KR20050053607A - 단백질 오조립 및 응집을 나타내는 질병을 치료하기 위한조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

단백질 조립 질환의 특징인 단백질 응집을 파괴할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물, 조성물, 및 제약 조성물이 상기 올리고뉴클레오티드를 동정하기 위한 시험관내 및 생체내 방법, 및 상기 조성물을 투여하여 상기 질환을 치료하기 위한 방법으로서 기술된다.

Description

단백질 오조립 및 응집을 나타내는 질병을 치료하기 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF DISEASES EXHIBITING PROTEIN MISASSEMBLY AND AGGREGATION}

관련 출원의 교차-참조

본 출원은 미국 가출원 제60/402,198호(2002. 8. 7. 출원)의 이익을 청구하고 있으며, 상기 출원의 개시내용은 그 전체가 본원에 참조문헌으로 삽입되었다.

기술분야

본 발명은 세포 생물학 분야에 속하는 것으로, 병리학적 단백질 응집체를 파괴할 수 있는 화합물, 조성물 및 제약 조성물 및 이같은 화합물, 조성물 및 제약 조성물을 확인하기 위한 방법 및 단백질 오조립 및 응집의 특성을 나타내는 질환을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.

통상적으로 가용성인 단백질의 오조립 및 응집이 넓은 범위의 질환의 원인이 되는 것으로 보인다. 이들은 유전적 신경퇴화 질환, 예를 들어, 헌팅턴병("HD"), 알츠하이머병, 낭포성 섬유증, 근위축성 측삭 경화증 및 파킨슨병; 유전적 혈액 질환; 감염성 프리온 질환, 예를 들어, 양 및 염소의 스크레이피, 소의 해면상뇌병증 및 쿠루병, 크로이츠펠트-야콥 질환(CJD), 게르스트만-스트로이슬러-샤인케르 질환 및 치명적 가족성 불면증을 포함한다.

헌팅턴병은 대부분의 경우 우성 형질로 유전되고, CAG 트리뉴클레오티드 서열이 확대되어서, 비정상적으로 긴 폴리글루타민 트랙(tract)을 가진 단백질의 번역을 초래하는 척수연수 근위축증, 척수소뇌성 실조증 1형, 2형, 3형, 6형 및 7형 및 담창구시상하부 위축증을 포함하는 신경변성 질환의 패밀리에 속한다. 문헌[Carmichael et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 97:9701-9705(2000)] 참조. 이들 질환이 상이한 위치에서 신경변성을 일으키지만, 이들은 모두 동일한 근본적인 병리학적 원인, 즉, 공격받기 쉬운 신경 세포 내의 세포내 단백질 응집의 형성 및 그로 이한 이들 신경 세포의 기능 상실을 공유한다.

헌팅턴병의 경우, 단백질 응집은 질환과 관련된 유전자에 의해 코딩되는 단백질인 "헌팅틴"의 유비퀴틴화된 N-말단 단편으로 구성된다. 문헌[DiFiglia et al., Science, 277:1990-93(1997)]. 이들 단편은 질환을 일으키는 형태의 단백질과 관련된 폴리글루타민 확대 영역을 포함한다. 포유동물 세포 모델 및 세포사에서의 이들 응집체의 형성은 박테리아 샤페론, GroEL 및 효모 열 쇼크 단백질 HSP104가 존재하는 경우 감소되는 것으로 밝혀져서, 단백질의 응집과 질환 병리학 사이에 뜻밖의 연결이 있음을 시사한다. 문헌[Carmichael et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 97:9701-9705 (2000)] 참조.

세포 내의 단백질 응집은 잠재적으로 세포내에서 독성 응집체를 형성할 수 있는 잘못 폴딩되고, 조립되지 않았거나 손상받은 단백질의 분해를 담당하는 유비퀴틴-프로테아좀 시스템의 기능을 직접적으로 손상시키는 것으로 밝혀졌다. 문헌[Bence et al., Science, 292:1552-55(2001)] 참조. 이같은 손상은 증가된 수준의 응집된 단백질이 이들 단백질을 분해하는 것을 담당하는 바로 그 시스템을 저해함으로써 포지티브 피드백 기작을 생성할 수 있고, 다수의 신경변성 질환에서 특징적인 급격한 세포 기능의 감소를 초래할 수 있다. 이러한 관점과 일치하여, 프로테아좀 활성의 직접적인 저해는 응집소기관(aggresome)-유사 봉입체(inclusion bodies)에서의 돌연변이 헌팅틴 단편의 축적을 초래한다. 문헌[Waelter et al., Mol. Biol. Cell, 12:1393-1407 (2001)] 참조.

알츠하이머병은 단백질 응집이 질환의 병리학에 최소한 부분적으로 원인이 되는 것으로 보이는 다른 질환이다. 알츠하이머병 환자의 뇌 조직으로부터 단리된 아밀로이드는 주로 "Aβ"(β 이차 구조의 아밀로이드(amyloid) 플라크)로 나타낸 패밀리의 단백질로 구성된다. 문헌[Koo et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 96:9989-90(1999)] 참조. 아밀로이드 플라크(Aβ₄₂)의 미량 성분은 매우 안정하고 규칙적인 원섬유를 형성할 수 있는 서열을 포함한다. 이 성분은 "핵제(nucleating)" 원섬유 형성을 초래할 수 있다. Aβ₄₂ 수준이 대부분 통상의 산발성 형태의 알츠하이머병에서 증가되지 않지만, 이들은 가족성 알츠하이머병과 연관되어 있는 프리세닐린(presenilin)-1, 프리세닐린-2 및 아밀로이드 베타-단백질 전구체에 돌연변이가 일어난 환자에서 증가한다. 문헌[Scheuner et al., Nature Med., 2:864-70(1996)] 참조. Aβ₄₂의 증가된 수준은 β-아밀로이드 전구체 단백질("APP")의 절단 패턴의 변화로부터 유래할 수 있거나(Sisodia, Science, 289:2296-97(2000)) 또는 감소된 수준의 Aβ₄₂ 자체의 분해에 의한 것일 수 있다. 문헌[Iwatat et al., Science, 292:1550-52(2001)] 참조.

파킨슨병은 비정상적인 단백질 상호작용의 결과로 발생하는 것으로 생각되는 또 다른 일반적인 변성 신경 운동계 질환이다. 환경적 요인이 증상에 원인이 되는 것으로 생각되어 왔지만, 유전적 인자 또한 관련되어 있다. 문헌[Cole et al., Neuromolecular Med., 1:95-109(2002)] 참조. 특히, 시냅스전 단백질, α-시누클레인을 코딩하는 유전자의 돌연변이가 파킨슨병의 신경병리학적 특징인 루이 소체(Lewy bodies)에서의 이들 단백질의 축적의 원인이 될 것이다.

또한, 프리온 질환이 특정 단백질의 잘못된 폴딩 및 응집으로 발생하는 것으로 보인다. PrP^C는 프리온 단백질의 정상적인 형태로 포유동물 중의 단일 카피 유전자에 의해 코딩된다. 문헌[Basler et al., Cell, 46:417-28(1986)] 참조. 발현되었을 때, 단백질은 일반적으로 신경 세포의 표면에서 발견된다. 프리온 질환은 정상적인 PrP^C-형태의 프리온 단백질이 불용성의 질환 유발 형태 PrP^Sc로 전환되어 발생하는 것으로 생각된다. 두 형태의 아미노산 서열은 동일하지만, 단백질은 다른 배열을 나타내는 것으로 보인다. 문헌[Pan et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 90:10962-66(1993)]. PrP^Sc는 프리온 질환의 전달 및 이들의 발병에 관여하는 것으로 보인다. 상기에서 언급한 바와 같이, 프리온 질환은 양 및 염소의 스크레이피, 소의 해면상뇌병증 및 쿠루병, 크로이츠펠트-야콥 질환, 게르스트만-스트로이슬러-샤인케르 질환 및 치명적 가족성 불면증을 포함한다. 문헌[Prusiner et al., 미국 특허 제6,214,366호] 참조.

또한, 단백질 오조립 및 응집은 가족성 아밀로이드 다발신경병증 및 노인성 전신성 아밀로이드증으로 알려진 증상에 관여한다. 문헌[Kelly, Curr. Opin. Struct. Biol. 6:11-17(1996)]. 아밀로이드 원섬유는 티록신 및 레티놀의 운반에 관여하는 사량체 단백질인 트랜스티레틴(transthyretin)의 돌연변이된 형태로부터 다양한 조직에서 형성된다. 문헌[Jacobson et al., Adv. Hum. Genet., 20:69-123(1991)]. 돌연변이는 사량체 구조를 불안정화시키고, 아밀로이드 형성 중간체가 리소좀에서 발견되는 낮은 pH 조건 하에서 형성되도록 하는 것으로 보인다. 문헌[Miroy et al., Proc. Nat'l. Sci. USA 93:15051-56 (1996)]. 단백질의 야생형은 사량체를 유지하고 이들 조건 하에서 아밀로이드를 형성하지 않는다.

다수의 기타 질환들이 단백질의 잘못된 폴딩, 오조합 및(또는) 응집을 수반하는 것으로 생각된다. 이같은 질환(및 관련 단백질)은 근위축 측삭 경화증(슈퍼옥사이드 디스뮤타제), 픽 질환(픽 소체 중 타우 단백질), 타입 II 당뇨병(아밀린), 다발성 골수종-혈장 세포 악액질(IgG 경쇄), 갑상선 수질성 암종(프로칼시토닌), 만성신부전증(β₂-마이크로글로빈), 울혈심부전증(심방성 나트륨 이뇨인자), 만성 염증(혈청 아밀로이드 A), 죽상경화증(아포A1), 가족성 아밀로이드증(겔솔린)을 포함한다. 문헌[Prusiner et al., 미국 특허 제6,214,366호] 참조.

단백질의 잘못된 폴딩 및 응집이 다수의 질환의 발병에 관련되어 있지만, 응집 과정을 되돌릴 수 있으며, 병리학적 증상을 완화시킬 수 있는 것으로 현재 가능한 치료법은 매우 적다. 그러나, 몇몇 실험 결과는 응집의 역전이 치료적으로 유용할 것임을 시사한다.

예를 들어, 최근들어 몇몇 수지상 다가양이온이 배양된 스크레이피-감염된 신경모세포종으로부터 스크레이피 프리온 전구체 단백질을 제거하는 것으로 밝혀졌지만, 이 과정의 기작은 분명하지 않다. 문헌[Prusiner et al., 미국 특허 제6,214,366호] 참조.

혈청 아밀로이드 P 성분("SAP")의 원섬유로의 결합을 저해하는 소분자가 동정되었으며, 인간 아밀로이드증의 치료에서의 사용이 제안되었다. 문헌[Pepys et al., Nature, 417:254-59(2002)] 참조. 아밀로이드 원섬유로의 SAP 결합의 소분자 억제제를 이용한 7명의 인간 전신성 아밀로이드증의 치료가 순환 SAP 수준의 상당한 감소를 가져왔다. 문헌[Pepys et al., Nature, 417:254-59(2002)] 참조. 아밀로이드 원섬유로의 SAP 결합의 추가적인 저해제의 스크린 방법이 개시되었다. 문헌[Pepys et al., 미국 특허 제6,126,918호] 참조.

시험관내 생물리학적 실험이 트랜스티레틴의 리간드의 단백질로의 결합이 단백질의 사량체 형태를 안정화시키고, 아밀로이드의 형성을 억제할 수 있음을 보여주었다. 문헌[Miroy et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 93:15051-56(1996)] 참조.

TATA-결합 단백질의 나선형 영역으로부터 유래된 스페이서 분절(segment)로 분리된 폴리글루타민 분절을 함유한 이가 억제제 단백질이 배양된 세포 중의 확대된 폴리글루타민 반복 서열을 함유한 단백질의 응집을 저해한다. 문헌[Karantsev et al., Nature Genetics, 30:367-76(2002)]. 동일한 억제제 구조체가 트랜스유전자로 발현되었을 때 성인 치사율 및 신경 퇴화를 억제한다. 문헌[Drosophila model. ld]. 참조.

트랜스글루타미나제 저해제, 예를 들어, 시스타민 및 모노댄실 카다베린이 확대된 폴리글루타민 분절을 함유한 단백질을 발현하는 배양된 세포에서 응집체 형성 및 아폽토시스성 세포사를 억제하는데 사용되어 왔다. 문헌[Tsuji, 미국 특허 제6,355,690호] 참조.

푸사르산 및 피콜린산이 아연 의존적 중합화 및 βA_1-40 아밀로이드 펩티드의 원섬유 형성을 억제하는데 사용되어 왔다. 문헌[Douglas et al., 미국 특허 출원 공개 US 제2002/0037908 A1호] 참조. 또한, 이들 동일한 약제가 사망한 알츠하이머 환자의 뇌 절편으로부터 β-아밀로이드 단백질의 방출을 초래한다.

상기 발견은 단백질 응집의 형성을 저해하거나 또는 이미 형성된 응집체 구조를 파괴할 수 있는 약물이 단백질 오조립 및 응집으로 유발된 질환 치료에 유용할 것이라는 것을 나타낸다. 미국 특허 제6,420,122호는 세포에서 단백질 응집의 분해에 효과적인 추가적인 약물을 동정하는 시험관내 방법을 기술하고 있다.

이같은 질환의 수가 많고, 개인 및 사회에 미치는 그 영향의 심각도를 고려할 때, 신규하고 효과적인 치료적 접근법을 개발해야 할 명백한 필요가 존재한다.

발명의 요약

본 발명은 단백질 응집체를 코딩하는 핵산의 서열과 서열 면에서 관련이 없는 올리고뉴클레오티드가 단백질 조립 장애에서 응집체를 파괴하거나 또는 응집을 예방하는데 효과적이라는 예상치 못한 발견에 기초한다.

제1면에서, 본 발명은 세포에서 단백질 응집체의 응집을 예방하거나, 감소시키거나 또는 파괴하는데 효과적인 올리고뉴클레오티드를 확인하는 방법을 제공한다.

방법은 세포에서 이종 서열의 다수의 올리고뉴클레오티드 종 각각을 단백질 응집체를 갖고 있거나 이를 발생시킬 것 같은 세포 내로 개별적으로 도입하여 서열이 상이한 다수한 올리고뉴클레오티드로부터 단백질 응집체를 예방하거나, 감소시키거나 또는 파괴하는데 효과적인 올리고뉴클레오티드 종을 동정하고, 또한 응집체를 예방하거나, 감소시키거나 또는 파괴시키고(또는) 세포 생존을 증가시키는데 효과적인 올리고뉴클레오티드 종을 동정하는 것을 포함한다.

단백질 응집체는 헌팅틴(htt), Aβ, 타우, α-시누클레인, 아트로핀-1, 아탁신-1, 아탁신-2, 아탁신-3, 아탁신-7, 알파 1A, PrP^Sc, 트랜스티레틴, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제, 아밀린, IgG 경쇄, 프로칼시토닌, β₂-미크로글로불린, 심방성 나트륨 이뇨인자, 혈청 아밀로이드 A, 아포A1 및 겔솔린으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

올리고뉴클레오티드는 길이가 4 nt 이상, 일반적으로 6 nt 이상이고, 유용하게는 9 nt 이상, 25 nt 이상, 나아가 30 nt 이상일 수 있다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 그 길이가 35 nt, 40 nt, 45 nt, 나아가 50 nt 이상일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 유용하게 또는 일반적으로 개질, 예를 들어, 하나 이상의 포스포티오에이트 링커 또는 2'-OMe 유사체를 가질 수 있다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 단백질 응집체를 코딩하는 핵산의 10개 이상의 일련의 뉴클레오티드의 임의의 부분과 서열면에서 동일하지 않고 비상보적이다. 다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 단백질 응집체를 코딩하는 핵산 서열의 최소한 일부에 대해 서열 상보성 또는 동일성을 가질 수 있다. 스크리닝 실시태양에서, 다수의 올리고뉴클레오티드가 일반적으로 서로 동일하지 않다.

일련의 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 수동 트랜스펙션, 화학적 트랜스펙션 및 기계적 트랜스펙션으로 이루어지는 군으로부터 선택된 트랜스펙션 방법으로 시험관 내에서 세포 내로 도입된다.

올리고뉴클레오티드 및 단백질 응집체 중 하나 또는 모두가 검출 가능하게 표지될 수 있다. 응집체가 표지된 실시태양에서, 필수적인 것은 아니나 일반적으로 표지는 응집체에 재조합적으로 융합된다. 이같은 표지는 예를 들어, GFP-유사 발색단을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다.

다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 생체 내에서 세포 내로 도입될 수 있다.

제2 실시태양에서, 본 발명은 단백질 조립 장애가 있는 환자의 치료 방법을 제공한다. 방법은 임의로 제약학상 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합된 단백질 응집을 예방하거나, 감소시키거나 또는 파괴하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 종을 포함하는 유효량의 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

대부분의 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 4 nt 이상, 일반적으로 6 nt 이상이고, 유용하게는 9 nt 이상, 25 nt 이상, 나아가 30 nt 이상일 수 있다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 그 길이가 35 nt, 40 nt, 45 nt, 나아가 50 nt 이상일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 유용하게 또는 일반적으로 개질, 예를 들어, 하나 이상의 포스포티오에이트 링커 또는 2'-OMe 유사체를 가질 수 있다.

일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 단백질 응집체를 코딩하는 핵산의 10개 이상의 일련의 뉴클레오티드의 임의의 부분과 서열면에서 동일하지 않고 비상보적이다. 다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 단백질 응집체를 코딩하는 핵산 서열의 최소한 일부에 대해 서열 상보성 또는 동일성을 가질 수 있다.

많은 실시태양에서, 제약 조성물 중의 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 종은 하나 이상의 말단 개질, 예를 들어, 말단 포스포티오에이트 링커 또는 2'-OMe 유사체를 포함한다.

일부 실시태양에서, 조성물은 서열, 길이 또는 조성 중 하나 이상이 상이한, 2 이상의 올리고뉴클레오티드 종, 흔히 각각 서열, 길이 또는 조성이 상이한 3, 4, 5 또는 나아가 10-50 종의 상이한 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

치료적 방법은 단백질 응집 또는 오조립 병인을 갖는 질환, 예를 들어 알츠하이머병, 헌팅턴병, 섬유증, 근위축성 측삭 경화증, 파킨슨병, 척수연수 근위축증, 척수소뇌성 실조증 1형, 2형, 3형, 6형 및 7형, 담창구 시상하부 위축증, 프리온 질환, 스크레이피, 소해면상뇌병증, CJD, 신규 변이체 CJD, 픽 질환, 타입 II 당뇨병, 다발성 골수종-혈장 세포 악액질, 갑상선 수질성 암종, 만성 신부전, 울혈 심부전증, 만성 염증, 죽상경화증(apoA1) 및 가족성 아밀로이드증의 치료에 사용될 수 있다.

도면의 간단한 설명

본 발명의 상기 및 기타 목적은 하기 상세한 기술 및 첨부된 도면(동일한 문자는 전체적으로 동일한 부분을 지칭함)을 고려하여 명백해질 것이다.

도 1A는 단백질 응집체의 응집을 파괴하거나 또는 예방하는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 능력을 시험관내의 배양된 세포 내에서 분석하는 시험 프로토콜을 개시하는 흐름도이다.

도 1B는 단백질 응집체의 응집을 파괴하거나 또는 예방하는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 능력을 시험관내의 배양된 세포 내에서 분석하는 시험 프로토콜을 개시하는 매우 상세한 흐름도이다.

도 1C는 단백질 응집체의 응집을 파괴하거나 또는 예방하는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 능력을 세포 생존율 기준으로 시험관내의 배양된 세포 내에서 분석하는 실험 프로토콜을 도식화한 흐름도이다.

도 2A-2C는 어두운 배경에 대해서 헌팅틴-GFP 융합 단백질의 응집체가 빛을 나타내는 PC12 세포 배양의 형광 현미경 사진으로, 도 2A는 대조군 배양을 나타내고, 도 2B는 본 발명에 따른 Kan uD3T/25G 올리고뉴클레오티드를 사용한 트랜스펙션 후 응집체 형성의 감소를 나타내고, 도 2C는 본 발명에 따른 Kan uD12T/25G 올리고뉴클레오티드를 사용한 트랜스펙션 후 응집체 형성의 비슷한 정도의 감소를 나타낸다.

도 3A-3C는 어두운 배경에 대해서 헌팅틴-GFP 융합 단백질의 응집체가 빛을 나타내는 PC12 세포 배양의 형광 현미경 사진으로, 도 3A는 대조군 배양을 나타내고, 도 3B는 본 발명에 따른 Kan uRD3/25G 올리고뉴클레오티드를 사용한 트랜스펙션 후 응집체 형성의 감소를 나타내고, 도 3C는 본 발명에 따른 Kan uR/25G 올리고뉴클레오티드를 사용한 트랜스펙션의 효과를 나타낸다.

도 4A-4E는 어두운 배경에 대해서 헌팅틴-GFP 융합 단백질의 응집체가 빛을 나타내는 PC12 세포 배양의 형광 현미경 사진으로, 도 4D 및 4E는 트랜스펙션되지 않은 대조군 배양을 나타내고, 도 4A-4C는 표시된 것과 같이 본 발명에 따른 3종의 상이한 올리고뉴클레오티드로 트랜스펙션된 배양을 나타낸다.

도 5는 본질적으로 도 1B의 프로토콜에 따른 표시된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행된 세포-기반 분석에서의 응집체 형성을 정량화하는 챠트로, 가시적인 응집체를 교차비(Odds ratio)로 기록하고, 응집체를 함유한 세포의 평균 분획을 괄호 안에 나타내고, 표준 편차를 나타내는 오차 막대를 4번의 독립적인 실험의 평균으로부터 계산하였다.

도 6은 본질적으로 도 1B의 프로토콜에 따른 표시된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행된 세포-기반 분석에서의 응집체 형성을 정량화한 챠트로, 가시적인 응집체를 교차비로 기록하고, 응집체를 함유한 세포의 평균 분획을 괄호 안에 나타내고, 표준 편차를 나타내는 오차 막대를 4번의 독립적인 실험의 평균으로부터 계산하였다.

도 7은 도 1C에 도식화된 프로토콜에 따라 올리고뉴클레오티드 HDS-9의 부재 또는 존재 하에서 돌연변이 헌팅틴 생성의 유도 후의 세포 생존을 도표화한 것이다.

도 8은 본 발명의 세포 생존 분석에서 플라스크 표면에 부착된 생세포의 신속한 가시화를 나타내는 현미경 사진이다.

도 9A는 본 발명에 따른 표시된 올리고뉴클레오티드 또는 화합물로 배양한 후 셀룰로스 아세테이트 필터 상에 포획된 재조합 돌연변이 헌팅틴 N-말단 응집체를 나타내고, 도 9B는 음성 대조군에서 관측된 응집체의 양의 백분율을 표로 작성한 것이다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 약 4 nt 뉴클레오티드의 짧은 길이 내지 약 25 nt의 긴 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물이 세포 내에서 병적으로 응집된 단백질(이후, "단백질 응집체" 또는 "응집체"로도 불림)의 분해에 영향을 줄 수 있다는 발견에 기초하고 있다. 이러한 영향은 단백질 응집체를 코딩하는 유전자 서열과 확인할 수 있는 수준의 서열 연관성이 없는 올리고뉴클레오티드에서 관측될 수 있다. 올리고뉴클레오티드가 합성될 수 있다는 용이성, 이들이 세포 내부로 전달될 수 있다는 용이성, 전신성 독성의 결여 및 수십년 이상의 안티센스 접근법으로부터 유래한 풍부한 투약 경험에 비추어, 단백질 응집체를 분해하기 위한 짧은 올리고뉴클레오티드의 사용은 이들 질환을 치료하기 위해 현재 고안되고 있는 접근법들에 비해 상당한 장점을 제공한다.

본 발명의 조성물 및 방법에서 사용되는 올리고뉴클레오티드는 약 4 nt 뉴클레오티드의 짧은 길이 내지 약 25 nt의 긴 길이일 수 있고, 따라서, 그 길이가 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 뉴클레오티드일 수 있다(임의의 말단 봉쇄기는 제외).

올리고뉴클레오티드는 천연 5'-3' 포스포디에스테르 뉴클레오시드간(internucleoside) 결합의천연에서 발견되는 핵염기, 예를 들어, DNA, RNA 또는 이들의 키메라를 포함할 수 있거나, 또는 천연에서 발견되지 않는 임의의 또는 모든 핵염기(비천연 핵염기), 비천연 핵염기내 결합 또는 올리고뉴클레오티드 길이 전체를 통해서나 또는 이들 중 하나 이상의 부분에 국지화된 합성후 개질을 함유할 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 안티센스 응용에서 일반적으로 사용되는 개질된, 흔히 뉴클레아제-내성의 뉴클레오시드간 결합을 유용하게 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Hartmann et al., (eds.), Manual of Antisense Methodology(Perspectives in Antisense Science), Kluwer Law International(1999)(ISBN:079238539X); Stein et al. (eds.), Applied Antisense Oligonucleotide Technology, Wiley-Liss (cover(1998)(ISBN:0471172790); Chadwick et al. (eds.), Oligonucleotide as Therapeutic Agents-Symposium No. 209, John Wiley & Son Ltd. (1997)(ISBN:0471972797)] 참조(이들은 본원에 그 전체 내용이 참조문헌으로 삽입되었다).

개질된 올리고뉴클레오티드 골격은 예를 들어, 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 비롯한 기타 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 비롯한 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르 및 일반적인 3'-5' 결합을 가진 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 결합된 유사체 및 반대 극성을 갖는 것들로, 뉴클레오시드 단위체의 인접한 쌍이 3'-5' 에서 5'-3' 또는 2'-5' 에서 5'-2'로 연결된 것들을 포함할 수 있다. 상기 인산-함유 결합의 제조를 개시하고 있는 미국 특허의 예는 이에 제한되는 것은 아니지만, 제3,687,808호; 제4,469,863호; 제4,476,301호; 제5,023,243호; 제5,177,196호; 제5,188,897호; 제5,264,423호; 제5,276,019호; 제5,278,302호; 제5,286,717호; 제5,321,131호; 제5,399,676호; 제5,405,939호; 제5,453,496호; 제5,455,233호; 제5,466,677호; 제5,476,925호; 제5,519,126호; 제5,536,821호; 제5,541,306호; 제5,550,111호; 제5,563,253호; 제5,571,799호; 제5,587,361호; 및 제5,625,050호를 포함한다(이들은 본원에 그 전체 내용이 참조문헌으로 삽입되었다).

본 발명의 올리고뉴클레오티드에서 유용한 기타 개질된 올리고뉴클레오티드 골격은 인산 원자가 결여된 것들, 예를 들어, 단쇄 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 결합, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 결합 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로시클릭 뉴클레오시드간 결합으로 형성된 골격을 포함한다. 이들은 모르폴리노 결합을 갖는 것들(뉴클레오시드의 당 부분으로부터 일부로 형성됨); 실록산 골격; 술파이드, 술폭시드 및 술폰 골격; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 알켄 함유 골격; 술파메이트 골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 골격; 술포네이트 및 술폰아미드 골격; 아미드 골격; 및 기타 혼합된 N,O,S 및 CH₂ 성분부를 갖는 골격을 포함한다. 상기 골격의 제조를 교시하고 있는 대표적인 미국 특허는 이에 제한되는 것은 아니지만, 미국 특허 제5,034,506호; 제5,166,315호; 제5,185,444호; 제5,214,134호; 제5,216,141호; 제5,235,033호; 제5,264,562호; 제5,264,564호; 제5,405,938호; 제5,434,257호; 제5,466,677호; 제5,470,967호; 제5,489,677호; 제5,541,307호; 제5,561,225호; 제5,596,086호; 제5,602,240호; 제5,610,289호; 제5,602,240호; 제5,608,046호; 제5,610,289호; 제5,618,704호; 제5,623,070호; 제5,663,312호; 제5,633,360호; 제5,677,437호; 및 제5,677,439호를 포함한다(이들은 본원에 그 전체 내용이 참조문헌으로 삽입되었다).

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 또한 화학적으로 허용되는 표준 포스포디에스테르 결합인 비천연형의 핵염기 또는 천연형의 핵산에서 발견되지 않는 기타 유형의 결합을 포함할 수 있다(당업자에게 명백하듯이, 이전에 비천연적으로 발생하는 것으로 생각되었던 다양한 핵염기가 이후 자연계에 존재하는 것으로 밝혀졌다).

따라서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 공지된 퓨린 및 피리미딘 헤테로사이클과 같은 핵염기 및 헤테로사이클 유사체 및 이들의 호변이성체를 포함할 수 있다. 핵염기의 예시적인 예는 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신, 우라실, 퓨린, 크산틴, 디아미노퓨린, 8-옥소-N⁶-메틸아데닌, 7-디아자크산틴, 7-디아자구아닌, N⁴,N ⁴-에타노시토신, N⁶,N⁶-에타노-2,6-디아미노퓨린, 5-메틸시토신, 5-(C³-C ⁶)-알키닐시토신, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 슈도이소시토신, 2-히드록시-S-메틸-4-티아졸로피리딘, 이소시토신, 이소구아닌, 이노신 및 미국 특허 제5,432,272호(본원에 그 전체내용이 참조문헌으로 삽입되었음)에 기술된 "비천연 발생" 핵염기이다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드에서 유용한 비천연형 핵염기 중에서, 고정된 핵산(LNA) 유사체가 특정 단백질 응집체에 유용할 것이나, 현재까지 시험된 LNA-함유 올리고뉴클레오티드는 헌팅틴 응집체를 탈응집시키는 효과가 약한 것으로 입증되었고, 이는 하기 실시예에서 추가로 기술될 것이다.

LNAs는 바이시클릭 또는 트리시클릭 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 유사체 및 이같은 유사체를 함유하는 올리고뉴클레오티드이다. LNAs의 기본적인 구조 및 기능적 특성은 WO 제99/14226호, WO 제00/56748호, WO 제00/66604호, WO 제98/39352호 및 미국 특허 제6,043,060호 및 미국 특허 제6,268,490호를 비롯한 다양한 문헌 및 특허에 기술되어 있다(이들 모두는 그 전체가 본원에 참조문헌으로 삽입되었다).

또한, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 2'-O-알킬 유사체, 예를 들어, 2'-OMe 유사체를 포함할 수 있다. 5'-3' 포스포디에스테르 결합의 디옥시리보뉴클레오티드에 결합될 때, 생성되는 올리고뉴클레오티드는 RNA 및 DNA의 키메라이다.

자연계에서 발견되는 핵산 조성의 차이-예를 들어, 개질된 뉴클레오시드간 결합, 비천연 발생형 핵염기 및 합성후 개질-이 올리고뉴클레오티드 길이 전체에 걸쳐 존재할 수 있거나, 또는 이들의 이산성 부분에 국지화될 수 있다.

또한, 본 발명에서 유용한 올리고뉴클레오티드는 임의의 5' 및 3' 말단 한쪽 또는 양쪽에서 말단기를 포함할 수 있다. 이같은 말단기는 분해를 감소시키는데 유용하거나, 또는 첨가적으로 또는 별법으로 기타 기능을 제공할 수 있다.

예를 들어, 5'-말단은 화학적으로 또는 효소적으로 인산화되어서 올리고뉴클레오티드 (-) 전하를 증가시킬 수 있다.

별법으로, 5' 말단은 일차 아민기를 포함하도록 개질될 수 있고, 일반적으로 아미노 개질 포스포래미다이트, 예를 들어, β-시아노에틸(CE) 포스포래미다이트(버지니아주 스털링 소재 글렌 리서치 인크(Glen Research, Inc.))를 사용하여 고상 합성 중에 부착될 수 있다. 5' 말단은 달리 반응성 티올기를 나타내도록 개질될 수 있고, 이는 고상 합성 중에 티올 개질된 포스포래미다이트, 예를 들어, (S-트리틸-6-메르캅토헥실)-(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)-포스포래미다이트(버지니아주 스털링 소재 글렌 리서치 인크)를 사용하여 부착될 수 있다.

아민 및 티올-개질된 올리고뉴클레오티드는 기타 성분, 예를 들어, 단백질, 지질 또는 탄수화물에 용이하게 콘쥬게이트될 수 있다.

이러한 성분들 중에서 치료적 관심의 대상이 되는 세포 유형으로 올리고뉴클레오티드를 표적화하는 기능을 하는 것들이 유용하다.

예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO 제02/47730호 및 WO 제00/37103호(본원에 참조문헌으로 전체 내용이 삽입됨)는 치료적 성분을 신경 세포로 세포내 전달하기 위한 화합물을 기술하고 있다. 표적 성분은 뉴로트포핀, 예를 들어, NGF, BDNF, NT-3, NT-4, NT-6 및 이들의 단편으로 다양한 클래스의 신경 세포에 의한 화합물의 표적화된 세포내 이입에 영향을 주는 것들이다. 이같은 성분은 신경 질환, 예를 들어, 척수연수 근위축증, 척수소뇌성 실조증 1형, 2형, 3형, 6형 및 7형, 담창구 시상하부 위축증, 파킨슨병 및 프리온-기반 뇌병증의 특징적 단백질 응집을 분해하기 위해 의도된 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 유용하게 부착될 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드에 유용하게 부착될 수 있는 기타 표적 성분은 혈액 뇌 경계를 가로지르는 통과를 용이하게 하는데, 예를 들어, OX26 모노클로날 항체(본원에 그 전체 내용이 참조문헌으로 삽입된 문헌[Pardridge, "Brain drug delivery and blood-brain barrier transport", Drug Delivery 3:99-115 (1996)] 참조, 또는 본원에 그 전체내용이 참조문헌으로 삽입된 미국 특허 제5,154,924호 및 제5,977,307호 참조) 또는 표적 생세포, 예를 들어, 락토즈아민화된 알부민(Ponzetto et al, Hepatology 14(1): 16-24(1991), 본원에 그 전체 내용이 참조문헌으로 삽입됨)이 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드의 3' 말단은 다른 것들 중에서도 단백질, 탄수화물 및 지질로의 올리고뉴클레오티드의 용이한 콘쥬게이션을 허용하기 위해 유사하게 아민 또는 티올 개질될 수 있다.

기타 5' 및 3' 말단-개질은 예를 들어, 올리고뉴클레오티드의 세포외 및 세포내 분포를 모니터할 수 있도록 하는 형광 표지를 포함한다.

말단 개질에 유용한 형광 표지는 공지되어 있으며, 예를 들어, 형광 이소티오시아네이트(FITC), 알로파이코시아닌(APC), R-파이코에리트린(PE), 페리디닌 클로로필 단백질(PerCP), 텍사스 레드(Texas Red), Cy3, Cy5, Cy7 및 형광 공명 에너지 탠덤 형광단, 예를 들어, PerCP-Cy5.5, PE-Cy5, PE-Cy5.5, PE-Cy7, PE-텍사스 레드 및 APC-Cy7을 포함한다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드의 5' 또는 3' 말단에 유용하게 부착되는 기타 형광단은 특히, Alexa Fluor350, Alexa Fluor488, Alexa Fluor532, Alexa Fluor546, Alexa Fluor568, Alexa Fluor594, Alexa Fluor647(미국 오레곤주 유젠 소재 몰레큘라 프로브 인크(Molecular Probes, Inc.)로부터 구입할 수 있는 모노클로날 항체 표지 키트), BODIPY 염료, 예를 들어, BODIPY493/503, BODIPY FL, BODIPY R6G, BODIPY 530/550, BODIPY TMR, BODIPY 558/568, BODIPY 558/568, BODIPY 564/570, BODIPY 576/589, BODIPY 581/591, BODIPY TR, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, 캐스케이드 블루, 캐스케이트 옐로우, 댄실, 리스아민 로다민 B, 마리나 블루, 오레곤 그린 488, 오레곤 그린 514, 퍼시픽 블루, 로다민 6G, 로다민 그린, 로다민 레드, 테트라메틸로다민, 텍사스 레드(미국 오레곤주 유젠 소재 몰레큘라 프로브 인크로부터 구입할 수 있음) 및 Cy2, Cy3.5 및 Cy5.5를 포함한다.

또한, 올리고뉴클레오티드는 2차 표지화 또는 정제에 유용한 3' 및(또는) 5'기, 예를 들어, 바이오틴, 디니트로페닐 또는 디곡시게닌을 포함할 수 있다.

상기 올리고뉴클레오티드로 바람직한 서열이 공지된 경우, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 목적하는 핵염기 및 링키지에 적합하게 표준 고상(solid phase) 화학을 이용하여 유용하게 합성할 수 있다.

목적하는 서열이 아직 미정인 경우에는, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 조합적으로 유용하게 합성될 수 있다. 즉 임의의 목적하는 길이의 올리고뉴클레오티드에 대한 모든 가능한 올리고뉴클레오티드를 제공하고 이로부터 목적하는 서열을 선택할 수 있다.

이러한 조합적 방법은 당업계에 공지되어 있다. 가장 간단한 방법에서는, 모든 가능한 핵염기 모노머들이 매 합성 사이클에 사용된다. 상기 접근법의 단점은 이종 서열의 올리고뉴클레오티드가 혼합물 중에 존재한다는 것이다. 다른 방법으로는 하이쓰루풋 병열 합성법(high throughput parallel synthesis)이 있는데, 여기서는 서열이 다른 올리고뉴클레오티드는 분리된다. 예를 들어, 쳉 등의 문헌[Cheng et al.,"High throughput parallel synthesis of oliginucleotide with 1536-channel synthesizer,"Nucl. Acids Res. 30(18): e93(2002)]참조.

따라서 본 발명의 일 양상에 의하면, 본 발명은 서열이 다른 다수의 올리고뉴클레오티드로부터, 세포내 단백질 응집체의 응집을 파괴하는데 효과적인 올리고뉴클레오티드를 동정하는 방법을 제공한다.

상기 방법은, 이종 서열을 갖는 다수의 올리고뉴클레오티드 각각을 개별적으로 단백질 응집체를 갖거나 또는 가질것 같은 세포내에 도입하고, 파괴나 응집의 예방에 가장 효과적인 올리고뉴클레오티드를 동정하는 것을 포함한다.

테스트에 사용되는 올리고뉴클레오티드는 서열이 상이하다. 임의로 이들 올리고뉴클레오티드는 조성, 예를 들면 길이, 비내재적 뉴클로시드간 결합의 존재, 위치 및 수, 비내재적 핵염기의 존재, 위치, 수 및 화학, 및 말단 변형의 위치, 존재 및 개수에 있어서 추가적으로 차이가 있을 수 있다.

상기 세포는 일반적으로 배양된 세포이고, 따라서 올리고뉴클레오티드는 시험관내에서(in vitro) 상기 세포로 도입된다. 그러나, 다른 실시태양에서는 상기 세포가 실험실 동물 내에 존재하고, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 동물내로 투여에 의해 도입된다.

본 방법에의 사용을 위해 선택된 세포는 파괴가 필요한 단백질의 응집을 보이거나 응집을 일으킬 것이다.

예를 들어, 헌팅틴 응집을 감소시키거나 예방하기 위한 올리고뉴클레오티드의 선택이 요망되는 경우, 검정법에 사용하기 위하여 선택하는 세포는 헌팅틴 응집을 보이거나 앞으로 보일 것이고, 이러한 세포주 중 하나는 하기 실시예1에 기술한다.

유사하게, Aβ(β 이차 구조의 아밀로이드 플라크)의 응집을 감소시키거나 또는 예방하기 위한 올리고뉴클레오티드의 선택이 요망되는 경우, 선택된 세포는 Aβ 응집을 보이거나 앞으로 보일 것이다. 알파-시누클레인(α-synuclein) 응집의 감소 또는 예방을 위한 올리고뉴클레오티드의 선택이 요망되는 경우, 선택된 세포는 알파-시누클레인 응집을 보이거나 앞으로 보일 것이다. 본 발명의 검정법에 유용한 기타 단백질 응집체로는 예를 들어, 아트로핀-1, 아탁신-1, 아탁신-2, 아탁신-3, 아탁신-7, 알파 1A, 타우 단백질, PrP^sc 및 트랜스티레틴 등이 있다.

상기 세포들은, 예를 들어 치유하고자 하는 질병에 걸린 환자로부터 유도한 자연적으로 생성된 것 또는 조작된 것일 수 있다. 따라서 단백질 응집체는 비록 치료적으로 응집되기는 하나 자연적으로 발생하는 단백질 응집체이거나 또는 비자연적으로 생성되는 단백질 응집체일 수 있다.

비자연적으로 생성되는 단백질 응집체 중에서, 상기 단백질 응집체를 함유하는 융합물 또는 이의 응집-담당 부분, 및 검출가능한 마커가 특히 유용하다.

이러한 검출가능한 마커 중에는, 녹색 형광 단백질(GFP)-유사 발색단을 갖는 형광 단백질이 특히 유용한 것으로 입증되었다.

본원에서, "GFP-유사 발색단"이란 중앙의 α-헬릭스와 11 가닥의 β-배럴(β-can)을 포함하는 내재적인 형광 단백질 기로서, 상기 중앙의 α-헬릭스는 두 개의 방향족 고리 시스템과 그 사이의 브리지를 포함하는 복합 π공명 시스템을 갖는 것을 의미한다. 여기서 "내재적인 형광"이란 그 GFP-유사 발색단이 전적으로 그 아미노산 서열에 의해 코딩되고, 보조인자나 기질의 도움없이 발색을 할 수 있는 것을 의미한다. 예를 들어 하기 실시예 1에 기재된 PC12 신경 세포주는, 인헨스드 GFP(녹색 형광 단백질) 유전자에 융합된 교대적이고 반복적인 코돈 ... CAA CAG CAG CAA CAG CAA...을 함유하는 HD 유전자 엑손 1을 함유한다.

GFP-유사 발색단은 천연적으로 존재하는 단백질, 예를 들어, 에이 빅토리아 GFP(A. victoria GFP)(GenBank accession number AAA27721), 레닐라 레니포미스 GFP(Renilla reniformis GFP), FP583(GenBank accession no.AF168419)(DsRed), FP593(AF272711), FP483(AF168420), FP484(AF168424), FP595(AF246709), FP486(AF168421), FP538(AF168423), 및 FP506(AF168422)에서 발견되는 GFP-유사 발색단으로부터 선택되고, 내재적 형광을 보유하기에 필요한 정도의 천연 단백질만을 포함할 필요가 있다. 형광에 필요한 최소한의 도메일을 결정하는 방법은 공지되어 있다. 리 등의 문헌[Li et al.,"Deletions of the Aequorea victoria Green Fluorescent Protein Define the Minimal Domain Required for Fluorescence,"J. Biol. Chem. 272: 28545-28549(1997)] 참조.

별법으로, 상기 GFP-유사 발색단은 자연에 존재하는 것으로부터 개질된 GFP-유사 발색단으로부터도 선택할 수 있다. 일반적으로 이러한 개질은 이종 발현 시스템에서의 재조합체의 생산 향상을 위하여(단백질 서열의 변경이 있거나 없거나), 천연 단백질의 여기 및(또는) 방출 스펙트럼의 변경을 위하여, 정제를 용이하게 하거나, 클로닝을 용이하게 하거나, 클로닝의 결과로서 또는 연구의 우연한 결과로서 이루어진다.

이러한 개질된 GFP-유사 발색단을 제조하는 방법 및 이들의 형광 활성을 검사하는 방법은 이들 단독으로 및 융합 단백질의 일부로서 모두에서 당업계에 공지되어 있다. 이들 노력의 조기 결과는 그 전문이 본 명세서에 참고문헌으로 삽입되는 헤임 등의 논문[Heim et. al., Curr. Biol. 6: 178-182(1996)]에 개시되어 있다. 유용한 형질변형의 타뷸레이션(tablulation)을 포함하는 좀 더 최근의 자료로는 그 전문이 본 명세서에 참고문헌으로 삽입되는 팜 등의 논문[Palm et. al.,"Spectral Variants of Green Fluorescent Protein, "in Green Fluorescent Proteins, Conn(ed.), Methods Enzymol. vol. 302, pp. 378- 394(1999)]이 있다.

이렇게 개질된 다양한 발색단들이 현재 상업적으로 이용가능하고 본 발명의 융합 단백질의 제조에 바로 사용될 수 있다.

예를 들어, EGFP("강화(enhanced) GFP")[코멕 등(Cormack et. al.), Gene 173: 33-38(1996); U. S. Pat. Nos. 6,090, 919 and 5,804, 387]은 더 밝은 형광과, 포유동물 세포에서 향상된 발현 및 플로우 사이토미터(flow cytometer)에의 사용에 최적화된 여기 스펙트럼을 갖도록 조작된 적색-시프트된(red-shifted) GFP의 인간 코돈-최적화 변이체이다. EGFP는 본 발명의 융합단백질에 GFP-유사 발색단을 유용하게 부여할 수 있다. 플라스미드와 바이러스를 포함하는 다양한 EGFP 벡터가 상업적으로 이용가능하다(Clontech Labs, Palo Alto, CA, USA). 예를 들어, 박테리아 발현을 위한 벡터, N-말단 단백질 융합 발현 벡터, C-말단 단백질 융합 발현을 위한 벡터 및 비시스트로닉(bicistronic) 발현 벡터 등이 있다.

방출 스펙트럼의 다른 말단을 향하여, EBFP("enhanced blue fluorescent protein") 및 BFP2은 그린으로부터 블루로 방출을 시프트하고, 형광의 밝기를 향상시키며 단백질의 용해도를 개선시키는 4 개의 아미노산 치환을 포함한다. [Heim et al., Curr.Biol. 6: 178-182(1996); Cormack et al., Gene 173: 33-38(1996)]

EBFP는 포유동물 세포내 발현에 최적화되었고, 최초의 불가사리 코돈을 함유하는 BFP2는 박테리아에서 발현가능하다. 이하 상술하는 바와 같이, 생산의 숙주세포는 결과의 융합 단백질의 유용성에 영향을 미치지 않는다. EBFP 및 BFP2로부터의 GFP-유사 발색단들은 본 발명의 융합 단백질에 유용하게 포함될 수 있고, 이들 블루-시프트된 변이체를 포함하는 벡터들은 클론텍 랩(Palo Alto, CA, USA)으로부터 입수가능하다.

유사하게, 클론텍 랩으로부터 입수가능한 EYFP("enhanced yellow fluorescent protein")는 방출을 그린에서 옐로우이쉬 그린으로 시프트하는 EBFP와는 다른 4개의 아미노산 치환을 함유한다. [Orme et. al., Science 273: 1392-1395(1996)]

개선된 옐로우 형광 단백질 변이체인 시트린(Citrine)은 헤이칼 등의 문헌[Heikal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 11996-12001(2000)]에 기재되어 있다. ECFP("enhanced cyan fluorescent protein")(Clontech Labs, Palo Alto, CA, USA)는 6개의 아미노산 치환을 함유하는데, 이 중 하나는 방출 스펙트럼을 그린에서 시안으로 시프트한다[Heim et al., Curr. Biol. 6: 178-182(1996); Miyawaki etal,, Nature 388: 882-887(1997)]. 이들 GFP 변이체 각각의 GFP-유사 발색단은 본 발명의 융합 단백질 응집체에 유용하게 포함될 수 있다.

상기 GFP-유사 발색단은 또한, 미국특허번호 제6,124,128호; 제6,096,865호; 제6,090,919호; 제6,066,476호; 제6,054,321호; 제6,027,881호; 제5,968,750호; 제5,874,304호; 제5,804,387호; 제5,777,079호; 제5,741,668호; 및 제5,625,048호에 기재된 것들을 포함하는 다른 개질된 GFP들로부터 유도될 수도 있다. 상기 특허 문헌의 개시들은 그 전체를 본 명세서에 참고로서 포함한다.

검출가능한 마커를 갖는 재조합 융합 단백질 응집체(또는 그의 응집-담당 단편), 예를 들어, GFP-유사 발색단을 포함하는 단백질은, 단백질 응집체의 세포내 위치 및 국소 농도를 정량적 및 정성적으로 관찰함으로써 세포내 응집 및 응집의 파괴를 검출할 수 있게 한다.

상기 융합된 마커가 형광인 경우, 즉 GFP-유사 발색단을 갖는 단백질 부분인 경우, 응집은 일반적으로 형광 현미경을 이용하여 가시적으로 관찰할 수 있다. 아머샴 바이오사이언스 인 셀 분석 시스템(Amersham Biosciences IN Cell Analysis System) 및 셀로믹스 어레이스켄 HCS 시스템(Cellomics ArrayScan HCS System)과 같은 하이 쓰루풋 장치를 이용하면, 형광 태그된 부위의 세포 하부 구조내 위치 및 농도를 검출하고 통계적 및 동력학적으로 정량화하는 것이 가능하다. 그 전문이 참고문헌으로서 본 명세서에 삽입된 미국특허번호 제5,989,835호 참조.

형광 마커 이외의 마커들이 사용될 수 있고, 또 마커들이 응집 단백질에 재조합적으로 융합될 필요는 없다.

예를 들어, 단백질을 항체가 인식하는 태그에 재조합적으로 융합시키고 이로써 특이적으로 염색가능하게 할 수 있다.

이러한 태그의 예로는, 믹(myc) 태그 펩티드, 항-Xpress 항체에 의해 검출가능한 Xpress 에피토프(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA), 항-V5 항체에 의해 검출가능한 V5 에피토프(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA), 항-FLAG 항체에 의해 검출가능한 FLAG 에피토프(Stratagene, La Jolla, CA, USA) 등이 있다.

기타 유용한 태그로는, 고정된 금속 친화도 크로마토그래피(immobilized metal affinity chromatography)에 의해, 예를 들어, NiNTA 레진(QiagenInc., Valencia, CA, USA) 또는 TALONw7M 레진(cobalt immobilized affinity chromatography medium, Clontech Labs, Palo Alto, CA, USA)를 이용하여, 재조합 융합 단백질 응집체의 정제를 용이하게 하기 위한 폴리히스티딘 태그; 칼모듈린 친화도 레진(calmodulin affinity resin)(Stratagene, La Jolla, CA, USA) 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제에 의해 정제가 가능한 칼모듈린 결합 펩티드 태그, 여기서 글루타티온에의 결합 친화도 및 특이성으로 인하여 Glutathione-Superflow Resin(Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA)과 같은 글루타티온 친화도 레진에 의한 정제 및 후속하여 유리 글루타티온의 용출이 가능하다.

이론에 의해 구속되려는 의도는 없이, 단백질 응집에 억제 효과를 갖는 올리고뉴클레오티드는 잘못 응집된 단백질과 물리적으로 결합하고 있는 수도 있다. 올리고뉴클레오티드가 단백질 응집체에 계속하여 결합하기에 적합한 조건하에서 상기 단백질 응집체를 단리하면 단백질 응집체에 가장 큰 친화도를 갖는 올리고뉴클레오티드를 농축할 수 있다. [Kazantsev et. al, Nature Genetics 30: 367-76(2002), 그 전문을 참고문헌으로 본 명세서에 삽입함]

마커는 단백질 응집체에 재조합적으로 융합할 필요가 없다. 예를 들어, 단백질 응집체는 후속 염색으로 표지될 수 있다.

본 발명의 이러한 양상에 따른 다른 실시태양에서는 올리고뉴클레오티드가 표지될 수 있다.

올리고뉴클레오티드의 표지화는 검정하는 세포내로 유입되는 올리고뉴클레오티드의 양을 측정하고 표준화하려는 목적으로 특히 유용하다. 올리고뉴클레오티드의 표지화는 검정하는 올리고뉴클레오티드의 세포내 및 세포외 분포를 알 수 있게 한다.

일반적으로, 올리고뉴클레오티드를 표지화할 때, 그 단백질 응집체도 표지 한다. 이는 올리고뉴클레오티드 및 단백질 응집체의 세포 하부구조내 분포가 서로 달라서 상보적인 정보를 제공할 수 있기 때문이다.

올리고뉴클레오티드는 예를 들어 방사성 핵종(radionuclide), 발색단, 또는 가시화가능한 헵텐으로 표지화될 수 있다. 방사성 핵종으로 표지화한 경우에는, 그 올리고뉴클레오티드의 세포 하부 구조내 위치를 예를 들어 x-ray 필름 또는 phosphor imager를 이용하여 검출할 수 있다. 발색단으로 표지하는 경우, 올리고뉴클레오티드를 표지하는 발색단은 임의로 단백질 응집체의 표지에 사용된 발색단과 구별되는 여기 및(또는) 방출 스펙트럼을 갖는 것이고, 그 올리고뉴클레오티드의 위치 및 농도는 적당한 형광 검출 장치에 의해 측정된다.

올리고뉴클레오티드는 합성 도중 또는 이후에 표지화될 수 있다. 상술한 바와 같이, 표지는 5' 및(또는) 3' 말단에 위치할 수 있다. 부가하여 또는 별법으로, 상기 표지는 올리고뉴클레오티드의 중간에 위치할 수 있다.

시험관내에서 검정하는 경우, 본 발명의 상기 방법에 사용되는 세포는 동일한 단백질 응집체를 발현하는 클론된 세포주이다. 단백질 응집체는 세포 염색체, 천연 좌위 또는 조작된 구조체가 삽입된 또다른 위치로부터, 또는 에피좀 구조체로부터 발현될 수 있다.

세포를 배양중 검정하는 경우, 단백질 응집체의 파괴능에 대해 시험할 올리고뉴클레오티드를 공지의 트랜스펙션 기술로 세포내에 도입할 수 있다.

올리고뉴클레오티드의 길이가 짧기 때문에, 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 세포내이입 기작(endocytotic mechanisms)에 의해 추가의 도입용이제(facilitation)의 도움없이, 수동적으로 도입될 수 있다.

별법으로 화학적 트랜스펙션 수단을 이용할 수 있다.

화학적 트랜스펙션에서는, DNA를 인산칼슘으로 공동 침전시키거나 또는 리포좀계 또는 비리포좀계 지질 기재 물질을 이용하여 도입할 수 있다. 인산칼슘 트랜스펙션에 이용가능한 시판 키트가 존재한다(CalPhos™ 포유류 트랜스펙션 키트, Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA). 또한, 지질매개 트랜스펙션은 LIPOFECTAMINE™ 2000, LIPOFECTAMINE™ 시약, CELLFECTIN 시약, 및 LIPOFECTIN 시약(Invitrogen,Carlsbad, CA, USA), DOTAP 리포좀 트랜스펙션 시약, FuGENE 6, X-tremeGENE Q2, DOSPER(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN USA), Effectene™, PolyFect, Superfect(Qiagen, Inc., Valencia, CA, USA)와 같은 시판되는 시약을 사용하여 실시할 수 있다.

전기천공(electroporation), 바이오리스틱스(biolistics), 마이크로인젝션과 같은 기계적 수단을 사용할 수도 있다. 포유동물 세포를 전기천공하는 방법은 온라인상의 Electroprotocols(Bio-Rad, Richmond, CA, USA, http://wwww.bio-rad.com/LifeScience/pdf/New_Gene_Pulser.pdf)에서 얻을 수 있다.

입자충격술에 대하여는 예를 들어 쳉 등의 문헌[Cheng et al., Proc. Natl, Acad. Sci. USA 90(10):4455-9(1993); Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(24): 9568-72(1990)]참조.

또한 그 전문이 참고로서 본 명세서에 삽입되는 노톤 등의 문헌[Norton et al.(eds), Gene Transfer Methods: Introducing DNA into Livisng Cells and ORganisms, Bio Techniques Books, Eaton Publising Co.(2000)(ISBN 1-881299-3401)] 참조.

상이한 서열 및(또는) 조성을 갖는 각 올리고뉴클레오티드는 개별적으로 검정하여 단백질 응집체의 파괴 또는 예방에의 효율성을 다른 올리고뉴클레오티드의 것과 비교할 수 있다. 부가하여 또는 별법으로, 초기 스크리닝을 용이하게 하거나 또는 부가적이거나 시너지 효과를 갖는 올리고뉴클레오티드 조합을 동정하기 위하여, 올리고뉴클레오티드의 풀을 시험할 수도 있다.

본 발명의 상기 양상에 따른 방법에서는, 일반적으로 올리고뉴클레오티드를 세포 배양내로의 도입에 적합한 조성물, 예를 들어 완충 수성 조성물 내에 포함시킨다. 보통 수시간 내지 수일이 걸리는 검정법의 지속시간에 따라, 바람직하게는 올리고뉴클레오티드를 멸균 수성 조성물내에 제조할 수도 있다.

반드시는 아니지만 전형적으로, 배지 내 단백질에 의한 올리고뉴클레오티드의 우연한 격리를 예방하기 위하여 시험할 세포를 혈청이 제거된 배지에서 시험한다.

올리고뉴클레오티드를 세포내로 도입한 후, 단백질 응집체의 정도를 검사하여 올리고뉴클레오티드의 단백질 응집체의 붕괴 및 예방에의 효능을 결정한다. 이 효능은 다양한 시점 중 임의 시간에 통계적으로 결정되거나, 또는 동력학적으로 결정될 수도 있고, 다양한 효능 메트릭스가 사용될 수도 있다.

예를 들어, 응집체 정도는 투여 후 특정 시점에서의 세포내 단백질 응집체의 총부피로서, "핀포인트 응집체"와 같이 별개로 구별가능한 응집체 수로서, 투여후 특정 시점에서의 세포내 단백질 응집체의 가장 큰 밀도로서, 투여후 특정시점에서 세포내 단백질 응집체의 가장 큰 밀도와 가장 작은 밀도와의 차이로서 평가될 수 있다. 동력학적 검정법에서 파괴 효과도는, 세포의 하나 이상의 부위에서의 응집체의 밀도 또는 부피의 산재 속도로서 평가될 수 있다. 이러한 메트릭스 중 선택은 어느 정도는 세포 유형, 검정법에 선택된 응집체에 의해 결정될 것이고, 당업계에 잘 알려져 있다.

이 검정법 방법은 일반적으로는 원하는 효능을 갖는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 또는 그 조합이 동정될 때까지 반복될 것이다.

본 발명의 이러한 양상에서는 다른 시험관내 검정법이 사용되어도 좋다.

어떤 경우에는, 단백질 응집체가 세포 사멸을 초래할 수 있고, 올리고뉴클레오티드의 응집체 억제 및 파괴능이 세포 사멸을 억제하는 올리고뉴클레오티드의 능력으로 동정될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Carmichael et al., Proc. Nat'l Acad. Sci, USA, 97:9701-9705(2000)] 및 실시예 4 및 5 참조.

응집체의 파괴 및 예방에 유용한 올리고뉴클레오티드는 상기 및 하기 실시예에 나타낸 것과 같은 시험관내 검정법을 통하여 선택할 수 있지만, 본 발명의 다른 실시태양에서는 단백질 응집체의 동물 모델을 이용하여 생체내에서 검정될 것이다. 이러한 생체내 검정법에서는, 올리고뉴클레오티드의 효능이 부가적으로 증상의 감소 또는 지연과 같은 임상적 효능 징후에 의한 평가가 가능하다. 비동물들에서는 희생 후 사후 검정법을 이용하여 또한 효능을 평가할 수 있다. 다양한 이러한 검정법법들을 이후 실시예에 기술하였다. 또한, 그 전문을 참고로서 본 명세서에 삽입하는 문헌[Kazantsev et al., Nature Genetices 30:367-76(2002)] 참조.

두 번째 양상으로 본 발명은 단백질 조립에 문제가 있는 인간 및 동물 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은, 단백질 응집체를 파괴 또는 예방하는 1 종 이상의 올리고뉴클레오티드 종 및 임의로 제약학상 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합하여 포함하는 조성물 유효량을 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 이러한 양상에 따른 방법으로 치료가 가능한 질환의 예로는 표 1에 나타낸 것이 있다.

자기조립에 의한 크로스-β 피브릴 생성으로 인한 아밀로이드 형성(amyloidogenic) 단백질 및 아밀로이드 질환
임상적 증상	전구 단백질	피브릴 성분
알츠하이머병	β단백질	베타 단백질 1-40, 1-41, 1-42, 1-43
원발성 전신성 아밀로이드증	면역글로불린 경쇄	경쇄 전체 또는 그의 단편
속발성 전신성 아밀로이드증	혈청 아밀로이드 A	아밀로이드 A(76 잔기 단편)
노인성 전신성 아밀로이드증	트랜스티레틴	트랜스티레틴 또는 그 단편
가족성 아밀로이드 다발신경병증 I	트랜스티레틴	45종을 초과하는 트랜스티레틴 변이체
유전성 뇌 아밀로이드 혈관병증	시스타틴 C	시스타틴 C -10 잔기
혈액투석관련 아밀로이드증	β2-마이크로글로불린	β2-마이크로글로불린
가족성 아밀로이드 다발신경병증 III	아포리포단백질 A-1	아포리포단백질 A-1의 단편들
핀란드 유전성 전신성 아밀로이드증	겔솔린	겔솔린의 71 아미노산 단편
타입 II 당뇨병	아일렛 아밀로이드 폴리펩티드(IAPP)	IAPP의 단편
갑상선의 수질성 암종	칼시토닌	칼시토닌의 단편들
해면상 뇌병증	프리온	프리온 또는 그 단편들
심방성 아밀로이드증	심방성 이뇨인자 (ANF)	ANF
유전성 비-신경병증 전신성 아밀로이드증	리소자임	리소자임 또는 그 단편들
주입-국소화 아밀로이드증	인슐린	인슐린
유전성 신 아밀로이드증	피브리노겐	피브리노겐 단편들

본 발명에 따른 방법으로 치유가능한 질환으로는 헌팅턴 질환, 알츠하이머병, 낭포성 섬유증, 근위축성 측삭 경화증, 파킨슨병, 척수연수 근위축증, 척수소뇌성 실조증 1형, 2형, 3형, 6형 및 7형, 담창구시상하부 위축증, 스크레이피, 소의 해면상뇌병증, CJD 및 신규 변이체 CJD를 포함하는 프리온 질병 등도 포함된다.

투여 조성물은 시험관내 또는 생체내 모델에서 병인성 단백질의 응집을 파괴 또는 예방하는 것으로 사전 입증된 1 종 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함할 것이고 상기한 임의의 구조적 개질을 포함할 수 있다.

본 조성물은 1 종 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함할 것이고, 적어도 서열, 길이 또는 조성(예를 들어, 개질된 핵염기간 결합의 존재, 위치 및 개수에 있어서)의 임의의 하나 이상의 차이점을 갖는 2, 3, 4, 5, 10, 20, 25, 30, 40 및 많게는 50 내지 60개의 상이한 종을 포함할 수 있다.

제약학상 허용되는 담체 및(또는) 부형제가 임의로, 그러나 전형적으로 포함되고, 목적하는 투여방법에 따라 적합하게 선택된다.

제약 제제는 당업계에 잘 알려져 있고, 게나로의 문헌[Gennaro(ed.), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20^th ed., Lippincott, Williams & Wilkins(2000)(ISBN: 0683306472)], 안셀 등의 문헌[Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7^th ed., Lippincott Williams & Wilkins Publishers(1999)(ISBN: 0683305727)] 및 키베 문헌[Kibbe(ed.), Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association, 3^rd ed.(2000)(ISBN: 091733096X)]에 추가로 기재되어 있고, 이들 문헌 전부를 본 명세서의 참고문헌으로 삽입하므로, 본 명세서에서는 상세히 기재할 필요가 없다.

특히 핵산 투여를 위해 고안된 제약 제제도 또한 공지되어 있다.

예를 들어, 본 발명의 올리고뉴클레오티드와 사용될 예시적 담체의 하나로는 그 자체로는 생물학적 활성을 갖지 않고, 활성 올리고뉴클레오티드를 분해하거나 이를 순환으로부터 제거하는 것을 촉진함으로써 생체 내에서 활성 올리고뉴클레오티드의 생활성을 감소시킬 수 있는 생체내 프로세스에 의해 인식될 수 있는 핵산, 또는 그 유사체가 있다. 활성 올리고뉴클레오티드와 담체 핵산을 전형적으로는 과량의 불활성 물질과 함께 공동 투여함으로써 주로 불활성 담체와 공통 수용체에 대한 핵산 사이의 경쟁으로 인한 간, 신장 또는 기타 순환밖 저장소로부터 회복되는 활성 핵산의 양을 실질적으로 감소시킬 수 있다. 미야오 등의 문헌[Miyao et al, Antisense Res.Dev., 5:115-121(1995)] 및 타카쿠라 등의 문헌[Takakura et al., Antisense & Nucl. Acid Drug Dev., 6:177-183(1996)] 참조.

제약학상 허용되는 담체 및(또는) 부형제는 액체 또는 고체일 수 있고, 적어도 부분적으로는 목적하는 투여경로에 따라, 올리고뉴클레오티드 및 소정 제약 조성물의 다른 성분들과 혼합시 목적하는 벌크, 일관성 등을 제공하도록 선택되어 진다.

본 발명의 실시에 유용한 투여경로는 장내투여 및 비경구 투여 모두를 포함하고, 경구, 정맥내, 근육내, 피하, 흡입, 국소, 설하, 직장, 동맥내, 수질내, 난포막내, 심실속, 점막투과, 경피 투과, 비내, 복막내, 폐내 및 자궁내 투여를 포함한다.

신경세포내 단백질 응집 또는 오조립으로 인한 질병의 치료에서, 특정 투여 경로는 혈액/뇌 장벽을 통과하여 활성 올리고뉴클레오티드의 통과가 필요할 것이다.

유용한 실시태양에서는 올리고뉴클레오티드를 수송하고 그 표면이 파드리지(Pardridge)의 미국특허번호 제6,372,250호에 기재된 수 천 가닥의 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 덮힌 중성 리포좀을 이용한다. 상기 표면 코팅은 혈액 단백질의 리포좀 표면 부착을 방지하고 리포좀의 혈액으로부터의 제거를 감속시킨다. 이것은 또한 담체-매개된 이송 및 수용체 매개된 트란스시토시스 시스템에 의해 인식되는 리간의 부착 자리를 제공하여 리포좀이 혈액/뇌 경계를 통과할 수 있게 한다. 일부의 경우, 상기 리간드는 수용체 매개된 세포내이입(endocytosis) 시스템을 통한 세포에 의한 페길레이티드(pegylated) 리포좀의 흡수를 매개한다.

뇌에 위치하는 손상된 신경세포를 치유하는 다른 방법은, 인드웰링 카테타(indewelling catheter)와 같은 이식가능한 장치를 사용하여, 적당한 조성 중의 올리고뉴클레오티드를 신경세포 내로 직접 주입할 수 있다. 별법으로, 올리고뉴클레오티드 조성물은 비내 투입, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드를 함유하는 용액을 환자의 비 점막에 바르는 방법으로 투여된다. 이 투여 방법은 올리고뉴클레오티드의 뇌로의 후진 이송을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 따라서 환자를 수술하지 않고도 상기 올리고뉴클레오티드를 뇌 세포에 전달할 수 있다. 참고문헌 미국특허번호 제5,624,898호 및 제6,180,603호. 이 전문을 본 명세서에 참고문헌으로 삽입한다.

또다른 덜 선호되는 별법에서는, 삼투압 충격을 유도하는 통상적인 방법에 따라, 삼투압 충격에 의해 올리고뉴클레오티드를 뇌로 전달한다.

중추신경계내 신경 세포, 특히 뇌로의 전달을 최대화할 수 있는 기타 다른 전달 시스템 및 담체를 선택할 수 있다. 이러한 전달 시스템 및 담체는 당업자에게는 공지되어 있다. 이들 전달 시스템으로는 리포좀, 폼, 와퍼, 겔 및 피브린 클롯 등이 있다. 전달 시스템으로는 인드웰링 카테터와 같은 이식가능한 기구 및 주입 펌프 등이 있다. 전달 방법은 치료할 신경세포의 위치 및 유형에 따라 선택될 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 개개 환자의 임상적 상태, 투여 부위 및 방법, 투여 스케쥴, 환자 나이, 성별, 체중 및 기타 의학분야 종사자에게 알려진 요소를 감안하여 표준 의학계 관습에 따라 투여된다.

따라서 본 발명에서 약학적으로 "유효량"이란 당업계에 공지된 고려사항들을 감안하여 결정된다. 이 양은 임상적 징후 및(또는) 증상의 개선(예를 들어 오조립되거나 응집된 단백질 양의 감소 또는 증상의 제거 또는 개선 및 기타 다른 임상적 징후들을 포함하나 이에 한정되지는 않음)을 이루거나, 또는 질병의 징후나 증상의 발생이나 진행을 지연시키는데 효과적이다. 상술한 바와 같이, 1회 투여에서 치유나 상기의 개선 또는 지연이 달성될 것이라고 요구되지는 않는다.

제약조성물은 바람직하게는 단백질의 오조립 및 응집을 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 적어도 약 50%, 60%, 70%, 비록 이러한 드라마틱한 효과가 요구되지 않는다 하여도 가장 바람직하게는 적어도 약 80-100% 역행시키기에 효과적인 양으로 투여된다. 투여되는 양은 독성을 최소화하면서 단백질 오조립 및 응집의 역행을 최대화하는데 효과적인 양이 선호된다.

투여량은 손상된 세포의 수, 세포의 위치, 투여경로, 전달 방법, 치료가 국소적인지 전신적인지 및 치료가 다른 치료법과 조합하여 사용되는지에 따라 다를 수 있다. 투여량은 표준 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 당업자라면 환자의 상황에 따라 적정 투여량과 투여 스케쥴을 결정할 수 있다.

조성물은 바람직하게는 단백질의 오조립 및 응집이 완전히 역행될때까지 투여한다. 바람직하게는 조성물을 약 2일 내지 1년 투여하지만, 만성적 평생 투여도 배제하지는 않는다. 유리하게는, 투여시간을 다른 투여방법과 커플링시킬 수 있다. 올리고뉴클레오티드 투여는 수술 또는 기타 다른 약물과의 치료와 같은 다른 치료와 조합하여, 그 전 또는 그 후에 투여할 수 있다.

본 발명은 하기 비제한적 실시예를 참고하여 더 잘 이해될 것이다.

실시예 1

HD 유전자와 혼성화하지 않는 비특이적 올리고뉴클레오티드의 투여는 세포 배양 연구에서 HD 단백질의 응집 형성을 감소시킨다.

PC12 신경세포주(L. Thompson(UCI) 제공)을 사용하였다. 문헌[Boado et al., J. Pharmacol. and Experimental Therapeutics 295(1):239-243(2000)] 참조, 이 문헌의 개시내용을 참고로서 본 명세서에 삽입한다.

각 PC12 세포주는 그 유전체에 삽입된 HD 엑손 1과 GFP의 융합을 코딩하는 구조물을 갖는다(Kazantsev et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 96:11404-09(1999), 이 논문의 개시내용을 참고로서 본 명세서에 삽입한다).

이들 세포는 따라서 향상된 GFP 유전자에 융합된 교대적이고 반복적인 코돈... CAA CAG CAG CAA CAGCAA... 을 함유하는 조작된 HD 유전자 엑손 1을 포함한다. 이 융합 단백질의 발현은 단백질 응집 부위에 그린 형광을 나타낸다. 이 융합 유전자는 뮤리스테론에 의해 조절가능한 유도성 프로모터의 조절하에 있다.

이들 실험에 사용된 한 세포주는 대략 46 글루타민 반복(CAA 또는 CAG에 의해 코딩됨)을 갖는 구조물이고, 다른 세포주는 약 103 글루타민 반복을 갖는다.

C12 세포를 DMEM, 5% 말 혈청(열 불활성화됨), 2.5% FBS 및 1% Pen-Strep에서 배양하고, 제오신(Zeocin) 및 G418에서 소량으로 유지하였다. 트랜스펙션 24시간 전에 세포를 폴리-L-리신 커버슬립으로 코팅된 24-웰 플레이트에 5 x 10⁵ 세포/ml의 농도로 선택제 없이 플레이팅하였다.

표적 HD 유전자에 대한 서열 상보성을 가지지 않는 단일 가닥 DNA 분자를, HD 유전자 엑손 1-GFP 융합 유전자를 함유하는 PC12 세포에 첨가했다; 서열 상보성이 결여되어, 올리고뉴클레오티드는 헌팅틴 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA 또는 그 상보체와 감지할 수 있을 정도로 혼성화하지 않는다. 상기 올리고뉴클레오티드는 후술하는 바와 같이 변형된다.

리포펙타민 2000(LipofectAMINE 2000; "LF2000")을 LF2000 대 올리고뉴클레오티드의 다양한 비율에서 사용하여 트랜스펙션 조건을 최적화했다.

LF2000을 옵티-멤 I(Opti-Mem I) (무혈청 배지)로 5 분간 배양했다. 올리고뉴클레오티드를 첨가하고 실온에서 20 분간 추가로 배양했다. 지질/DNA 혼합물을 세포에 적용하고 37℃에서 밤새 배양했다. 밤새 배양 후 뮤리스테론을 첨가하여 HD 유전자 엑손 1-GFP의 발현을 유도한다. 프로토콜을 도 1A에 도시하였다.

별법으로, 뮤리스테론의 첨가에 의해 유전자 발현을 유도한 후 48 시간 후에 비 특이적 올리고뉴클레오티드를 PC12 세포에 첨가한다; 그리고 48-72 시간 후에, 공초점 현미경 검사로 세포를 가시화한다.

코히어런트(Coherent) 크립톤 아르곤 레이저 및 헬륨 네온 레이저 및 자이스(Zeiss) 510 LSM 공초점 현미경이 갖추어진 자이스 역전 100M 액시오스코프(Axioskop)로 데이터를 얻는다. 샘플을 랩-테크(Lab-Tek) II 챔버 커버 글래스 시스템에 로딩하여 이미지를 개선시킨다. 7회의 독립적인 실험으로 대물렌즈의 시야 영역 내에서 헌팅틴-GFP 응집의 수를 계수한다. "핀포인트(pinpoint) 응집"을 계수하는 데 있어서의 관찰자의 치우침을 제어하기 위하여, 수 명의 과학자에게 대조군 및 치료 세포 군으로부터 다양한 영역에서 헌팅틴-GFP 융합 단백질 응집체를 치우치지 않고 계수하도록 요청하였다.

올리고뉴클레오티드가 없는 경우, 프로모터의 활성화에 의해 높은 수준의 헌팅틴-GFP 융합 유전자 발현이 유도되며, 뒤이어 도 2A 및 3A에서 볼 수 있는 헌팅틴-GFP 융합 단백질 응집체(밝은 핀포인트)의 모습이 나타난다.

HD 유전자와 감지할 정도로 혼성화하지 않는("비 특이적" 또는 "HD 비 특이적") 올리고뉴클레오티드의 존재 하에 헌팅틴-GFP 융합 단백질 응집체의 존재의 가시적인 감소가 관찰된다. "Kan uD3T/25G"라고 명명된 올리고뉴클레오티드는 다음과 같은 서열 및 구조를 갖는다:

5'T*T*G*TGCCCAGTCGTAGCCGAAT*A*G*C 3' [SEQ ID NO: 1]

(Kan uD3T/25G)

여기서, 별표는 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다. 도 2B는, Kan uD3T/25G를 투여하면, 유도되었으나 트랜스펙션되지 않은 세포와 비교하여, 헌팅틴-GFP 융합 단백질 응집체가 감소한다는 것을 보여준다(도 2A).

Kan uD12T/25G라고 명명되고 다음과 같은 구조를 가진, 모든 포스포로티오에이트 결합을 갖는 25mer HD 비특이적 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 경우에도 유사한 결과가 나타났다.

5'T*T*G*T*G*C*C*C*A*G*T*C*G*T*A*G*C*C*G*A*A*T*A*G*C 3'

[SEQ ID NO: 2]

(Kan uD12T/25G)

여기서, 별표는 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다(도 2C 참조). 감소의 정도는 양 올리고뉴클레오티드의 경우에 실제로 유사하다: 도 2B 및 2C는 동일한 확대에서의 샷이 아니다.

모든 포스포로티오에이트 결합을 갖는 15mer 단일 가닥 HD 비 특이적 올리고뉴클레오티드로서 다음과 같은 서열을 갖는 Kan uD7T/15G에 대해서도 유사한 결과가 얻어졌다:

5'G*C*C*C*A*G*T*C*G*T*A*G*C*C*G 3' [SEQ ID NO: 3]

(Kan uD7T/15G)

여기서, 별표는 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다.

Kan uRD3/25G에 대해서도 헌팅틴-GFP 융합 단백질 응집체 형성의 감소가 또한 관찰되었다:

5'uugTGCCCAGTCGTAGCCGAATagc 3' [SEQ ID NO: 4]

(Kan uRD3/25G)

여기서, 각 말단은 세 개의 2'0-Me 유사체(소문자로 나타냄)를 갖는다. 도 3B와 도 3A를 비교해볼 수 있다.

그러나, 두 개의 다른 비 특이적 올리고뉴클레오티드(각각 Kan uR/25G 및 Kan uR/15G로 명명된)는 효과를 거의 또는 전혀 가지지 않는다. Kan uR/25G(도 3C 참조)는 모든 2'-OMe 유사체(소문자로 나타냄)를 함유하는 25-mer이다:

5'uugugcccagucguagccgaauagc 3' [SEQ ID NO: 5]

(Kan uR/25G)

그리고 Kan uR/15G는 모든 2'-OMe 유사체(소문자로 나타냄)를 함유하는 15-mer이다:

5'gcccagtcgtagccg 3' [SEQ ID NO: 6]

(Kan uR/15G).

Kan uRD3/25G의 존재로 인한 응집체 형성의 감소는 Kan uD3T/25G 또는 Kan uD12T/25G의 존재로 인해 관찰되는 것만큼 크지는 않다.

특정 실험에서, HD 유전자에 특이적이지 않은 과량의(>25 μg) 올리고뉴클레오티드가 트랜스펙션될 때에만 전술한 헌팅틴-GFP 융합 단백질 응집체 형성 효과의 감소가 관찰된다. 헌팅틴-GFP 융합 단백질 응집체 형성을 감소시키는 데 요구되는 HD 비 특이적 올리고뉴클레오티드의 최적 양은 변할 수 있으며 쉽게 측정될 수 있다.

요약하면, 각각의 말단에 세 개의 포스포로티오에이트를 가지는 Kan uD3T/25G, 또는 모든 포스포로티오에이트로 치환된 Kan uD12T/25G 또는 Kan uD7T/15G와 같은, 비 특이적 단일 가닥 DNA는, 유도후에 형성되는 HD 단백질 응집체 수를 감소시키는 데 있어 효과적이다. Kan uRD3/25G와 같은, 각각의 말단에 2'-0-메틸 RNA를 갖는 단일 가닥 DNA는 효과적이긴 하지만 Kan uD3T/25G 또는 Kan uD12T/25G보다는 덜하다. 비 특이적 이중 가닥 키메라 RNA/DNA 올리고뉴클레오티드 또한 응집체 수를 감소시키는 데 있어서 덜 효과적이다(나타내지 않음). Kan uR/25G 또는 Kan uR15/G와 같은, 2'-0-메틸 RNA 잔기를 가진 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 효과가 거의 또는 전혀 없다.

이와 동일한 실험 시스템을 사용하여, 상이한 길이, 상이한 염기 조성, 상이한 염기 변형 및 상이한 농도를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 검사하여 HD 응집분리를 일으키는 최적의 길이, 조성, 서열 및 농도를 결정한다.

유사한 시스템을 고안하여 α-시뉴클레인, Aβ 및 프리온과 같은 기타 단백질의 응집을 분해하는 최대의 능력을 가지는 올리고뉴클레오티드를 동정한다.

실시예 2

상이한 조성의 짧은 올리고뉴클레오티드를 사용하는 세포 배양 연구

실시예 1에 더하여, 몇몇 다른 단일 가닥 DNA 분자를, HD 유전자 엑손 1-GFP 융합 유전자를 함유하는 PC12 세포에 첨가한다. 올리고뉴클레오티드는 "+" 접두사로 표시된 LNA 잔기를 포함하여, 다음을 포함한다.

5'+C+T+CA+GG+AG+T+C+AG+G+TG 3' [SEQ ID NO: 7]

(klo17LNA)

5'+T+T+GTGCCCAGTCGTAGCCGAAT+A+G+C 3' [SEQ ID NO: 8]

(Kan klo1: 25mer)

5'+G+C+C+C+A+G+T+C+G+T+A+G+C+C+G 3' [SEQ ID NO: 9]

(Kan klo2)

5'+G+C+C+CAGTCGTA+G+C+C+G 3' [SEQ ID N0: 10]

(Kan klo3)

5'+C+A+G+T+C+G+T+A+G 3' [SEQ ID NO: 11]

(Kan klo4)

PC12 세포([Boado et al., J. Pharmacol. and Experimental Therapeutics 295(1):239-243(2000)])를 사용한다. 이들 특정 PC12 세포는 eGFP(강화(enhanced) GFP) 융합 리포터 구조체에 융합된 HD 유전자의 제1 엑손에, 폴리 Q 트랙(tract)을 코딩하는 CAG/CAA 트랙 중 약 103의 CAG 또는 CAA 반복을 함유한다. 이 PC12 세포주는 그 게놈에 통합된 구조체(실시예 1 및 2 및[Kazantsev et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 96:11404-09(1999)] 참조)를 갖는다. 따라서 이들 세포는 GFP 유전자에 융합된 교대의 반복 코돈 ... CAA CAG CAG CAA CAG CAA...를 함유하는 조작된(engineered) HD 유전자 엑손 1을 함유한다. 실시예 1에 기재된 바와 같이, 이들 PC12 세포 중의 HD 유전자 엑손 1-GFP 융합 유전자는 뮤리스테론에 의해 조절되는 유도가능한 프로모터의 제어 하에 있다.

실시예 1에 기재된 이들 PC12 세포에 대한 프로토콜([Boado et al., J. Pharmcol Exp Ther. 295(1):239-243(2000)])은 실질적으로 다음과 같다.

klo17LNA의 존재 하에 헌팅틴-GFP 단백질 응집체의 외관의 가시적인 감소가 관찰되지 않는다. 실제, 이 실시예에서 상기 나타난 LNA 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드 중 어느 것도 헌팅틴-GFP 단백질 응집체 형성을 감소시키지 않는다. Kan uD12T/25G는 이들 세포에 대해 독성 효과를 갖는다(즉, 더 많은 세포 사멸을 야기한다). 도 4A를 참조할 수 있다.

실시예 3

세포 배양 연구

이 연구에서, 통합 카피의 폴리(103) Q-eGFP 융합 유전자를 함유하는 PC12 세포주 중의 응집체 형성을 억제하는 능력에 대하여 수 개의 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드를 테스트한다.

PC12 세포(PC12-HD103QE, UCI의 Dr. L. Thompson로부터 선사받음)를 DMEM, 5% 말 혈청(열 불활성화된), 2.5% FBS, 1 % Pen-Strep, 0.2mg/ml Zeocin, 및 100 μg/ml G418 중에 유지한다. 선별하지 않고 배지 중에서 트랜스펙션시키기 전에 24시간 동안 5x10⁵ 세포의 밀도로 폴리-D-리신 커버슬립에 의해 코팅된 Lab-Tek II 용기 중에 세포를 플레이팅한다.

2 μg/ml 리포펙타민(LipofectAMINE) 2000(LF2000, Invitrogen Corp. , Carlsbad, CA)에서 트랜스펙션 조건이 최상인 것으로 나타났다. 샘플을 Opti-Mem I 감소-혈청 배지(Invitrogen Corp. , Carlsbad, CA)로 5 분간 배양한 후, 올리고뉴클레오티드를 첨가한다; 배양은 실온에서 20 분간 지속된다. 이어 상기 지질/올리고뉴클레오티드 혼합물을 적용하고, 24 시간 후에, 융합 유전자 발현을 위해 5mM 뮤리스테론(Invitrogen Corp.)으로 세포를 유도하였다.

코히어런트 크립톤 아르곤 레이저 및 헬륨 네온 레이저 및 자이스 510 LSM 공초점 현미경이 구비된 자이스 역전 100M 액시오스코프(Axioskop)를 사용하여 트랜스펙션 후 72 시간 동안 단백질 응집체를 모니터링하였다.

복수의(≥3) 무작위로 고른 영역 중에서 100X 대물렌즈를 사용하여 시야 영역당 대략 500 세포를 분석하고, 익명의 샘플로부터 계수를 기록한다. 봉입체(inclusion body)를 함유하는 세포의 수를 HD-eGFP 융합 단백질을 발현하는 세포의 총 수로 나누어 응집체를 함유하는 세포의 백분율을 계산한다. 양(positive)으로 기록되기 위해, 세포는 하나 또는 그 이상의 응집체를 가져야 한다. 4개의 독립적인 실험의 평균을 포함시켜 응집체를 가진 세포의 수를 결정한다.

봉입체를 가진 eGFP-발현 세포의 비율을 리포좀으로 처리되었으나 표적화 벡터로는 아닌 eGFP-발현 세포의 비율로 나누어 유도된 값인 교차비, 및 표준 편차를 문헌[Carmichael et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:9701-9705(2000)]에 기재된 대로 결정한다.

이 연구에 사용된 올리고뉴클레오티드의 서열을 아래에 나타내었다. 이들 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트(*), 인터뉴클레오시드 결합, 고정 핵산(Locked Nucleic Acid; LNA) 잔기(+) 또는 2'-O-메틸 잔기(소문자)와 같은 변형을 다양하게 함유한다.

HD3S/53T

5'-C*G*A*GTCCCTCAAGTCCTTCCAACAGCTGCAACAGCAAC

AACAGCAGCAAC*A*G*A-3' [SEQ ID NO: 12]

HD3S/53

5'-G*C*T*GTTGCTGCTGTTGTTGCTGTTGCAGCTGTTGGAAGGACT

TGAGGGAC*T*C*G-3' [SEQ ID NO: 13]

HD3S/15

5'-C*T*G*TTGCAGCTG*T*T*G-3' [SEQ ID NO: 14]

HD3S/9

5'-T*T*G*CAG*C*T*G-3'[SEQ ID NO: 15]

HD1S/9

5'-T*TGCAGCT*G-3' [SEQ ID NO: 16]

HD1S/6

5'-C*AGCT*G-3' [SEQ ID NO: 17]

HD1S/9-NS

5'-G*TCGTAGC*C-3' [SEQ ID NO: 18]

HD1S/6-NS

5'-G*TCGT*A-3' [SEQ ID NO: 19]

HD3S/53T는 각각의 말단에 세 개의 포스포로티오에이트 결합을 함유하는 53-mer이며, HD 유전자의 전사되는 가닥에 상보적이다. HD3S/53은 구조 면에서 동일하지만, 전사되지 않는(NT) 가닥에 상보적이다. 유사하게, HD3S/15 및HD3S/9는 NT 가닥에 상보적이지만, 길이에 있어 각각 15 및 9 염기이다. HD1S/9 및 HD1S/6는 또한 "특이적 NT" 올리고-즉, HD 유전자에 상보적-이나, 각각의 말단에 단 한 개의 포스포로티오에이트 결합을 함유한다. 더 짧은 서열이 53-mer에 함유된 HD-서열의 중앙 영역을 포괄한다. 다른 올리고뉴클레오티드에서, 길이가 상이한 티오에이트 및 디에스테르 결합 연결 올리고머 숫자 사이의 대략의 비율을 유지하기 위하여(53 대 15 대 9 대 6), 9-mer 및 6-mer에서 포스포로티오에이트 결합의 수는 3개에서 1개로 감소한다.

상기 올리고뉴클레오티드 중 다른 것들, HD1S/9-NS 및 HD1S/6-NS는 비특이적(NS) 올리고머(즉, HD-유전자 서열에 상당한 상보성을 가지지 않는)이며, 각 말단에 단일 포스포로티오에이트 결합을 함유한다.

각각의 올리고뉴클레오티드는 동일한 몰 량에서 미지수의 통합 카피의 융합 유전자 HD103QE를 함유하는 PC12 래트 크롬친화성세포종 세포주 내로 트랜스펙션된다. 이 통합 유전자는 103 개의 CAG 반복을 함유하는 절단된 Htt 서열로서, C 말단에서 강화된 녹색 형광 단백질(eGFP) 태그에 융합되고 뮤리스테론에 의해 유도 가능하다([Kazantsev et al, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 96:11404-11409(1999)]). 각 올리고뉴클레오티드에 대해 5 μg과 동등한 몰 양은 세포 독성을 나타내지 않는 반면, 각 올리고뉴클레오티드의 25 μg 당량은 다양한 결과를 가져오며, 어떠한 경우 지속적인 독성을 가져온다.

도 1B는 이들 올리고머의 응집체 형성 억제에 대한 영향을 평가하는 데 사용되는 실험 프로토콜을 도시한다. 반응을 개시하기 위해, 세포를 소량의 제오신(Zeocin) 및 G418 중에 유지하고, 폴리-D-리신 커버슬립(coverslips)으로 코팅된 랩-테크(Lab-Tek) II 챔버 중에 플레이팅한다. LF2000을 사용하여 상기 올리고를 트랜스펙션시키고, 24 시간 후에, 뮤리스테론으로 세포를 유도한다. 단백질 응집체는 24 시간 후에 처음 나타나고 유도 후 48 및 72 시간 사이에 최대치에 도달하였다.

샘플을 랩-테크(Lab-Tek) II 챔버 커버-유리 소자에 로딩하여 이미지 분석을 개선시키고 정량을 가능케 한다. 코히어런트 크립톤 아르곤 및 헬륨 네온 레이저를 사용하는 자이스 역전 100M 액시오스코프 공초점 현미경(510LSM) 중에서 세포를 관찰하여 단백질 응집 저해를 측정한다. 보지 않고 세 개의 무작위적으로 선택된 시야 영역에서 봉입체(inclusions)를 계수하고, 각각은 대략 500 개의 세포를 함유한다.

4 개의 독립적인 실험의 평균으로부터의 결과를 도 5에 나타내었다.

응집체를 함유하는 eGFP-발현 세포의 비율을, 리포좀은 있지만 첨가된 올리고뉴클레오티드는 없는 모조(mock) 트랜스펙션 중의 eGFP-발현 세포의 비율로 나누어 유도된 교차비로서, 응집체 또는 봉입체의 수를 표현한다. eGFP를 발현하는 세포의 총 수는 날에 따라 다를 수 있지만 봉입체를 가지는 세포의 상대적인 비율은 실험에 따라 약간씩만 차이가 나기 때문에, 이는 가시적인 응집체를 평가하기 위한 대략적인 통계치이다. 우리 실험에서 사용되는 세포주가 단일 클론성 단리물이기 때문에, eGFP를 발현하는 세포의 백분율은 90%를 넘는다. 세포 생존능력은 실험들 사이에 일치하는 것으로 나타난다(트리판 블루 염색(Trypan Blue staining)을 통해 > 90%).

도 5는 트랜스펙션 후 72 시간 후에 분석된 실험으로부터 얻은 데이터, 융합의 충분한 발현을 가능케 하는 시간 점 및 봉입체의 축적에 적당한 시간을 나타낸다.

모조 트랜스펙션된 세포의 약 90%가 eGFP 융합 단백질을 발현하는 것으로 나타나며, 이들 세포 중, 60-65%가 식별가능하고 가시적인 봉입체를 함유하며, 종종 세포당 수 개를 함유한다. 대조군에서, 유도된 PC12 세포는 리포좀 캐리어를 가진 모조 트랜스펙션을 경험하며 기저선 교차비를 산출한다. 괄호 안의 숫자는 4번의 개별적인 실험으로부터 500 세포의 영역 당 발견된 응집체를 가진 세포의 평균 분획을 나타낸다. 반면, 표준 편차 바아는 교차비 데이터 중의 평방편차(variance)를 나타낸다.

특정 올리고뉴클레오티드를 리포좀과 혼합하여 트랜스펙션시키면, 봉입체 형성의 억제가 관찰된다: 올리고뉴클레오티드 HD3S/53T 및 HD3S/53은, 비록 HD 유전자의 전사(T) 또는 비전사 가닥 중 하나와 혼성화하도록 고안되었지만, 봉입체 수를 50% 이상 감소시킨다. 올리고뉴클레오티드를 단축하면 이 성질을 보존한다: HD3S/15(15-mer) 및 HD3S/9(9-mer)는 53-mer 정도로 효과적이다.

우리는 9-mer 및 6-mer 중에서 비례하여 포스포로티오에이트 결합의 수를 감소시켜 포스포로티오에이트 대 포스포디에스테르 염기 결합의 비율을 더 큰 올리고머 중의 변형의 비율과 대략 동일하도록 유지한다. 도 5에 나타난 바와 같이, 3' 및 5' 말단에 단일 포스포로티오에이트 결합을 함유하는 9-mer 및 6-mer 양자 모두 PC12 세포 중 응집체 형성 억제에 있어 활성을 유지한다. 이 변형을 제거하면 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 소화가 일어나 재현불가능하고 일관성없는 결과가 나타난다(데이터 나타내지 않음).

생체 내 비변형 올리고머의 반감기는 종종 분(20)으로 측정되며, 세포 중 유리 데옥시리보뉴클레오티드의 수준 자체가 엄격하게 조절되기 때문에 심지어는 세포에 잠재적으로 소화가능한 DNA 분자를 제공하는 것이 세포 대사에 영향을 줄 수 있다.

다음, 우리는 가장 짧은 올리고머들의 서열을 스크램블링하여 HD 유전자에 대한 서열 상보성을 갖지 않도록 한다. 도 5에 나타난 바와 같이, HD1S/9-NS 및 HD1S/6NS(양자 모두 비 특이적)는 봉입체 형성 방지에 있어 또한 효과적이다; 사실, 봉입체 감소 수준은 HD3S/53 올리고머에서 나타난 것에 필적한다. 분명히, 뉴클레오티드 서열은 봉입체 형성의 억제에 있어서 인자가 아니다.

올리고뉴클레오티드의 길이가 봉입체 형성 억제에 있어서 중요한 인자가 아닌 것으로 나타나므로, 최소한 53 내지 6 nt의 범위 내에서, 우리는 상이한 염기 변형을 가진 일련의 25-mer(상기 개괄한 분자 종의 평균 길이)를 합성한다.

서열을 하기에 나타내었으며, 포스포로티오에이트 결합은 별표로, 2'-OMe 잔기는 소문자로 나타내었다:

HD12S/25-NS

5'-T*T*G*T*G*C*C*C*A*G*T*C*G*T*A*G*C*C*G*A*A*T

*A*G*C-3' [SEQ ID NO: 20]

HD3S/25-NS

5'-T*T*G*TGCCCAGTCGTAGCCGAAT*A*G*C-3' [SEQ ID NO: 21]

HDR/25-NS

5'-ttgtgcccagtcgtagccgaatagc-3' [SEQ ID NO: 22]

HD3R/25-NS

5'-ttgTGCCCAGTCGTAGCCGAATagc-3' [SEQ ID NO: 23]

HD/58

5'-CAGCAGCAGTAGCAGCAGCAGCUUUUgcugcugcugcugcugcug

cugcuguuuuCAG-3' [SEQ ID NO: 24]

HD12S/25-NS는 25-mer이며, HD 융합 유전자에 비특이적이고, 모든 PS 결합을 함유한다.

HD3S/25-NS는 25-mer이고, HD 융합 유전자에 비특이적이고, 3 말단 PS 결합을 함유한다.

HDR/25-NS는 25-mer이고, HD 융합 유전자에 비특이적이고, 모든 2'-0- 메틸 RNA를 함유한다.

HD3R/25-NS는 25-mer이고, HD 융합 유전자에 비특이적이고, 3 말단 2'-0-메틸 RNA 잔기를 함유한다.

HD3L/25-NS는 25-mer이고, HD 융합 유전자에 비특이적이고, 각 말단에 3 LNA 잔기를 함유한다.

HD/58은 58-mer이고, 이중 가닥 헤어핀 분자이며, CAG 반복에 대해 특이적이다.

도 6에 나타난 바와 같이, HD12S/25-NS-각 결합이 포스포디에스테르이기 보다는 포스포로티오에이트인 비특이적 올리고-는, 도 5에 나타난 데이터와 비교하여 근소한(marginal) 봉입체 감소에 대한 효과를 갖는다. 이는 뉴클레아제 저항성을 부여하는 변형인 모든 2'-O-메틸 RNA 염기를 함유하는 올리고머인 HDR/25-NS, 및 DNA 잔기의 구조를 바꾸고 이를 더욱 RNA처럼 만드는 변형인 모든 고정된(locked) 핵산으로 구성된 15-mer인 HDL/15-NS에 대해서도 마찬가지이다. 말단 포스포로티오에이트 결합의 중요성은, 각 말단에 세 개의 고정된 핵산 잔기 또는 세 개의 2'-0-메틸 RNA 잔기를 가진 두 개의 25-mer인, HD3L/25-NS 및 HD3R/25-NS로부터 얻어진 결과에 의해 강조된다. 이들 올리고머를 사용하는 경우, 봉입체의 감소가 거의 또는 전혀 관찰되지 않는다.

올리고뉴클레오티드의 단일 가닥 특성의 중요성을 조사하기 위하여, 우리는 30 염기 사이에 내부적인 상보성을 지녀 유리 말단 없이 자발적으로 이중 가닥 헤어핀으로 폴딩되는 단일 가닥 58-mer를 만들었다. 이 분자를 PC12 시스템 중에서 테스트할 때, 응집 억제에 비효과적인 것으로 나타난다(도 6). 양성 대조군으로서, 우리는 양쪽 말단에 세 개의 포스포로티오에이트 결합을 다시 가지는 비특이적 25-mer인 HD3S/25-NS를 테스트한다; 이 분자는 53-mer, 15-mer, 및 9-mer 친척과 유사한 수준에서 봉입체 형성 억제에 꽤 효과적인 것으로 나타난다.

따라서, 올리고뉴클레오티드의 길이 및 서열은 중요하지 않은 것으로 나타나는 반면, 염기 또는 결합 변형의 수 및 유형 및 단일 가닥 특성은 유도가능한 PC12 세포 중에서 봉입체 형성 억제에 중요한 것으로 나타난다.

실시예 4

헌팅틴 응집체의 분리 검출을 위한 세포 생존 검정

eGFP(강화 GFP) 유전자(Dr. Erik Schweitzer, UCLA로부터 선사받음)에 융합된, 103 폴리글루타민 반복(각 Q는 CAA 또는 CAG에 의해 코딩됨; 본질적으로 교대하는 CAACAG)를 함유하는 헌팅틴의 제1 엑손을 함유하는 세포주인 PC12/pBWN:httex를 사용한다. 이 세포주는, 폴리 Q 트랙(본원에 참고로 인용된[Schweitzer et al., J. Cell. Science 96:375-381(1990)] 참조)을 코딩하는 본질적으로 교대하는 CAACAG를 가지는 구조물을 혼입하였다. 헌팅틴-eGFP 융합의 발현을 지정하는 프로모터는 엑디손(ecdysone) 유사체에 의해 조절된다.

유도 후에 헌팅틴 응집체 형성이 압도적이기 때문에 이들 세포는 유용하다; 결국, 세포는 사멸한다. 따라서, 지속된 녹색 형광에 의해 나타나는 바와 같이, 헌팅틴 응집체 형성의 파괴는 궁극적으로 세포 수명 및 증식을 연장한다. 연장된 세포 수명을 세심하게 측정한다.

세포가 느린 성장율을 가지기 때문에, 트랜스펙션 전 4-5일에 1x10⁵ 세포를 폴리-D-리신 코팅된 T25 플라스크 중에 통과시킨다. 500 ㎕ 옵티멤(Optimem)과 혼합된 5 μg 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로 10 μg 리포펙타민2000을 사용하여 세포를 트랜스펙션시킨다. 다음 올리고뉴클레오티드를 이 검정에서 테스트한다: Kan uD3T/25G, Kan uD12T/25G, Kan uRD3/25G.

트랜스펙션 후 24 시간 후에 0.1 μM 테부페노지드를 첨가하여 세포를 유도한다(제1일). 유도 후 제2, 3, 6 및 7일에 공초점 현미경 사진을 촬영한다.

유도 후 제7일에, 올리고뉴클레오티드로 처리한 플라스크 중에 약 1%의 세포가 생존한다; 대조적으로, 유도 후 제6일에, 비처리 세포(ut)는 생존하지 않는다.

따라서, 이들 세포를 단일 가닥 DNA 분자로 처리하면 헌팅틴 응집체의 분리가 야기되고 이들 세포의 생존이 증가한다.

따라서, HD 유전자에 비특이적인 단일 가닥 DNA 분자는 이들 세포 중에서 헌팅틴 단백질 응집체의 분리를 야기하며, 이는 이들 세포 중에서 세포 생존으로서 명백하다.

이 세포 시스템을 사용하여, 단백질 응집의 붕괴를 일으키고 세포 생존을 연장시키는 올리고뉴클레오티드를 동정할 수 있다.

실시예 5

세포 생존 검정 실험

PC12 세포/pBWN-Httex1-HD103QE(UCLA, Dr. E. Schweitzer로부터 선사받음)를 DMEM(고(高) 글루코스), 5% FBS, 10% 말 혈청(미국 캘리포니아 칼스배드 소재, Invitrogen Corp.), 1 % Pen-Strep 및 25mM HEPES, pH 7.4 중에 유지하고 9.5% C02 중에서 37℃에서 키운다. 세포(10⁵)를 트랜스펙션 전 48시간에 폴리-D-리신 코팅된 T25cm² 플라스크 중에 플레이팅한다. 2:1 비율의 리포펙타민2000 대 올리고뉴클레오티드를 사용하여 Opti-Mem I 중에서 트랜스펙션을 수행한다.

트랜스펙션 후, 0.1 μM 테부페노지드로 세포를 유도하여 htt-eGFP 융합을 발현시킨다. 코히어런트 크립톤 아르곤 레이저 및 헬륨 네온 레이저 및 자이스 510 LSM 공초점 현미경이 구비된 자이스 역전 100M 액시오스코프를 사용하여 유도 후 24 시간에 세포 생존 측정을 시작한다. 유도 후 7일의 기간에 걸쳐 공초점 사진을 촬영하고, 플라스크에의 부착에 의해, 생존 세포를 생존하지 못한 세포와 구분한다. 최소한 다섯개의 무작위로 선택된 영역에서 시야 영역당 약 500 세포가 계수되며 4회의 독립적 실험에 대해 평균한다.

봉입체가 HD-관련 신경독성과 상호연관되기 때문에, 우리는 도 1C에 나타난 프로토콜로 세포 생존에 올리고뉴클레오티드가 미치는 영향을 테스트한다. 이를 위해, 우리는, 실시예 1-3에서 사용된 세포주와 대조적으로 유도 후 급속히 사멸하는 HD103QE를 함유하는 독립적으로 유도된 PC12 세포주를 사용한다([Schweitzer et al., J. Cell Sci. 96:375-381(1990); Suhr et al., Proc. Natl. Acad. Sc . USA 95:7999-8004(1998)]).

각 말단에 1 포스포로티오에이트 결합을 가진다는 점에서 구조상 그 관련 분자 HD3S/9(상기 실시예에 서열 주어짐)와 유사한 HD1S/9(9mer)(상기 실시예에 서열 주어짐)로 트랜스펙션 전 48 시간 전에 세포를 플레이팅한다. 상기한 바와 동일한 방법을 사용하여 유도 후 14일간 생존하는 세포의 수를 공초점 현미경법으로 평가한다. 다시, 이틀 후, 및 순차적인 날들에, 4번의 별도 실험에서 다섯 개의 상이한 무작위 선택 영역에 대해 시야 영역 당 약 500 세포를 익명으로 계수한다. 유도 후 24 시간 후에 살아있는 세포의 측정을 시작하며 후속적인 측정은 도 7에 나타낸 시점에서 한다.

모조 트랜스펙션을 경험하는 세포는 유도 후 72시간 이내에 사멸한다. 제4일에, 모조-처리 샘플 중에는 살아있는 세포가 관찰되지 않지만, HD1S/9-NS로 처리한 세포에서는 7일동안 생존이 관찰된다. 죽은 세포는 모든 샘플에서 명백하지만, 생존한 세포는 플라스크 표면에의 부착에 의해 쉽게 검출된다(도 8).

살아남지 못한 세포는 배양 플라스크 중에서 분리되고 소집되어(round up) 현탁된 채로 잔류한다; 이들은 계수 전에 접시로부터 배지를 흡입함으로써 쉽게 제거된다. 7일 후, 거의 40%의 세포가 생존한 채로 남으며, 14일 후 생존한 세포 개체수는 두 배 이상이 되었다.

폴리글루타민 반복 길이가 25라는 점 외에는 Q103을 함유하는 PC12 세포주 유도체와 동일한 세포주인 PC12/pBWN-httex1-HD25QE를 세포 생존 검정에 대한 대조군으로서 사용한다. 유도 후, 7일간의 배양 후에 단지 5%의 세포 생존 감소가 관찰되며, 임의의 올리고뉴클레오티드의 첨가는 이들 세포의 생존에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(데이터 나타내지 않음).

실시예 6

응집 억제에 대한 시험관 내 검정

두 개의 무작위로 선택된 PCR 프라이머를 포함하는 수 개의 올리고뉴클레오티드를, 시험관내 돌연변이 헌팅틴 응집 검정에서 억제 효과에 대해 테스트한다.

이 검정은 본질적으로 문헌[Huang et al.,Somat. Cell Mol. Genet. 24(4):217-33(1998)]에 기재된 대로 수행하며, 이 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본원에 참고로 포함된다. 간략히, 58 글루타민 잔기를 함유하는 돌연변이 헌팅틴 N-말단 단편이 박테리아 중에서 GST 융합으로서 발현된다. 정제된 융합 단백질을 프로테아제로 처리하여 N-말단 htt 단편을 방출하며, 이는 24시간 이내에 완전히 응집체를 형성한다. 실험 샘플은 40 μM의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 응집체 형성이 완료된 후, 적합한 세공 크기를 가진 셀룰로스 아세테이트 멤브레인 상에 응집체를 포획하여 정량한다.

도 9A 및 9B는 헌팅틴 응집체의 형성에 대한 테스트 올리고뉴클레오티드의 영향을 나타낸다.

예상한 대로, 공지 억제제인 콩고 레드(Congo Red)는 응집체 형성을 완전히 차단한다.

두 개의 무작위로 선택된 PCR 프라이머를 비롯하여 시험한 올리고뉴클레오티드는 모두 응집에 대해 억제 효과를 나타냈다. 이는 억제가 서열 특이적인 것이 아니라는 상기 실시예에서 논의한 결과와 일치한다. 시험한 올리고뉴클레오티드 중에서, HD3S/53은 50%를 초과하는 억제를 나타냈고(음성 대조군에 대해 정규화), HDR/25G는 85%를 초과하는 보다 강한 효과를 나타냈다.

HDR/25G는 HDR/25-NS와 동일하다.

이러한 결과는 올리고뉴클레오티드와 돌연변이 헌팅틴의 폴리Q 트랙(tract) 간의 직접적인 상호작용을 시사한다.

첫째, 보다 긴 올리고뉴클레오티드가 보다 짧은 올리고뉴클레오티드보다 강한 억제 효과를 나타냈다.

길이와 효과의 관계는 앞선 실시예에서의 세포-기반 검정법에서보다는 본 실시예의 시험관내 검정법에서 보다 용이하고 직접적으로 평가되는데, 이는 세포-기반 검정법의 배양된 세포 내에 존재하는 뉴클레아제가 없기 때문이다. 본 실시예에 사용한 시험관내 검정법에서, 9 내지 18 뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오티드는 동일한 약한 효과를 나타냈다. 36mer인 PCR 프라이머 1은 보다 강한 효과를 나타냈고(25% 억제), 53mer인 HD3S/53은 가장 강한 억제 효과를 나타냈다. 길이가 증가하면 억제 효과가 증가하는 것이 명백하다.

둘째, RNA가 DNA보다 훨씬 더 효과적이었다. 시험관내 검정법의 pH인 pH 약 8.0에서는, 추가의 리보스 히드록실기가 용이하게 수소결합을 형성할 수 있다. 이같은 RNA 올리고뉴클레오티드의 보다 높은 효과는, 폴리Q 트랙에서 올리고뉴클레오티드와 글루타민 잔기 간의 수소결합 형성을 통해서처럼 추가의 수소결합이 응집체의 억제에 직접적으로 관여하고, 이러한 상호작용이 헌팅틴 단편 자체 간의 상호작용을 억제하여 응집체 형성을 억제한다는 것을 암시하고 있다.

실시예 7

헌팅틴 응집체의 파괴에 효과적인 4염기 단일가닥 올리고뉴클레오티드의 동정

다수의 올리고뉴클레오티드를 헌팅틴 응집체를 파괴하는 능력에 대해 스크리닝하기 위해, 4염기 단일가닥 올리고뉴클레오티드의 가능한 256개 모두를 합성했다.

하나의 세트는 5'-첫째 염기(5'-most base)의 포스포로티오에이트 결합으로 개질시키고, 다른 세트는 3'-마지막 염기(3'-most base)의 포스포로티오에이트 결합으로 개질시켰으며, 추가의 세트는 올리고뉴클레오티드 전체에 걸쳐서 포스포로티오에이트 결합으로 개질시켰다. 그렇지 않다면, 모든 염기들은 표준 디옥시리보뉴클레오티드였다.

이러한 4-mer 올리고뉴클레오티드를 일정 범위의 농도에 걸쳐 실시예 1-2 및 실시예 3에 각각 설명한 검정법 중 하나 또는 둘 다에 따라, 헌팅틴 단백질 응집체의 분리 능력에 대해 개별적으로 시험했고, 가장 효과적인 4-mer 올리고뉴클레오티드를 동정했다.

실시예 8

단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 HD 트랜스제닉 동물 모델 시스템으로의 투여는 헌팅턴 단백질 응집체 감소를 야기한다

헌팅턴병에 대한 동물 모델 시스템을 수득했다.

예를 들어, 문헌[Brouillet, Functional Neurology 15(4):239-251(2000)]을 참조하고, 이 문헌의 개시 내용은 본원에 참고자료로 삽입된다. 또한, Ona et al., Nature 399:263-267(1999), Bates et al., Hum. Mol, Genet. 6(10):1633-7(1997) 및 Hansson et al., J. Neurochem. 78:694-703을 참조하고, 이 문헌의 개시 내용은 본원에 참고자료로 삽입된다. 또한, Rubinsztein, Trends in Genetics, 18(4):202-209(2002)를 참조하고, 이 문헌의 개시 내용은 본원에 참고자료로 삽입된다.

예를 들면, 인간 헌팅틴 단백질, 그의 일부, 또는 인간 헌팅턴 단백질 또는 그의 일부를 포함하는, 예를 들면 폴리-Q 트랙을 코딩하는 엑손 1의 CAG 반복 분절 중 36 이상의 CAG 반복(별법으로, 임의의 수의 CAG 반복은 CAA일 수 있다)과의 융합 단백질을 발현하는 트랜스제닉 마우스이다.

상기 트랜스제닉 마우스주는 예를 들어, R6/2 주(Mangiarini et al., Cell 87:493-506(1996), 이 문헌의 개시 내용은 전체로서 본원에 참고자료로 삽입된다)이다. R6/2 마우스는 트랜스제닉 헌팅턴병 마우스로서, 인간 HD 유전자의 엑손 1을 과발현한다(내인성 프로모터의 조절하에). R6/2 인간 HD 유전자의 엑손 1은 연장된 CAG/폴리글루타민 반복 길이를 갖는다(평균 150의 CAG 반복). 이 마우스는 인간 헌팅턴병의 다수 특징들을 갖는, 진행성이고 궁극적으로는 치명적인 신경 질환을 일으킨다. 부분적으로는 헌팅틴의 N-말단 부분(HD 엑손 1에 의해 코딩됨)으로 구성되는 비정상적인 응집체는, R6/2 마우스의 세포질과 세포핵 모두에서 발견된다(Davies et al., Cell 90:537-548(1997), 이 문헌의 개시 내용은 본원에 참고자료로 삽입된다). 바람직하게는, 트랜스제닉 동물의 인간 헌팅틴 단백질은 55 이상의 CAG 반복을 갖고, 보다 바람직하게는 약 150 CAG 반복을 갖는다. 이러한 트랜스제닉 동물은 헌팅턴병-유사 표현형을 나타낸다.

상기 트랜스제닉 마우스는 출생후 8 내지 10주 후에 체중 증가 및 수명의 감소와 비정상적인 보행, 휴지성 떨림, 뒷다리 클래스핑(clasping) 및 활동과다를 특징으로 하는 운동 장애(예를 들어, R6/2 주; 문헌[Mangiarini et al., Cell 87:493-506(1996)] 참조)가 나타나는 것이 특징이다. 표현형은 운동기능 감소증으로 점차 악화된다. 이러한 트랜스제닉 마우스의 뇌는 뇌화학적이고 조직학적인 이상, 예를 들어 신경 전달 물질 수용체(글루타메이트, 도파민성)에서의 변화, N-아세틸아스파테이트(뉴런의 완전성에 대한 마커) 농도의 감소, 및 층(striatum) 및 뇌 크기의 감소도 나타낸다. 또한, 상기 동물의 뇌조직에는 전체 길이의 인간 헌팅틴 단백질 또는 그의 트랜스제닉 부분을 포함하는 비정상적인 응집체가 존재한다. R6/2 주는 이러한 트랜스제닉 마우스 주의 예이다. 문헌[Mangiarini et al., Cell 87:493-506(1996), Davies et al., Cell 90:537-548(1997), Brouille, Functional Neurology 15(4):239-251(2000) 및 Cha et al,., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:6480-6485(1998)] 참조.

동물 모델에서 올리고뉴클레오티드의 응집-파괴 효과를 시험하기 위해, 상이한 농도의 Kan uD3T/25G, Kan uD12T/25G, 또는 실시예 4에서 동정한 임의의 4-mer 올리고뉴클레오티드를 예를 들면, 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물을 뇌실에 직접적으로 주사함으로써 트랜스제닉 동물에게 투여했다, 그리고, 마우스 모델에 대해 상기 예를 들어 기술한 바와 같은 헌팅턴병-유사 증상의 진행을 모니터링하여, 올리고뉴클레오티드에 의한 치료가 증상의 감소 또는 지연을 야기하는지를 결정했다.

그 다음, 동물을 희생시켜 뇌절편을 얻었다. 그리고, 트랜스제닉 인간 헌팅틴 단백질, 그의 일부, 또는 인간 헌팅틴 단백질 또는 그의 일부를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 응집체의 존재에 대해 뇌절편을 분석했다. 이 분석법은 예를 들어, 뇌조직 절편을 항-헌팅틴 항체로 염색하고, 항-헌팅틴 항체를 인식하는 FITC와 컨쥬게이션된 2차 항체(예를 들어, 항-헌팅틴 항체는 마우스 항-인간 항체이고, 2차 항체는 인간 항체에 대해 특이적임)를 첨가하여, 형광 현미경법으로 단백질 응집체를 가시화하는 것을 포함한다. 별법으로, 항-헌팅틴 항체를 FITC와 직접 컨쥬게이션시킬 수 있다. 그리고, 헌팅틴 단백질 응집체의 수준을 형광 현미경법으로 가시화했다.

실시예 9

단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 HD 트랜스제닉 동물 모델 시스템으로의 투여는 수명을 연장시킨다

본 연구에서는 시험한 각각의 올리고뉴클레오티드에 대해, 60 마리의 R6/2 마우스(잭슨 래보라토리즈(Jackson Laboratories) 주 B6CBA-TgN(HDexon1)62Gpb/J)를 사용했다.

마우스를 7일 동안 순응시키고 랩다이어트(LabDiet) 5K52와 탭 워터(tap water)를 자유롭게 주었다. 적합한 건강 상태와 적응력을 가졌는지 확인하기 위해 연구 시작 전에 동물을 검사했고, 병들었거나 부적절한 동물은 연구에 사용하지 않았다.

순응 후, 자발적으로 호흡하는 몸무게 약 20 g의 6주령 R6/2 마우스를 외과적 시술에 대해 대조군으로 사용하는 마우스 1-20, 약물 대조군으로 사용하는 마우스 21-40, 및 실험 그룹을 구성하는 마우스 41-60의 세 가지의 치료 그룹 중 하나에 무작위로 배정했다.

0일째에 마우스 21-60을 마취시키고, 두개골 위에 2 cm의 시상 절개를 만들었다. 전정에서 1 mm 우측으로 두개(cranium) 상에 작은 구멍을 만들었다. 마이크로캐뉼러를 3 mm 깊이로 삽입하여 치과용 아크릴로 고정시키고, 알젯(Alzet) 2004 삼투 펌프(알자 코포레이션(Alza Corp., 캘리포니아 마운틴 뷰)에 연결시켰다.

삼투 펌프에 200 ㎕의 비히클(동물 21-40) 또는 올리고뉴클레오티드 용액(동물 41-60)를 채웠다. 펌프는 약물 또는 비히클을 4주 동안 지속적으로 전달한다. 연구에 사용한 모든 마우스가 죽을 때까지, 펌프 내에 사용된 약물의 정체를 모르게 실험을 진행했다.

투여는 4주(28일) 동안 자동적으로, 그리고 지속적으로 계속되었다.

마우스는 매일 살아있는지 평가했다.

치료에 대한 반응의 지표로서 치료 그룹 간에 가능한 동물의 체중 차이를 평가하기 위해, 연구 기간 동안 매주마다 1번씩 동물 각각의 체중을 측정했다. 20%를 초과하는 체중 감소가 나타난 동물은 안락사시켰다.

각 주마다 1번씩, 로타로드(rotarod) 장치 상에서 각각의 동물을 시험했다. 5 rpm 및 15 rpm에서 마우스를 로타로드 상에 놓고, 마우스가 로드에서 떨어지거나 10분이 지나면 실험을 종결시켰다.

연구 마지막에 생존율 및 질병 진행을 측정했다. 치료 그룹 간의 통계학적인 차이는 스투던트 t-테스트(Student's t-test), 윌콕손 결합조 테스트(Wilcoxon matched pair test), 생존 커브의 로그랭크 평가를 사용하여 결정했다. 치료 그룹 간의 체중 차이도 평가했다.

실험 과정에 대한 추가적인 상세한 내용은 문헌[Ona et al., Nature 399:263-267(1999), 및 Chen et al., Nature Med. 6(7):797-801(2000)]에서 찾을 수 있고, 이 문헌의 개시 내용은 전체로서 본원에 참고자료로 삽입된다.

하기 올리고뉴클레오티드를 시험했다: HD3S/53T; HD3S/53; HD3S/15; HD3S/9; HD1S/9; HD1S/9-NS; HD1S/6; HD1S/6-NS; HD12S/25-NS; HDR/25-NS; HD3L/25-NS; HD3R/25-NS; HD/58 및 HD3S/25-NS.

마우스 41-60의 생존율은 현저하게 증가했고, 운동 수행으로 평가한 질병의 진행은 대조군 동물 1-40에 비해 HD3S/53T; HD3S/53; HD3S/15; HD3S/9; HD1S/9; HD1S/9-NS; HD1S/6; HD1S/6-NS; 및 HD3S/25-NS로 처리한 마우스에서 현저하게 지연되었다.

실시예 10

단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 HD 초파리 모델 시스템으로의 투여는 헌팅틴 단백질 응집체의 감소를 야기한다

헌팅턴병에 대한 드로소필라 멜라노개스터(Drosophila melanogaster) 모델 시스템을 수득했다. 예를 들어, 문헌[Steffan et al., Nature, 413:739-743(2001) 및 Marsh et al., Human Molecular Genetics 9:13-25(2000)]을 참조하고, 이 문헌의 개시 내용은 전체로서 본원에 참고자료로 삽입된다. 예를 들어, 인간 헌팅틴 단백질, 그의 일부(예를 들어, 엑손 1), 또는 인간 헌팅틴 단백질 또는 그의 일부를 포함하는, 예를 들어 폴리 Q 트랙을 코딩하는 엑손 1의 CAG 반복 분절 중 36 이상의 CAG 반복(바람직하게는 51 이상의 반복)(별법으로, 임의의 수의 CAG 반복은 CAA일 수 있다)과의 융합 단백질을 발현하는 트랜스제닉 초파리이다. 이러한 트랜스제닉 파리가 뉴런에서 인간 헌팅틴 단백질, 그의 일부(예를 들어, 엑손 1), 또는 인간 헌팅턴 단백질 또는 그의 일부를 포함하는 융합 단백질을 발현하도록 파리를 조작했다.

이 초파리 모델에서 본원에 기술한 올리고뉴클레오티드의 효과를 시험하기 위해, 상이한 농도의 Kan uD3T/25G, Kan uD12T/25G, 또는 실시예 4에서 동정한 임의의 4-mer 올리고뉴클레오티드를 예를 들면, 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물을 뇌에 직접 주입하거나, 올리고뉴클레오티드를 경구 투여하거나, 올리고뉴클레오티드를 먹이의 일부로 투여함으로써 트랜스제닉 초파리에게 투여했다. 올리고뉴클레오티드의 투여는 초파리 생활사의 다양한 단계에서 수행했다.

올리고뉴클레오티드에 의한 치료가 증상의 감소 또는 지연을 야기하는지 결정하기 위해, 헌팅턴병-유사 증상의 진행을 모니터링했다.

하기 검정법 중 하나 또는 다른 것을 추가로 수행했다.

첫번째의 추가 검정법에서는, 상기 파리에서 헌팅틴 단백질 응집체의 분리, 또는 헌팅틴 단백질 응집체 형성의 감소를 모니터링했다.

두번째의 추가 검정법에서는, 치사율 및(또는) 광수용체 뉴런의 변성을 모니터링했다.

인간 헌팅틴 단백질, 그의 일부(예를 들어, 엑손 1), 또는 인간 헌팅틴 단백질 또는 그의 일부를 포함하는 융합 단백질의 발현으로 인한 신경 변성은, 각각의 초파리 개안(ommatidium)의 광수용체 뉴런에 의해 만들어지는 7개의 가시 감간분체(rhabdomeres, 세포하 광집적 구조체)의 규칙적인 사다리꼴 배열로 구성된 파리의 겹눈에서 쉽게 관찰된다. 인간 헌팅틴 단백질, 그의 일부(예를 들어, 엑손 1), 또는 인간 헌팅틴 단백질 또는 그의 일부를 포함하는 융합 단백질의 발현은 감간분체의 진행성 상실을 야기한다.

상기 초파리 모델에서 본원에 기술한 올리고뉴클레오티드의 투여 결과를 평가하여, 가장 효과적인 올리고뉴클레오티드를 동정했다.

실시예 11

단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 HD 시험관내 모델 시스템으로의 투여는 헌팅틴 단백질 응집체의 감소를 야기한다

폴리글루타민 응집체에 대해 미세역가 플레이트 검정법을 수행했다. 문헌[Berthelier et al., Anal. Biochem. 295:227-236(2001)]을 참조하고, 이 문헌의 개시 내용은 본원에 참고자료로 삽입된다.

상기 문헌[Berthelier et al.]에 따라, 다양한 길이의 폴리 Q 펩티드를 합성했다. 바람직하게는, 상기 펩티드는 폴리Q에 인접한 Lys 잔기쌍을 갖는다, 펩티드는 비오틴화시킬 수 있다. 펩티드는 약 Q₂₈일 수 있다. 예시적인 펩티드는 비오틴화된 K₂Q₃₀K₂이다. 펩티드는 정제할 수 있다.

펩티드는 실질적으로 문헌[Berthelier et al., Analytical Biochemistry 295:227-236(2001), 이 문헌은 전체로서 본원에 참고자료로 삽입된다]에 기술된 방법에 따라 가용화되고 분리된다. 그 다음, 문헌[Berthelier et al., Analytical Biochemistry 295:227-236(2001)]에 기술된 바와 같이 가용화된 펩티드로부터 폴리 Q 응집체를 형성시켰다. 응집체를 원심분리로 수집하고 완충액(예를 들어 PBS, 0.01% Tween 20 및 0.05% NaN₃)에 재현탁시켜, 에펜돌프 튜브에 등분하여 넣었다. 액체 질소에서 튜브를 신속하게 동결시키고 -80℃에서 보관했다. 실질적으로 문헌[Berthelier et al., Analytical Biochemistry 295:227-236(2001)]에 기술된 바와 같이, 비오틴화된 펩티드 및 그의 응집체를 제조했다. 일부 또는 모든 웰에 응집체를 갖는 96-웰 미세역가 플레이트를, 실질적으로 문헌[Berthelier et al., Analytical Biochemistry 295:227-236(2001)]에 기술된 바와 같이 제조했다. 일부 실험에서는 웰 당 20 ng의 응집체를 사용했다. 실질적으로 문헌[Berthelier et al., Analytical Biochemistry 295:227-236(2001)]에 기술된 바와 같이, 응집체 연장 검정법을 수행했다.

미세역가 응집체 연장 검정법을 사용하여, 실시예를 비롯한 본원에 기술한 올리고뉴클레오티드(올리고뉴클레오티드는 상이한 농도의 HDA3T/53일 수 있다)가 상기 미세역가 시험관내 응집체 연장 검정법에서 폴리 Q 응집체 연장을 억제하는 능력을 시험했다.

실시예 12

단일 가닥 올리고뉴클레오티드에 의한 단백질 오조립의 억제를 측정하기 위한 효모 시스템의 사용

효모에서 올리고뉴클레오티드에 의한 단백질 오조립의 억제를 분석했다.

2가지의 효모(S. cerevisiae) 균주를 제공했다: 23 Q 반복(CAG(임의의 CAG 반복은 CAA일 수 있다)) 또는 75 Q 반복을 갖는 인간 HD의 처음 170개 코돈을 함유하는, 바람직하게는 GFP에 융합된 W303-1a(MAT a, Ade 2-1, trp 1-1, can 1-100, leu 2-3, 112 his 3-11, 15 ura 3-1). 상기 각각의 균주는 유도성 프로모터(Gal 1, 10) 또는 항시발현성 프로모터(GPD-1)의 조절하에, 바람직하게는 NLS(핵 국소화 신호)를 갖는 삽입체 HD 유전자를 포함한다. 헌팅틴의 일부는 핵에 국소화되고 이 세포 내에서 단백질 응집체가 형성된다. 문헌[Hughes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:13201-13206(2001)]을 참조하고, 이 문헌의 개시 내용은 본원에 참고자료로 삽입된다.

상기 효모 시스템에서는 본원에 기술한 임의의 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 Kan uD3T/25G, Kan uD12T/25G, Kan uRD3/25G, 또는 기타 임의의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드에 의한 단백질 오조립의 억제를 시험했다.

올리고뉴클레오티드의 용량 수준을 시험했다. 일부 경우에는, 효모 세포를 히드록시우레아로 처리하여 세포 성장을 감소시키고 세포 주기의 S기를 연장시켰다. 일부 경우에는, 올리고뉴클레오티드의 첨가 전에 트리코스타틴 A(TSA)를 첨가했다. TSA 및 올리고뉴클레오티드를 함께 사용하면 단백질 오조립의 억제에 대해 상승적인 효과를 얻을 수 있다.

단백질 오조립의 억제는 웰 당 10³개의 세포를 포함하는 96-웰 플레이트에서 효모를 희석시켜 수행했다. 자이스 액시오버트 공초점 현미경(Zeiss axiovert confocal microscope)를 사용하여 헌팅틴 단백질 응집체의 형성을 모니터링했고(문헌[Hughes et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 98:13201-13206(2001)] 참조), 단백질 응집을 파괴 또는 억제하는데 가장 우수한 효과를 갖는 올리고뉴클레오티드를 동정했다.

본 명세서에 언급된 모든 특허 및 공보들은 각각 본원에 참고자료로서 구체적으로, 그리고 개별적으로 삽입된 것처럼 본원에 참고자료로 삽입된다. 본 발명은 상기한 예시 및 실시예에 의해 상세히 기술되었지만, 그 전체 범위의 동등물과 함께 본 발명의 영역만을 정의하는 첨부된 청구범위의 취지 또는 영역으로부터 벗어남이 없이 특정한 변화 및 변형을 가할 수 있음은 본원의 교시에 비추어 당업자에게 명백할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> UNIVERSITY OF DELAWARE <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF DISEASES EXHIBITING PROTEIN MISASSEMBLY AND AGGREGATION <130> 41428-0117KR <140> <141> <150> PCT/US03/024868 <151> 2003-08-07 <150> 60/402,198 <151> 2002-08-07 <160> 25 <170> PatentIn Ver. 3.3 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <220> <223> see specification for specific linkages, modifications and preferred embodiments <400> 1 ttgtgcccag tcgtagccga atagc 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <220> <223> see specification for specific linkages, modifications and preferred embodiments <400> 2 ttgtgcccag tcgtagccga atagc 25 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <220> <223> see specification for specific linkages, modifications and preferred embodiments <400> 3 gcccagtcgt agccg 15 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic Oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <220> <223> see specification for specific linkages, modifications and preferred embodiments <400> 4 uugtgcccag tcgtagccga atagc 25 <210> 5 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <220> <223> see specification for specific linkages, modifications and preferred embodiments <400> 5 uugugcccag ucguagccga auagc 25 <210> 6 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <220> <223> see specification for specific linkages, modifications and preferred embodiments <400> 6 gcccagtcgt agccg 15 <210> 7 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <220> <223> see specification for specific linkages, modifications and preferred embodiments <400> 7 ctcaggagtc aggtg 15 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <220> <223> see specification for specific linkages, modifications and preferred embodiments <400> 8 ttgtgcccag tcgtagccga atagc 25 <210> 9 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <220> <223> see specification for specific linkages, modifications and preferred embodiments <400> 9 gcccagtcgt agccg 15 <210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <220> <223> see specification for specific linkages, modifications and preferred embodiments <400> 10 gcccagtcgt agccg 15 <210> 11 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <220> <223> see specification for specific linkages, modifications and preferred embodiments <400> 11 cagtcgtag 9 <210> 12 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <220> <223> see specification for specific linkages, modifications and preferred embodiments <400> 12 cgagtccctc aagtccttcc aacagctgca acagcaacaa cagcagcaac aga 53 <210> 13 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <220> <223> see specification for specific linkages, modifications and preferred embodiments <400> 13 gctgttgctg ctgttgttgc tgttgcagct gttggaagga cttgagggac tcg 53 <210> 14 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <220> <223> see specification for specific linkages, modifications and preferred embodiments <400> 14 ctgttgcagc tgttg 15 <210> 15 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <220> <223> see specification for specific linkages, modifications and preferred embodiments <400> 15 ttgcagctg 9 <210> 16 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <220> <223> see specification for specific linkages, modifications and preferred embodiments <400> 16 ttgcagctg 9 <210> 17 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <220> <223> see specification for specific linkages, modifications and preferred embodiments <400> 17 cagctg 6 <210> 18 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <220> <223> see specification for specific linkages, modifications and preferred embodiments <400> 18 gtcgtagcc 9 <210> 19 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <220> <223> see specification for specific linkages, modifications and preferred embodiments <400> 19 gtcgta 6 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <220> <223> see specification for specific linkages, modifications and preferred embodiments <400> 20 ttgtgcccag tcgtagccga atagc 25 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <220> <223> see specification for specific linkages, modifications and preferred embodiments <400> 21 ttgtgcccag tcgtagccga atagc 25 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <220> <223> see specification for specific linkages, modifications and preferred embodiments <400> 22 ttgtgcccag tcgtagccga atagc 25 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <220> <223> see specification for specific linkages, modifications and preferred embodiments <400> 23 ttgtgcccag tcgtagccga atagc 25 <210> 24 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic Oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <220> <223> see specification for specific linkages, modifications and preferred embodiments <400> 24 cagcagcagt agcagcagca gcuuuugcug cugcugcugc ugcugcugcu guuuucag 58 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic CAA/CAG glutamine encoding oligonucleotide <220> <223> see specification for specific linkages, modifications and preferred embodiments <400> 25 caacagcagc aacagcaa 18

Claims (20)

1. 이종의 서열 및(또는) 조성을 갖는 다수의 올리고뉴클레오티드 종(species) 각각을 단백질 응집체를 갖고 있거나 단백질 응집체의 응집을 일으킬 것 같은 세포 내로 개별적으로 도입하고, 상기 응집을 예방, 감소 또는 파괴하는데 효과적인 하나 이상의 다수 올리고뉴클레오티드 종을 동정하는 것을 포함하는,

   서열 및(또는) 조성이 다른 다수의 올리고뉴클레오티드 종으로부터 세포 내에서의 단백질 응집체의 응집을 파괴하는데 효과적인 올리고뉴클레오티드 종을 동정하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 단백질 응집체가 헌팅틴, Aβ, 타우, α-시누클레인(synuclein), 아트로핀-1, 아탁신-1, 아탁신-2, 아탁신-3, 아탁신-7, 알파 1A, PrPSc, 트랜스티레틴(transthyretin), 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 아밀린, IgG 경쇄, 프로칼시토닌, β2-마이크로글로불린, 심방성 나트륨 이뇨인자, 혈청 아밀로이드 A, 아포A1 및 겔솔린으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 종 각각의 길이가 6 nt 이상인 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 종 각각의 길이가 25 nt 이상인 방법.
5. 제1항에 있어서, 적어도 다수의 올리고뉴클레오티드 종이 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 방법.
6. 제5항에 있어서, 적어도 다수의 올리고뉴클레오티드 종이 각각의 말단에 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 상기 세포 내로 시험관내 도입되는 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 단백질 응집체가 검출 가능하도록 표지된 것인 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 표지가 상기 응집체에 재조합적으로 융합된 것인 방법.
10. 제12항에 있어서, 상기 표지가 GFP-유사 발색단을 포함하는 폴리펩티드인 방법.
11. 임의로 제약학상 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 단백질 응집체의 응집을 예방, 지연 또는 파괴하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 종을 포함하는 유효량의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 단백질 응집체의 응집으로 야기되는 질환을 갖는 대상의 치료 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 질환이 알츠하이머병, 낭포성 섬유증, 근위축성 측삭 경화증, 파킨슨병, 척수연수 근위축증, 척수소뇌성 실조증 1형, 2형, 3형, 6형 및 7형, 담창구시상하부 위축증, 프리온 질환, 스크레이피, 소의 해면상뇌증, CJD, 신규 변이체 CJD, 픽 질환, 타입 II 당뇨병, 다발성 골수종-혈장 세포 악액질, 갑상선 수질성 암종, 만성 신부전, 울혈 심부전증, 만성 염증, 죽상경화증(apoA1) 및 가족성 아밀로이드증으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
13. 제11항에 있어서, 하나 이상의 상기 올리고뉴클레오티드 종의 길이가 6 nt 이상인 방법.
14. 제13항에 있어서, 하나 이상의 상기 올리고뉴클레오티드 종의 길이가 25 nt 이상인 방법.
15. 제11항에 있어서, 하나 이상의 상기 올리고뉴클레오티드 종이 하나 이상의 말단 개질을 포함하는 것인 방법.
16. 제15항에 있어서, 상기 하나 이상의 말단 개질이 포스포로티오에이트 결합 및 2'-OMe 유사체로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 말단 개질이 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합인 방법.
18. 제11항에 있어서, 상기 조성물이 서열, 길이 또는 조성 중 하나 이상에 있어서 상이한 둘 이상의 올리고뉴클레오티드 종을 포함하는 것인 방법.
19. 제11항에 있어서, 상기 투여가 정맥내 또는 수막강내 주입을 포함하는 것인 방법.
20. 제11항에 있어서, 상기 투여가

    상기 대상으로부터의 세포를 생체외 트랜스펙션시킨 다음,

    상기 트랜스펙션된 세포를 상기 대상으로 재도입하는 것을 포함하는 것인 방법.