WO2011142310A1

WO2011142310A1 - ｃＤＮＡの合成方法

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Publication number: WO2011142310A1
Application number: PCT/JP2011/060643
Authority: WO
Inventors: 祐子中林; 上森　隆司; 向井　博之; 浅田　起代蔵
Original assignee: タカラバイオ株式会社
Priority date: 2010-05-14
Filing date: 2011-05-09
Publication date: 2011-11-17
Also published as: EP2570480A4; KR101697811B1; US9169482B2; KR20130062296A; EP2570480A1; EP2570480B1; JP5940447B2; JPWO2011142310A1; CN102884186B; CN102884186A; US20130065281A1

Abstract

　ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料中のＤＮＡをエンドデオキシリボヌクレアーゼにより分解し処理試料とした後、エンドデオキシリボヌクレアーゼの熱失活又はエンドデオキシリボヌクレアーゼの除去を行うことなく、当該処理試料及び逆転写酵素を含有し、かつエンドデオキシリボヌクレアーゼが活性を示さない反応液を調製し、逆転写反応を行うことを特徴とする、ｃＤＮＡの合成方法。本発明のｃＤＮＡ合成方法及びキットは、広く遺伝子工学の分野に有用である。

Description

ｃＤＮＡの合成方法

　本発明は、ｃＤＮＡの合成に有用な方法及びｃＤＮＡの合成に有用なキットに関する。

　生命現象を解明するためには、様々な遺伝子のｍＲＮＡ分子の解析が非常に重要である。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、すなわち逆転写酵素の発見により、ＲＮＡを鋳型にｃＤＮＡを合成する逆転写反応が可能となり、ｍＲＮＡ分子の解析法は長足の進歩を遂げ、逆転写酵素を用いたｍＲＮＡ分子の解析法は現在、遺伝子に関する研究において必須の実験法となっている。逆転写反応によって合成されたｃＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ断片を増幅するＰＣＲ法はＲＴ－ＰＣＲ法と呼ばれている。ＲＴ－ＰＣＲ法はｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡのクローニングやｃＤＮＡライブラリーの作製に利用されるほか、特定のＲＮＡの発現状態を調べる方法としても有用である。

　しかし、ｃＤＮＡ合成に使用される試料中にＤＮＡが混在する場合には、ＲＮＡをコードしているＤＮＡ上の領域や偽遺伝子が増幅されることがあるため、ＲＮＡを鋳型として合成されたＤＮＡのみを選択的に取得することが難しくなる。試料中に混在したＤＮＡ由来の増幅産物の生成を防ぐために、逆転写反応時にヌクレオチドアナログとＴｍ値を低下させる化合物とを用いる方法（特許文献１）や、試料中のＤＮＡをデオキシリボヌクレアーゼＩ（以下、ＤＮａｓｅＩと称することがある）等のエンドデオキシリボヌクレアーゼ（以下、エンドＤＮａｓｅと称することがある）により分解した後に逆転写反応を行う方法等が採用されている。

　試料中のＤＮＡをＤＮａｓｅＩにより分解した後に逆転写反応を行う場合、ｃＤＮＡの分解を防ぐため、熱処理やフェノール／クロロホルム抽出等によりＤＮａｓｅＩを逆転写反応前に不活化又は除去するのが一般的である。しかしながら、フェノール／クロロホルム抽出は煩雑であり、また、ＤＮａｓｅＩの反応に必須な２価の金属イオンはその存在下での熱処理によりＲＮＡの加水分解を引き起こすことが知られている。ＤＮａｓｅＩと逆転写酵素とを同時に作用させる方法も提案されている（特許文献２、３）が、ＤＮａｓｅＩはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド中のＤＮＡをも分解するため、この方法で逆転写反応により合成されたｃＤＮＡはＤＮａｓｅＩによって分解を受ける。

国際公開第９９／０９２１３号パンフレット特開２００５－３０４３９６号公報国際公開第２００６／１０３０３９号パンフレット

　本発明が解決しようとする課題は、試料中に混在するＤＮＡ由来の増幅産物の生成を簡便に防ぐことが可能なｃＤＮＡ合成方法を提供することにある。

　本発明者らは、エンドＤＮａｓｅが活性を示さず、かつ逆転写酵素が活性を示す反応液組成を調製可能であることを見出し、さらにこの知見に基づいて上記の課題を解決可能なｃＤＮＡの合成方法及びｃＤＮＡ合成用キットに関する本発明を完成させた。

　即ち、本発明は、
［１］　ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料中のＤＮＡをエンドデオキシリボヌクレアーゼにより分解し処理試料とした後、エンドデオキシリボヌクレアーゼの熱失活又はエンドデオキシリボヌクレアーゼの除去を行うことなく、当該処理試料及び逆転写酵素を含有し、かつエンドデオキシリボヌクレアーゼが活性を示さない反応液を調製し、逆転写反応を行うことを特徴とする、ｃＤＮＡの合成方法、
［２］　（ａ）ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料ならびにエンドデオキシリボヌクレアーゼを含む組成物を得る工程、（ｂ）エンドデオキシリボヌクレアーゼが試料中のＤＮＡを分解するのに十分な条件で、工程（ａ）で得られた組成物を処理する工程、及び（ｃ）工程（ｂ）で処理された組成物に添加剤と逆転写酵素を加えてエンドデオキシリボヌクレアーゼが活性を示さない反応液を調製し、逆転写酵素による逆転写反応を行う工程を含む、［１］に記載の方法、
［３］　エンドデオキシリボヌクレアーゼがデオキシリボヌクレアーゼＩである、［１］に記載の方法、
［４］　逆転写酵素がモロニーマウス白血病ウイルス由来逆転写酵素である、［１］に記載の方法、
［５］　添加剤が、還元剤、一価カチオン及びその塩からなる群より選択された少なくとも１種である、［２］に記載の方法、
［６］　一価カチオンがアンモニウムイオンである、［５］に記載の方法、
［７］　ｃＤＮＡの増幅方法であって、［１］～［６］いずれかに記載の方法により合成されたｃＤＮＡを鋳型として遺伝子増幅反応を行う工程を含む方法、並びに
［８］　（Ａ）エンドデオキシリボヌクレアーゼ、（Ｂ）緩衝剤、（Ｃ）逆転写酵素、及び（Ｄ）逆転写酵素が活性を示し、かつエンドデオキシリボヌクレアーゼが活性を示さない逆転写反応用の組成物を調製するための添加剤を含む、［１］～［７］いずれかに記載の方法のためのキット
に関する。

　本発明により、試料中に混在するＤＮＡ由来の増幅産物の生成を防ぐことが可能で、かつ操作性や定量性等に優れたｃＤＮＡの合成が可能となる。

図１は、実施例２におけるアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。図２は、実施例８におけるリアルタイムＰＣＲの結果を示す図である。

　本発明のｃＤＮＡ合成方法は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料中のＤＮＡをエンドデオキシリボヌクレアーゼにより分解し処理試料とした後、エンドデオキシリボヌクレアーゼの熱失活又はエンドデオキシリボヌクレアーゼの除去を行うことなく、当該処理試料及び逆転写酵素を含有し、かつエンドデオキシリボヌクレアーゼが活性を示さない反応液を調製し、逆転写反応を行うことを特徴とする。

　従来、試料中のＤＮＡをエンドＤＮａｓｅにより分解した後に逆転写反応を行う方法では、逆転写反応前にエンドＤＮａｓｅを熱失活するかエンドＤＮａｓｅを除去する必要があったが、本発明の方法ではこれらの操作は必要ない。すなわち、本発明によればエンドＤＮａｓｅによる試料中のＤＮＡの分解と逆転写反応の間に、６０℃以上の熱処理又は特定成分の分離操作を実施する必要はない。よって、本明細書において、「エンドデオキシリボヌクレアーゼ（エンドＤＮａｓｅ）の熱失活」とはエンドＤＮａｓｅを含む試料を６０℃以上で熱処理することを、「エンドデオキシリボヌクレアーゼ（エンドＤＮａｓｅ）の除去」とはエンドＤＮａｓｅを含む試料からエンドＤＮａｓｅを分離することを示し、「エンドデオキシリボヌクレアーゼの熱失活又はエンドデオキシリボヌクレアーゼの除去を行うことなく」とは前記のような操作を実施しないことである。

　本発明を特に限定するものではないが、本発明の方法に用いる試料としては、ＲＮＡを含む試料であればよく、例えば、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料が挙げられる。具体的には、細胞、組織、血液のような生体由来試料、これを公知の方法で処理することによって得られる核酸含有試料、食品、土壌、排水のような生物を含有する可能性のある試料が例示される。生体由来試料を公知の方法で処理する事によって得られる核酸含有試料の例としては、例えば細胞破砕物やそれを分画して得られる試料、該試料中の全ＲＮＡ、あるいは特定のＲＮＡ分子群、例えば、ｍＲＮＡを富化した試料等が挙げられ、それらの中にＤＮＡが混在する試料であってもよい。

　本明細書においてエンドデオキシリボヌクレアーゼ（エンドＤＮａｓｅ）とは、ＤＮＡ鎖をエンド型に切断する酵素のことをいう。本発明に使用されるエンドＤＮａｓｅとしては二本鎖ＤＮＡ特異的エンドＤＮａｓｅが好適に例示され、例えばＤＮａｓｅＩやＳｈｒｉｍｐ　ＤＮａｓｅ等の配列非特異的エンドヌクレアーゼや制限酵素等の配列特異的エンドヌクレアーゼがより好適に例示される。

　試料中のＤＮＡをエンドＤＮａｓｅにより分解した処理試料としては、試料中のＤＮＡがエンドＤＮａｓｅにより分解されるような条件下に保持した試料であれば特に限定はなく、当業者であれば使用するエンドＤＮａｓｅや試料に応じて適宜調製することができる。本発明を特に限定する物ではないが、エンドＤＮａｓｅとしてＤＮａｓｅＩを用いる場合、保持する条件としては、好ましくは２０℃～４５℃で１０秒～１２時間、より好ましくは２５℃～４４℃で３０秒～１時間、さらに好ましくは３０℃～４３℃で１分～３０分の条件が例示される。

　本発明に使用される逆転写酵素は、逆転写活性、すなわちＲＮＡを鋳型としてこれに相補的なＤＮＡを合成する活性を有する酵素であればよく、例えばモロニーマウス白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ由来逆転写酵素）やトリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ由来逆転写酵素）等のウイルス由来の逆転写酵素、好熱性バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｃａ　ＤＮＡポリメラーゼ等）等の真正細菌由来の逆転写酵素、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属細菌由来の逆転写活性とＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ等）が例示される。本発明には、ウイルス由来の逆転写酵素が好適に使用され、ＭＭＬＶ由来逆転写酵素がより好適に使用される。また、逆転写酵素は天然由来酵素又は組換体酵素のいずれも本発明に使用でき、逆転写活性を有する範囲で天然由来のアミノ酸配列に改変が施された逆転写酵素も本発明に使用できる。

　本明細書において「エンドデオキシリボヌクレアーゼが活性を示さない反応液」とは、「エンドデオキシリボヌクレアーゼがＤＮＡ分解活性を示さない反応液」であり、例えば、当該反応液に４０μｇ／ｍＬの子牛胸腺ＤＮＡを含有させ、これを製品に表示の力価で８Ｕ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ（タカラバイオ社）の存在下で２５℃、１０分間保持しても２６０ｎｍの吸光度が実質的に変化しない反応液のことを言う。

　当該処理試料及び逆転写酵素を含有し、かつエンドＤＮａｓｅが活性を示さない反応液は、例えばエンドＤＮａｓｅによる試料中のＤＮＡの分解を行った後の反応液に、エンドＤＮａｓｅがＤＮＡ分解活性を示さない組成となるように添加剤、逆転写酵素、その他の成分を加えることによって調製できる。すなわち、（ａ）試料及びエンドデオキシリボヌクレアーゼを含む組成物を得る工程、（ｂ）エンドデオキシリボヌクレアーゼが試料中のＤＮＡを分解するのに十分な条件で工程（ａ）により得られた組成物を処理する工程、ならびに（ｃ）工程（ｂ）で処理された組成物に添加剤と逆転写酵素を加えてエンドデオキシリボヌクレアーゼが活性を示さない反応液を調製し、逆転写反応を行う工程を含む方法は、本発明の方法の好適な態様の一つである。

　上記の工程（ａ）における試料及びエンドデオキシリボヌクレアーゼを含む組成物には、さらにＴｒｉｓ－ＨＣｌ等の緩衝剤、マグネシウムイオンやマンガンイオン等の２価の金属イオン、及びジチオトレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、以下、ＤＴＴと称することがある）等の還元剤が含まれることが好ましい。緩衝剤、２価の金属イオン、及び還元剤の種類や濃度は、次の工程（ｂ）においてエンドＤＮａｓｅが試料中のＤＮＡを分解する活性を示す範囲内で、エンドＤＮａｓｅの反応特性や安定性等の酵素学的性質、あるいは実験に基づいて適宜選択可能であり、エンドＤＮａｓｅが高い活性を示し、かつ高い安定性を示すように設定することが好ましい。例えば、緩衝剤の種類や濃度は、その添加によりエンドＤＮａｓｅの至適ｐＨ付近に設定すればよく、例えば、エンドＤＮａｓｅとしてＤＮａｓｅＩを用いる場合、ｐＨ５～１０に反応液のｐＨを調整することが可能なものが好ましい。また、還元剤の種類や濃度は、エンドＤＮａｓｅが高い安定性を示すように設定すればよく、例えば、エンドＤＮａｓｅとしてＤＮａｓｅＩを用いる場合、１ｍＭ以上５ｍＭ未満のＤＴＴを組成物中に含有させることが好ましい。

　前記の工程（ｂ）におけるエンドデオキシリボヌクレアーゼが試料中のＤＮＡを分解するのに十分な条件は、後の逆転写反応やその後の核酸増幅反応において、試料中のＤＮＡ由来の産物が実質的に確認できなくなるようにＤＮＡの分解が行なわれる温度や時間の条件であれば特に限定はなく、当業者であれば使用するエンドＤＮａｓｅや試料に応じて適宜設定することができる。本発明を特に限定する物ではないが、エンドＤＮａｓｅとしてＤＮａｓｅＩを用いる場合、２０℃～４５℃で１０秒～１２時間の条件が好適に例示され、２５℃～４４℃で３０秒～１時間の条件がより好適に例示され、３０℃～４３℃で１分～３０分の条件がさらにより好適に例示される。

　前記の工程（ｃ）における添加剤としては、還元剤、一価のカチオン及びその塩からなる群より選択される少なくとも１種が例示される。添加剤は、例えば当該添加剤を含む水溶液、好ましくは当該添加剤を含む緩衝液の形状として本発明に使用することができる。上記の緩衝液に使用する緩衝剤の種類や濃度は、反応液を所望のｐＨにできるものであれば特に限定はないが、その添加により逆転写反応に使用する逆転写酵素の至適ｐＨ付近に反応液のｐＨを変化させることが可能なものが好ましい。上記の緩衝剤としては、本発明を特に限定するものではないが、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ等のグッドバッファーが例示される。上記の還元剤としては、例えばＤＴＴ等のチオール還元剤や２－メルカプトエタノールが例示される。また、上記の一価のカチオンとしては、アンモニウムイオン、並びにカリウムイオン、リチウムイオン、及びナトリウムイオン等のアルカリ金属イオン等が例示され、これらの塩、例えば硫酸アンモニウムや塩化カリウムを用いてもよい。還元剤や一価カチオン又はその塩の種類や使用量は、添加剤を添加した組成物においてエンドＤＮａｓｅが活性を示さず、かつ逆転写酵素が有効に機能する組成となるようなものであれば特に限定はなく、当業者であれば本明細書の開示に基づいて適宜決定することができる。特に本発明を限定するものではないが、エンドＤＮａｓｅが活性を示さず、かつ逆転写酵素が有効に機能する組成物に含まれる成分としては、例えばエンドＤＮａｓｅがＤＮａｓｅＩの場合、硫酸アンモニウム、ＤＴＴ及び塩化カリウムが例示される。硫酸アンモニウムの組成物中の濃度としては、５ｍＭ以上が好適に例示され、１０ｍＭ～３０ｍＭがより好適に例示され、１４ｍＭ～２８ｍＭがさらに好適に例示される。また、ＤＴＴの濃度としては、５ｍＭ以上が好適に例示され、１１ｍＭ～３０ｍＭがより好適に例示され、１２ｍＭ～２０ｍＭがさらに好適に例示される。また、塩化カリウムの濃度としては、１ｍＭ以上が好適に例示され、３ｍＭ～３０ｍＭがより好適に例示され、５ｍＭ～２０ｍＭがさらに好適に例示される。具体的には、組成物中の最終濃度として、好ましくは５ｍＭ以上の硫酸アンモニウム、５ｍＭ以上のＤＴＴ、及び１ｍＭ以上の塩化カリウムを含むよう、より好ましくは１０ｍＭ～３０ｍＭの硫酸アンモニウム、１１ｍＭ～３０ｍＭのＤＴＴ、及び３ｍＭ～３０ｍＭの塩化カリウムを含むよう、さらに好ましくは１４ｍＭ～２８ｍＭの硫酸アンモニウム、１１ｍＭ～３０ｍＭのＤＴＴ、及び５ｍＭ～２０ｍＭの塩化カリウムを含むよう、さらに好ましくは１４ｍＭ～２８ｍＭの硫酸アンモニウム、１２ｍＭ～２０ｍＭのＤＴＴ、及び５ｍＭ～２０ｍＭの塩化カリウムを含むよう、前記添加剤を配合する。

　また、上記の添加剤は、逆転写酵素、緩衝剤、オリゴヌクレオチドプライマー及びｄＮＴＰ等の逆転写反応に必要な成分と混合した逆転写反応液調製用の緩衝液として本発明に使用することができる。操作性と逆転写酵素の安定性を考慮すれば、逆転写酵素以外の逆転写反応に必要な成分はこの緩衝液に含有させ、逆転写酵素のみを別途加える態様が好適である。

　逆転写反応の条件は、鋳型ＲＮＡに相補的なプライマー伸長鎖を合成するために十分な条件であれば特に限定はない。鋳型ＲＮＡに相補的なプライマー伸長鎖を合成するために十分な条件とは、特に限定するものではないが、温度条件としては２５～６０℃が好適であり、３０～５０℃がより好適である。また、反応時間としては、５～１２０分が好適であり、１５～６０分がより好適である。また、逆転写反応後に、逆転写酵素が不活化する条件で反応液をインキュベートしてもよい。逆転写酵素を不活化する条件としては、例えば８５℃で５秒間の条件が例示される。

　本発明のｃＤＮＡの増幅方法は、本発明のｃＤＮＡの合成方法により合成されたｃＤＮＡを鋳型として遺伝子増幅反応を行う工程を含む。ｃＤＮＡを鋳型とした核酸の増幅にはＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法等の当分野で周知の遺伝子増幅法が利用できる。例えば核酸の増幅にＰＣＲ法を用いる場合、一般的なＰＣＲの条件が適用でき、例えば、二本鎖鋳型ＤＮＡの一本鎖への解離（変性）、一本鎖鋳型ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、プライマーからの相補鎖合成（伸長）の３つのステップからなる反応により、又は「シャトルＰＣＲ」［『ＰＣＲ法最前線』、「蛋白質核酸酵素」別冊、第４１巻、第５号、４２５頁～４２８頁（１９９６）］と呼ばれる、前述の３ステップ反応のうちプライマーのアニーリング及び伸長のステップを同一温度で行なう２ステップ反応により実施される。ＰＣＲ法としては、インターカレーティング色素やＦＲＥＴ標識プローブ等を用いて核酸の増幅をモニタリング可能なリアルタイムＰＣＲも利用できる。

　本発明のキットは、本発明のｃＤＮＡの合成方法又は本発明のｃＤＮＡの増幅方法に使用するためのキットであり、（Ａ）エンドデオキシリボヌクレアーゼ、（Ｂ）緩衝剤、（Ｃ）逆転写酵素、及び（Ｄ）逆転写酵素が活性を示し、かつエンドデオキシリボヌクレアーゼが活性を示さない逆転写反応用の組成物を調製するための添加剤を含む。上記（Ｂ）の緩衝剤には、エンドＤＮａｓｅの反応に必要な２価の金属イオン等が含まれていてもよい。また、（Ｄ）の添加剤には、逆転写酵素による逆転写反応に必要な、オリゴヌクレオチドプライマーやｄＮＴＰが含まれていてもよい。

　以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１　エンドＤＮａｓｅ活性を抑制する反応組成の探索－１
　５ＵのＤＮａｓｅＩ〔Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮａｓｅ　Ｉ（ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ）、タカラバイオ社〕、２００ｎｇのマウスゲノムＤＮＡ、及び表１に記載の成分を含有する２０μＬの反応液を５種類（反応液１～５）調製した。また、ＤＮａｓｅＩを含まない以外は上記と同様の組成の反応液２０μＬを５種類調製した。なお、反応液１は、各成分がＤＮａｓｅＩの標準的な反応液組成の半分の濃度となるように設定しており、反応液２は逆転写酵素の至適ｐＨ近辺のｐＨとなりかつ逆転写酵素の基質となるｄＮＴＰを含むように設定している。これらの反応液を３７℃で１５分間インキュベートした後、８５℃で５秒間インキュベートした。次に、Ｒｓｐ１８遺伝子領域を標的配列としたリアルタイムＰＣＲにより、各反応液中に残存するゲノムＤＮＡの量を定量した。なお、リアルタイムＰＣＲには、ＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　ＥｘＴａｑ（Ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ、タカラバイオ社）を用い、プライマー対としては、配列表の配列番号１に記載の核酸配列からなるプライマー及び配列表の配列番号２に記載の核酸配列からなるプライマーを用いた。

　リアルタイムＰＣＲによるゲノムＤＮＡの定量結果、及び各反応液組成におけるゲノムＤＮＡの分解の抑制率を表２に示す。表２に示すように反応液中のゲノムＤＮＡが完全に分解される反応液１に対し、ＫＣｌや（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を添加した反応液やＤＴＴの濃度を高めた反応液３～５では、ＤＮＡ分解の抑制効果が認められた。特に、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を添加した反応液４やＤＴＴの濃度を高めた反応液５では、高いＤＮＡ分解の抑制効果が認められた。なお、分解の抑制率は、以下の式より算出した。
　　　抑制率（％）＝ＤＮａｓｅＩを含む反応液のＤＮＡ量／ＤＮａｓｅＩを含まない反応液のＤＮＡ量×１００

実施例２　エンドＤＮａｓｅ活性を抑制する反応組成の探索－２
　エンドＤＮａｓｅ活性を完全に抑制する反応組成を構築するために、５ＵのＤＮａｓｅＩ（タカラバイオ社）、２００ｎｇのマウスゲノムＤＮＡ、及び表３に示す成分を含有する反応液２０μＬを６種類（反応液１～６）調製した。また、ＤＮａｓｅＩを含まない以外は同様の組成の反応液２０μＬを６種類調製した。これらの反応液を３７℃で１５分間インキュベートした後、８５℃で５秒間インキュベートした。次に、各反応液をアガロースゲル電気泳動に供することにより、マウスゲノムＤＮＡのＤＮａｓｅＩによる分解を確認した。

　電気泳動結果を図１に示す。図１に示すように、反応液１及び２の組成においてはＤＮａｓｅＩの作用によりゲノムＤＮＡのバンドは完全に消失した。一方、反応液３及び４の組成においては、ＤＮａｓｅＩ存在下でもゲノムＤＮＡのバンドは完全には消失せずスメア状の泳動像が確認できた。このことから、反応液３及び４ではＤＮａｓｅＩ活性が抑制されていることが確認できた。また、その抑制の程度は反応液４の方が大きいことから、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４は濃度依存的にＤＮａｓｅＩの活性を抑制することが確認できた。さらに、反応液５及び６の組成においては、ゲノムＤＮＡのバンドはＤＮａｓｅＩ存在下でも全く変化しないことから、これらの反応液では完全にＤＮａｓｅＩ活性が抑制されていることが確認できた。このことから、ＫＣｌ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４の添加やＤＴＴ濃度を高めること以外に、Ｍｇ濃度を調整することによってＤＮａｓｅＩ活性をさらに抑制できることが示された。以上の結果から、例えば、反応液１の組成でＤＮａｓｅＩによるＤＮＡの分解を行った後、終濃度が反応液５あるいは６の組成になるように別途調製した添加剤を添加することでＤＮａｓｅＩが作用しない別の酵素反応が可能となることが示唆された。

実施例３　ＤＮａｓｅ活性の確認
　ＤＮａｓｅＩによるゲノムＤＮＡの分解が確認された実施例２の表３の反応液２に記載の成分を有する反応液とゲノムＤＮＡの分解が確認されなかった実施例２の表３の反応液５に記載の組成を有する反応液について、これらの反応液中でのＤＮａｓｅＩのＤＮａｓｅ活性を測定した。なお、以下に示すＤＮａｓｅの活性単位は、子牛胸腺ＤＮＡを基質として反応液のＯＤ２６０の吸光度を１分間に０．００１増加させる酵素量を１Ｕとしている。

　まず、表３の反応液２又は５に記載の成分、ＤＮａｓｅＩ（タカラバイオ社、製品に表示の力価＝５Ｕ／μＬ）の６０倍希釈溶液を１００μＬ、及び４０μｇの子牛胸腺ＤＮＡを含有する計１ｍＬの溶液を調製し、これを２５℃で１０分間保持しながら１分毎に吸光度（ＯＤ２６０）を測定した。その結果、表３の反応液２に記載の成分を有する反応液では、希釈前のＤＮａｓｅＩ（製品に表示の力価＝５Ｕ／μＬ）１μＬ当たり３９Ｕの活性が認められたのに対し、表３の反応液５に記載の組成においては吸光度の変化は認めらなかった。

　次に、表３の反応液５に記載の成分、ＤＮａｓｅＩ（５Ｕ／μＬ）を５０μＬ、及び４０μｇの子牛胸腺ＤＮＡを含有する１ｍＬの溶液を２５℃で１０分間保持しながら１分毎に吸光度（ＯＤ２６０）を測定した。その結果、表３の反応液５に記載の成分を有する反応液においては吸光度の変化は認められなかった。

　以上の通り、表３の反応液２に記載の成分を有する反応液においては製品の表示力価比べ約８倍の活性を示すのに対し、表３の反応液５に記載の成分を有する反応液においては、表３の反応液２に記載の成分を有する反応液における活性測定時の３０倍のＤＮａｓｅＩを用いても活性は検出限界以下であった。このことから、表３の反応液５に記載の成分を有する反応液では、ＤＮａｓｅＩの活性が完全に抑制されていることが確認できた。

実施例４　ＤＮａｓｅＩが作用しない反応組成におけるＤＮａｓｅＩ存在下の逆転写反応－１
　実施例２の表３の反応液５に記載の成分を有する反応液及び実施例２の表３の反応液６に記載の成分を有する反応液において、逆転写酵素による逆転写反応を行った場合に反応液中のＤＮａｓｅＩがｃＤＮＡ合成に及ぼす影響について、以下の方法で検証した。

　２μｇ／μＬから２０ｐｇ／μＬの段階希釈したマウス肝臓全ＲＮＡ溶液１μＬ、１０ＵのＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ社）、表３の反応液２に記載の成分、及び５ＵのＤＮａｓｅＩを含有する計１０μＬの混合液を調製した。また、ＤＮａｓｅＩを含まない以外は上記と同様の組成の混合液１０μＬも調製した。これらの混合液を４２℃で２分間インキュベートした後、２００ＵのＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）　ＲＴａｓｅ（タカラバイオ社）、２０ＵのＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ社）、５０ｐｍｏｌのＯｌｉｇｏ　ｄＴ　ｐｒｉｍｅｒと１００ｐｍｏｌのＲａｎｄｏｍ　６ｍｅｒｓを含有する１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．２）、２０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのｄＮＴＰ、２８ｍＭ又は５６ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を含む溶液をそれぞれ１０μＬずつ添加混合した。すなわち、ＤＮａｓｅ処理後の混合液に逆転写酵素を含む上記溶液を添加し、逆転写酵素、ＤＮａｓｅＩ、ＲＮａｓｅ阻害剤及びプライマー以外の終濃度を表３の反応液５に記載の成分又は表３の反応液６に記載の成分とした。次に、３７℃で１５分間の条件で逆転写反応を行った後、８５℃で５秒間の条件で逆転写酵素を失活させた。逆転写反応後のｃＤＮＡ合成量は、Ｒｓｐ１８遺伝子領域を標的配列としたリアルタイムＰＣＲにより評価した。なお、リアルタイムＰＣＲには、ＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　ＥｘＴａｑ（Ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ、タカラバイオ社）を用い、プライマー対としては、配列表の配列番号１に記載の核酸配列からなるプライマー及び配列表の配列番号２に記載の核酸配列からなるプライマーを用いた。

　リアルタイムＰＣＲの結果を表４に示す。表４に示されるように、ＤＮａｓｅＩの有無ではＣｔ値に差がなかった。この結果から、表３の反応液５に記載の成分を有する反応液及び表３の反応液６に記載の成分を有する反応液において、逆転写酵素によるｃＤＮＡ合成にＤＮａｓｅＩが影響を及ぼさないことが確認できた。

実施例５　ＤＮａｓｅＩが作用しない反応組成におけるＤＮａｓｅＩ存在下の逆転写反応－２
　ＤＮａｓｅＩが作用しない反応組成におけるＤＮａｓｅＩ存在下の逆転写酵素によるｃＤＮＡ合成量を、ＤＮａｓｅＩを含有しない標準的な逆転写反応組成によるｃＤＮＡ合成量と比較した。

　２μｇ／μＬから２０ｐｇ／μＬの段階希釈したマウス肝臓全ＲＮＡ溶液１μＬ、実施例２の表３の反応液２に記載の成分、及び５ＵのＤＮａｓｅＩを含有する計１０μＬの混合液を調製した。この混合液を４２℃で２分間インキュベートした後、２００ＵのＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）　ＲＴａｓｅ（タカラバイオ社）、２０ＵのＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ社）、５０ｐｍｏｌのＯｌｉｇｏ　ｄＴ　ｐｒｉｍｅｒと１００ｐｍｏｌのＲａｎｄｏｍ　６ｍｅｒｓを含有する１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．２）、２０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのｄＮＴＰ、２８ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を含む溶液を１０μＬ添加混合した。すなわち、ＤＮａｓｅ処理後の混合液に逆転写酵素を含む上記溶液を添加し、逆転写酵素、ＤＮａｓｅＩ、ＲＮａｓｅ阻害剤及びプライマー以外の終濃度を実施例２の表３の反応液５に記載のものとした。次に、３７℃で１５分間の条件で逆転写反応を行った後、８５℃で５秒間の条件で逆転写酵素を失活させた。

　一方、ＤＮａｓｅＩを含有しない標準的な逆転写反応組成は、２μｇ／μＬから２０ｐｇ／μＬの段階希釈したマウス肝臓全ＲＮＡ溶液１μＬ、２００ＵのＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）　ＲＴａｓｅ（タカラバイオ社）、２０ＵのＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ社）、５０ｐｍｏｌのＯｌｉｇｏｄＴ　ｐｒｉｍｅｒ、及び１００ｐｍｏｌのＲａｎｄｏｍ　６ｍｅｒｓ、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭのＫＣｌ、及び３ｍＭのＭｇＣｌ_２を含む計１０μＬの反応液とした。この反応液を用いて３７℃で１５分間の条件で逆転写反応を行った後、８５℃で５秒間の条件で逆転写酵素を失活させた。

　逆転写反応後のｃＤＮＡ合成量は、Ｒｓｐ１８遺伝子領域を標的配列としたリアルタイムＰＣＲにより評価した。なお、リアルタイムＰＣＲには、ＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　ＥｘＴａｑ（Ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ、タカラバイオ社）を用い、プライマー対としては、配列表の配列番号１に記載の核酸配列からなるプライマー及び配列表の配列番号２に記載の核酸配列からなるプライマーを用いた。

　リアルタイムＰＣＲの結果を表５に示す。表５に示されるように、本発明の方法によるリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより得られたＣｔ値と従来の標準的なリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより得られたＣｔ値とがほぼ一致した。これにより本発明の方法は、ＤＮａｓｅＩによるｃＤＮＡ合成産物の分解を完全に抑制しながら、効率良く逆転写反応を行うことが可能であることが明らかになった。

実施例６　ＤＮａｓｅＩが作用しない反応組成におけるＤＮａｓｅＩ存在下の逆転写反応－３
　本発明のｃＤＮＡ合成方法により得られるｃＤＮＡ合成量を、試料中のＤＮＡのＤＮａｓｅＩによる分解の後にＤＮａｓｅＩを熱失活させる従来のｃＤＮＡ合成方法により得られるｃＤＮＡ合成量と比較した。

　一方、ＤＮａｓｅＩを熱失活させる従来のｃＤＮＡ合成方法では、２μｇ／μＬから２０ｐｇ／μＬの段階希釈したマウス肝臓全ＲＮＡ溶液１μＬ、実施例２の表３の反応液１に記載の成分、及び５ＵのＤＮａｓｅＩを含有する計１０μＬの混合液を調製し、これを４２℃で２分間インキュベートした後に９５℃で１０分間インキュベートし、ＤＮａｓｅＩを熱失活させた。ここに、２００ＵのＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）　ＲＴａｓｅ（タカラバイオ社）、２０ＵのＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ社）、５０ｐｍｏｌのＯｌｉｇｏ　ｄＴ　ｐｒｉｍｅｒ、１００ｐｍｏｌのＲａｎｄｏｍ　６ｍｅｒｓ、１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３００ｍＭのＫＣｌ、１２ｍＭのＭｇＣｌ_２、及び１ｍＭのｄＮＴＰを含む溶液を１０μＬ添加混合した。すなわち、ＤＮａｓｅ処理、ＤＮａｓｅ熱失活処理後の混合液に逆転写酵素を含む上記溶液を添加し、標準的な逆転写反応液組成を有する組成物とした。次に、３７℃で１５分間の条件で逆転写反応を行った後、８５℃で５秒間の条件で逆転写酵素を失活させた。

　リアルタイムＰＣＲの結果を表６に示す。表６に示されるように、試料中のＤＮＡ分解の後にＤＮａｓｅＩを熱失活させる従来のｃＤＮＡ合成方法で得られたｃＤＮＡを鋳型とした場合のＣｔ値は、本発明の方法によるリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより得られたＣｔ値と比較して２サイクル程度の遅れが認められる。これは、ＤＮａｓｅＩの熱失活の際にｃＤＮＡ合成の鋳型となるＲＮＡが分解したことが原因と考えられる。本実施例により、ＤＮａｓｅＩの熱失活の必要がない本発明のｃＤＮＡ合成方法の有用性が示される。

実施例７　本発明の方法におけるゲノムＤＮＡの分解
　本発明のｃＤＮＡの合成方法を実施することによる試料中のＤＮＡの分解を下記の方法により確認した。

　まず、２００ｎｇ／μＬのマウスゲノムＤＮＡ溶液１μＬ、１０ＵのＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ社）、表３の反応液２に記載の成分、及び５ＵのＤＮａｓｅＩを含有する計１０μＬの混合液を調製した。また、ＤＮａｓｅＩを含まない以外は上記と同様の組成の混合液１０μＬも調製した。これらの混合液を４２℃で２分間インキュベートした後、２０ＵのＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ社）、５０ｐｍｏｌのＯｌｉｇｏ　ｄＴ　ｐｒｉｍｅｒと１００ｐｍｏｌのＲａｎｄｏｍ　６ｍｅｒｓを含有する１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．２）、２０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのｄＮＴＰ、２８ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を含む溶液をそれぞれ１０μＬずつ添加混合した。すなわち、ＤＮａｓｅ処理後の混合液に上記溶液を添加し、ＤＮａｓｅＩ、ＲＮａｓｅ阻害剤及びプライマー以外の終濃度を表３の反応液５に記載の成分とした。次に、３７℃で１５分間、８５℃で５秒間の反応を行った。反応後のマウスゲノムＤＮＡの残存量は、Ｒｓｐ１８遺伝子領域を標的配列とした４０　ｃｙｃｌｅｓのリアルタイムＰＣＲにより評価した。なお、リアルタイムＰＣＲには、ＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　ＥｘＴａｑ（Ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ、タカラバイオ社）を用い、プライマー対としては、配列表の配列番号１に記載の核酸配列からなるプライマー及び配列表の配列番号２に記載の核酸配列からなるプライマーを用いた。

　リアルタイムＰＣＲの結果、ＤＮａｓｅＩを含まない混合液を用いた場合のＣｔ値が２２．６８であったのに対して、ＤＮａｓｅＩを含む混合液を用いた場合は増幅産物が一切確認できなかった。この結果から、本発明のｃＤＮＡの合成方法では、試料中に混在するＤＮＡに由来する増幅産物の生成を避けられることを確認した。

実施例８　本発明の方法によるｃＤＮＡ合成の効率
　本発明の方法によるｃＤＮＡ合成の効率を、ＤＮａｓｅＩと逆転写酵素とを同時に作用させる方法によるｃＤＮＡ合成の効率と比較した。

（１）鋳型ＲＮＡ
　鋳型としては、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ抽出キット　ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡ　ＩＩ（マッハライ・ナーゲル社）の標準プロトコルに従ってゲノムＤＮＡが除去され、精製されたマウス肝臓全ＲＮＡ溶液を２μｇ／μＬから２０ｐｇ／μＬに段階希釈したものを使用した。

（２）ＤＮａｓｅＩと逆転写酵素とを同時に作用させる方法によるｃＤＮＡ合成
　上記鋳型ＲＮＡ溶液を１μＬ、実施例２の表３の反応液１に記載の成分、０．５ｍＭのｄＮＴＰ、２００ＵのＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）　ＲＴａｓｅ（タカラバイオ社）、２０ＵのＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ社）、５０ｐｍｏｌのＯｌｉｇｏ　ｄＴ　ｐｒｉｍｅｒ、１００ｐｍｏｌのＲａｎｄｏｍ　６ｍｅｒｓ、及び５ＵのＤＮａｓｅＩを含む計２０μＬの混合液を、鋳型ＲＮＡの濃度がそれぞれ異なる計６種類について調製した。また、鋳型ＲＮＡ溶液の代わりに滅菌蒸留水１μＬを添加した混合液も調製した。対照として、ＤＮａｓｅＩを含まない以外は上記と同様の組成の混合液２０μＬも調製した。こうして調製した各混合液について３７℃、１５分間の条件で逆転写反応を行った後、８５℃、５秒間の条件で逆転写酵素を失活させた。

（３）本発明の方法によるｃＤＮＡ合成
　上記（１）に記載の鋳型ＲＮＡ溶液を１μＬ、実施例２の表３の反応液２に記載の成分、及び５ＵのＤＮａｓｅＩを含有する計１０μＬの混合液を、鋳型ＲＮＡの濃度がそれぞれ異なる計６種類について調製した。また、鋳型ＲＮＡ溶液の代わりに滅菌蒸留水１μＬを添加した混合液も調製した。対照として、ＤＮａｓｅＩを含まない以外は上記と同様の組成の混合液１０μＬも調製した。こうして調製した混合液を４２℃で２分間インキュベートした後、２００ＵのＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）　ＲＴａｓｅ（タカラバイオ社）、２０ＵのＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ社）、５０ｐｍｏｌのＯｌｉｇｏ　ｄＴ　ｐｒｉｍｅｒと１００ｐｍｏｌのＲａｎｄｏｍ　６ｍｅｒｓを含有する１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．２）、２０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのｄＮＴＰ、２８ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を含む溶液を１０μＬ添加混合した。すなわち、ＤＮａｓｅ処理後の混合液に逆転写酵素を含む上記溶液を添加し、逆転写酵素、ＤＮａｓｅＩ、ＲＮａｓｅ阻害剤及びプライマー以外の終濃度を実施例２の表３の反応液５に記載のものとした（反応液最終容量２０μＬ）。次に、３７℃で１５分間の条件で逆転写反応を行った後、８５℃で５秒間の条件で逆転写酵素を失活させた。

（４）リアルタイムＰＣＲによるｃＤＮＡ合成量の評価
　上記（２）、（３）により得られたｃＤＮＡの合成量を、Ｒｓｐ１８遺伝子領域を標的配列としたリアルタイムＰＣＲにより評価した。なお、リアルタイムＰＣＲには、ＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　ＥｘＴａｑ（Ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ、タカラバイオ社）を用い、プライマー対としては、配列表の配列番号１に記載の核酸配列からなるプライマー及び配列表の配列番号２に記載の核酸配列からなるプライマーを用いた。リアルタイムＰＣＲの結果を表７及び図２に示す。表７及び図２中「（３）」は上記（３）により得られたｃＤＮＡの合成量をリアルタイムＰＣＲにより評価した結果を、「（２）」は上記（２）により得られたｃＤＮＡの合成量をリアルタイムＰＣＲにより評価した結果を示す。

　表７及び図２に示す通り、ＤＮａｓｅＩと逆転写酵素とを同時に作用させる方法、即ち、（２）方法のＤＮａｓｅ（＋）では、ＤＮａｓｅによってｃＤＮＡ合成量が低下し、Ｃｔ値が大きくなった。この原因としては、逆転写反応により合成されたｃＤＮＡのＤＮａｓｅによる分解が挙げられる。一方、本発明の方法では、ＤＮａｓｅによるｃＤＮＡ合成への影響は認められなかった。

　本発明のｃＤＮＡ合成方法及びキットは、広く遺伝子工学の分野に有用である。

SEQ ID NO:1 ; Primer to amplify the cDNA fragment of mouse Rsp18 gene.
SEQ ID NO:2 ; Primer to amplify the cDNA fragment of mouse Rsp18 gene.

Claims

　ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料中のＤＮＡをエンドデオキシリボヌクレアーゼにより分解し処理試料とした後、エンドデオキシリボヌクレアーゼの熱失活又はエンドデオキシリボヌクレアーゼの除去を行うことなく、当該処理試料及び逆転写酵素を含有し、かつエンドデオキシリボヌクレアーゼが活性を示さない反応液を調製し、逆転写反応を行うことを特徴とする、ｃＤＮＡの合成方法。
　下記工程（ａ）～（ｃ）：
（ａ）ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料ならびにエンドデオキシリボヌクレアーゼを含む組成物を得る工程；
（ｂ）エンドデオキシリボヌクレアーゼが試料中のＤＮＡを分解するのに十分な条件で、工程（ａ）で得られた組成物を処理する工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で処理された組成物に添加剤と逆転写酵素を加えてエンドデオキシリボヌクレアーゼが活性を示さない反応液を調製し、逆転写酵素による逆転写反応を行う工程
を含む、請求項１に記載の方法。
　エンドデオキシリボヌクレアーゼがデオキシリボヌクレアーゼＩである、請求項１に記載の方法。
　逆転写酵素がモロニーマウス白血病ウイルス由来逆転写酵素である、請求項１に記載の方法。
　添加剤が、還元剤、一価カチオン及びその塩からなる群より選択された少なくとも１種である、請求項２に記載の方法。
　一価カチオンがアンモニウムイオンである、請求項５に記載の方法。
　ｃＤＮＡの増幅方法であって、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法により合成されたｃＤＮＡを鋳型として遺伝子増幅反応を行う工程を含む方法。
　下記（Ａ）～（Ｄ）：
（Ａ）エンドデオキシリボヌクレアーゼ、
（Ｂ）緩衝剤、
（Ｃ）逆転写酵素、及び
（Ｄ）逆転写酵素が活性を示し、かつエンドデオキシリボヌクレアーゼが活性を示さない逆転写反応用の組成物を調製するための添加剤
を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法のためのキット。