JPWO2003044197A1 - ハンチントン病遺伝子転写因子 - Google Patents
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Abstract
Description
この出願の発明は、ハンチントン病遺伝子の転写因子(transcriptional factor)に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、ハンチントン病遺伝子の遺伝子産物の転写に関与し、ハンチントン病の発病等に重要な役割を果たすハンチントン病遺伝子の転写因子と、この因子を利用するための各種遺伝子材料に関するものである。
背景技術
ハンチントン病(Huntington’s disease:HD)は、常染色体優性遺伝を示す神経変性疾患の一つである。このHD発症の本態は、HD病原因遺伝子(HD遺伝子)の第1エクソン内に存在するCAGリピート配列の特異的な増大に伴いHD遺伝子がコードする機能不明なタンパク質ハンチンチン(huntingtin)のN末端側に存在するグルタミン残基が異常伸長してポリグルタミン配列を形成することに起因すると考えられている。またHD遺伝子は様々な組織で発現しているにも関わらず、選択的な神経細胞の変性脱落を示すことも知られている。
神経細胞死の選択性の重要な要因として、原因遺伝子の発現制御が考えられる。事実、マウスモデルの研究は、変異型ハンチンチン発現量の抑制が疾患症状を改善する可能性を示唆している(Cell 101:57−66,2000)。
前記のとおり、HD遺伝子の発現制御機構を解明することがHDの新しい治療法や治療薬の開発にとって重要かつ不可欠であると考えられる。しかしながら、ヒトHD遺伝子について、その転写に関与する分子(転写因子)は未だ見出されていない。
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、ヒトHD遺伝子の転写因子を提供することを課題としている。
またこの出願の発明は、このHD転写因子をコードするポリヌクレオチドや抗体等を提供することを課題としてもいる。
発明の開示
この発明は、第1の態様として、配列番号2および配列番号4のそれぞれのアミノ酸配列を有することを特徴とする、単離精製されたハンチントン病遺伝子転写因子を提供する。この第1の態様において、ハンチントン病遺伝子転写因子は、ハンチントン病遺伝子転写調節領域に存在する配列番号7の塩基配列のうち、第144−150番目配列、第164−170番目配列および第184−190番目配列の少なくとも一つを認識することを特徴の一つとしている。
この発明は、第2の態様として、前記のそれぞれのハンチントン病遺伝子転写因子をコードする、単離精製されたポリヌクレオチドを提供する。
この第2態様における具体的な態様は、配列番号1および配列番号3のそれぞれの塩基配列を有するポリヌクレオチドである。
この発明は、第3の態様として、前記のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、10塩基対以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを提供する。
この発明は、第4の態様として、前記のポリヌクレオチドを保有する組換えベクターを提供する。
この発明は、第5の態様として、前記の組換えベクターによる形質転換細胞を提供する。
この発明は、第6の態様として、前記のハンチントン病遺伝子転写因子に対する抗体を提供する。
なお、この発明において、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は特定塩基数の断片を意味するものでなく、一応の目安として100bp以上の断片をポリヌクレオチド、100bp未満の断片をオリゴヌクレオチドとするが、例外も存在する。
発明を実施するための最良の形態
この発明の第1の態様は、配列番号2および配列番号4のそれぞれのアミノ酸配列を有することを特徴とするHD遺伝子転写因子[以下、「HD/TF」と記載することがある]である。具体的には、配列番号2のアミノ酸配列を有するHD遺伝子転写因子(HD/TF−1)と、配列番号4のアミノ酸配列を有するHD遺伝子転写因子(HD/TF−2)である。
この発明の転写因子HD/TF−1およびHD/TF−2は、HD遺伝子の転写の開始に関与する機能(転写開始因子)、転写産物の伸長を正または負に調節する機能(転写伸長因子)、および転写調節に関与する機能(転写調節因子)のうち、少なくとも1つの機能を有するタンパク質である。なお、HD遺伝子は公知(Cell72:971−983,1993;Genomics 25:707−715,1995;GenBank Accession No.L34020)である。配列番号7は、この公知のHD遺伝子の一部ゲノム配列である。HD遺伝子の転写は配列番号7の第219番目gあるいは第229番目cから開始し、第364−366番目のatgコドンからタンパク質がコードされている。この発明の転写因子HD/TF−1およびHD/TF−2は、HD遺伝子の転写調節領域中の第144−150番目配列、第164−170番目配列および第184−190番目配列に存在する「gccggcg」配列を認識する(すなわち、この発明の転写因子はこのgccggcgに結合する)。しかもこの3箇所のgccggcg配列はそれぞれ13塩基配列を介して連続的に存在するという特徴を有している。従って、この発明の転写因子HD/TF−1およびHD/TF−2は、この特徴的なgccggcg配列に結合するタンパク質として定義することもできる。
この発明のHD遺伝子転写因子は、HDにおける病変異型ハンチンチンの生成を人為的に制御する治療技術の開発や、HDの選択的な神経細胞死に対する治療法、治療薬の開発に有用である。具体的には、この転写因子に拮抗的または促進的に作用する低分子化合物をスクリーニングすることによって、新たな治療薬の開発が期待される。また、このこれらの転写因子またはその一部断片(ペプチド)は、抗体作製の抗原としても使用される。なお、低分子化合物のスクリーニング等においては、前記のgccggcg配列を含む配列(例えば精製ポリヌクレオチドや精製オリゴヌクレオチド等)を利用することもできる。
この発明の転写因子HD/TF−1およびHD/TF−2は、それぞれ、ヒトの細胞から単離する方法、配列番号2および4のアミノ酸配列に基づき化学合成によってポリペプチドを調製する方法等によって得ることができる。また、この発明の形質転換細胞から単離・精製する方法によって大量に生産することができる。すなわち、形質転換体細胞を培養し、その培養物から、例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、SDS−PAGE、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等によって単離、精製することによりHD/TF−1およびHD/TF−2をそれぞれ大量に得ることができる。なお、このような遺伝子工学的手法によって得られたHD/TF−1およびHD/TF−2には、それぞれ他の任意のタンパク質との融合タンパク質も含まれる。例えば、グルタチン−S−トランスフェラーゼ(GST)や緑色蛍光タンパク質(GFP)との融合タンパク質などが例示できる。さらに、細胞で発現したタンパク質は、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。したがって、修飾されたタンパク質もこの発明のHD遺伝子転写因子の範囲に含まれる。このような翻訳後修飾としては、N末端メチオニンの脱離、N末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテアーゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化などである。
また、この第1態様の転写因子には、配列番号2および4における一部連続配列からなるペプチド(5アミノ酸残基以上)もその範囲に含まれる。このようなペプチドは、例えばこの発明の転写因子に対する抗体作製のための抗原として使用できる。
この発明の第2の態様は、前記2種類のHD遺伝子転写因子をそれぞれコードするポリヌクレオチドである。このポリヌクレオチドは、HD/TF−1およびHD/TF−2をそれぞれコードするゲノム遺伝子DNA、ゲノム遺伝子から転写されたRNA(mRNA)、mRNAから合成されたcDNA(配列番号1および3)が含まれる。また、配列番号1および3のポリヌクレオチドは、その1本鎖形態とその相補鎖、およびそれらが対合した2本鎖形態が含まれる。
HD/TF−1およびHD/TF−2をそれぞれコードするゲノム遺伝子DNAは、例えば、配列番号1および3の塩基配列またはその一部配列からなるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドをプローブとしてヒトゲノムDNAライブラリーをスクリーニングすることによって単離するすることができる。得られたゲノム遺伝子は、例えば、PCR(Polymerase Chain Reaction)法、NASBN(Nucleic acid sequence based amplification)法、TMA(Transcription−mediated amplification)法およびSDA(Strand Displacement Amplification)法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することができる。
また、cDNAは、ヒト細胞から抽出したポリ(A)+RNAを鋳型として合成することができる。ヒト細胞としては、人体から手術などによって摘出されたものでも培養細胞でもよい。cDNAは、公知の方法(Mol.Cell Biol.2,161−170,1982;J.Gene25,263−269,1983;Gene,150,243−250,1994)を用いて合成することができる。あるいは、オリゴヌクレオチドをプライマーとして、ヒト細胞から単離したmRNAを鋳型とするRT−PCR法を用いて、目的cDNAを合成することもできる。これらのcDNAは、例えばHD/TF−1およびHD/TF−2の遺伝子工学的な製造に使用することができる。
この発明の第3の態様は、前記第2態様のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、10塩基対以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。このオリゴヌクレオチドは、具体的には、前記のポリヌクレオチドをスクリーニングする場合等に使用するオリゴヌクレオチドプローブ、または前記のポリヌクレオチドをPCR増幅する際に使用するオリゴヌクレオチドプライマー等である。
オリゴヌクレオチドプローブは、前記のゲノム遺伝子または前記ポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズするDNA断片またはRNA断片である。例えば、配列番号1または3の塩基配列における連続10〜99塩基のDNA断片等である。ここで、ストリンジェント条件とは、前記の遺伝子またはポリヌクレオチドプローブとの特異的なハイブリッド形成を可能とする条件であり、ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程における塩濃度、有機溶媒(ホルムアミド等)の濃度、温度条件によって規定される。詳しくは、米国特許No.6,100,037等に詳しく規定されている。
また、オリゴヌクレオチドプライマーは、前記の遺伝子やポリヌクレオチドをPCR増幅するための少なくとも2つのオリゴヌクレオチドのセットである。このようなプライマーセットは、配列番号1または3の塩基配列に基づき設計し、合成・精製の各工程を経て調製することができる。なお、プライマー設計の留意点として、例えば以下を指摘することができる。プライマーのサイズ(塩基数)は、鋳型DNAとの間の特異的なアニーリングを満足させることを考慮し、15−40塩基、望ましくは15−30塩基である。ただし、LA(long accurate)PCRを行う場合には、少なくとも30塩基が効果的である。センス鎖(5’末端側)とアンチセンス鎖(3’末端側)からなる1対(2本)のプライマーが互いにアニールしないよう、両プライマー間の相補的配列を避けると共に、プライマー内のヘアピン構造の形成を防止するため自己相補配列をも避けるようにする。さらに、鋳型DNAとの安定な結合を確保するためGC含量を約50%にし、プライマー内においてGC−richあるいはAT−richが偏在しないようにする。アニーリング温度はTm(melting temperature)に依存するので、特異性の高いPCR産物を得るため、Tm値が55−65℃で互いに近似したプライマーを選定する。また、PCRにおけるプライマー使用の最終濃度が約0.1〜約1μMになるよう調整する等を留意すうことも必要である。また、プライマー設計用の市販のソフトウェア、例えばOligoTM[National Bioscience Inc.(米国)製]、GENETYX[ソフトウェア開発(株)(日本)製]等を用いることもできる。
この発明の第4の態様は、前記第2態様のポリヌクレオチドを保有する組換えベクターである。このベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターであり、インサートしてのポリヌクレオチドの種類や、その使用目的等に応じて適宜のものを使用する。例えば、cDNAまたはそのORF領域をインサートとしてHD/TF−1およびHD/TF−2を遺伝子工学的に生産する場合には、インビトロ転写用の発現ベクターや、大腸菌、枯草菌等の原核細胞、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞のそれぞれに適した発現ベクターを使用することができる。また、前記のゲノム遺伝子DNAをインサートとする場合には、BAC(Bacterial Artificial Chromosome)ベクターやコスミドベクター等を使用することができる。
この発明の第5の態様は、前記の組換えベクターによる形質転換細胞である。例えば、前記の組換えベクターを用いてHD/TF−1やHD/TF−2を遺伝子工学的に製造する場合には、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。これらの形質転換体細胞は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法など公知の方法によって組換えベクターを細胞に導入することによって調製することができる。
この発明の第6の態様は、前記のHD遺伝子転写因子に対する抗体である。この抗体は、HD遺伝子転写因子を認識するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、HD/TF−1およびHD/TF−2のそれぞれのエピトープに結合することができる全体分子、およびFab、F(ab’)2、Fv断片等が全て含まれる。このような抗体は、前記のHD/TF−1およびHD/TF−2またはそれらのペプチドを抗原として動物を免役した後、血清から得ることができる。あるいは、上記の真核細胞用発現ベクターを注射や遺伝子銃によって、動物の筋肉や皮膚に導入した後、血清を採取することによって作製することができる。動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ニワトリなどが用いられる。免疫した動物の脾臓から採取したB細胞をミエローマと融合させてハイブリドーマを作製すれば、モノクローナル抗体を産生することができる。
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
実施例
実施例1
HD遺伝子転写因子の単離
HD遺伝子の転写因子を単離するため、HD遺伝子の−364〜+158領域(プロモーター領域、転写開始点、CAGリピート配列を含む:図1参照)をPCR増幅し、pHISiまたはpHISi−1のSmaIサイトに挿入してレポーターコンストラクトを構築した。このレポーターコンストラクトを用いた酵母のOne Hybrid Systemにより、ヒト精巣cDNAライブラリー(CLONTECH社のHuman Testis MATCHMAKER cDNA library)をスクリーニングした。その結果、3つの陽性cDNAクローン2、8および11が同定された。
なお、One Hybrid System全ての手続は、CLONTECH社のMATCHMAKER One−Hybrid System Protocolに従った。
次に、各クローンの結合領域を決定するために、HD遺伝子の−364〜+158領域をさらに次の4つの領域に分けたレポーターコンストラクト;−364〜−213(R1)、−230〜−113(R2)、−131〜+51(R3)および+29〜+158(R4)を作成し(図1参照)、酵母のOne Hybrid Systemを用いて解析を行った。図2に示したように、3つの陽性クローンのうち、クローン2および8が、HD遺伝子転写調節領域であるR2領域への結合活性を示すことが確認された。すなわち、cDNAクローン2(約1.3kb)およびcDNAクローン8(約1.8kb)の発現産物が、HD遺伝子転写因子であることが明らかとなった。
これらのcDNAクローン2および8は、それぞれベクターpACT2のEcoRI−XhoIサイトに挿入されていた。
実施例2
クローン2およびクローン8の発現解析
実施例1で単離したcDNAクローン2およびcDNAクローン8のヒト組織における発現をノーザンブロットにより解析した。ノーザンブロッティングは、TOYOBO社のGene HynterTMmembrane(Human Normal Tissue mRNA blot I,II,III,IV)を用いて行った。プローブDNAはcDNAクローン2および8を含むpACT2ののEcoRI−XhoIサイト断片を放射性同位元素で標識したものを使用した。10mg/ml濃度のHerring testis DNAを含む1.1×Hybrid solution(0.55M sodium ohosphate−1.1mM EDTA−7.7%SDS)中でメンブレンとプローブDNAとを65℃で一晩ハイブリダイズさせた。メンブレンの洗浄は、2×SSC、室温、5分間2回、引き続き2×SSC−1%SDS、65℃、30分間1回の条件で行った。その後、X線フィルムへの露光を行うことでシグナルを得た。
その結果、図3に示したとおり、cDNAクローン2および8にそれぞれ対応するヒト遺伝子は、前全身的な発現パターンを示すことが確認された。また、cDNAクローン2のmRNAサイズは約1.8kb、cDNAクローン8のmRNAは約5.5kbであることも判明した。
実施例3
完全長cDNAの取得
実施例1で得られたcDNAクローン2および8は、実施例2の結果により判明したmRNAよりもサイズが小さいため、以下の方法により、それぞれの完全長cDNAを単離した。
すなわち、クローン2については、ヒト精巣由来のmRNA(CLONTECH社のHuman Testis mRNA)を用いてcDNAライブラリーを作成し、cDNAクローン2を含む組換えベクターpACT2のEcoRI−XhoIサイト断片を放射性同位元素で標識したものをプローブとして、cDNAライブラリーをスクリーニングした。なお、cDNAライブラリーの作製は、STRATAGENE社のZAP−cDNA synthesis kitを用い、そのプロトコールに従って行った。
その結果、サイズの異なる2つのcDNAが得られた。1つはDNAサイズが約1.5kb(cDNAクローン2M)であり、もう一方はDNAサイズが1.8kb(cDNAクローン2L)であることから、cDNAクローン2Lが完全長cDNAであることが判明した。そして、このcDNAクローン2Lの発現産物をHD遺伝子転写因子HD/TF−1とした。
一方、クローン8については、cDNAライブラリーのスクリーニングからは完全長cDNAが得られなかったため、5’RACE(rapid amplification of cDNA ends)法によって5’領域をカバーするcDNAを取得した。鋳型mRNAは、CLONTECH社のHuman Testis mRNAを用い、PCRプライマーは配列番号5(cDNAクローン8の368nt〜393nt領域)および配列番号6(cDNAクローン8の312nt〜333nt領域)の合成オリゴヌクレオチドを使用した。なお、この5’RACE法は、CLONTECH社のSMARTTMRACE cDNA Amplification Kitを用い、そのプロトコールに準じて行った。
その結果、実施例1で取得した5’領域断片は既に開始コドン(メチオニン)を含む翻訳領域を完全にコードしていることが明らかとなった。クローン8のcDNAサイズとmRNAサイズの違いは、3’非翻訳領域の長さの違いによるものであると判断された。cDNAクローン8がコードするタンパク質をHD遺伝子転写因子HD/TF−2とした。
実施例4
組換え発現ベクターの構築
cDNAクローン2Lの翻訳領域(配列番号2のアミノ酸位置1〜387に対応)、cDNAクローン8の翻訳領域(配列番号4のアミノ酸位置1〜513に対応)をそれぞれPCR増幅し、発現ベクターpEGFP−NおよびpEGFP−CのEcoRI−SalIサイト、発現ベクターpGEX−5X、pcDNA3.1/Myc−His(+)およびpcDNA3.1/HisのEcoRI−XhoIサイト、発現ベクターpBsCAG−2のNheI−NstIサイト(cDNAクローン2L)およびNheIサイト(cDNAクローン8)へ導入して、組換え発現ベクターを構築した。また、cDNAクローン2Lのアミノ酸位置1〜105、106〜321、322〜387にそれぞれ対応するDNA断片、cDNAクローン8のアミノ酸位置1〜168、169〜437、438〜513にそれぞれ対応するDNA断片をPCR増幅し、発現ベクターpGEX−5のEcoRI−XhoIサイトに導入して組換え発現ベクターを構築した。構築した組換えベクターは以下のとおりである。
ベクター1:pEGFP−N/2L(1−387)
ベクター2:pEGFP−N/8(1−513)
ベクター3:pEGFP−C/2L(1−387)
ベクター4:pEGFP−C/8(1−513)
ベクター5:pGEX−5X/2L(1−387)
ベクター6:pGEX−5X/8(1−513)
ベクター7:pcDNA3.1/Myc−His(+)/2L(1−387)
ベクター8:pcDNA3.1/Myc−His(+)8(1−513)
ベクター9:pcDNA3.1/His/2L(1−387)
ベクター10:pcDNA3.1/His/8(1−513)
ベクター11:pBsCAG−2/2L(1−387)
ベクター12:pBsCAG−2/8(1−513)
ベクター13:pGEX−5/2L(1−105)
ベクター14:pGEX−5/2L(106−321)
ベクター15:pGEX−5/2L(322−387)
ベクター16:pGEX−5/8(1−168)
ベクター17:pGEX−5/8(169−437)
ベクター18:pGEX−5/8(438−513)
実施例5
in vitro DNA結合解析
実施例3で取得されたクローン2Lおよびクローン8のそれぞれの遺伝子産物が、in vitro系においてDNA結合能を有するかをゲルシフトアッセイ法により解析した。プローブは、実施例1で使用したR1、R2、R3およびR4断片を放射性同位元素で標識したDNA断片を使用した。また、ターゲットタンパク質は、実施例4で構築したベクター5が発現するクローン2L遺伝子産物(HD/TF−1)とGSTとの融合タンパク質、およびベクター6が発現するクローン8遺伝子産物(HD/TF−2)とGSTとの融合タンパク質を使用した。
すなわち、融合タンパク質50ng〜200ng、2μg poly(dI−dC)を含む反応溶液(20mM Tris−HCl(pH7.6)−50mM KCl−10%Glycerol−1mM DDT)中で室温5分間インキュベーションを行った後、32Pで標識したプローブDNAを0.1ng反応溶液に加え、室温で20分間、結合反応を行った。反応終了後、反応溶液を4%PAGE(polyacrylamide gel electrophresis)に供した。電気泳動の終了したゲルを乾燥させ、X線フィルムに露光してシグナルを検出した。
また、競合活性の試験は、実施例4で構築したベクター5および6がそれぞれ発現する融合タンパク質100ngを使用し、次の条件を除き、前記の結合活性試験と同一に行った。すなわち、室温5分間のインキュベーション時に、10ng(プローブDNAの100倍量)の非標識DNAを競合DNAとして加えた後、32Pで標識したプローブDNAを0.1ng反応溶液に加え、室温で20分間、結合反応を行った。また、プローブDNAはR2およびR3断片を使用した。
結合活性の試験結果は、図4Aおよび図5Aに示したとおりであり、クローン2L遺伝子産物(HD/TF−1)およびクローン8遺伝子産物(HD/TF−2)とGSTとの融合タンパク質は、標識したR2プローブとR3プローブとに対して結合活性を示した。
また、競合活性の試験結果は図4Bおよび図5Bに示したとおりであり、融合タンパク質の結合はR2領域に対して特異的であり、R3領域には非特異的であることが確認された。
実施例6
ドメイン機能解析
実施例5の結果から、クローン2L遺伝子産物(HD/TF−1)およびクローン8遺伝子産物(HD/TF−2)がHD遺伝子のR2領域に対して特異的に結合することが確認されたことから、次に、クローン2L遺伝子産物のどの領域がHD遺伝子との結合に関与しているのかを解析した。
すなわち、実施例4で構築したベクター13、14、15がそれぞれ発現する融合タンパク質を用い、実施例5と同様の結合活性試験を行った。プローブDNAは標識R2断片を用いた。
結果は図6に示したとおりであり、クローン2L遺伝子産物のC末端領域がR2プローブDNAとの結合活性を示したことから、この領域がHD遺伝子転写調節領域に対する結合領域であることが明らかとなった。
次にこのC末領域がHD遺伝子転写調節領域のどのような配列を認識するのかを解析した。すなわち、実施例4で構築したベクター15が発現する融合タンパク質、およびクローン2L遺伝子産物のC末領域と高い相同性を示すクローン8遺伝子産物のC末領域をコードする様に構築したベクター18が発現する融合タンパク質10ng〜400ngをそれぞれ用い、実施例5と同様の結合反応を行った。ただし、プローブDNAは標識R1+R2断片(−364〜−113)を用いた。その後、これら反応溶液中に10×DNase I溶液(15ug/ml DNase I,50mM MgCl2)を1/10量加えて、25℃で1分間酵素消化反応を行った。DNase I stop溶液(1.6M ammonium acetate,95mM EDTA,0.8%SDS,0.3mg/ml Calf thymus DNA)を加えて反応を停止させ、DNA断片の精製を行った。精製DNAをローディングダイ(80%formamide,10mM EDTA(pH8),0.025%bromophenol blue,0.025%xylenecyanol)に溶解し、8M urea−8%acrylamide gelを用いての電気泳動による分離を行った。
結果は、図7に示したとおりであり、クローン2Lおよびクローン8遺伝子産物のC末領域(DNA結合ドメイン)が、HD遺伝子転写調節領域中の7bpのgccggcg配列を認識したこと、およびこの配列が13bpのスペーサー配列を挟んで3ヶ所に位置することから、これら領域がHD遺伝子転写調節領域における新規シスエレメントを構成していることが確認された。
実施例7
細胞内局所解析
実施例4で構築したベクター1〜4をHeLa細胞にトランスフェクションし、24時間後に細胞を4%パラホルムアルデヒド固定し、顕微鏡下で蛍光を観察した。
その結果、クローン2L遺伝子産物とGFPとの融合タンパク質は核内への局在を示すものも観察されたが、クローン8のそれは細胞質にのみ発現が観察された。
産業上の利用可能性
以上詳しく説明したとおり、この発明によって、HD遺伝子の転写因子が提供される。この転写因子によって、HDにおける病変異型ハンチンチンの生成を人為的に制御する治療技術の開発や、HDの選択的な神経細胞死に対する治療法、治療薬の開発が可能となる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図1は、HD遺伝子転写因子をコードするcDNAクローンのOne Hybrid Systemによる分離に使用したHD遺伝子の構成と、プローブDNAの領域を示す模式図である。
図2は、One Hybrid Systemによって単離された3つのクローンの各レポーターコンストラクトを持つ株における結合活性を試験した結果である。
図3は、クローン2L mRNAおよびクローン8mRNAのヒト組織における発現を調べたノーザンブロッティング分析の結果である。レーン1:心臓、2:脳、3:肝臓、4:膵臓、5:胎盤、6:肺、7:胃、8:空腸、9:回腸、10:大腸、11:直腸、12:筋、13:子宮、14:膀胱、15:腎臓、16:脾臓、17:子宮頚、18:卵巣、19:精巣、20:前立腺。
図4Aはクローン2L遺伝子産物とHD遺伝子断片との結合活性を調べたゲルシフトアッセイの結果であり、Bは競合活性を調べたゲルシフトアッセイの結果である。
図5Aはクローン8遺伝子産物とHD遺伝子断片との結合活性を調べたゲルシフトアッセイの結果であり、Bは競合活性を調べたゲルシフトアッセイの結果である。
図6は、HD遺伝子に対するクローン2L遺伝子産物の結合領域を調べたゲルシフトアッセイの結果(右の泳動像)と、この試験に用いたGST融合タンパク質の構成を示した模式図(左)である。
図7は、クローン2Lおよびクローン8遺伝子産物のC末領域を用いて、両産物が認識するHD遺伝子転写調節領域中のDNA配列を調べたDNase Iフットプリント解析の結果(左:全体の泳動像、右:拡大像)、並びにこの試験に用いたHD遺伝子転写調節領域中のDNA断片の位置の模式図とプロテクトされたコア配列である。
Claims (16)
- 配列番号2のアミノ酸配列を有することを特徴とする、単離精製されたハンチントン病遺伝子転写因子。
- ハンチントン病遺伝子転写調節領域に存在する配列番号7の塩基配列のうち、第144−150番目配列、第164−170番目配列および第184−190番目配列の少なくとも一つを認識する請求項1のハンチントン病遺伝子転写因子。
- 配列番号4のアミノ酸配列を有することを特徴とする、単離精製されたハンチントン病遺伝子転写因子。
- ハンチントン病遺伝子転写調節領域に存在する配列番号7の塩基配列のうち、第144−150番目配列、第164−170番目配列および第184−190番目配列の少なくとも一つを認識する請求項3のハンチントン病遺伝子転写因子。
- 請求項1のハンチントン病遺伝子転写因子をコードする、単離精製されたポリヌクレオチド。
- 配列番号1の塩基配列を有する請求項5のポリヌクレオチド。
- 請求項3のハンチントン病遺伝子転写因子をコードする、単離精製されたポリヌクレオチド。
- 配列番号3の塩基配列を有する請求項7のポリヌクレオチド。
- 請求項5または6のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、10塩基対以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
- 請求項7または8のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、10塩基対以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
- 請求項5または6のポリヌクレオチドを保有する組換えベクター。
- 請求項7または8のポリヌクレオチドを保有する組換えベクター。
- 請求項11の組換えベクターによる形質転換細胞。
- 請求項12の組換えベクターによる形質転換細胞。
- 請求項1のハンチントン病遺伝子転写因子に対する抗体。
- 請求項3のハンチントン病遺伝子転写因子に対する抗体。
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