y.，et al.(2005)J.Neurophysiol.93：594-602)以及通过鼻内给药而成功递送至肺部(Howard，KA.et al.，(2006)Mol.Ther.14：476-484；Zhang，X.et al.，(2004)J.Biol.Chem.279：10677-10684；Bitko，V.et al.，(2005)Nat.Med.11：50-55)。对于全身性给药RNAi剂用以治疗疾病，该RNA可经修饰或以药物递送系统进行递送；两种方法皆能防止dsRNA受到核酸内切酶与核酸外切酶在体内快速降解。RNA或其药物载剂的修饰亦可使该RNAi剂靶向组织且避免非所欲的脱靶效应(例如，不欲束缚于理论，相对于脱靶效应，已确定使用如本文所揭的GNA使dsRNA种子区域不安定，从而增强此类dsRNA的在靶效率，因为此类种子区域不安定会显著削弱该脱靶效应)。RNAi剂可以通过与亲脂性基团(如胆固醇)的化学接合而修饰，以增强细胞的摄取并防止降解。例如，将针对与亲脂性胆固醇部分接合的ApoB的RNAi剂经由全身性注射至小鼠体内，使其肝脏及空肠两处的apoB mRNA得以减弱(Soutschek，J.et al.，(2004)Nature 432：173-178)。业已证明，在前列腺癌小鼠模型中，RNAi剂与适配体的结合可抑制肿瘤生长并介导肿瘤的消退(McNamara，JO.et al.，(2006)Nat.Biotechnol.24：1005-1015)。于另一态样中，该RNAi剂可使用药物递送系统例如奈米颗粒、树枝状聚合物、聚合物、脂质体或阳离子递送系统进行递送。荷正电的阳离子递送系统促成分子RNAi剂(荷负电)的结合，亦增强在荷负电细胞膜处的交互作用，以允许细胞对RNAi剂的有效摄取。阳离子脂质、树枝状聚合物或聚合物可与RNAi剂结合，或被诱导形成囊泡或微胞(参见，例如，Kim SH.et al.，(2008)Journal of Controlled Release 129(2)：107-116)以包封该RNAi剂。当以全身性给药时，囊泡或微胞的形成进一步防止该RNAi剂降解。制备及施予阳离子-RNAi剂复合物的方法完全处于所属领域熟练技术人士的能力范围内(参见，例如，Sorensen，DR.，et al.(2003)J.Mol.Biol 327：761-766；Verma，UN.et al.，(2003)Clin.Cancer Res.9：1291-1300；Arnold，AS et al.(2007)J.Hypertens.25：197-205，其整体内容通过引用并入本文)。可用于全身性递送RNAi剂的药物递送系统的一些非限制性示例包括DOTAP(Sorensen，DR.，et al(2003)，同上；Verma，UN.et al.，(2003)，同上)、寡聚转染胺、「固体核酸脂质颗粒」(Zimmermann，TS.et al.，(2006)Nature 441：111-114)、心磷脂(Chien，PY.et al.，(2005)Cancer Gene Ther.12：321-328；Pal，A.et al.，(2005)IntJ.Oncol.26：1087-1091)、聚乙烯亚胺(Bonnet ME.et al.，(2008)Pharm.Res.Aug 16 Epubahead of print；Aigner，A.(2006)J.Biomed.Biotechnol.71659)、Arg-Gly-Asp(RGD)肽(Liu，S.(2006)Mol.Pharm.3：472-487)以及聚酰胺基胺(Tomalia，DA.et al.，(2007)Biochem.Soc.Trans.35：61-67；Yoo，H.et al.，(1999)Pharm.Res.16：1799-1804)。于一些态样中，一种RNAi剂与环糊精形成复合物以用于全身性给药。RNAi剂与环糊精的给药方法及医药组成物是可见于美国专利第7,427,605号中，该专利通过引用其整体并入本文。
本公开某些方面涉及降低细胞中SNCA靶标基因的表达的方法，包括令该细胞与本公开的双股RNAi剂接触。于一态样中，该细胞是肝脏细胞，可选地是肝细胞。于一态样中，细胞是肝脏外细胞，可选地是CNS细胞。
本公开另一方面涉及降低个体中SNCA靶标基因的表达的方法，包括投予该个体本公开的双股RNAi剂。
本公开另一方面涉及一种治疗患有SNCA相关病症的个体的方法，其包括投予该个体治疗有效量的本公开双股RNAi剂，从而治疗该个体。可通过本公开的方法治疗的示例性CNS疾患包括突触核蛋白病，诸如PD、多系统萎缩、路易体痴呆(LBD)、纯自主神经功能衰竭(PAF)、皮克病、进行性核上性麻痹、拳击性痴呆、与17号染色体相关的帕金森综合征、Lytico-Bodig病、缠结性痴呆、嗜银颗粒病、神经节细胞胶质瘤、神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、亚急性硬化性全脑炎、铅中毒性脑病、结节性硬化症、Hallervorden-Spatz病、脂褐质沉积症、皮质基底节变性、额颞叶痴呆、额颞叶退化、阿尔茨海默病、亨廷顿病、唐氏综合征、精神病、精神分裂症及克罗伊茨费尔特-雅各布病。
于一态样中，该双股RNAi剂是经皮下给药。
于一态样中，该双股RNAi剂是经鞘内给药。通过经鞘内施用该双股RNAi剂，该方法可降低SNCA靶标基因在大脑(如纹状体)或脊柱组织中的表达，诸如皮质、小脑、颈椎、腰椎及胸椎。
为便于阐述，本节中的制剂、组成物及方法主要是针对经修饰的siRNA化合物作讨论。惟，可以理解，此等制剂、组成物及方法可与其他siRNA化合物一起实施，例如未修饰的siRNA化合物，并且此等实施是本揭范围内。可经由多种途径将包含RNAi剂的组成物递送至个体。示例性途径包括：鞘内、静脉内、局部、直肠、肛门、阴道、鼻、肺及眼。
本公开的RNAi剂可并入适用于给药的医药组成物中。此类组成物典型地包括一或多种RNAi剂及药学可接受的载剂。如本文中所使用，术语「药学可接受的载剂」旨在包括与药物的给药相容的任意及全部溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂及抗真菌剂、等渗剂及吸收延迟剂等。此类用于药物活性物质的介质及剂的用途是所属领域习知者。除非任意传统介质或剂与活性化合物不相容，否则考虑其在组成物中的用途。补充活性化合物亦可并入该组成物中。
本公开的医药组成物可以多种方式给药，取决于是需要局部治疗抑或全身性治疗是所欲者，以及待治疗的区域。给药可为局部(包括眼部、阴道、直肠、鼻内、透皮)、口服或肠胃外给药。肠胃外给药包括静脉滴注、皮下、腹膜内或肌肉内注射，或鞘内或脑室内给药。
可选择给药途径及部位以增强其靶向性。举例而言，为靶向肌肉细胞，肌肉注射至感兴趣的肌肉内是合乎逻辑的选。可透过以气胶形式施用该RNAi剂以靶向肺细胞。通过以RNAi剂涂覆球囊导管以及机械地引入RNA，可靶向血管内皮细胞。
用于局部给药的制剂可包括透皮贴剂、软膏、洗剂、乳霜、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体及粉末剂。传统药物载剂、水性、粉末或油性基质、增稠剂等可为必要的或所欲者。经涂覆的保险套、手套亦是有用者。
用于口服给药的组成物包括粉末剂或颗粒剂、混悬剂或水溶液、糖浆剂、酏剂或非水介质、片剂、胶囊剂、含片或锭剂。于胶囊剂的情况中，可使用的载剂包括乳糖、柠檬酸钠及磷酸的盐。片剂中常用各种崩解剂，如淀粉，润滑剂例如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠及滑石粉。对于胶囊形式的口服给药，可用的稀释剂是乳糖及高分子量聚乙二醇。当须口服使用水性悬浮液时，可结合核酸组成物与乳化剂及悬浮剂。若需要，可加入某些甜味剂或调味剂。
用于鞘内或脑室内给药的组成物可包括无菌水溶液，其尚可含有缓冲剂、稀释剂和其他适宜的添加剂。
用于肠胃外给药的制剂可包括无菌水溶液，其亦可含有缓冲剂、稀释剂及其他适宜的添加剂。脑室内注射可经由例如附接至储液器的脑室内导管得以实行。对于静脉内使用，可控制溶质总浓度以使得该制备物等渗。
于一态样中，siRNA化合物例如双股siRNA化合物或ssiRNA化合物、组成物的给药是肠胃外给药，例如静脉内(如快速输注或扩散性输注)、皮内、腹膜内、肌肉内、鞘内、脑心室内、颅内、皮下、经黏膜、颊、舌下、内视镜、直肠、口腔、阴道、局部、肺、鼻内、尿道或经眼给药。给药可由该个体或另一人施行，例如医护人员。药品可依所量测的剂量供给，亦可供给于递送定量剂量的分配器中。下文更详细地讨论所选递送方式。
鞘内给药
于一态样中，该双股RNAi剂是经鞘内注射(即注射至浸有脑及脊髓组织的脊髓液中)加以递送。将RNAi剂经鞘内注射至脊髓液中是可通过快速输注或通过能植入皮下的微型泵进行，从而将siRNA规律且持续地递送至脊髓液中。脊髓液的循环是：自脉络丛产生后，在脊髓及背根神经节周围向下循环，随后向上经过小脑及皮层到达蜘蛛粒，液体于该处可离开CNS；即，根据注入化合物的尺寸、安定性及溶解度，经鞘内递送的分子可命中整个CNS中的靶标。
于一些态样中，鞘内给药是经由泵。该泵可为经手术植入的渗透泵。于一态样中，该渗透泵是植入于椎管的蛛网膜下腔，以便于鞘内给药。
于一些态样中，鞘内给药是经由用于药物的鞘内递送系统进行的，该系统包括容纳一定容积药剂的储液器，及配置为递送容纳于储液器中的一部分药剂的泵。关于该鞘内递送系统的更多细节可见于WO 2015/116658中，通过引用其整体并入本文。
鞘内注射的RNAi剂的量可能依靶标基因而异，且必须个别决定各靶标基因的必要施用量。典型地，该量的范围是10μg至2mg，可选地是50μg至1500μg，更可选地是100μg至1000μg之间。
本公开的载体-编码RNAi剂
靶向SNCA基因的RNAi剂可从插入DNA或RNA载体的转录单元中表达(参见，例如，Couture，A，et al.，TIG.(1996)，12：5-10；WO 00/22113，WO 00/22114，以及US 6,054,299)。该表达是可选地持续(数月或更久)，取决于所使用的特定构建体及靶标组织或细胞类型，。此等转殖基因可作为线性构建体、环状质体或病毒载体而引入，其可为整合或非整合载体。转殖基因亦可构建为使其作为染色体外质体进行遗传(Gassmann，et al.，(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：1292)。
RNAi剂的个别股或多股可自表达载体上的启动子转录。若两个分隔的股待表达以产生，例如dsRNA，可将两个分隔的表达载体共同引入(例如，通过转染或感染)靶标细胞内。或者，dsRNA的每一个别股均可由位于同一表达质体上的启动子转录。于一态样中，dsRNA表达为反向重复多核苷酸，其通过连接子多核苷酸序列接合，使得该dsRNA具有茎和环状结构。
RNAi剂表达载体通常是DNA质粒或病毒载体。与真核细胞相容的表达载体，可选地是彼等与脊椎动物细胞相容者，可用以产生用于表达如本文所揭RNAi剂的重组构建体。RNAi剂表达载体的递送可为全身性的，例如经静脉内或肌肉内给药，通过给药至从该患者外植的靶标细胞，再重新引入患者体内；或通过任何其他容许引入所欲的靶标细胞的手段。
可与本文所揭方法及组成物合用的病毒载体系统包括但不限于：(a)腺病毒载体；(b)逆转录病毒载体，包括但不限于慢病毒载体、莫洛尼鼠白血病病毒等；(c)相关病毒(AAV)载体；(d)单纯疱疹病毒载体；(e)SV 40载体；(f)多瘤病毒载体；(g)乳头状瘤病毒载体；(h)小核糖核酸病毒载体；(i)痘病毒载体，如正痘，例如痘疮病毒载体，或禽痘，例如金丝雀痘或家禽痘；以及(j)帮手依赖型或无肠腺病毒载体。复制缺陷病毒亦可为有利者。不同载体将会或不会整合至细胞基因组内。任选地，该构建体可包括用于转染的病毒序列。或者，可将该构建体整合入能进行游离复制的载体，例如EPV及EBV载体。用于重组表达RNAi剂的构建体通常需要调控性元件，例如启动子、增强子等，以确保该RNAi剂在靶标细胞内的表达。对于载体及构建体所虑及的其他方面是所属本领域已知者。
VI.本发明的医药组成物
本公开还包括医药组成物及制剂，其包括本公开的RNAi剂。于一态样中，是提供包括如本文所揭的RNAi剂及其药学可接受的载体的医药组成物。该含有RNAi剂的医药组成物可用于治疗与SNCA的表达或活性相关的疾病或病症，举例而言，SNCA相关神经退化性疾病，如突触核蛋白病，诸如PD、多系统萎缩、路易体痴呆(LBD)、纯自主神经功能衰竭(PAF)、皮克病、进行性核上性麻痹、拳击性痴呆、与17号染色体相关的帕金森综合征、Lytico-Bodig病、缠结性痴呆、嗜银颗粒病、神经节细胞胶质瘤、神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、亚急性硬化性全脑炎、铅中毒性脑病、结节性硬化症、Hallervorden-Spatz病、脂褐质沉积症、皮质基底节变性、额颞叶痴呆、额颞叶退化、阿尔茨海默病、亨廷顿病、唐氏综合征、精神病、精神分裂症及克罗伊茨费尔特-雅各布病。
此类医药组成物是根据递送方式加以配制。一个示例是将组成物配制为经肠胃外递送的全身性给药，例如经静脉内(IV)、肌肉内(IM)或用以皮下(subQ)递送。另一示例是将其配制以直接递送至CNS中的组成物，例如，经鞘内或玻璃体内的注射途径，可选地是输注至脑中(例如，纹状体中)，诸如通过连续泵进行输注。
于一些态样中，本公开的医药组成物是无热原者或非热原性者。
本公开的医药组成物可以足以抑制SNCA基因的表达的剂量给药。一般而言，本公开的RNAi剂的适宜剂量范围是接受者每公斤、每日约0.001至约200.0毫克，通常是落于每公斤体重每日约1至50毫克的范围内。
重复给药方案可包括定期施用治疗量的RNAi剂，例如每月至每六个月一次。于某些态样中，该RNAi剂是大约每季度给药一次(即大约每三个月一次)至大约每年两次。
于初始治疗方案(例如，负载剂量)之后，治疗的实施频次可降低。
于其他态样中，单一剂该医药组成物可为持久者，使得后续的剂量以不超过1、2、3或4个月或更长时间的间隔给药。于本公开一些态样中，是每月施用一次单一剂本公开的医药组成物。于本公开其他态样中，是每季度一次至每年两次施用单一剂本公开的医药组成物。
习知技艺人士应知悉，某些因素可影响有效治疗个体所需的剂量及时间，该等因素包括但不限于：疾病或病症严重程度、先前治疗、个体的总体健康状况或年龄，及既存的其他疾病。此外，使用治疗有效量的组成物治疗个体可包括单次治疗或一系列治疗。
小鼠遗传学的进展已产生用于研究将能受益于SNCA表达降低的SNCA相关疾病的小鼠模型。此等模型可用于RNAi剂的体内测试，以及用于确定治疗有效剂量。适宜的小鼠模型是所属领域已知者，并且包括例如本文中他处所揭示的小鼠模型。
本公开的医药组成物可经由多种方式给药，取决于局部治疗抑或全身性治疗何者为所需要者，以及取决于待治疗的区域。给药可为局部给药(例如，经透皮贴剂)、肺部给药，例如通过粉末或气胶的吸入或吹入，包括经喷雾器；气管内、鼻内给药、表皮及透皮给药、口服或肠胃外给药。肠胃外给药包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射或输注；皮下给药，例如经植入装置；或颅内，例如，经由脑实质内、鞘内或脑室内给药。
RNAi剂可以靶向特定组织的方式递送，诸如靶向肝脏、CNS(例如，脑的神经元、神经胶质或血管组织)或肝脏和CNS两者。
用于局部给药的医药组成物及制剂可包含透皮贴剂、软膏、洗剂、乳霜、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体及粉末。传统药物载剂、水性、粉末或油性基质、增稠剂等可为必要或合乎需要者。经涂覆的保险套、手套等亦是有用者。适宜的局部用制剂包括下述该等，其中本公开提出的RNAi剂与局部用递送剂如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂及界面活性剂混合。适宜的脂质及脂质体包括中性(例如，二油酰磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉荳蔻酰基磷脂酰胆碱DMPC、二硬脂酰基磷脂酰胆碱)、阴性(例如，二肉荳蔻酰基磷脂酰甘油DMPG)及阳离子性(例如，二油酰基四甲基胺基丙基DOTAP及二油酰磷脂酰乙醇胺DOTMA)。本公开提出的RNAi剂可包封于脂质体内或可与其形成复合物，尤其是与阳离子脂质体形成复合物。另选地，RNAi剂可与脂质复合，尤其是与阳离子脂质复合。适宜的脂肪酸及酯类包括但不限于花生四烯酸、油酸、二十烷酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉荳蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚麻油酸、次亚麻油酸、二癸酸酯、三癸酸酯、单油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱或C1-20烷基酯(例如肉荳蔻酸异丙酯IPM)、单甘油酯、二甘油酯或其药学可接受的盐。局部用制剂是详细揭示于US 6,747,014中，其通过引用并入本文。
A.含有膜分子组件的RNAi剂料剂
用于本公开的组成物及方法中的RNAi剂可配制为用于在膜分子组件如脂质体或微胞中递送。如本文中所使用，术语「脂质体」是指代由排列为至少一个双层，例如一个双层或复数个双层的两亲性脂质所构成的囊泡。脂质体包括单层及多层囊泡，其具有亲脂性材料形成的膜及水性内腔。水性部分含有RNAi剂组成物。亲脂性材料将水性内腔与水性外部隔离，而该水性外部并不包含该RNAi剂组成物，但在一些实例中，其可以包含该RNAi剂组成物。脂质体是可用于将活性成分转移并递送至欲作用部位。因脂质体的膜于结构上类似于生物膜，当将脂质体施用于组织时，脂质体双层与细胞膜的双层融合。随脂质体与细胞融汇的进行，含有该RNAi剂的内部水性内容物被递送入细胞内，于该处，该RNAi剂能特异性地结合靶标RNA并介导RNAi。于一些情况下，脂质体亦特异性靶向例如以将该RNAi剂导引至特定的细胞类型。
含有RNAi剂的脂质体可以通过多种方法制备的。于一示例中，将脂质体的脂质组分溶解于洗涤剂中，使其与脂质组分形成微胞。举例而言，该脂质组分可为两亲性阳离子脂质或脂质复合物。该洗涤剂可具有高临界微胞浓度且可为非离子性者。示例性的洗涤剂包括胆酸盐、CHAPS、辛基葡糖苷、去氧胆酸盐及月桂酰肌胺酸。然后将该RNAi剂制剂加入至含有脂质组分的微胞中。该脂质上的阳离子基团与RNAi剂相互作用，且于该RNAi剂周围凝聚形成脂质体。缩合后，例如通过渗析去除该洗涤剂，以获得RNAi剂的脂质体制剂。
若必要，可于缩合反应过程中加入(例如通过受控的添加)有助于缩合的载剂化合物。举例而言，该载剂化合物可为除核酸以外的聚合物(如精胺或亚精胺)。亦可调节pH值以利缩合。
在例如WO 96/37194中进一步揭示用于生产安定的多核苷酸递送媒介的方法，该方法将多核苷酸/阳离子脂质复合物作为递送媒介的结构组分而并入，其整体内容是通过引用并入本文。脂质体制剂尚可包括下列中揭示的示例性方法的一或多个方面：Felgner，P.L.et al.，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8：7413-7417；美国专利第4,897,355号；美国专利第5,171,678号；Bangham et al.，(1965)M.Mol.Biol.23：238；Olson et al.，(1979)Biochim.Biophys.Acta 557：9；Szoka et al.，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.75：4194；Mayhew et al.，(1984)Biochim.Biophys.Acta 775：169；Kim et al.，(1983)Biochim.Biophys.Acta728：339；and Fukunaga et al.，(1984)Endocrinol.115：757。常用的制备适当尺寸脂质聚集体以作为递送媒介的技术包括超音波处理以及冻融加压挤(参见，例如，Mayer et al.，(1986)Biochim.Biophys.Acta 858：161)。当需要一致性地较小(50至200nm)及相对均匀的聚集体时，可采用微流化(Mayhew et al.，(1984)Biochim.Biophys.Acta 775：169)。此等方法可很容易地适用于将RNAi剂制剂包封入脂质体内。
脂质体可归为两大类别。阳离子脂质体是荷正电的脂质体，其与荷负电的核酸分子相互作用而形成安定的复合物。荷正电的核酸/脂质体复合物结合至荷负电细胞表面而在胞内体中被内化。由于胞内体中的酸性pH值，该脂质体破裂并将其内容物释放至细胞质中(Wang et al.(1987)Biochem.Biophys.Res.Commun.，147：980-985)。
pH值敏感或荷负电的脂质体是可俘获核酸而非与其复合。由于核酸及脂质两者均带类似电荷，是发生排斥而非复合。尽管如此，一些核酸仍被截留于此等脂质体的水性内腔中。pH敏感的脂质体业已用于将编码胸苷激酶基因的核酸递送至培养中细胞单层。外源基因的表达是于靶标细胞中侦检出(Zhou et al.(1992)Journal of Controlled Release，19：269-274)。
一种脂质体组成物的主要类型包括除天然衍生的卵磷脂以外的磷脂。例如，中性脂质体组成物可由二肉荳蔻酰基卵磷脂(DMPC)或二棕榈酰基卵磷脂(DPPC)形成。阴离子脂质体组成物通常由二肉荳蔻酰基磷脂酰甘油形成，而阴离子促融合脂质体主要由二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)形成。另一种脂质体组成物是由卵磷脂(PC)形成，举例而言，诸如大豆PC及卵PC。另一种类型是由磷脂质或卵磷脂或胆固醇的混合物形成。
在体外及体内将脂质体引入细胞内的其他方法的示例包括美国专利第5,283,185号；美国专利第5,171,678号；WO 94/00569；WO 93/24640；WO 91/16024；Felgner，(1994)J.Biol.Chem.269：2550；Nabel，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90：11307；Nabel，(1992)Human Gene Ther.3：649；Gershon，(1993)Biochem.32：7143；and Strauss，(1992)EMBOJ.11：417。
业已检查非离子脂质体系统，尤其是包含非离子界面活性剂及胆固醇的系统，以确定其于递送药物至皮肤中的用途。包含NovasomeTMI(二月桂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)及NovasomeTMII(二硬脂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)的非离子脂质体制剂是用以递送环孢菌素A至小鼠皮肤的真皮内。其结果显示，此类非离子脂质体系统有效促进环孢素A沉积于皮肤的不同层中(Hu et al.，(1994)S.T.P.Pharma.Sci.，4(6)：466)。
脂质体尚包括「立体安定化」脂质体，如本文中所使用，该术语是指代含有一或多种特化脂质的脂质体，当该脂质掺入脂质体时，相比于缺乏此类特化脂质的脂质体，能延长循环中的寿命。立体安定化的脂质体的示例是下列彼等：其中，脂质体形成囊泡的脂质部分的一部分包含(A)一或多种糖脂质，如单唾液酸神经节苷脂GM1，或(B)是与一或多种亲水聚合物如聚乙二醇(PFG)部分予以衍生。尽管不欲受缚于任何特定理论，但该领域咸信，至少对于含有神经节苷脂、鞘磷脂或PEG衍生的脂质的立体安定化脂质体，此等立体安定化脂质体的循环半衰期的增强是源自网状内皮系统(RES)细胞对其摄取的减低(Allen et al.，(1987)FEBS Letters，223：42；Wu et al.，(1993)Cancer Research，53：3765)。
包含一或多种醣脂的多种脂质体是本领域已知者。Papahadjopoulos et al.(Ann.N.Y.Acad.Sci.，(1987)，507：64)报导单唾液酸神经节苷脂GM1、硫酸半乳糖脑苷脂及磷脂酰肌醇改善脂质体血液半衰期的能力。此等发现是通过下列阐述：Gabizon et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，(1988)，85：6949)。美国专利第4，837，028号及WO 88/04924，两者均授予Allen等人，揭露包含(1)鞘磷脂及(2)神经节苷脂GM1或硫酸半乳糖脑苷脂酯的脂质体。美国专利第5,543,152号(Webb等人)揭露包含鞘磷脂的脂质体。包含1，2-sn-二肉荳蔻酰基磷脂酰基胆碱的脂质体是揭露于WO 97/13499(Lim et al)中。
于一态样中，使用阳离子脂质体。阳离子脂质体具有能够与细胞膜融合的优点。非阳离子脂质体虽然不能与细胞膜有效融合，但其可在体内被巨噬细胞摄取，且可用以将RNAi剂递送至巨噬细胞。
脂质体的进一步优点包括：自天然磷脂中获得的脂质体具生物相容性及生物可降解性；脂质体可掺入多种水溶性及脂溶性药物；脂质体可保护其内部腔室所包封的RNAi剂不被代谢及降解(Rosoff，in ″Pharmaceutical Dosage Forms，″Lieberman，Rieger andBanker (Fds.)，1988，volume 1，p.245)。于脂质体制剂制备中的重要考虑因素是脂质表面电荷、囊泡尺寸及脂质体的水性体积。
荷正电的合成阳离子脂质，N-[1-(2，3-二油烯基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)可用以形成小脂质体，该等脂质体与核酸自发地相互作用而形成脂质-核酸复合物，其能够与组织培养细胞的细胞膜的荷负电脂质融合，从而达成RNAi剂的递送(参见，例如，Felgner，P.L.et al.，(1987)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 8：7413-7417，以及美国专利第4，897，355号关于DOTMA及其与DNA合用的描述)。
一种DOTMA类似物，1，2-双(油酰氧基)-3-(三甲基胺)丙烷(DOTAP)，可与磷脂质合用以形成DNA复合囊泡。LipofectinTM(Bethesda Research Laboratori es，Gaithersburg，Md.)是一将高度阴离子核酸递送至活体组织培养细胞内的有效的剂，该细胞包含荷正电的DOTMA脂质体，该脂质体与荷负电的多核苷酸自发地相互作用以形成复合物。当使用荷足够正电的脂质体时，所得复合物上的净电荷亦为正。以此方式制备的荷正电复合物自发地附接至荷负电的细胞表面、与细胞膜融合，并有效地将功能性核酸递送至如组织培养细胞内。另一可商购的阳离子脂质，1，2-双(油酰氧基)-3，3-(三甲基胺)丙烷(「DOTAP」)(Boehringer Mannheim，Indianapolis，Indiana)与DOTMA相异的处在于油酰基部分是通过酯而非醚连接。
其他经报导的阳离子脂质化合物包括接合至多种部分的彼等，包括，举例而言，已经接合至两种类型的脂质的一的羧基精胺，且包括化合物如5-羧基精胺甘胺酸二辛基油酰胺(「DOGS」)(TransfectamTM，Promega，Madison，Wisconsin)及二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺5-羧基精胺基酰胺(「DPPES」)(参见，例如，美国专利第5,171,678号)。
另一阳离子脂质接合物包括脂质与胆固醇的衍生物(「DC-Chol」)，其业已与DOPE组合而配制于脂质体内(参见，Gao，X.and Huang，L.，(1991)Biochim.Biophys.Res.Commun.179：280)。据报导，通过将多聚离胺酸与DOPE结合制成的脂多聚离胺酸于血清存在下可有效转染(Zhou，X.et al.，(1991)Biochim.Biophys.Acta1065：8)。对某些细胞系而言，据称此等含有经接合的阳离子脂质的脂质体，相较于含DOTMA的组成物，展现出更低的毒性且能提供更有效的转染。其他可商购的阳离子脂质产品包括DMRIE、DMRIE-HP(Vical，LaJolla，California)以及Lipofectamine(DOSPA)(LifeTechnology，Inc.，Gaithersburg，Maryland)。其他适用于寡核苷酸递送的阳离子脂质是揭示于WO 98/39359及WO 96/37194中。
脂质体制剂尤其适合以局部给药，而相较于其他制剂，脂质体具若干优点。此类优点包括，相对于所给药的药物的高全身性吸收，副作用减少；所给药的药物于所欲的靶标处的蓄积增加；以及，将RNAi剂给药至皮肤内的能力。于一些实作中，脂质体用于将RNAi剂递送至表皮细胞，且亦用于增强RNAi剂给药至真皮组织如渗透至皮肤内的能力。举例而言，脂质体可于局部施用。文献业已报导配制为脂质体的药物至皮肤的局部递送(参见，例如，Weiner et al.，(1992)Journal of Drug Targeting，vol.2，405-410 and du Plessis etal.，(1992)Antiviral Research，18：259-265；Mannino，R.J.and Fould-Fogerite，S.，(1998)Biotechniques 6：682-690；Itani，T.et al.，(1987)Gene 56：267-276；Nicolau，C.et al.(1987)Meth.Enzymol.149：157-176；Straubinger，R.M.and Papahadjopoulos，D.(1983)Meth.Enzymol.101：512-527；Wang，C.Y.and Huang，L.，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7851-7855)。
已经检查非离子脂质体系统，以确定它们于递送药物至皮肤内的效用，尤其包含非离子界面活性剂及胆固醇的系统。包含NovasomeI(甘油二月桂酸酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)及NovasomeII(二硬脂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)的非离子脂质体制剂是用于递送药物至小鼠皮肤的真皮内。此类具有RNAi剂的制剂可用于治疗皮肤病。
含有RNAi剂的脂质体可作成可高度变形者。该变形能力可使脂质体渗透穿过小于脂质体平均半径的孔。举例而言，传递体(高度可变形的脂质聚集体，是药物递送媒介的有吸引力候选者)是一种可变形的脂质体。传递体可揭示为脂质液滴，其可变形性如此的高以至于能轻易渗透穿过小于液滴的孔。传递体能适应其所使用的环境，例如，它们是自我优化(调适至皮肤的孔的形状)、自我修复、且可频繁达致其靶标而不片段化，且通常是自我加载者。为制备传递体，可通过将表面边缘活性剂(通常为界面活性剂)加入标准脂质体组成物中而作成。传递体已经用于将血清白蛋白递送至皮肤。业已证明传递体所介导的血清白蛋白递送，与皮下注射含血清白蛋白的溶液同样有效。包含RNAi剂的传递体可通过例如注射而经皮下递送，而将RNAi剂递送至皮肤内角质形成细胞。为跨越完整哺乳动物皮肤层，脂质囊泡必须于合适的透皮梯度影响下穿过一系列微孔，各该微孔直径均小于50nm。此外，由于脂质的特性，此等传递体可自我优化(调适为孔如皮肤内的孔的形状)、自我修复，且频繁达致其靶标而不片段化，且通常是自我加载者。
适用于本公开的其他制剂是揭示于2008年1月2日递交的美国临时申请第61/018,616号；，2008年1月2日提交的第61/018,611号；，2008年3月26日递交的第61/039,748；2008年4月22日递交的第61/047,087号及2008年5月8日递交的第61/051,528号。2007年10月3日提交的PCT申请号PCT/US2007/080331亦揭示适用于本公开的制剂。
界面活性剂广泛应用于制剂中诸如本文所揭的彼等，尤是乳液(包括微乳液)及脂质体中。对许多不同类型的界面活性剂(天然者及合成者)性质进行分类及排序最常用的方法是藉使用亲水/亲油平衡(HLB)进行。亲水基团(亦称「头部」)的性质是提供将制剂中所用的不同界面活性剂归类的最有用手段(Rieger，in Pharmaceutical Dosage Forms，MarcelDekker，Inc.，New York，N.Y.，1988，p.285)。
若界面活性剂分子未经离子化，则其是归类为非离子界面活性剂。非离子界面活性剂广泛应用于药物及化妆品中，且可在广泛的pH值范围下使用。通常，它们的HLB值范围是2至大约18，取决于其结构。非离子界面活性剂包括非离子酯，例如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、无水山梨醇酯、蔗糖酯及乙氧基化酯。非离子烷醇酰胺及醚如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化醇及乙氧基化/丙氧基化的嵌段聚合物，亦包括在此类别中。聚氧乙烯界面活性剂是非离子界面活性剂类中最常见的成员。
若界面活性剂分子在溶解或分散于水中时带有负电荷，则该界面活性剂是归类为阴离子界面活性剂。阴离子界面活性剂包括羧酸酯如皂类、酰基乳酸酯、胺基酸酰基酰胺、硫酸酯如烷基硫酸酯及乙氧基化烷基硫酸酯、磺酸盐如烷基苯磺酸盐、酰基羟乙磺酸盐、酰基酒石酸盐及磺基琥珀酸盐，及磷酸盐。阴离子界面活性剂类别中最常见的成员是烷基硫酸盐及皂类。
若表面活性剂分子溶解或分散于水中时带有正电荷，则该界面活性剂是归类为阳离子界面活性剂。阳离子界面活性剂包括四级铵盐及乙氧基化胺。四级铵盐是本类别中最常用的成员。
若界面活性剂分子具有携带正电荷或负电荷的能力，则界面活性剂是归类为两性的。两性界面活性剂包括丙烯酸衍生物、经取代的烷基酰胺、N-烷基甜菜碱类以及磷脂。
界面活性剂于医药产品、制剂及乳剂中的使用已经文献回顾(Rieger，inPharmaceutical Dosage Forms，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，1988，p.285)。
用于本公开方法中的RNAi剂亦可作为微胞制剂提供。「微胞」在本文中是定义为一种特定类型的分子组件，其中，两亲性分子排列为球状结构，使得该等分子的疏水部分全部朝向内侧，留下亲水部分与周遭的水相接触。若环境为疏水性，则逆向排列。
适用于透皮膜递送的混合微胞制剂可通过将siRNA组成物的水溶液、碱金属的C8至C22烷基硫酸盐以及微胞形成化合物混合而制备。示例性微胞形成化合物包括卵磷脂、透明质酸、透明质酸的药学可接受的盐类、乙醇酸、乳酸、洋甘菊提取物、黄瓜提取物、油酸、亚麻油酸、次亚麻油酸、亚麻酸、单油酸甘油酯、单油酸酯、单月桂酸酯、琉璃苣油、月见草油、薄荷醇、三羟基氧代胆烷基甘胺酸及其药学可接受的盐类、甘油、聚甘油、离胺酸、聚离胺酸、三油酸甘油酯、聚氧乙烯醚及其类似物、聚多卡醇烷基醚及其类似物、鹅去氧胆酸盐、去氧胆酸盐及其混合物。微胞形成化合物可于加入碱金属的烷基硫酸盐的同时或之后加入。基本上与任何类型成分混合皆能形成混合微胞，但剧烈混合以提供较小尺寸的微胞。
于一方法中，制备含有siRNA的组成物及至少一种碱金属烷基硫酸盐的第一微胞组成物。随后将将第一微胞组成物与至少三种微胞形成化合物混合，以形成混合微胞组成物。于另一方法中，该微胞组成物是通过混合siRNA组成物、碱金属烷基硫酸盐及至少一种微胞形成化合物，随后加入剩余的微胞形成化合物并剧烈混合加以制备。
可将苯酚或间甲酚添加至该混合微胞组成物中以安定该制剂并防止细菌生长。或者，苯酚或间甲酚可与微胞形成成份一并加入。亦可在形成该混合微胞组成物后加入等渗剂如甘油。
为了以喷雾形式递送微胞制剂，可将该制剂置于气胶喷散器内，且该喷散器是填充有推进剂。受压的推进剂于该喷散器中呈液态。调整成份比例，使得水相与推进剂相成为一相，即仅存在一相。如存在两相，则必须在如通过计量阀于喷散一部分内容物前摇动喷散器。所喷散的药剂是自计量阀中喷射出细小喷雾。
该推进剂可包括含氢氯的氟烃、含氢的氟烃、二甲醚及乙醚。于某些态样中，可使用HFA 134a(1，1，1，2四氟乙烷)。
主要成分的具体浓度可通过相对简单的实验确定。相较于经注射或经胃肠道给药者，经口腔吸收者，剂量通常需要增加例如至少两倍或三倍。
脂质颗粒
本公开的RNA剂，例如dsRNA完全包封于脂质制剂中，如LNP中，或包封于其他核酸-脂质颗粒内。
如本文中所使用，术语「LNP」是指代安定的核酸-脂质颗粒。LNP通常包含阳离子脂质、非阳离子脂质及防止颗粒聚集的脂质(例如，PEG-脂质接合物)。LNP非常有利于全身性应用，因其于静脉(i.v.)注射后展现出延长的循环系统中的寿命，并在远端部位(例如，与给药部位物理上分离的部位)蓄积。LNP包括「pSPLP」，其包括如WO 00/03683中所揭的经包封的缩合剂-核酸复合物。本公开的颗粒典型地具有约50nm至约150nm、更典型地约60nm至约130nm、更典型地约70nm至约110nm、最典型地约70nm至约90nm的平均直径，且基本上无毒。此外，当本公开的核酸-脂质颗粒中存在核酸时，该核酸在水溶液中对于核酸酶的降解具抵抗性。核酸-脂质颗粒及其制备方法揭示于例如美国专利第5,976,567号；第5,981,501号；第6,534,484号；第6,586,410；第6,815,432号；美国专利公开第2010/0324120号以及WO96/40964中。
于一态样中，脂质与药物的比率(品质/品质比率)(例如脂质与dsRNA的比率)将在约1∶1至约50∶1、约1∶1至约25∶1、约3∶1至约15∶1、约4∶1至约10∶1、约5∶1至约9∶1，或约6∶1至约9∶1的范围内。上述范围之间的范围亦视为本公开的一部分。
某些用于递送RNAi剂的特定的LNP制剂已经揭示于所属领域中，包括，举例而言，例如揭示于WO 2008/042973中的「LNP01」制剂，该专利通过引用并入本文。
其他示例性脂质-dsRNA制剂鉴别于下表中。
DSPC：二硬脂酰磷脂酰胆碱
DPPC：二棕榈酰磷脂酰胆碱
PEG-DMG：PEG-二肉荳蔻酰基甘油(C14-PEG或PEG-C14)(平均分子量为2000的PEG)
PEG-DSG：PEG-二苯乙烯基甘油(C18-PEG或PEG-C18)(平均分子量为2000的PEG)
PEG-cDMA：PEG-胺甲酰基-1，2-二肉荳蔻基氧基丙胺(平均分子量为2000的PEG)
包含SNALP(1，2-二亚亚麻氧基-N，N-二甲胺基丙烷(DLinDMA))的制剂是揭示于WO2009/127060中，该专利的整体内容通过引用并入本文。
包含XTC的制剂是揭示于WO 2010/088537中，该专利的整体内容通过引用并入本文。
包含MC3的制剂是揭示于例如美国专利公开第2010/0324120号中，该专利的整体内容通过引用并入本文。
包含ALNY-100的制剂是揭示于WO 2010/054406中，该专利的整体内容通过引用并入本文。
包含C12-200的制剂是揭示于WO 2010/129709中，该专利的整体内容通过引用并入本文。
用于口服给药的组成物与制剂包括粉末剂或颗粒剂、微粒、奈米颗粒、在水或非水介质中的悬浮液、溶液、胶囊、凝胶胶囊、小袋、片剂或微型片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可为合乎需要者。于一些态样中，口服制剂是本公开提出的dsRNA与一或多种渗透增强剂界面活性剂与螯合剂联合给药的制剂。合适的界面活性剂包括脂肪酸或其酯或盐类、胆汁酸或其盐。合适的胆汁酸/盐包括鹅去氧胆酸(CDCA)及熊去氧鹅去氧胆酸(UDCA)、胆酸、去氢胆酸、去氧胆酸、糖胆酸、甘胆酸、甘胺去氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺去氧胆酸、牛磺-24，25-二氢夫西酸盐及甘胺二氢呋喃钠。合适的脂肪酸包括花生四烯酸、十一烷酸、油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉荳蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚麻油酸、次亚麻油酸、二癸酸酯、三癸酸酯、单油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱或单甘油酯、二甘油酯或其药学可接受的盐类(例如，钠)。于一些态样中，使用渗透增强剂的组合，例如脂肪酸/盐与胆汁酸/盐的组合。一种示例性的组合是月桂酸、癸酸及UDCA的钠盐。其他渗透增强剂包括聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-十六烷基醚。本公开中提出的DsRNA可作为包含喷雾干燥颗粒在内的颗粒剂形式、或复合形成微粒或奈米颗粒经口服递送。DsRNA复合剂包括聚胺基酸；聚亚胺；聚丙烯酸酯；聚丙烯酸烷基酯、聚氧杂环丁烷、聚氰基丙烯酸烷基酯；阳离子化明胶、白蛋白、淀粉、丙烯酸酯、聚乙二醇(PEG)及淀粉；聚氰基丙烯酸烷基酯；DEAE衍生的聚亚胺、普鲁兰多糖、纤维素及淀粉。合适的络合剂包括聚壳醣、N-三甲基聚壳醣、聚-L-离胺酸、聚组胺酸、聚鸟胺酸、聚精胺酸、鱼精蛋白、聚乙烯吡啶、聚硫代二乙基胺基甲基乙烯P(TDAE)、聚胺基苯乙烯(例如对-胺基)、聚(氰基丙烯酸甲酯)、聚(氰基丙烯酸乙酯)，聚(氰基丙烯酸丁酯)，聚(氰基丙烯酸异丁酯)，聚(氰基丙烯酸异己酯)，DEAE-丙烯酸甲酯，DEAE-丙烯酸己酯，DEAE-丙烯酰胺，DEAE-白蛋白和DEAE-葡聚醣，聚丙烯酸甲酯，聚丙烯酸己酯，聚(D，L-乳酸)，聚(DL-乳酸-共-乙醇酸(PLGA)、海藻酸盐以及聚乙二醇(PFG)。dsRNA口服制剂及其制备详细揭示于美国专利第6,887,906号、美国专利第2003/0027780号及美国专利第6,747,014号中，该等专利均通过引用并入本文。
用于肠胃外、脑实质内(脑内)、鞘内、心室内或肝内给药的组成物和制剂可包括无菌水溶液，其亦可含有缓冲剂、稀释剂及其他适宜的添加剂，例如但不限于渗透促进剂、载剂化合物及其他药学可接受的载剂或赋形剂。
本公开的医药组成物包括但不限于溶液、乳液及含脂质体的制剂。此等组成物可为由多种组分生成，该等组分包括但不限于预成形的液体、自乳化的固体及自乳化的半固体。特佳者是当治疗APP相关疾病或病症时靶向脑的制剂。
本公开的医药制剂可便利地以单位剂型存在，可根据医药产业中习知的常规技术制备的。此类技术包括将活性成分与医药载剂或赋形剂带至联合的步骤。通常，是通过将活性成分与液体载体或精细分切的固体载剂或两者均匀且紧密地带至联合，随后若必要，令产物成形来制备该等制剂。
本公开的组成物可配制为多种可能剂型的任一者，例如但不限于片剂、胶囊剂、凝胶胶囊剂、液体糖浆剂、软凝胶剂、栓剂及灌肠剂。本公开的组成物亦可配制为处于水性、非水性或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液尚可含有增加悬浮液黏度的物质，其包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚醣。悬浮液亦可含有安定剂。
[其他制剂]
i.乳液
本公开的组成物可制备且配制为乳液。乳液是一种液体以通常直径超过0.1μm的液滴形式，分散于另一种液体中的典型非均质系统(参见，例如，Ansel’s PharmaceuticalDosage Forms and Drug Delivery Systems，Allen，LV.，Popovich NG.，and Ansel HC.，2004，Lippincott Williams&Wilkins(8th ed.)，New York，NY；Idson，in PharmaceuticalDosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，N.Y.，volume 1，p.199；Rosoff，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，Volume 1，p.245；Block in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，volume 2，p.335；Higuchi et al.，in Remington’sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1985，p.301)。乳液通常为双相系统，包含两个不相混溶的液相，彼此紧密混合并分散。通常，乳液可为油包水类(w/o)或水包油(o/w)类。当水相经精细切分为小液滴并分散于一整团油相中时，所得组成物称为油包水(w/o)乳液。或者，当油相经精细切分为小液滴并分散于一整团水相中时，所得组成物称为水包油(o/w)乳液。乳液除了含有分散相及活性药物的外，尚可包含其他组分，而该活性药物可以溶液形式以水相、油相或一独立相存在。乳化剂、安定剂、染料及抗氧化剂等药物赋形剂也可任选地存在于乳液中。医药乳液亦可为由多于两相构成的多重相乳液，例如油包水包油(o/w/o)或水包油包水(w/o/w)乳液。此类复配方制剂往往提供简单双相乳液所不具的某些优点。多重相乳液，其中o/w乳液的单个油滴容纳小水滴，形成w/o/w乳液。同样地，油滴容纳于安定存在于一油性连续相中的水滴的系统，提供o/w/o乳液。
乳液的特征在于很少或没有热力学安定性。通常，乳液的分散相或不连续相良好地分散于外部相或连续相中，并透过乳化剂手段或制剂的黏性维持其形式。乳液的任一相可为半固体或固体，如乳液型软膏基质及乳霜。其余安定乳液的方法须使用可并入乳液的任一相中的乳化剂。大致上，乳化剂可归为四类：合成界面活性剂、天然存在的乳化剂、吸收性基质及精细分散的固体(参见，例如Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDeiivery Systems，Allen，LV.，Popovich NG.，and Ansel HC.，2004，LippincottWilliams&Wilkins(8th ed.)，New York，NY；Idson，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，volume 1，p.199)。
合成界面活性剂，亦称为界面活性剂，已广泛用于乳液制剂中并已经文献回顾(参见，例如，Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，Allen，LV.，Popovich NG.，and Ansel HC.，2004，Lippincott Williams&Wilkins(8th ed.)，NewYork，NY；Rieger，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，volume 1，p.285；Idson，inPharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，1988，volume 1，p.199)。典型的界面活性剂是两亲性的，并包含亲水及疏水部分。界面活性剂的亲水性与疏水性的比率被称为亲水/亲脂平衡(HLB)，其是制剂制备中归类及选择界面活性剂的重要工具。依亲水性基团的性质，界面活性剂可归为不同的类别：非离子型、阴离子型、阳离子型及两性型(参见，例如，Ansel’s PharmaceuticalDosage Forms and Drug Delivery Systems，Allen，LV.，Popovich NG.，and Ansel HC.，2004，Lippincott Williams&Wilkins(8th ed.)，New York，NY Rieger，inPharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，MarcelDekker，Inc.，New York，N.Y.，volume 1，p.285)。
乳液制剂中使用的天然乳化剂包括羊毛脂、蜂蜡、磷脂、卵磷脂及阿拉伯胶。吸收基质具有亲水性，使得它们可吸收水以形成w/o乳液，而仍保持其半固体稠度，举例而言，无水羊毛脂及亲水性凡士林。经精细分切的固体亦被用作良好的乳化剂，尤其是与界面活性剂合用，或用于黏性制剂中。此等是包括极性无机固体，例如重金属氢氧化物、不溶胀粘土如膨土、镁铝海泡石、锂膨润石、高岭土、蒙脱石、胶体硅酸铝及胶体硅酸镁铝、颜料及非极性固体如碳或三硬脂酸甘油酯。
大量非乳化材料也包含于乳液制剂中，且对乳液的特性有所贡献。此等是包括脂肪、油类、蜡、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、保湿剂、亲水胶体、防腐剂及抗氧化剂(Block，inPharmaceuticalDosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，MarcelDekker，Inc.，New York，N.Y.，volume 1，p.335；Idson，in PharmaceuticalDosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，volume 1，p.199)。
亲水性胶体或水胶体包括天然存在的树胶及合成聚合物，例如，多醣(如阿拉伯胶、琼脂、海藻酸、角叉菜胶、关华豆胶、刺梧桐胶及黄蓍胶)、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羧丙基纤维素)及合成聚合物(如，卡波姆、纤维素醚及羧基乙烯基聚合物)。它们于水中分散或溶胀而形成胶体溶液，其是透过在分散相液滴周围形成坚固的界面膜，以及透过增加外部相的粘度来安定乳液。
由于乳液经常含有易于支持微生物生长的多种成分，例如，碳水化合物、蛋白质、固醇及磷脂质，此类制剂通常含有防腐剂。乳液制剂中常用的防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、四级铵盐、氯化苯二甲烃铵、对羟基苯甲酸酯及硼酸。抗氧化剂亦常添加至乳液制剂中以防止其变质。所使用的抗氧化剂可为自由基清除剂，例如，生育酚、没食子酸烷基酯、丁基羟基茴香醚、丁基羟基甲苯，或还原剂例如抗坏血酸及偏亚硫酸钠，以及抗氧化增效剂，例如柠檬酸、酒石酸及卵磷脂。
乳液制剂经由皮肤、口服及肠胃外途径的应用及其制造方法已经于文献中回顾(参见，例如，Ansel’s PharmaceuticalDosage Forms and Drug Delivery Systems，Allen，LV.，Popovich NG.，and Ansel HC.，2004，Lippincott Williams&Wilkins(8thed.)，New York，NY；Idson，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger andBanker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，volume 1，p.199)。用于口服递送的乳液制剂因其易于配制，以及在吸收及生物利用性的角度上的功效，已经广泛使用(参见，例如，Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，Allen，LV.，Popovich NG.，and Ansel HC.，2004，Lippincott Williams&Wilkins(8th ed.)，NewYork，NY；Rosoff，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，volume 1，p.245；Idson，inPharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，MarcelDekker，Inc.，New York，N.Y.，volume 1，p.199)。矿物油基质轻泻剂、油溶性维生素及高脂肪营养制剂是经常作为口服给药的o/w乳液的物质。
ii.微乳液
于本公开一态样中，RNAi剂及核酸的组成物是配制为微乳液。微乳液可定义为水、油及两亲物的系统，其是一单一的光学均向性及热力学上安定的液体溶液(参见，例如，Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Del ivery Systems，Allen，LV.，Popovich NG.，and Ansel HC.，2004，Lippincott Williams&Wilkins(8th ed.)，NewYork，NY；Rosoff，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，volume 1，p.245)。典型地，微乳液是通过下述方法制备的系统：首先，将油分散于界面活性剂水溶液中，随后加入足量的第四组分，通常是中等炼长的醇，以形成透明的系统。因此，微乳液亦被描述为两种不相混溶液体的热力学上安定、均向性的澄清分散液，该两种液体是通过界面活性分子的界面膜加以安定化(Leung and Shah，in：Controlled Release of Drugs：Polymers and AggregateSystems，Rosoff，M.，Ed.，1989，VCH Publishers，New York，pages 185-215)。微乳液往往经由将三至五种组分结合来制备，此类组分包括油、水、界面活性剂、助界面活性剂及电解质。微乳液是否为油包水(w/o)类型抑或水包油(o/w)类型则取决于所使用的油及界面活性剂的特性，亦取决于界面活性剂分子极性头部及烃尾部的结构及其几何封装(Schott，inRemington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1985，p.271)。
利用相图的现象学方法已经广泛研究，且为本领域技术人员提供了如何配制微乳液的完整知识(参见，例如，Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems，Allen，LV.，Popovich NG.，and Ansel HC.，2004，Lippincott Williams&Wilkins(8th ed.)，New York，NY；Rosoff，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Riegerand Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，volume 1，p.245；Block，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，MarcelDekker，Inc.，New York，N.Y.，volume 1，p.335)。相较于传统乳液，微乳液具有可将制剂中水不溶性药物溶解为自发形成的热力学上安定液滴的优点。
于制备微乳液中使用的界面活性剂包括但不限于离子界面活性剂、非离子界面活性剂、Brij 96、聚氧乙烯油基醚、聚甘油脂肪酸酯、四甘油单月桂酸酯(ML310)、四甘油单油酸酯(M0310)、六甘油单油酸酯PO310)、六甘油五油酸酯(PO500)、十甘油单癸酸酯(MCA750)、十甘油单油酸酯(MO750)、十甘油倍半油酸酯(SO750)、十甘油十油酸酯(DAO750)，其是单独使用或与助界面活性剂合用。助界面活性剂，一般是短链醇如乙醇、1-丙醇及1-丁醇，是通过渗透至表面活性剂膜中，随后因界面活性剂分子间生成的空隙而创造出失序的膜，从而增加界面流动性。惟，微乳液可于不使用助表面活性剂的情况下制备，且不含醇的自乳化微乳液系统是所属领域中已知者。水相典型可为但不限于水、药物的水溶液、甘油、PEG300、PEG400、聚甘油、丙二醇及乙二醇衍生物。油相可包括但不限于诸如Captex 300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸酯、中链(C8-C12)单、二及三甘油酯、聚氧乙基化甘油基脂肪酸酯、脂肪醇、聚乙二醇化甘油酯、饱和聚乙二醇化C8-C10甘油酯、植物油及硅油。
自药物溶解及增强药物吸收的角度观的，微乳液尤其引人注意。已经提出，基于脂质的微乳液(o/w及w/o两者)能增强药物口服的生物利用度，包括肽(参见，例如，美国专利第6,191,105号、第7,063,860号、第7,070,802号、第7,157,099号；Constantinides etal.，Pharmaceutical Research，1994，11，1385-1390；Ritschel，Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol.，1993，13，205)。微乳液具有以下优点：改善药物溶解性、保护药物不被酶水解、由于界面活性剂诱发的膜流动性及渗透性改变而可能加强药物的吸收、易于制备、比固体剂型更易于口服给药、改善临床潜能，以及降低毒性(参见，例如，美国专利第6,191,105号、第7,063,860号、第7,070,802号、第7,157,099号；Constantinides etal.，Pharmaceutical Research，1994，11，1385；Ho et al.，J.Pharm.Sci.，1996，85，138-143)。当于环境温度下将其组分带至一起时，通常可自发形成微乳液。这在配制不耐热的药物、肽或RNAi剂时，尤其有利。在化妆品及医药这两种应用当中，微乳液在透皮递送活性组分方面亦有效。预期本公开的微乳液组成物及制剂将促进胃肠道对RNAi剂及核酸的系统性吸收，以及改善对RNAi剂及核酸的局部细胞摄取。
本公开的微乳液亦可含有额外的组分及添加剂，如山梨糖醇酐单油酸酯(Grill3)、Labrasol及渗透增强剂，以改善制剂的性质并增强对本公开的RNAi剂及核酸的吸收。本公开的微乳液中使用的渗透增强剂可归类为属于下述五大类别的一者：界面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂以及非螯合非界面活性剂(Lee et al.，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems，1991，p.92)。此等类别各自已经讨论于上文中讨论。
iii.微粒
本公开的RNAi剂可掺入颗粒如微粒中。微粒可通过喷雾干燥生产，但亦可通过其他方法生产，包括冻干、蒸发、流化床干燥、真空干燥或此等技术的组合。
iv.渗透增强剂
于一态样中，本公开使用多种渗透增强剂以实现核酸尤其是RNAi剂至动物皮肤的有效递送。大多数药物以经离子化及未经离子化两种形式存在于溶液中。惟，通常仅脂溶性或亲脂性药物容易跨越细胞膜。已经发现，若待被跨越的细胞膜经渗透增强剂处理，则即便是非亲脂性药物仍能跨越该细胞膜。渗透促进剂除了有助于非亲脂性药物经扩散跨越细胞膜以外，亦增强亲脂性药物的渗透能力。
渗透增强剂可归类为属于以下五大类别的一者：界面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂、及非螯合非界面活性剂(参见，例如，Malmsten，M.Surfactants and polymers indrug delivery，Informa Health Care，New York，NY，2002；Lee et al.，CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，p.92)。上述各类别的渗透增强剂更详尽揭示于下。
界面活性剂(或「表面活性剂」)是一种化学实体，当其溶解于水溶液中时，降低该溶液的表面张力，或该水溶液与另一种液体间的界面张力，使得RNAi剂经由黏膜的吸收度得以提升。除了胆汁盐及脂肪酸的外，此类渗透增强剂亦包括如十二烷基硫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂基醚以及聚氧乙烯-20-十六烷基醚)(参见，例如，Malmsten，M.Surfactants andpolymers in drug delivery，Informa Health Care，New York，NY，2002；Lee et al.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，p.92)；以及全氟化学乳液如FC-43。Takahashi et al.，J.Pharm.Pharmacol.，1988，40，252)。
作为渗透增强剂而作动的多种脂肪酸及其衍生物包括，举例而言，油酸、月桂酸、癸酸(正癸酸)、肉荳蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚麻油酸、次亚麻油酸、二癸酸酯、三癸酸酯、单油酸甘油酯(1-单油酰基-rac-甘油)、二月桂酸甘油酯、辛酸、花生四烯酸、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱、C1-20烷基酯(例如甲基、异丙基及t-丁基)及其单甘油酯及二甘油酯(即油酸酯、月桂酸酯、癸酸酯、肉荳蔻酸酯、棕榈酸酯、硬脂酸酯、亚麻油酸酯等)(参见，例如，Touitou，E.，et al.Enhancement in Drug Del ivery，CRC Press，Danvers，MA，2006；Lee et al.，Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems，1991，p.92；Muranishi，Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems，1990，7，1-33；El Hariri et al.，J.Pharm.Pharmacol.，1992，44，651-654)。
胆汁的生理作用包括促进对脂质及脂溶性维生素的分散及吸收(参见，例如，Malmsten，M.Surfactants and polymers in drug delivery，Informa Health Care，NewYork，NY，2002；Brunton，Chapter 38in：Goodman&Gilman’s The Pharmacological Basisof Therapeutics，9th Ed.，Hardman et al.Eds.，McGraw-Hill，New York，1996，pp.934-935)。多种天然胆汁盐及其合成衍生物可作为渗透增强剂。因此，术语「胆汁盐」包括任何胆汁的任意天然组分及其任意的合成衍生物。适宜的胆汁盐包括例如胆酸(或其药学可接受的钠盐，胆酸钠)、去氢胆酸(去氢胆酸钠)、去氧胆酸(去氧胆酸钠)、甘胆酸(甘胆酸钠)、糖胆酸(糖胆酸钠)、甘胺去氧胆酸(甘胺去氧胆酸钠)、牛磺胆酸(牛磺胆酸钠)、牛磺脱氧胆酸(牛磺脱氧胆酸钠)、鹅脱氧胆酸(鹅去氧胆酸钠)、熊去氧胆酸(UDCA)、牛磺-24，25-二氢夫西酸钠(STDHF)、糖基二氢夫西地酸钠以及聚氧乙烯9-月桂基醚(POE)(参见，例如Malmsten，M.Surfactants and polymers in drug delivery，Informa Health Care，NewYork，NY，2002；Lee et al.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，page 92；Swinyard，Chapter 39In：Remington’s Pharmaceutical Sciences，18thEd.，Gennaro，ed.，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1990，pages 782-783；Muranishi，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1990，7，1-33；Yamamoto etal.，J.Pharm.Exp.Ther.，1992，263，25；Yamashita et al.，J.Pharm.Sci.，1990，79，579-583)。
与本公开关联使用的螯合剂可定义为藉与金属离子形成错合物而将该金属离子从溶液中去除的化合物，其结果是令RNAi剂经黏膜的吸收得以提升。关于它们作为渗透增强剂于本公开中的用途，螯合剂进一步具有作为DNase抑制剂的附加优点，盖大多数经鉴定的DNA核酸酶需要二价金属离子以进行催化，因而受到螯合剂的抑制(Jarrett，J.Chromatogr.，1993，618，315-339)。适宜的螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、柠檬酸、水杨酸盐(如水杨酸钠、5-甲氧基水杨酸盐及高香草酸盐)、胶原的N-酰基衍生物、月桂醇聚醚-9以及β-二酮(烯胺)的N-胺基酰基衍生物(参见，例如，Katdare，A.etal.，Excipient development for pharmaceutical，biotechnology，and drug delivery，CRC Press，Danvers，MA，2006；Lee et al.，Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems，1991，page 92；Muranishi，Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems，1990，7，1-33；Buur et al.，J.Control Rel.，1990，14，43-51)。
在本文中，非螯合非界面活性剂渗透增强化合物可定义为，其作为螯合剂或作为界面活性剂的活性不显著，但仍能增强经消化道黏膜吸收RNAi剂的化合物(参见，例如，Muranishi，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1990，7，1-33)。此类渗透增强剂包括如不饱和环脲、1-烷基-及1-烯基氮杂环-烷酮衍生物(Lee et al.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，page 92)；以及非固醇类抗发炎剂，如双氯芬酸钠、吲哚美辛及丁二苯吡唑二酮(Yamashita et al.，J.Pharm.Pharmacol.，1987，39，621-626)。
能够于细胞层级增强RNAi剂摄入的剂，亦可加入本公开的医药组成物及其他组成物中。举例而言，阳离子脂质体如lipofectin(Junichi et al，美国专利第5,705,188号)、阳离子甘油衍生物，及聚阳离子分子诸如聚离胺酸(WO 97/30731)，亦已知能增强细胞对dsRNAs的摄取。
其他剂可用以增强所给药的核酸的渗透，包括二醇类如乙二醇及丙二醇、吡咯类如2-吡咯、氮酮类及萜烯类如柠檬烯及薄荷酮。
yi.赋形剂
与载剂化合物相比，「药物载剂」或「赋形剂」是药学可接受的溶剂、悬浮剂或用于将一种或多种核酸递送至动物的任何其他药学惰性媒介。赋形剂可为液体或固体，且当与核酸及给定医药组成物的其他组分合并时，基于计划的给药模式来选择，以提供所欲的体积、稠度等。典型药物载剂包括但不限于黏合剂(例如预胶凝的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素等)；填充剂(例如乳糖及其他糖、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯或磷酸氢钙等)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石粉、二氧化硅、胶体二氧化硅、硬脂酸、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、醋酸钠等)；崩解剂(如淀粉、羧甲基淀粉钠等)；以及润湿剂(如月桂基硫酸钠等)。
不与核酸产生有害反应、适用于非肠胃外给药的药学可接受的有机或无机赋形剂，亦可用以配制本公开的组成物。适宜的药学可接受载剂包括但不限于水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、黏性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
用于核酸局部给药的制剂可包括无菌及非无菌水溶液、在常用溶剂如醇中的非水溶液、或核酸在液体或固体油基质中的溶液。溶液尚可包含缓冲剂、稀释剂及其他适宜的添加剂。可使用不与核酸产生有害反应的适用于非肠胃外给药的药学可接受的有机或无机赋形剂。
适宜的药学可接受的赋形剂包括但不限于水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、黏性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
vii.其他组分
本公开的组成物可额外包含常见于其他医药组成物中的辅助组分，用量是它们在所属领域中已确立者。是以，举例而言，该组成物可含有额外、可相容、具药学活性的材料诸如，举例而言，止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗发炎剂，或可含有可用于物理上配制多种剂型的本公开组成物的材料，例如染料、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂及安定剂。惟，当加入此类材料时，此类材料不应过度干扰本公开的组成物组分的生物活性。该制剂可经灭菌，且任选地可与不与该制剂的核酸发生有害反应的助剂混合，诸如润滑剂、防腐剂、安定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂或芳香物质等。
水性悬浮液可含有增加悬浮液黏度的物质，包括如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚醣。悬浮液亦可含有安定剂。
于一些态样中，本公开提出的医药组成物包含(a)一种或多种RNAi剂以及(b)一种或多种通过非RNAi机制发挥作用，且可用于治疗SNCA相关神经退化性疾病的剂。此类剂的示例包含但不限于多巴胺激动剂及促进剂，其中包括：卡比多巴-左旋多巴、左旋多巴、恩他卡朋、托卡朋、阿卡朋、普拉克索、罗匹尼罗、阿朴吗啡、罗替戈汀、司来吉兰、雷沙吉兰、沙芬酰胺、金刚烷胺、伊曲茶碱、三己芬迪、苯扎托品、利凡斯的明、多奈哌齐、加兰他敏及美金刚。
此类化合物的毒性及治疗功效可由细胞培养物或实验动物中的标准制药流程来确定，举例而言，用于确定LD50(将群体的50％致死的剂量)及ED50(对群体的50％治疗有效的剂量)的流程。毒性及疗效间的剂量比率为治疗指标，其可表示为LD50/ED50的比。展现高治疗指标的化合物是较佳者。
从细胞培养分析及动物研究中获得的数据，可用于订定在人体内使用的剂量范围。本公开提出的组成物剂量通常落于包含ED50在内的体循环浓度范围内，几乎没有或没有毒性。取决于所采用的剂型及所使用的给药途径，剂量可在此范围内变动。对于在本公开提出的方法中使用的任何化合物，最初可自细胞培养分析估计其治疗有效的剂量。剂量可于动物模型中订定，以达该化合物于血浆中的循环浓度范围，或(当适宜时)靶标序列的多肽产物的血浆中循环浓度范围(例如，达成多肽的浓度下降)，该范围包括IC50(即在细胞培养物中分析的，达对症状的半数最大抑制时的受测化合物浓度)。此讯息可用来更准确地确定可用于人体中的剂量，举例而言，可藉高效液相色层分析量测血浆中的量。
除了如上文所讨论的给药外，本公开提出的RNAi剂亦可与其他在治疗由核苷酸重复序列表达所介导的病理进程中已知有效的剂合用。在任何情况下，给药的医师可基于所属领域中已知、或本文所述的标准功效测量手段观察到的结果，来调整RNAi剂给药量及给药时机。
VII.试剂盒
于某些方面，本公开提供包括合适容器的试剂盒，该容器含有siRNA化合物的药物制剂，例如，双股siRNA化合物或siRNA化合物(例如前驱物，如可经加工为siRNA化合物的较大siRNA化合物，或编码siRNA化合物的DNA，如双股siRNA化合物，或siRNA化合物或其前驱物)。于某些态样中，该药物制剂的个别组分可于一个容器内提供。另选地，可能需要于两个或多个容器中分别提供该药物制剂组分，例如，一个用于siRNA化合物制剂的容器及至少另一个用于载剂化合物的容器。该试剂盒可包装为多种不同配置，诸如一个盒子中的一或多个容器。可根据试剂盒提供的说明书结合不同组分，例如，可根据本文所述方法结合此等组分，以制备及施用一种医药组成物。试剂盒尚可包括递送装置在内。
VIII.抑制SNCA表达的方法
本公开进一步提供抑制细胞中SNCA基因的表达的方法。该方法包括令细胞与有效抑制细胞内SNCA表达量的RNAi剂如双股RNAi剂接触，从而抑制SNCA于细胞内的表达。于本公开某些态样中，SNCA于CNS(例如，脑)细胞中被优先抑制。于本公开其他态样中，SNCA于肝脏(例如，肝细胞)中被优先抑制。于本公开某些态样中，SNCA于CNS(例如，脑)细胞及肝脏细胞(例如，肝细胞)中被抑制。
细胞与RNAi剂如双股RNAi剂的接触是可于体外或体内进行。令细胞于体内与RNAi剂接触是包括令个体(例如，人类个体)体内细胞或细胞群与该RNAi剂接触。体外接触细胞的及体内接触细胞的方法的结合亦是可能者。
如上文所讨论，与细胞接触可为直接或间接者。此外，与细胞的接触可经由靶向配体来施行，包含本文所揭或所属领域已知的任意配体。于一些态样中，靶向配体是碳水化合物部分，例如GalNAc配体，或将该RNAi剂导引至感兴趣位置的其他任意配体。
如本文所用，术语「抑制(inhibiting)」与「减少(reducing)」、「静默化(silencing)」、「下调(downregulating)」、「抑阻(suppressing)」及其他类似的术语可互换使用，且包含任意等级的抑制。于某些态样中，抑制的等级，例如针对本公开的RNAi剂，是可于细胞培养条件下评估，例如其中，细胞培养物中的细胞经由LipofectamineTM介导的转染，以接近10nM或更低、1nM或更低者等的细胞浓度进行转染。给定RNAi剂的减弱，可通过比较其在处理前的细胞培养物中、与处理后的细胞培养物中的量来加以判定，任选地，亦与经混合或其他形式的对照RNAi剂平行处理的细胞进行比较。细胞培养物中的减弱，例如可选地50％或更多的减弱，可由此判定为「抑制」、「减少」、「下调」或「抑阻」等业已出现的指标。明确预期，于所属领域描述的适当控制条件下，亦可于体内系统中评估本公开的RNAi剂所靶向的mRNA或编码的蛋白质的量(并因此评估由本公开的RNAi剂造成「抑制」等的程度)。
在本文中，术语「抑制SNCA基因的表达」或「抑制SNCA表达」是包括抑制任何SNCA基因(例如，小鼠SNCA基因、大鼠SNCA基因、猴SNCA基因或人类SNCA基因)，以及编码SNCA蛋白的SNCA基因的变体或突变体的表达。因此，于经遗传操作的细胞、细胞群或生物体的背景下，SNCA基因可为野生型SNCA基因、突变SNCA基因或基因转殖SNCA基因组。
「抑制SNCA基因的表达」包括对SNCA基因的任意量的抑制，举例而言，至少部分抑制SNCA基因的表达，如至少20％的抑制。于某些态样中，是至少30％、至少40％、任选地至少50％、至少约60％、至少70％、至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的抑制；或是低于检测方式的侦检等级。
SNCA基因的表达可基于与SNCA基因的表达相关的任意变数的量来评估，例如，SNCA mRNA量或SNCA蛋白量，或诸如神经发炎量，例如，小胶质细胞与星形胶质细胞活化，以及与神经元细胞死亡及/或外泌体(神经元或其他神经元)内SNCA mRNA/蛋白质量相关的大脑区域中的SNCA沉积。
抑制可通过该等变数中一或多个绝对或相对量，相对于对照量的降低加以评估。对照量可为所属领域中使用的任意类型对照量级，例如给药前的初始量，或自未治疗或以对照物(例如，仅含缓冲液的对照物或非活性剂对照物)治疗的类似个体、细胞或样本所测得的量。
于本公开方法的一些态样中，SNCA基因的表达是被抑制至少20％、30％、40％，可选地是至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％，或是低于该检测的侦检量。于某些态样中，该方法包含对SNCA表达的临床相关抑制，例如，通过降低SNCA表达的剂治疗个体后的临床相关结果加以证明者。
对SNCA基因的表达的抑制，可通过第一细胞或细胞群(此类细胞可存在于例如源自个体的样本中)所表达的mRNA量减少而体现，其中，SNCA基因被转录且已经处理(例如，通过令一或多个细胞与本公开的RNAi剂接触，或通过将本公开RNAi剂给药至其体内存在或曾存在该细胞的个体)，使得其SNCA基因的表达，相较于实质上相同于第一个细胞或细胞群但未经如是处理的第二个细胞或细胞群(未经RNAi剂处理或未以靶向目标基因的RNAi剂处理的对照细胞)是受到抑制。该抑制程度可表示为：
于其他态样中，对SNCA基因的表达的抑制可根据与SNCA基因的表达，如SNCA蛋白表达相关参数的降低来评估。SNCA基因静默化可于表达SNCA的任意细胞中(不论其是与表达构建体同源或异源)作判定，以及通过本领域已知的任意检测来判定。
对SNCA蛋白质表达的抑制可通过细胞或细胞群表达的SNCA蛋白质的量(例如，源自个体的样本中所表达的蛋白质量)的降低而体现。如上所述，对mRNA的抑制的评估，经处理细胞或细胞群中蛋白质表达量的抑制，可类似地表示为相对于对照细胞或细胞群中蛋白质量的百分比。
可用来评估对SNCA基因的表达的抑制的对照细胞或细胞群，尚包括未与本公开的RNAi剂接触的细胞或细胞群。举例而言，对照细胞或细胞群可源自使用RNAi剂治疗个体之前的个别个体(例如，人或动物个体)。
可利用所属领域已知的用于评估mRNA表达的任意方法，判定细胞或细胞群的SNCAmRNA表达量。于一态样中，样本中的SNCA表达量是透过侦测经转录的多核苷酸或其部分，例如SNCA基因的mRNA来加以判定。可使用RNA抽取技术从细胞中抽取出RNA，包括如使用酸性苯酚/异硫氰酸胍(RNAzol B；Biogenesis)、RNeasyTMRNA制备试剂盒或PAXgene(PreAnalytix，Switzerland)抽取。采用核糖核酸杂交的典型检测形式则包括核连缀检定、RT-PCR、RNase保护测定、北方墨点、原位杂交与微阵列分析。可使用WO2012/177906中揭示的方法来侦测循环SNCA mRNA，该专利的全部内容是通过引用并入本文。
于一些态样中，是使用核酸探针来判定SNCA的表达量。如本文中所使用，术语「探针」是指代能选择性结合至特定的SNCA核酸或蛋白质或其片段的任意分子。探针可由所属领域技术人士合成，或衍生自适宜的生物制剂。探针可专门设计为带有标记。可作为探针分子的示例包括但不限于RNA、DNA、蛋白质、抗体及有机分子。
单离的mRNA可用于杂交或扩增分析中，包括但不限于南方或北方墨点测定、聚合酶连锁反应(PCR)分析及探针阵列。一种用于判定mRNA量的方法涉及令单离的mRNA与可与SNCA mRNA杂交的核酸分子(探针)接触。于一态样中，举例而言，通过单离的mRNA于琼脂糖凝胶上电泳、并将mRNA自该凝胶转移至膜诸如硝酸纤维素膜上，从而将mRNA固定于固体表面并令其与探针接触。于备选的态样中，例如在基因晶片阵列中，探针是固定于固体表面上且令mRNA与该探针接触。熟练的技术人士可容易地采用已知的mRNA检测方式以判定SNCA mRNA量。
用于判定样本中SNCA表达量的另一方法涉及例如样本中mRNA的核酸扩增或逆转录酶(以制备cDNA)的过程，该过程是例如通过RT-PCR(Mullis，1987，美国专利第4,683,202号)、连接酶连锁反应(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：189-193)、自我持续的序列复制(Guatelli et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173-1177)、Q-Beta复制酶(Lizardiet al.(1988)Bio/Tochnology 6：1197)、滚环式复制(Lizardi et al.，美国专利第5，854，033号)或任意其他核酸扩增方法进行，而后使用所属领域技术人士习知的技术侦检所扩增的分子。若核酸分子以非常低的数量存在，则此等检测方式对于侦检核酸分子尤其有用。于本公开特定方面，SNCA的表达量是通过定量荧光RT-PCR(即TaqManTM系统)、通过荧光素酶检定，或通过其他本领域公知用于量测SNCA的表达或mRNA量的方法加以判定。
可使用膜印迹法(例如杂交分析中所使用者，如北方墨点、南方墨点、印迹等)或微孔、样本管、凝胶、珠或纤维(或包含经结合的核酸的任意固体支持物)来监测SNCA mRNA的表达量。参见美国专利号第5,770,722号、5,874,219号、5,744,305号、5,677,195号及5,445,934号，该等专利通过引用并入本文。SNCA表达量的判定尚可包括处于溶液中的核酸探针。
于一些态样中，使用分支DNA(bDNA)测定或实时PCR(qPCR)评估mRNA的表达量。于本文提供的实施例中揭示并以示例说明了该PCR方法的用途。此类方法尚可用于侦检SNCA核酸。
SNCA蛋白的表达量可使用所属领域已知的用于量测蛋白质量级的任意方法加以判定。此类方法包括诸如电泳、毛细管电泳、高效液相层析(HPLC)、薄层层析(TLC)、超扩散层析、流体或凝胶沉淀反应、吸收光谱、比色检定、分光光度测定、流式细胞术、免疫扩散(单或双)、免疫电泳、西方墨点、放射免疫检定(RIA)、酶联免疫吸附检定(ELISA)、免疫荧光检定、电化学发光检定等。此类检定尚可用于侦检指示SNCA蛋白的存在或复制的蛋白质标志物。
于一些态样中，本公开的方法于治疗SNCA相关疾病中的功效是通过SNCA mRNA量的降低(例如，通过脑部活检或其他方式评估CSF样本的SNCA量)加以评估。
于一些态样中，本公开的方法于治疗SNCA相关疾病中的功效是通过SNCA mRNA量的降低(例如，通过脑部活检或其他方式评估肝脏样本的SNCA量)加以评估。
于本公开方法的一些态样中，向个体施用RNAi剂，从而将RNAi剂递送至该个体体内的特定位置。对SNCA表达的抑制是可通过量测源自该个体体内特定位置如CNS细胞样本中SNCA mRNA或SNCA蛋白量或其改变量进行评估。于某些态样中，该方法包含对SNCA表达的临床相关抑制，举例而言，如通过以降低SNCA表达的剂治疗个体后的临床相关结果所证明者。
如本文所使用，术语「检测」或「判定」被分析物的量，是理解为：执行该等步骤以确定材料如蛋白质、RNA是否存在。如本文中所使用，检测或判定手段包含检测或判定低于所采用方法的侦检量的被分析物量。
IX.治疗或预防SNCA相关神经退化性疾病的方法
本公开进一步提供使用本公开的RNAi剂或含有本公开的RNAi剂的组成物，以减低或抑制细胞中SNCA表达的方法。该方法包括令细胞与本公开的dsRNA接触，并将该细胞维持一段足够的时间以获致SNCA基因的mRNA转录本的降解，从而抑制SNCA基因于细胞中的表达。基因的表达的降低可通过所属领域中已知的任意方法加以评估。例如，SNCA表达的减低可通过使用对于本领域技术人员是常规的方法，例如北方墨点法、qRT-PCR来侦检SNCA的mRNA表达量而加以判定；或通过使用对于本领域技术人员是常规的方法，如西方墨点法、免疫学技术及质谱方析来侦检SNCA蛋白量而加以判定。
于本公开的方法中，是可于体外或体内接触该细胞，意即，该细胞可位于个体体内。
适合使用本公开的方法进行治疗的细胞可为表达SNCA基因的任意细胞。适用于本公开方法的细胞可为哺乳动物细胞，如灵长类细胞(诸如人类细胞或非人灵长类细胞，例如猴细胞或黑猩猩细胞)、非灵长类动物细胞(诸如大鼠细胞或小鼠细胞。于一态样中，该细胞是人类细胞，如人类CNS细胞。于一态样中，该细胞是人类细胞，如人类肝脏细胞。于一态样中，该细胞是人类细胞，如人类CNS细胞及人类肝脏细胞。
于细胞中，SNCA表达被抑制至少约30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或约100％，意即，低于侦检量。于较佳态样中，SNCA表达被抑制至少50％。
本公开的体内方法可包括向个体施用含有RNAi剂的组成物，其中，该RNAi剂包含与待治疗哺乳动物SNCA基因的RNA转录本的至少一部分互补的核苷酸序列。当待治疗的生物体为哺乳动物如人类时，组成物可通过所属领域已知的任意手段给药，包括但不限于口服、腹膜内或肠胃外途径，包括颅内(例如，脑室内、脑实质内及鞘内)、静脉内、肌肉内、玻璃体内、皮下、穿皮、气道(气胶)、鼻腔、直肠和局部(包括颊及舌下)给药。于某些态样中，组成物是通过静脉输注或注射给药。于某些态样中，组成物是通过皮下注射给药。于某些态样中，组成物是通过鞘内注射给药。
于一些态样中，该给药是通过长效型注射(depot injection)进行。长效型注射可于一长时间段内以持续一致的方式释放RNAi剂。因此，长效型注射可降低获得所欲的效果(例如，所欲的SNCA抑制、治疗或预防效果)所需的给药频率。长效型注射亦能提供更为一致的血清浓度。长效注射可包含皮下注射或肌肉内注射。于较佳态样中，长效注射是皮下注射。
于一些态样中，是经由泵给药。该泵可为外部泵或经外科植入的泵。于某些态样中，该泵是经皮下植入的渗透泵。于其他态样中，该泵是输液泵。输液泵可用于颅内、静脉内、皮下、动脉或硬膜外输液。在较佳态样中，该输液泵是皮下输液泵。于其他态样中，该泵是将该RNAi剂递送至CNS的经外科植入的泵。
可基于局部治疗或全身性治疗是否为所欲者，并根据待治疗的区域来选择给药方式。可选择给药的途径及部位以增强其靶向性。
一方面，本公开进一步提供抑制哺乳动物中SNCA基因的表达的方法。该方法包括向哺乳动物施用包含靶向哺乳动物细胞中SNCA基因的dsRNA的组成物，并于该哺乳动物体内维持足够时间以获得SNCA基因的mRNA转录本的降解，从而在该细胞中抑制SNCA基因的表达。基因的表达的降低可通过所属领域已知的任意手段如本文揭示的qRT-PCR加以评估。蛋白质产量的降低可通过所属领域已知的任意手段如本文揭示的ELISA加以评估。于一态样中，CNS活检样本或脑脊液(CSF)样本作为组织材料，以用于监测SNCA基因或蛋白质表达量(或其代替者)的降低。
本公开进一步提供治疗有此需要的个体的方法。本公开的治疗方法包括将本公开的RNAi剂给药至个体，例如在给予治疗有效量的靶向SNCA基因的RNAi剂或包含靶向SNCA基因的RNAi剂的医药组成物时，将能受益于SNCA表达的抑制的个体。
此外，本公开提供预防、治疗或抑制SNCA相关神经退化性疾病或病症进展的方法，例如突触核蛋白病，如PD、多系统萎缩、路易体痴呆(LBD)、纯自主神经功能衰竭(PAF)、皮克病、进行性核上性麻痹、拳击性痴呆、与17号染色体相关的帕金森综合征、Lytico-Bodig病、缠结性痴呆、嗜银颗粒病、神经节细胞胶质瘤、神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、亚急性硬化性全脑炎、铅中毒性脑病、结节性硬化症、Hallervorden-Spatz病、脂褐质沉积症、皮质基底节变性、额颞叶痴呆、额颞叶退化、阿尔茨海默病、亨廷顿病、唐氏综合征、精神病、精神分裂症及克罗伊茨费尔特-雅各布病。
该方法包括向该个体施用治疗有效量的任意RNAi剂，例如dsRNA剂，或本文提供的医药组成物，从而预防、治疗或抑制该个体中SNCA相关神经退化性疾病或病症的进展。
本公开的RNAi剂可作为「自由RNAi剂」施用。自由RNAi剂是于医药组成物不存在下施用。该裸RNAi剂可处于合适的缓冲溶液中。该缓冲溶液可包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐，或其任意的组合。于一态样中，该缓冲溶液是磷酸盐缓冲生理食盐水(phosphate buffered saline，PBS)。含有该RNAi剂的缓冲溶液的pH及渗透压可经调节，使其适合施用于个体。
或者，本公开的RNAi剂可作为医药组成物给药，例如，作为dsRNA脂质体制剂给药。
将能受益于SNCA基因的表达的减少或抑制的个体是患有SNCA相关神经退化病症的个体。
本公开进一步提供使用RNAi剂或其医药物组成物的方法，例如，用于治疗将能获益于SNCA表达的降低或抑制的个体，如患有SNCA相关神经退行性病症的个体，该方法与其他药物或其他治疗方法合并施用，例如，与已知药物或已知治疗方法如当前用于治疗此等病症者合并施用。例如，于某些态样中，靶向SNCA的RNAi剂与诸如可用于治疗本文别处所载或该领域已知的SNCA相关神经退化性病症的剂合并施用。举例而言，适用于治疗将能获益于SNCA表达减少的个体(如患有SNCA相关神经退化性病症的个体)的附加药剂及治疗可包含当前用于治疗SNCA症状的剂。该RNAi剂及附加治疗剂可同时施予或于同一组合中施予，例如鞘内给药，或附加治疗剂可作为独立组成物的一部分或于独立的时间或通过该领域已知或本文中揭示的另一方法施用。
示例性附加治疗剂及治疗包括多巴胺调节剂，尤其是如卡左双多巴(carbidopa-levodopa)、左旋多巴(levodopa)、恩他卡朋(entacopone)、托卡朋(tolcapone)、奥匹卡朋(opicapone)、普拉克索(pramipexole)、罗匹尼罗(ropiniro1e)、阿朴吗啡(apomorphine)、罗替戈汀(rotigotine)、司来吉兰(selegiline)、雷沙吉兰(rasagiline)、沙芬酰胺(safinamide)、阿曼他丁(amantadine)、伊曲茶碱(istradefylline)、三己芬迪(trihexyphenidyl)、苯扎托品(benztropine)、利凡斯的明(rivastigmine)，多奈哌齐(donepezil)、加兰他敏(galantamine)及美金刚(memantine)，以及物理、职业和言语治疗、包括心肺、阻力、柔软度、步态及平衡练习在内的锻炼计划，以及涉及将电极植入大脑目标区域的深部脑刺激(DBS)。
于一态样中，该方法包含施用本文中提出的组成物，使得靶标SNCA基因的表达下降，该下降至少持续一个月。于某些态样中，表达的下降持续至少2个月、3个月或6个月。
可选择地，可用于本文提出的方法及组成物的RNAi剂是特异性地靶向靶标SNCA基因的RNA(原代或经处理者)。使用RNAi剂抑制此等基因的表达的组成物及方法可如本文所揭示者制备及实施。
根据本公开的方法施用dsRNA可致使罹患SNCA相关神经退化性疾病的病患体内此等疾病或病症的严重性、征候、症状或标志物降低。在本文的语境中，「降低」是意指该量于统计上显著或临床上显著下降。该降低可为，举例而言，至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或约100％。
治疗或预防疾病的成效可通过下述评估的，诸如：量测疾病进展、疾病缓解、症状严重性、疼痛的减轻、生活品质、维持疗效所需的药物剂量、疾病标志物、或任何适用于待治疗的给定疾病或预防的靶向的其他可量测的参数。通过量测此类参数中任一者或参数的任意组合以监控治疗或预防的成效，完全处于熟悉该领域人士的能力范围内。举例而言，可通过诸如定期监控个体的认知、学习或记忆来评估SNCA相关神经退化性疾病的疗效。比较后期读数与初始读数，为医师提供治疗是否有效的指示。通过测量此类参数中任一者或参数的任意组合以监控治疗或预防的成效，完全处于熟悉该领域人士的能力范围内。与靶向SNCA的RNAi剂或其医药组成物的给药有关，「有效对抗」SNCA相关神经退化性疾病是表明，以临床上适宜的方式给药于统计上显著对至少一部分病患导致有益的效果，例如症状改善、治愈、疾病减轻、寿命延长、生活品质改善，或熟悉治疗SNCA相关神经退化性疾病及相关肇因的医师普遍认为具有积极意义的其他效果。
当疾病状态的一项或多项参数于统计学上显著改善，或预期会恶化或出现症状者未恶化或出现症状时，是证明其治疗或预防的成效。举例而言，可量测的疾病参数至少10％及可选择地至少20％、30％、40％、50％或更高的有利改变，可为有效治疗的指标。给定RNAi剂药物或该药物制剂的功效，亦可使用该领域已知的、用于给定疾病的实验动物模型来判断。使用实验动物模型时，当观察到标志物或症状于统计学上显著降低时，是证明治疗具有功效。
另选地，可通过如诊断领域的熟练人士基于临床上接受的疾病严重性分级标准所判定的疾病严重度的降低来量测该功效。任何导致如以合适的标准测得的疾病严重度减轻的正向改变，代表使用如本文所揭示的RNAi剂或RNAi制剂进行了妥善的治疗。
可对个体施予治疗量的dsRNA，诸如约0.01mg/kg至约200mg/kg。
RNAi剂可经由鞘内、玻璃体内注射或静脉输注于一段期间内定期给药。于某些态样中，于初始的治疗方案后，可降低该治疗的实施频次。该RNAi剂的给药可减低SNCA量，例如，于病患的细胞、组织、血液、CSF样本或其他腔室中的SNCA减低至少20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或至少约99％或更多。于较佳态样中，该RNAi剂的给药可将例如病患细胞、组织、血液、CSF样本或其他腔室中的SNCA量减低至少50％。
于投予全剂量的RNAi剂前，可向病患投予较小的剂量，诸如5％输液反应，并监控副作用诸如过敏反应。于另一实例中，可监控病患的非所欲的免疫刺激效应，如提高的细胞因子(例如，TNF-α或INF-α)量。
另选地，该RNAi剂可由皮下给药，即通过皮下注射给药。一次或多次注射可用来向个体递送所欲的如月剂量的RNAi剂。该注射可于一段时间内重复实施。该注射可定期重复实施。于某些态样中，于初始治疗方案后，可降低该治疗的实施频次。重复剂量方案可包括规律地投予治疗量的RNAi剂，诸如每月或延长至每个季度一次、每年两次、每年一次。于某些态样中，该RNAi剂是大约每个月施用一次至大约每个季度一次(亦即，约每三个月一次)。
除非另作定义，本文使用的所有科技术语含义是同于本发明本领域技术人员所一般理解者。尽管与本文所揭方法及材料类似或等效者，可用于实务中或测试本公开提出的RNAi剂及方法，但适宜方法及材料是揭示如下。本文所揭的所有出版物、专利申请、专利及其他参考文献通过引用而以其整体并入本文。如有矛盾之处，则以包括定义在内的本说明书为准。此外，材料、方法及实施例仅作为示例说明的用而非意在限制。
非正式序列表亦随本文递交，形成所递交的说明书的一部分。
[实施例]
实施例1：材料及方法
生物资讯学
一组靶向人类α突触核蛋白基因的siRNA(SNCA；人NCBI refseq ID NM_007308.3；NCBI GeneID：6622；SEQ ID NO：1)以及来自食蟹猴的毒理学物种SNCA(XM_005555422.2；SEQ ID NO：3)异种同源物，是使用自定义的R与Python脚本所设计。所有siRNA均设计为与人类SNCA转录本完美相配，以及与食蟹猴异种同源物完美或接近完美相配的一个子集。该人类SNCA NM_007308REFSEQ mRNA，版本3(SEQ ID NO：1)具有3312个碱基的长度。siRNA设计集的基本原理与方法如下。使用随机森林模型决定从位置10至末端的各潜在23mersiRNA的预测效果，该模型是源自对来自数千种相异siRNA设计的mRNA的减弱的直接测量，该等siRNA设计是针对繁杂的脊椎动物基因。对于siRNA的各股，是于暴力字串搜寻中使用自定义Python脚本以量测该siRNA与人类转录组中所有潜在比对间的误配数量与位置。对种子区域中的误配予以额外权重，此处定义为反义寡核苷酸位置2至9，以及siRNA裂解位点，此处定义为反义寡核苷酸位置10至11。对于种子误配、裂解位点与直到反义位置19的其他位置，误配相对权重为2.8、1.2、1。忽略首个位置的误配。通过对每个加权误配的值求和来计算各股的特异性得分。优先考虑在人和食蟹猴中的反义得分>＝2且预测效果>＝50％的减弱的siRNA。
体外筛选-荧光素酶检测
Cos-7细胞(ATCC，Manassas，VA)于37℃下、5％CO2环境中，于补充有10％FBS的DMEM(ATCC)中生长至接近汇合，然后经胰蛋白酶消化而从平板中释放。多剂量实验是于l0nM与0.1nM下进行。siRNA与psiCHECK2-SNCA(人NM_007308与小鼠NM_009221)质体转染是以含有3’非翻译区(UTR)的质体进行。通过于每孔中加入5μL siRNA双链体及5μL(5ng)psiCHECK2质体及每孔4.9μL Opti-MEM与0.1μL Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad CA.cat#13778-150)进行转染，接着在室温下培养15分钟。随后将混合物加入细胞中，并将细胞重新悬浮于35μL新鲜完全培养基中。经转染的细胞培养于37℃、5％CO2环境中。
siRNA与psiCHECK2质体经转染48小时后，量测Firefly(转染对照)及Renilla(与SNCA靶标序列融合)荧光素酶。首先，从细胞中去除培养基。随后通过向每孔中加入20μL荧光素酶试剂与20μL DMEM的混合物以量测Firefly荧光素酶活性。将混合物于室温下培养30分钟，随后于Spectramax(分子装置)上量测发光(500nm)以检测Firefly荧光素酶信号。Renilla荧光素酶活性的测量方法为向每孔中加入20μL室温Stop&缓冲液与0.1μLStop&受质混合物，并将培养板培养10-15分钟，随后再次量测发光以判定Renilla荧光素酶讯号。Stop&混合物可淬灭firefly荧光素酶讯号，并为Renilla荧光素酶反应提供持续发光。通过将每孔内的Renilla(SNCA)讯号标准化为Firefly(对照)讯号来判定siRNA活性。然后相对于以相同载体转染但未以siRNA处理、或以非靶向siRNA处理的细胞，评估其siRNA活性量。所有转染均以n＝4进行。
体外筛选-细胞培养与转染
通过将4.9μL Opti-MEM以每孔0.1μL RNAiMAX(Invitrogen，Carlsbad CA.cat13778-150)添加至每孔5μL siRNA双链体中，连同4份各siRNA双链体，将细胞转染至384孔板，在室温下培养15分钟。随后将40μL含有～5x103细胞的MEDIA添加至siRNA混合物中。细胞于RNA纯化前培养24小时。实验于10nM和0.1nM下进行。在具有EMEM(ATCC目录号30-2003)的人类肝癌Hep3B细胞(ATCC HB-8064)、具有EMEM培养基的小鼠神经母细胞瘤Neuro-2A细胞(ATCC CCL-131)以及人类神经母细胞瘤BF(2)-C、HeLa与B16F10细胞中进行转染实验。BF(2)-C细胞(ATCC CRL-2268)是于EMEM：F12培养基(Gibco目录号11765054)中生长。HeLa细胞与B16F10细胞是依据标准规范生长。
体外筛选-使用′ABI高容量cDNA反转录试剂盒合成cDNA(Applied Biosystems，Foster City,CA，Cat#4368813)
将含有1.2μL 10X的缓冲液、0.48μL 25X的dNTP、1.2μL 10x的随机引物、0.6μL的反转录酶、0.6μL RNase的抑制剂与每个反应7.92μL H20的12μL主混合物添加至上述分离的与珠结合的RNA。将板密封、混合并于电磁振荡器上室温培养10分钟，随后于37℃下培养2小时。复以上述方案进行分支DNA测定。
体外筛检-实时PCR
将2μL eDNA添加至包含0.5μL人或小鼠GAPDH TaqMan探针(ThermoFisher cat4352934E或4351309)、0.5μL适当SNCA探针(Thermo Fisher Taqman人：Hs00268077，小鼠：Mm00485946)于384孔板(Roche cat 04887301001)中，每孔含有5μL Lightcycler 480个探针预混液(Roche Cat#04887301001)。实时PCR是于LightCycler480实时PCR系统(Roche)中进行。各双链体均以N＝4进行测试，并将资料标准化为以非靶向对照siRNA转染的细胞。为计算相对倍数变化，使用ΔΔCt方法分析实时资料，并将其标准化为以非靶向对照siRNA转染的细胞所进行的测定。
实施例2：减弱内源性SNCA以及经由双荧光素酶(Dual-Luciferase)psiCHECK2载体表达的SNCA
生成一系列SNCA iRNA剂，其经修饰(基于表1中的关键)与未修饰序列系列于表2与表3中。使用表2及3中所示的双链体，BE2-(C)、HeLa和B16F10细胞是用于筛选内源性SNCA转录本的减弱。使用表2与3中的双链体，表达双荧光素酶psiCHECK2载体的Cos7细胞是用于筛选外源性SNCA转录本的抑制。将双股siRNA以10nM与0.1nM的浓度添加至细胞中。在BE(2)-细胞中观察到的SNCA转录量参见表4、5与9。在HeLa与B16F10细胞中观察到的SNCA转录量如表6所示。藉双荧光素酶系统观察到的SNCA量参见表7。鉴定许多双链体并显现稳健的SNCA抑制。
实施例3：SNCA RNAi剂的体内评估
通过经AAV转基因表达人SNCA的小鼠中筛选人SNCA的减弱，评估选定的SNCA靶向RNAi剂的体内功效与先导化合物鉴定。用于该等研究的选定RNAi剂包括：靶向SNCA 3’UTR的双链体：AD-464778、AD-464782、AD-464694、AD-464634、AD-464779及靶向SNCA编码序列的双链体：AD-464590、AD-464313、AD-464314、AD-464585、AD-464586、AD-464592及AD-464229。所有上述双链体均具有L96GalNAc配体(表2)的化学修饰序列，如表1所示。对应的未修饰序列如表3所示。
为在小鼠中鉴定RNAi的体内功效，首先于小鼠中转导人SNCA。编码完整的智人SNCA转录本与3’UTR(参考Hs00240906_m1)的构建体被包封于AAV8衣壳内，并于8周龄的C57BL/6雌小鼠中以2.0E+10基因组的拷贝/剂量转导。于AAV给药后7天，以3mg/kg皮下注射上述双链体或1x PBS。投予双链体后1周，收获小鼠肝脏并以Taq Man测定Hs00240906_m1以评估SNCA表达。将资料标准化为经PBS处理的样本。使用常规技术进行cDNA合成与qRT-PCR。结果示于图1及表8。大多数测试的RNAi剂于体内表现出SNCA抑制。
进一步评估了特定靶向huSNCA 3’-UTR 双链体AD-464634与特定靶向huSNCA编码序列双链体AD-464314的体内功效(参见图2以了解AD-464634与AD-464314序列及修饰模式)，剂量为3mg/kg与10mg/kg，评估时间点为第7日与第14日。在以靶向huSNCA 3’-UTR AD-464634双链体与靶向huSNCA编码序列AD-464314双链体治疗的小鼠中，于第7天和第14天的时间点均观察到人类SNCA的稳健减弱(图3)。对两种受测双链体都观察到剂量效应，特别是在第14日时间点。即便于第14日时间点亦观察到强烈的huSNCA的减弱，两种双链体均确定为适合进一步的体内先驱开发研究。
实时PCR亦证实了AAV转导于产生在肝脏中表达人SNCA的小鼠中的功效。在huSNCAAAV转导小鼠的肝组织中特别评估了人SNCA表达量(分别以2e10或2e11病毒颗粒转导的huSNCA AAV)，于转导后第7、14与21日量测huSNCA量。在所有时间点均观察到小鼠肝脏中具有可侦测到的人SNCA量，并且以剂量效应方式与所投予的病毒颗粒量相关联(较高量的AAV转导产生较低的循环阈值(cT)；图4)。
在大鼠SNCA AAV转导小鼠中，复于体内评估了选定双链体的小鼠/大鼠交叉反应性。亦于大鼠SNCA转导小鼠中检查了小鼠中的的交叉反应性。编码完整的褐家鼠(Rattusnorvegicu)SNCA转录本与3’UTR(参见NM_019169.2)的构建体是包装于AAV8衣壳内，并于8周龄的C57BL/6雌小鼠中以2.0E+10基因组的拷贝/剂量转导。于投予AAV后第14日，以3mg/kg剂量皮下注射双链体(AD-476344、AD-475666、AD-476306、AD-476061、AD-464814、AD-475728和AD-4644229)或1xPBS至小鼠。投予双链体后14日，收获肝脏并以Taq ManRn00569821_m1测定评估SNCA的表达。将资料标准化为PBS处理的样本。使用常规技术进行cDNA合成与qRT-PCR。AD-476061、AD-464814与AD-475728以及可能AD-464229表现出显著的大鼠SNCA的减弱(图5)。
实施例4：在SNCA转录本中的热点游走识别出许多具稳健SNCA的减弱特性的其它RNAi剂
当在Be(2)C细胞环境中以0.1nM、1.0nM和10nM给药时，合成拥有表12中所示序列及修饰模式的额外经修饰的靶向SNCA的RNAi双链体及评估人类SNCA的减弱。得到人类SNCA的减弱结果，且siRNA及相关的减弱结果是依照1nM拟合值排序(表14)。由此，识别出多种能够抑制人类SNCA的其他靶向SNCA双链体，并且在热点游走中所测得的SNCA减弱量，与用于对观察的双链体排序的估算1nM拟合值之间具有强相关性(图6)。
非正式序列表的「mRNA」序列与本文中列出的某些「mRNA靶标」序列可记为引用胸腺嘧啶(T)残基而非尿嘧啶(U)残基。对所属领域具通常知识的技术人员显而易见的是，此类记载「T」残基而非「U」残基的序列可源自NCBI登录记录，记录将直接对应于mRNA序列的DNA序列(不是RNA序列)列为「mRNA」序列。此种直接对应于mRNA序列的DNA序列在技术上构成了DNA序列，其是选定的mRNA的cDNA(互补DNA)序列的互补序列。因此，虽然mRNA靶标序列实际上确实包括尿嘧啶(U)而非胸腺嘧啶(T)，但源自NCBI记录的「mRNA」序列包括胸腺嘧啶(T)残基而非尿嘧啶(U)残基。
表1.用于表示核酸序列的核苷酸单体的缩写。
应当理解，当此等单体存在于寡核苷酸中时，其是通过5’-3’-磷酸二酯键相互连结。
表9.给药至小鼠的经修饰双链体序列
表10.第7日与第14日小鼠体内SNCA的减弱结果，双链体剂量为3mg/kg及10mg/kg。(见图3)
非正式序列表
等效物
本领域技术人员或能够仅使用常规实验来探明本文所揭示的态样及方法的多种等效物。此类等效物拟涵盖于权利要求书的范畴内。

Claims (98)

1.一种双股核糖核酸(dsRNA)剂，其是用于抑制SNCA的表达，其中，所述dsRNA剂包含构成双股区域的正义股及反义股，并且其中，所述正义股包含：包含与SEQ ID NO:1的核苷酸序列的一部分具有0或1个误配的至少15个接续核苷酸的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:1的核苷酸序列的一部分具有至少90％核苷酸序列同一性的核苷酸序列；以及，所述反义股包含与SEQ ID NO:2的核苷酸序列对应的部分具有0或1个误配的至少15个接续核苷酸的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:2的核苷酸序列的一部分具有至少90％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。
2.一种双股核糖核酸(dsRNA)剂，其是用于抑制SNCA的表达，其中，所述RNAi剂包含正义股及反义股，其中，所述反义股包含互补区域，所述互补区域包含与选自表2、3、12及13的反义序列所组成的群组中的反义序列相异不超过3个核苷酸的至少15个接续核苷酸。
3.根据权利要求1或2所述的dsRNA剂，其中，所述正义股或所述反义股接合至一个或多个亲脂性部分。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的dsRNA剂，其中，所述正义股包含与SEQ ID NO:1的核苷酸序列一部分具有0或1个误配的至少17个接续核苷酸的核苷酸序列，以及所述反义股包含与SEQ ID NO:2的核苷酸序列对应的部分具有0或1个误配的至少17个接续核苷酸的核苷酸序列，从而使所述正义股互补于所述反义股中的至少17个接续核苷酸。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的dsRNA剂，其中，所述正义股包含与SEQ ID NO:1的核苷酸序列的一部分具有0或1个误配的至少19个接续核苷酸的核苷酸序列，以及所述反义股包含与SEQ ID NO:2的核苷酸序列对应的部分具有0或1个误配的至少19个接续核苷酸的核苷酸序列，从而使所述正义股互补于所述反义股中的至少19个接续核苷酸。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的dsRNA剂，其中，所述正义股包含：包含与SEQ IDNO:1的核苷酸序列的一部分具有0或1个误配的至少21个接续核苷酸的核苷酸序列，以及所述反义股包含与SEQ ID NO:2的核苷酸序列对应的部分具有0或1个误配的至少21个接续核苷酸的核苷酸序列，从而使所述正义股互补于所述反义股的至少21个接续核苷酸。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的dsRNA剂，其中，所述正义股或所述反义股是选自由表2、3、12及13中任一者中的任意正义股及反义股所组成的群组。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的dsRNA剂，其中，所述正义股或所述反义股均接合至一个或多个亲脂性部分。
9.根据权利要求2所述的dsRNA剂，其中，所述亲脂性部分是接合至所述dsRNA剂的所述双股区域中的一个或多个位置。
10.根据权利要求8或9所述的dsRNA剂，其中，所述亲脂性部分是经由连结子或载剂接合。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的dsRNA剂，其中，通过logKow量测，所述亲脂性部分的亲脂性是超过0。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的dsRNA剂，其中，通过所述双股RNAi剂的血浆蛋白结合检定中的未结合片段量测，所述双股RNAi剂的疏水性是超过0.2。
13.根据权利要求12所述的dsRNA剂，其中，所述血浆蛋白结合检定是使用人血清白蛋白的电泳迁移率变化测定。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的dsRNA剂，其中，所述dsRNA剂包括至少一个经修饰的核苷酸。
15.根据权利要求14所述的dsRNA剂，其中，不超过5个所述正义股的核苷酸及不超过5个所述反义股的核苷酸是未经修饰的核苷酸。
16.根据权利要求14所述的dsRNA剂，其中，所述正义股的所有所述核苷酸及所述反义股的所有核苷酸均是包含修饰。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的dsRNA剂，其中，所述经修饰的核苷酸中至少一者是选自由下列组成的群组：去氧核苷酸、3'-端去氧-胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基的修饰核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸、2'-去氧修饰的核苷酸、锁定的核苷酸、未锁定的核苷酸、构形受限的核苷酸、约束的乙基核苷酸、无碱基核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、2'-C-烷基修饰的核苷酸、2'-羟基修饰的核苷酸、2'-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸、啉基核苷酸、胺基磷酸酯、包含非天然碱基的核苷酸、四氢吡喃修饰的核苷酸、1,5-无水己糖醇修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、包含5'-硫代磷酸酯基团的核苷酸、包含5'-甲基膦酸酯基团的核苷酸、包含5'-磷酸酯或5'-磷酸酯模拟物的核苷酸、包含磷酸乙烯酯的核苷酸、包含腺苷-二醇核酸(GNA)的核苷酸、包含胸苷-二醇核酸(GNA)S异构物的核苷酸、包含2-羟甲基-四氢呋喃-5-磷酸酯的核苷酸、包含2'-去氧胸苷-3'-磷酸酯的核苷酸、包含2'-去氧鸟苷-3'-磷酸酯的核苷酸，以及链结至胆固醇基衍生物及十二烷酸双癸酰胺基团的末端核苷酸，及其组合。
18.根据权利要求17所述的dsRNA剂，其中，所述经修饰的核苷酸是选自由下列所组成的群组：2'-去氧-2'-氟修饰的核苷酸、2'-去氧-修饰的核苷酸、3'端去氧-胸腺嘧啶核苷酸(dT)、锁定的核苷酸、无碱基的核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、啉基核苷酸、胺基磷酸酯，以及包含非天然碱基的核苷酸。
19.根据权利要求17所述的dsRNA剂，其中，所述经修饰的核苷酸是包含3'端去氧-胸腺嘧啶核苷酸(dT)的短序列。
20.根据权利要求17所述的dsRNA剂，其中，所述核苷酸上的修饰是2’-O-甲基修饰、GNA修饰及2’-氟修饰。
21.根据权利要求17所述的dsRNA剂，还包含至少一个硫代磷酸酯类核苷酸间连结。
22.根据权利要求21所述的dsRNA剂，其中，所述dsRNA剂是包含6至8个硫代磷酸酯类核苷酸间连结。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的dsRNA剂，其中，各股长度不超过30个核苷酸。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的dsRNA剂，其中，至少一股包含至少1个核苷酸的3'突出。
25.根据权利要求1至23中任一项所述的dsRNA剂，其中，至少一股包含至少2个核苷酸的3'突出。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的dsRNA剂，其中，所述双股区域的长度是15至30个核苷酸对。
27.根据权利要求26所述的dsRNA剂，其中，所述双股区域的长度是17至23个核苷酸对。
28.根据权利要求26所述的dsRNA剂，其中，所述双股区域的长度是17至25个核苷酸对。
29.根据权利要求26所述的dsRNA剂，其中，所述双股区域的长度是23至27个核苷酸对。
30.根据权利要求26所述的dsRNA剂，其中，所述双股区域的长度是19至21个核苷酸对。
31.根据权利要求26所述的dsRNA剂，其中，所述双股区域的长度是21至23个核苷酸对。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的dsRNA剂，其中，各股是具有19至30个核苷酸。
33.根据权利要求1至31中任一项所述的dsRNA剂，其中，各股是具有19至23个核苷酸。
34.根据权利要求1至31中任一项所述的dsRNA剂，其中，各股是具有21至23个核苷酸。
35.根据权利要求8至34中任一项所述的dsRNA剂，其中，所述一个或多个亲脂性部分是接合至至少一股上的一个或多个内部位置。
36.根据权利要求35所述的dsRNA剂，其中，所述一个或多个亲脂性部分是经由连结子或载剂接合至至少一股上的一个或多个内部位置。
37.根据权利要求36所述的dsRNA剂，其中，所述内部位置包括除来自至少一股各端的末两个位置以外的所有位置。
38.根据权利要求36所述的dsRNA剂，其中，所述内部位置包括除来自至少一股各端的末三个位置以外的所有位置。
39.根据权利要求36至38所述的dsRNA剂，其中，所述内部位置不包括所述正义股的裂解位点区域。
40.根据权利要求39所述的dsRNA剂，其中，所述内部位置包括除自所述正义股5'端算起的位置9至12处以外的所有位置。
41.根据权利要求39所述的dsRNA剂，其中，所述内部位置是包括除自所述正义股3'端算起的位置11至13处以外的所有位置。
42.根据权利要求36至38所述的dsRNA剂，其中，所述内部位置不包括所述反义股的裂解位点区域。
43.根据权利要求42所述的dsRNA剂，其中，所述内部位置是包括除自所述反义股5'算起的位置12至14处以外的所有位置。
44.根据权利要求36至38所述的dsRNA剂，其中，所述内部位置包括除自所述正义股3'端算起的位置11至13处，以及所述反义股5'端算起的位置12至14处以外的所有位置。
45.根据权利要求1至44中任一项所述的dsRNA剂，其中，所述一或多个亲脂性部分是接合至一或多个选自下列所组成的群组的内部位置：自各股的5'端算起，所述正义股上的位置4至8处及13至18处，以及所述反义股上的位置6至10处及15至18处。
46.根据权利要求45所述的dsRNA剂，其中，所述一或多个亲脂性部分是接合至一或多个选自下列所组成的组的内部位置：自各股的5'端算起，所述正义股上的位置5、6、7、15及17处，以及所述反义股上的位置15及17处。
47.根据权利要求9所述的dsRNA剂，其中，所述双股区域中的所述位置不包括所述正义股的裂解位点区域。
48.根据权利要求1至47中任一项所述的dsRNA剂，其中，所述正义股为21个核苷酸的长度，所述反义股为23个核苷酸的长度，而所述亲脂性部分是接合至所述正义股的位置21、位置20、位置15、位置1、位置7、位置6或位置2处，或所述反义股的位置16处。
49.根据权利要求48所述的dsRNA剂，其中，所述亲脂性部分是接合至所述正义股的位置21、位置20、位置15、位置1或位置7处。
50.根据权利要求48所述的dsRNA剂，其中，所述亲脂性部分是接合所述正义股的位置21、位置20或位置15处。
51.根据权利要求48所述的dsRNA剂，其中，所述亲脂性部分是接合至所述正义股的位置20或位置15处。
52.根据权利要求48所述的dsRNA剂，其中，所述亲脂性部分是接合至所述反义股的位置16处。
53.根据权利要求1至52中任一项所述的dsRNA剂，其中，所述亲脂性部分是脂族、脂环族或多脂环族化合物。
54.根据权利要求53所述的dsRNA剂，其中，所述亲脂性部分是选自由下列所组成的群组：脂质、胆固醇、视黄酸、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾固酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶氧基己醇、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基基团、棕榈酸、肉荳蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆酸、二甲氧基三苯甲基或啡。
55.根据权利要求54所述的dsRNA剂，其中，所述亲脂性部分含有饱和或不饱和的C4-C30烃链以及任选的官能基，其选自由羟基、胺、羧酸、磺酸酯、磷酸酯、硫醇、迭氮化物及炔组成的群组。
56.根据权利要求55所述的dsRNA剂，其中，所述亲脂性部分含有饱和或不饱和的C6-C18烃链。
57.根据权利要求55所述的dsRNA剂，其中，所述亲脂性部分含有饱和或不饱和的C16烃链。
58.根据权利要求57所述的dsRNA剂，其中，所述饱和或不饱和的C16烃链是接合至自所述股5'端算起的位置6处。
59.根据权利要求1至56中任一项所述的dsRNA剂，其中，所述亲脂性部分是经由载剂接合，所述载剂替换所述内部位置或所述双股区域中的一个或多个核苷酸。
60.根据权利要求59所述的dsRNA剂，其中，所述载剂是选自由下列所组成的群组的环状基团：吡咯啶基、吡唑啉基、吡唑啶基、咪唑啉基、咪唑啶基、哌啶基、哌基、[1,3]二氧戊环基、唑啶基、异唑啶基、啉基、噻唑啶基、异噻唑啶基、喹啉基、嗒酮基、四氢呋喃基及十氢萘基；或是基于丝胺酸醇骨干或二乙醇胺骨干的非环状部分。
61.根据权利要求1至56中任一项所述的dsRNA剂，其中，所述亲脂性部分是经由连结子接合至所述双股iRNA剂，所述连结子含有醚、硫醚、脲、碳酸酯、胺、酰胺、顺丁烯二酰亚胺-硫醚、二硫化物、磷酸二酯、磺酰胺连结、键击反应产物或胺基甲酸酯。
62.根据权利要求1至61中任一项所述的双股iRNA剂，其中，所述亲脂性部分是接合至核碱基、糖部分或核苷间连结。
63.根据权利要求1至62中任一项所述的dsRNA剂，其中，所述亲脂性部分或靶向配体是经由选自由下列生物可裂解连结子所组成的群组接合：DNA、RNA、二硫化物、酰胺、半乳糖胺、葡萄糖胺、葡萄糖、半乳糖、甘露糖的官能化单醣或寡醣，及其组合。
64.根据权利要求1至63中任一项所述的dsRNA剂，其中，所述正义股的3'端是经由具有胺的环状基团的端帽保护，所述环状基团是选自由下列组成的群组：吡咯啶基、吡唑啉基、吡唑啶基、咪唑啉基、咪唑啶基、哌啶基、哌基、[1,3]二氧戊环基、唑啶基、异唑啶基、啉基、噻唑啶基、异噻唑啶基、喹啉基、嗒酮基、四氢呋喃基及十氢萘基。
65.根据权利要求1至64中任一项所述的dsRNA剂，还包含靶向肝脏组织的靶向配体。
66.根据权利要求65所述的dsRNA剂，其中，所述靶向配体是GalNAc接合物。
67.根据权利要求1至66任一项所述的dsRNA剂，还包含：
发生于反义股3'端第一个核苷酸间连结处的末端手性修饰，且具有Sp组态的连结磷原子，
发生于反义股5'端第一个核苷酸间连结处的末端手性修饰，且具有Rp组态的连结磷原子，或
发生于正义股5'端第一个核苷酸间连结处的末端手性修饰，且具有Rp组态或Sp组态的连结磷原子。
68.根据权利要求1至66任一项所述的dsRNA剂，还包含：
发生于反义股3'端第一及第二个核苷酸间连结处的末端手性修饰，且具有Sp组态的连结磷原子，
发生于反义股5'端第一个核苷酸间连结处的末端手性修饰，且具有Rp组态的连结磷原子，或
发生于正义股5'端第一个核苷酸间连结处的末端手性修饰，且具有Rp或Sp组态的连结磷原子。
69.根据权利要求1至66任一项所述的dsRNA剂，还包含：
发生于反义股3'端第一、第二及第三个核苷酸间连结处的末端手性修饰，且具有Sp组态的连结磷原子，
发生于反义股5'端第一个核苷酸间连结处的末端手性修饰，且具有Rp组态的连结磷原子，或
发生于正义股5'端第一个核苷酸间连结处的末端手性修饰，且具有Rp或Sp组态的连结磷原子。
70.根据权利要求1至66任一项所述的dsRNA剂，还包含：
发生于反义股3'端第一及第二个核苷酸间连结处的末端手性修饰，且具有Sp组态的连结磷原子，
发生于反义股3'端第三个核苷酸间连结处的末端手性修饰，且具有Rp组态的连结磷原子，
发生于反义股5'端第一个核苷酸间连结处的末端手性修饰，且具有Rp组态的连结磷原子，或
发生于正义股5'端第一个核苷酸间连结处的末端手性修饰，且具有Rp或Sp组态的连结磷原子。
71.根据权利要求1至66任一项所述的dsRNA剂，还包含：
发生于反义股3'端第一及第二个核苷酸间连结处的末端手性修饰，且具有Sp组态的连结磷原子，
发生于反义股5'端第一及第二个核苷酸间连结处的末端手性修饰，且具有Rp组态的连结磷原子，或
发生于正义股5'端第一个核苷酸间连结处的末端手性修饰，且具有Rp或Sp组态的连结磷原子。
72.根据权利要求1至71任一项所述的dsRNA剂，还包含位于所述反义股5'端处的磷酸酯或磷酸酯模拟物。
73.根据权利要求72所述的dsRNA剂，其中，所述磷酸酯模拟物是5’-乙烯基磷酸酯(VP)。
74.根据权利要求1至71任一项所述的dsRNA剂，其中，所述双链体的所述反义股5′端位置1处的碱基对是A:U碱基对。
75.根据权利要求1至71任一项所述的dsRNA剂，其中，所述正义股具有总计21个核苷酸，并且，所述反义股具有总计23个核苷酸。
76.一种细胞，其是含有根据权利要求1至75任一项所述的dsRNA剂。
77.一种用于抑制SNCA基因编码的表现的药物组成物，其包含根据权利要求1至75任一项所述的dsRNA剂。
78.一种医药组成物，其是包含根据权利要求1至75任一项所述的dsRNA剂及脂质体制剂。
79.一种抑制细胞中SNCA基因表达的方法，所述方法包括：
(a)令所述细胞与根据权利要求1至75任一项所述的dsRNA剂或根据权利要求77或78所述的医药组成物接触；以及
(b)将步骤(a)中产生的细胞维持足以令SNCA基因的mRNA转录物降解的时间，从而抑制所述SNCA基因在细胞中的表达。
80.根据权利要求79所述的方法，其中，所述细胞是位于个体体内。
81.根据权利要求80所述的方法，其中，所述个体是人。
82.根据权利要求79至81任一项所述的方法，其中，SNCA的表达是被抑制至少50％。
83.根据权利要求81所述的方法，其中，所述个体符合SNCA相关疾病的至少一项诊断标准。
84.根据权利要求81所述的方法，其中，所述个体被诊断有SNCA相关疾病。
85.根据权利要求84所述的方法，其中，所述SNCA相关疾病是突触核蛋白病，且可选择地选自由下列所组成的群组：PD、多系统萎缩、路易体痴呆(LBD)、纯自主神经功能衰竭(PAF)、皮克病、进行性核上麻痹、拳击性痴呆、与17号染色体相关的帕金森综合征、Lytico-Bodig病、缠结性痴呆、嗜银颗粒病、神经节细胞胶质瘤、神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、亚急性硬化性全脑炎、铅中毒性脑病、结节性硬化症、Hallervorden-Spatz病、脂褐质沉积症、皮质基底节变性、额颞叶痴呆、额颞叶退化、阿尔茨海默病、亨廷顿病、唐氏综合征、精神病、精神分裂症及克罗伊茨费尔特-雅各布病。
86.一种治疗被诊断有SNCA相关神经退化性疾病个体的方法，所述方法包括向所述个体投予治疗有效量的根据权利要求1至75任一项所述的dsRNA剂、或根据权利要求77或78所述的医药组成物，从而治疗所述个体。
87.根据权利要求86所述的方法，其中，所述治疗包括改善所述疾病的至少一种病征或症状。
88.根据权利要求86所述的方法，其中，所述治疗包括预防所述疾病的进展。
89.根据权利要求86所述的方法，其中，所述SNCA相关疾病是具有选自由以下一种或多种症状组成的群组的特征：震颤、运动缓慢(运动迟缓)、肌肉僵硬、姿势及平衡受损、自发运动丧失、言语改变、书写改变、视觉、听觉、嗅觉或触觉幻觉、身体功能(自主神经系统)调节不良如头晕、跌倒和排便问题、认知问题如意识模糊、注意力不集中、视觉空间问题及记忆力减退、睡眠困难如快速眼动(REM)睡眠行为障碍(其中睡眠时肢体动作表达出梦境)、注意力波动包括嗜睡、长时间发呆、白天长时间小睡或言语混乱、忧郁及冷漠、姿态型低血压(当一个人起立时血压突然下降，导致其感到头晕目眩，需要坐下、蹲下或躺下以防止昏厥)、笨拙或不协调、膀胱控制问题、手或四肢挛缩(关节周围肌肉或肌腱慢性缩短，导致关节无法自由运动)、比萨综合征(身体似乎向一侧倾斜的异常姿势)、颈项前屈(颈部向前弯曲，头部下垂)以及不自主及无法控制的叹息或喘气。
90.根据权利要求86所述的方法，其中，所述SNCA相关神经退化性疾病是选自由下列所组成的群组：突触核蛋白病例如PD、多系统萎缩、路易体痴呆(LBD)、纯自主神经功能衰竭(PAF)、皮克病、进行性核上麻痹、拳击性痴呆、与17号染色体相关的帕金森综合征、Lytico-Bodig病、缠结性痴呆、嗜银颗粒病、神经节细胞胶质瘤、神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、亚急性硬化性全脑炎、铅中毒性脑病、结节性硬化症、Hallervorden-Spatz病、脂褐质沉积症、皮质基底节变性、额颞叶痴呆、额颞叶退化、阿尔茨海默病、亨廷顿病、唐氏综合征、精神病、精神分裂症及克罗伊茨费尔特-雅各布病。
91.一种在符合至少一项SNCA相关神经退化性疾病诊断标准的个体中预防SNCA相关神经退化性疾病发生的方法，所述方法是包括向所述个体投予治疗有效量的根据权利要求1至75任一项所述的dsRNA剂或根据权利要求77或78所述的医药组成物，从而在符合至少一项SNCA相关神经退化性疾病诊断标准的所述个体中预防SNCA相关神经退化性疾病的发生。
92.根据权利要求86至91中任一项所述的方法，其中，所述个体是人。
93.根据权利要求91所述的方法，其中，所述个体被诊断有SNCA相关疾病。
94.根据权利要求93所述的方法，其中，所述SNCA相关疾病是选自由下列突触核蛋白病所组成的群组：例如帕金森病、多系统萎缩、路易体痴呆(LBD)、纯自主神经功能衰竭(PAF)、皮克病、进行性核上性麻痹、拳击性痴呆、与17号染色体相关的帕金森综合征、Lytico-Bodig病、缠结性痴呆、嗜银颗粒病、神经节细胞胶质瘤、神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、亚急性硬化性全脑炎、铅中毒性脑病、结节性硬化症、Hallervorden-Spatz病、脂褐质沉积症、皮质基底节变性、额颞叶痴呆、额颞叶退化、阿尔茨海默病、亨廷顿病、唐氏综合征、精神病、精神分裂症及克罗伊茨费尔特-雅各布病。
95.根据权利要求80至94中任一项所述的方法，其中，所述dsRNA剂是以约0.01mg/kg至约50mg/kg的剂量投予至所述个体。
96.根据权利要求80至95中任一项所述的方法，其中，所述dsRNA剂是以鞘内方式投予至所述个体。
97.根据权利要求80至96中任一项所述的方法，还包括向所述个体投予适于治疗或预防SNCA相关疾病或异常的额外药剂或疗法。
98.一种经修饰的双股核糖核酸(RNAi)剂，用于抑制表2、9或12中所列SNCA基因的表达，其中，各所述正义股的3'端是可选择地通过以下两种方式修饰：(i)去除所述3'端L96配体及(ii)以硫代磷酸酯核苷酸间连结替换所述三个3'端核苷酸间的所述两个磷酸二酯核苷酸间连结。
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