CN117802208A - 逆转录试剂盒和逆转录方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种逆转录试剂盒和逆转录方法，包括用于混合于同一反应体系使用的裂解试剂、RNA提纯试剂、逆转录试剂和稳定试剂；其中，裂解试剂用于裂解植物细胞，RNA提纯试剂用于减少反应体系中植物细胞裂解产生的基因组杂质，逆转录试剂用于逆转录植物细胞中的RNA得到逆转录产物，稳定试剂用于稳定逆转录试剂及其逆转录产物。本申请创造性地通过设计RNA提纯试剂、稳定试剂与裂解试剂、逆转录试剂组合使用，提高裂解产物的RNA纯度和逆转录产物的稳定性，实现了在一管式或者一锅式反应中，直接加入植物样本反应即可得到纯度较高的cDNA，操作简单，精简了实验流程，减少合成cDNA的时间。
Description
技术领域
本申请涉及分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种逆转录试剂盒和逆转录方法。
背景技术
逆转录又称为反转录，是以RNA为模板，通过逆转录酶，合成cDNA的过程，是DNA生物合成的一种特殊方式，由逆转录酶进行催化。逆转录的发现对分子生物学、基因工程技术的发展起到了巨大的推动作用，是构建、表达真核或者原核生物目的基因，构建cDNA文库，检测基因序列等分子细胞生物学实验中不可或缺的工具，与Taq酶等共同构成了现代生物技术的基础工具。
目前，虽然逆转录酶和试剂已经进行了诸多改良，逆转录操作方法的改进很少。经典的方法进行逆转录，先通过Trizol试剂对细胞进行裂解，接着通过氯仿将DNA、RNA和蛋白质进行分层，进一步通过异丙醇、乙醇等对RNA进行分离和纯化，检测鉴定之后进行逆转录操作，整个操作过程流程较长，用时较长，长流程的操作极大的增加了RNA的降解风险，为了获得质量较好的RNA，操作时需谨慎小心，并且需要较为专业的人员进行。
一些逆转录方法直接用样本裂解得到RNA，再使用逆转录buffer将其逆转录为cDNA，时间较短，但所使用的裂解液组分简单，得到的cDNA纯度不佳；并且从样本到cDNA需要两步，RNA仍有一定的降解风险，且buffer的热稳定性没有保障，容易影响逆转录效果和逆转录产物的稳定性。
因此，如何优化逆转录反应流程是提升逆转录效果的难点。
发明内容
为了解决上述问题，优化逆转录合成的实验流程，提升逆转录产物的质量，本申请的第一目的在于提供一种逆转录试剂盒，包括用于混合于同一反应体系使用的裂解试剂、RNA提纯试剂、逆转录试剂和稳定试剂；其中，裂解试剂用于裂解植物细胞，RNA提纯试剂用于减少反应体系中植物细胞裂解产生的基因组杂质，逆转录试剂用于逆转录植物细胞中的RNA得到逆转录产物，稳定试剂用于稳定逆转录试剂及其逆转录产物。
本申请创造性地通过设计RNA提纯试剂、稳定试剂与裂解试剂、逆转录试剂在同一个反应体系中使用，可以提高裂解产物的RNA纯度和逆转录产物的稳定性，实现了在逆转录试剂中直接加入植物样本反应即可得到纯度较高的cDNA，操作简单，精简了实验流程，减少合成cDNA的时间，节约了时间成本。
在其中一个实施方式中，试剂盒满足以下条件(1)～(4)中的至少一个：
(1)裂解试剂包括NP-40和RNasin；
(2)RNA提纯试剂包括多酚除杂试剂、DNA除杂试剂、金属盐抑制试剂和蛋白除杂试剂中的至少一种；
可选地，多酚除杂试剂包括聚乙二醇、BSA、聚乙烯吡咯烷酮、β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸和二硫苏糖醇中的至少一种；
可选地，DNA除杂试剂包括热敏dsDNase酶；
可选地，金属盐抑制试剂包括EGTA、EDTA、IDHA和DTPA中的至少一种；
可选地，蛋白除杂试剂包括十二烷基硫酸钠、聚乙二醇、甘露醇、氯仿、异硫氰酸胍；
(3)逆转录试剂包括逆转录缓冲试剂、dNTPs、耐高温逆转录酶和逆转录引物中的至少一种；
可选地，逆转录缓冲试剂的pH值为8.0～8.6，包括Tris、NH4Ac、MgAc2和KAc；
可选地，耐高温逆转录酶包括转录酶RTSTO；
(4)稳定试剂包括DTT、TCEP、甘油和明胶中的至少一种。
在其中一个实施方式中，以试剂盒中各试剂混合后的总质量计，各试剂的浓度满足以下条件(1)～(15)中的至少一个：
(1)裂解试剂中NP-40的质量百分浓度为1％～3％；
(2)裂解试剂中RNasin的工作浓度为5U/μL～25U/μL；
(3)多酚除杂试剂的质量百分浓度为0.1％～0.4％；
(4)蛋白除杂试剂的质量百分浓度为5％～10％；
(5)DNA除杂试剂中热敏dsDNase酶的工作浓度为工作0.5U/μL～2.5U/μL；(6)金属盐抑制试剂的工作浓度为6mM～7.5mM；
(7)逆转录缓冲试剂中NH4Ac的工作浓度为50mM～100mM；
(8)逆转录缓冲试剂中MgAc2的工作浓度为15mM～22.5mM；
(9)逆转录缓冲试剂中KAc的工作浓度为200mM～250mM；
(10)逆转录试剂中的逆转录引物的工作浓度为0.0125mM～0.025mM；
(11)逆转录试剂中dNTPs的工作浓度为2.5mM～5mM；
(12)逆转录试剂中耐高温逆转录酶的工作浓度为5U/μL～25U/μL；
(13)逆转录试剂中DTT或TCEP的工作浓度为20mM～50mM；
(14)稳定试剂中明胶的工作浓度为0.01g/L～0.05g/L；
(15)稳定试剂中甘油的质量百分浓度为20％～30％。
在其中一个实施方式中，逆转录引物包括随机引物和特异性引物，随机引物可随机合成小片段cDNA，特异性引物可合成全长片段cDNA；
可选地，随机引物的序列为：NNNNNN；
可选地，特异性引物的序列为：
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
本申请的第二目的在于提供一种逆转录方法，包括采用上述逆转录试剂盒与植物样本混合进行cDNA合成反应。
在其中一个实施方式中，cDNA合成反应的时间为15min～20min。
在其中一个实施方式中，cDNA合成反应包括不同反应阶段：裂解除杂反应、逆转录反应和酶失活反应，不同反应阶段分别在不同温度下进行。
在其中一个实施方式中，不同反应阶段满足以下条件(1)～(3)中的至少一个：
(1)裂解除杂反应的反应温度为37℃，恒温反应时间为10min～30min；
(2)逆转录反应的反应温度为50℃～60℃，反应时间为5～10min；
(3)酶失活反应的反应温度为85℃～92℃，反应时间为5s～30s。
在其中一个实施方式中，植物样本包括植物叶片样本。
在其中一个实施方式中，植物包括小麦、拟南芥、油菜、水稻和番茄中的至少一种。
附图说明
为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例1提供的SDS对多酚杂质的清除效果；
图2为本申请实施例1提供的BAS对多酚杂质的清除效果；
图3为本申请实施例1提供的EGTA对镁离子的清除效果；
图4为本申请实施例1提供的EDTA对镁离子的清除效果；
图5为本申请实施例1提供的PEG对蛋白杂质的清除效果；
图6为本申请实施例1提供的甘露醇对蛋白杂质的清除效果；
图7为本申请实施例1提供的MIX试剂中逆转录酶RTSTO与普通逆转录酶MMLV逆转录效果差异；
图8为本申请实施例1提供的逆转录酶RTSTO与普通逆转录酶MMLV对MIX试剂合成水稻cDNA的稳定性差异；
图9为本申请实施例1提供的逆转录酶RTSTO与普通逆转录酶MMLV对MIX试剂中合成番茄cDNA的稳定性差异；
图10为本申请实施例1提供的pH对MIX试剂逆转录效果的影响结果；
图11为本申请实施例1提供的pH对MIX试剂合成水稻cDNA的稳定性的影响结果；
图12为本申请实施例1提供的pH对MIX试剂合成番茄cDNA的稳定性的影响结果；
图13为本申请实施例1提供的DTT浓度对MIX试剂合成番茄cDNA的稳定性的影响结果；
图14为本申请实施例1提供的DTT浓度对MIX试剂合成水稻cDNA的稳定性的影响结果；
图15为本申请实施例1提供的TCEP浓度对MIX试剂合成番茄cDNA的稳定性的影响结果；
图16为本申请实施例1提供的TCEP浓度对MIX试剂合成水稻cDNA的稳定性的影响结果；
图17为本申请实施例1提供的不同浓度组合对MIX试剂的逆转录效果的影响结果；
图18为本申请实施例1提供的不同浓度组合对MIX试剂合成番茄cDNA的稳定性的影响结果；
图19为本申请实施例1提供的不同浓度组合对MIX试剂合成水稻cDNA的稳定性的影响结果；
图20为本申请实施例1提供的cDNA合成过程裂解除杂反应时间的筛选结果；
图21为本申请实施例1提供的cDNA合成过程逆转录反应温度的筛选结果；
图22为本申请实施例1提供的cDNA合成过程逆转录反应时间的筛选结果；
图23为本申请实施例1提供的cDNA合成过程酶失活反应条件的筛选结果。
具体实施方式
现将详细地提供本申请实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本申请。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本申请进行多种修改和变化而不背离本申请的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
因此，旨在本申请覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本申请的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本申请更广阔的方面。
为了至少部分解决上述技术问题的至少一个，本申请的第一方面提供了一种逆转录试剂盒，包括用于混合于同一反应体系使用的裂解试剂、RNA提纯试剂、逆转录试剂和稳定试剂；其中，裂解试剂用于裂解植物细胞，RNA提纯试剂用于减少反应体系中植物细胞裂解产生的基因组杂质，逆转录试剂用于逆转录植物细胞中的RNA得到逆转录产物，稳定试剂用于稳定逆转录试剂及其逆转录产物。
本申请创造性地通过设计RNA提纯试剂、稳定试剂与裂解试剂、逆转录试剂组合在同一个反应体系中使用，可以提高裂解产物的RNA纯度和逆转录产物的稳定性，实现了在逆转录试剂中直接加入植物样本反应即可得到纯度较高的cDNA，操作简单，精简了实验流程，减少合成cDNA的时间，节约了时间成本。
一些实施方案中，裂解试剂包括NP-40和RNasin，用于裂解植物样本中植物细胞，释放植物细胞裂解产物。
一些实施方案中，裂解试剂还包括无核酸酶水，可以理解的是，裂解试剂中的无核酸酶水并不是必须的，无核酸酶水也可以作为RNA提纯试剂、逆转录试剂和稳定试剂中至少一种的组成成分。
一些具体实施方案中，以试剂盒中各试剂混合后的总质量计，裂解试剂中NP-40的质量百分浓度为1％～3％。进一步可以为1％～2％。
一些具体实施方案中，裂解试剂中RNasin的工作浓度为5U/μL～25U/μL；进一步为5U/μL～15U/μL；更进一步为5U/μL～10U/μL。
一些实施方案中，RNA提纯试剂包括多酚除杂试剂、DNA除杂试剂、金属盐抑制试剂和蛋白除杂试剂中的至少一种，用于去除裂解产物中的多种杂质对合成cDNA的影响，提高裂解产物中RNA的纯度，进而提升合成产物cDNA的纯度。
一些具体实施方案中，多酚除杂试剂包括十二烷基硫酸钠、聚乙二醇、BSA、聚乙烯吡咯烷酮、β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸和二硫苏糖醇中的至少一种，用于去除裂解产物中的多酚杂质。
一些实施方案中，以试剂盒中各试剂混合后的总质量计，多酚除杂试剂的质量百分浓度为0.1％～0.4％。
一些实施方案中，DNA除杂试剂包括热敏dsDNase酶，dsDNase酶用于清除基因组DNA杂质，并且可在后续反应程序中通过高温抑制其活性，避免其对逆转录产物的稳定性造成影响。
一些具体实施方案中，热敏dsDNase酶的工作浓度为工作0.5U/μL～2.5U/μL；进一步为0.5U/μL～2U/μL；更进一步为0.5U/μL～1U/μL。
一些具体实施方案中，金属盐抑制试剂包括EGTA、EDTA、IDHA和DTPA中的至少一种，可与金属离子螯合，从而抑制金属离子发挥作用，减少金属离子对逆转录引物扩增合成cDNA的影响。
一些实施方案中，金属盐抑制试剂的工作浓度为6mM～7.5mM。进一步可以为6mM～7mM。更进一步可以为6mM～6.5mM。
一些具体实施方案中，蛋白除杂试剂包括十二烷基硫酸钠、聚乙二醇、甘露醇、氯仿和异硫氰酸胍中的至少一种，示例性地，聚乙二醇用于使蛋白沉淀变性，高浓度的甘露醇则易于形成结晶态而促进蛋白质药物的聚集。
一些实施方案中，以试剂盒中各试剂混合后的总质量计，蛋白除杂试剂的质量百分浓度为5％～10％。进一步可以为5％～8％。更进一步可以为5％～6％。
一些实施方案中，逆转录试剂包括逆转录缓冲试剂、dNTPs、耐高温逆转录酶和逆转录引物中的至少一种，用于对裂解产物中的RNA直接进行逆转录反应。
一些实施方案中，逆转录缓冲试剂的pH值为8.0～8.6。进一步可以为8.0～8.3。更进一步可以为8.0～8.1。
一些具体实施方案中，逆转录缓冲试剂包括Tris、NH4Ac、MgAc2和KAc，用于为逆转录反应提供稳定的pH环境。
一些实施方案中，逆转录缓冲试剂中NH4Ac的工作浓度为50mM～100mM。进一步可以为50mM～80mM。进一步可以为50mM～60mM。
一些实施方案中，逆转录缓冲试剂中MgAc2的工作浓度为20mM～22.5mM。进一步可以为20mM～22mM。更进一步可以为20mM～21mM。
一些实施方案中，逆转录缓冲试剂中KAc的工作浓度为200mM～250mM。进一步可以为200mM～230mM。进一步可以为200mM～210mM。
一些实施方案中，逆转录试剂中dNTPs的工作浓度为2.5mM～5mM。进一步可以为2.5mM～4mM。更进一步可以为2.5mM～3mM。
一些实施方案中，耐高温逆转录酶包括转录酶RTSTO。本申请的逆转录反应试剂中，耐高温逆转录酶RTSTO相比于传统方法中使用的MMLV具有更好的耐高温性能和更好的转录效果。
一些实施方案中，逆转录试剂中耐高温逆转录酶的工作浓度为5U/μL～25U/μL。进一步为5U/μL～15U/μL。更进一步为5U/μL～10U/μL
一些实施方案中，稳定试剂包括DTT、TCEP、甘油和明胶中的至少一种，用于提高逆转录产物的稳定性。其中，TCEP可代替DTT使用，TCEP稳定性更强，毒性低。
一些具体实施方案中，稳定试剂中DTT或TCEP的工作浓度为20mM～50mM。进一步为20mM～40mM。更进一步为20mM～50mM。
一些具体实施方案中，稳定试剂中明胶的工作浓度为0.01g/L～0.05g/L。进一步为0.01g/L～0.04g/L。更进一步为0.01g/L～0.03g/L。
一些具体实施方案中，以试剂盒中各试剂混合后的总质量计，稳定试剂中甘油的质量百分浓度为20％～30％。进一步为20％～26％。更进一步为为20％～22％。
一些实施方案中，逆转录引物包括随机引物和特异性引物，用于根据植物样本裂解产物中的RNA合成cDNA。其中，随机引物可随机结合RNA模板合成小片段cDNA，特异性引物可特异性结合RNA模板合成全长片段cDNA。
一些具体实施方案中，随机引物的序列为：NNNNNN。
一些具体实施方案中，特异性引物的序列为：
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN。
一些实施方案中，逆转录试剂中的逆转录引物的工作浓度为0.0125mM～0.025mM。进一步为0.0125mM～0.020mM。进一步为0.0125mM～0.015mM。
本申请的第二方面提供了一种逆转录方法，包括采用上述逆转录试剂盒和植物样本混合进行cDNA合成反应。
一些实施方案中，cDNA合成反应的时间为15min～1h。进一步为15min～40min。更进一步为15min～30min。
一些实施方案中，cDNA合成反应包括不同反应阶段，不同反应阶段包括裂解除杂反应、逆转录反应和酶失活反应，不同反应阶段分别在不同温度下进行。其中，裂解除杂反应用于裂解释放植物细胞的RNA并通过热敏DNA酶除去基因组杂质，逆转录反应用于将细胞中释放的RNA逆转录合成cDNA同时使热敏DNA酶失活，酶失活反应用于灭火逆转录酶。
一些具体实施方案中，裂解除杂反应的反应温度为37℃，恒温反应时间为10min～30min；进一步为10min～20min；更进一步为10min～15min；
一些具体实施方案中，逆转录反应的反应温度为50℃～60℃，反应时间为5min～20min；进一步为5min～15min；更进一步为5min～15min。
一些具体实施方案中，酶失活反应的反应温度为85℃～92℃，反应时间为5s～30s。进一步为5s～10s。更进一步为5s～20s。
一些具体实施方案中，植物样本包括植物叶片样本。
一些具体实施方案中，植物包括小麦、油菜、拟南芥、水稻和番茄中的至少一种。
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述。
本实施例提供了一种逆转录方法，包括：在一管同时含有裂解试剂、基因组除杂试剂、逆转录试剂和稳定剂的混合试剂中，可以直接加入植物样本按照预设的反应程序进行反应，即可得到植物样本的cDNA。该方法和反应程序具有操作简单，反应快速、高效的特点。
相应地，本实施例提供一种用于直接加入植物样本进行反应即可得到cDNA的混合试剂。本实施例针对植物样本配制多种除杂试剂，特别地使用热敏dsDNase酶与耐高温逆转录酶在同一反应体系中混合使用，得到一管可直接进行cDNA合成的混合试剂。
具体地，混合试剂包括以下配制组分：
1％～3％NP-40、0.1％～0.4％SDS或BSA、0.5U/μL-2U/μL热敏dsDNase酶、200mM～250mM Tris8.3、50mM～100mM NH4Ac、20mM～22.5mM MgAc2、200mM～250mM KAc、6mM～7.5mMEGTA、2.5mM～5mM dNTP、0.0125mM～0.025mM逆转录引物(随机引物+T20VN)、20mM～50mMDTT或TCEP、5U/μL～25U/μL RNasin、0.01g/L～0.05g/L明胶、5U/μL～25U/μL耐高温逆转录酶RTSTO、20％～30％甘油、5％～10％PEG6000和无RNA酶水；
其中，本实施例混合试剂的组分中的SDS(或BSA)、EGTA、EDTA、PEG、甘露醇可以清除裂解后产生的多酚和蛋白质，提高RNA纯度从而提高cDNA纯度。本实施混合试剂组分中的DTT、明胶以及将逆转录酶的种类由MMLV替换为RTSTO可以提高逆转录试剂稳定性，大幅提高逆转录效果。
进一步，本实施例提供一种利用一管混合试剂加入植物样本即可得到cDNA的逆转录方法，该方法使用上述混合试剂和植物样本混合后在同一反应体系进行cDNA合成反应。
在一个实施方案中，该cDNA合成反应通过PCR仪上设置相应的反应程序实现，反应程序包括：a)植物样本裂解的温度和时间；b)去基因组的温度和时间；c)逆转录的温度与时间(逆转录反应过程包含dsDNase酶的灭活)；d)灭活逆转录酶的温度和时间。
其中，裂解和去基因组的温度为37℃，恒温10min～30min，逆转录的温度为50℃～60℃，反应时间为5min～20min，酶失活的温度为85℃～92℃，反应时间为5s～30s，4℃保存。本申请中实施例1和实施例2使用的qPCR引物如表1所示。
表1
实施例1
本实施例针对植物样本的cDNA，探究了不同反应组分对逆转录反应体系中杂质的影响，具体结果如下所示。
1、SDS和BSA对杂质的清除效果
将小麦和水稻cDNA稀释3倍的cDNA模板中加入提前配置的1％的酚类杂质，使用擎科TSE501为荧光定量的预混液。qPCR体系包括：预混液：10μL，cDNA模板：1～2μL，0～～10％浓度的SDS或BSA1μL，上下游引物各0.4μL(引物见表1)，水添加至20μL。qPCR程序根据TSE501说明书进行设置，加入SDS的反应结果如下表2和图1所示所示。加入BSA的反应结果如下表3和图2所示所示。
表2
| 样本 | 0％SDS | 0.1％SDS | 0.4％SDS | 4％SDS | 10％SDS |
| 小麦4 | 26.262 | 25.053 | 25.014 | 28.633 | 34.704 |
| 小麦24 | 24.282 | 21.199 | 20.906 | 24.565 | 30.596 |
| 水稻1 | 33.410 | 30.578 | 30.500 | 32.077 | 36.306 |
| 水稻4 | 30.456 | 28.671 | 28.206 | 30.033 | 33.931 |
表3
| 0％BSA | 0.05％BSA | 0.1％BSA | 0.4％BSA | 1％BSA | |
| 小麦4 | 26.262 | 26.412 | 25.164 | 25.053 | 27.633 |
| 小麦24 | 24.282 | 24.232 | 20.506 | 21.199 | 23.565 |
| 水稻1 | 33.410 | 33.210 | 30.400 | 30.578 | 32.877 |
| 水稻4 | 30.456 | 30.306 | 28.356 | 28.671 | 30.583 |
根据表2和表3以及图1和图2的检测结果可知，0.1％～0.4％的SDS或BSA对酚类杂质可以起到清除作用。
2、EGTA和EDTA对杂质的清除效果
前期检测结果表明在TSE501中额外加入50mM镁离子会明显影响扩增，本实施例在小麦和水稻cDNA稀释3倍的cDNA模板中加入50mM的镁离子(，使用擎科TSE501为荧光定量的预混液。qPCR体系包括：预混液：10μL，cDNA模板：1～2μL，0～10mM浓度的EGTA或EDTA1μL，上下游引物各0.4μL(引物见表1)，水添加至20μL。qPCR程序根据TSE501说明书进行，加入EGTA的检测结果如表4和图3所示。加入EDTA的检测结果如表5和图4所示。
表4
| 0mMEGTA | 3mMEGTA | 6mMEGTA | 7.5mMEGTA | 10mMEGTA | 15mMEGTA | |
| 小麦4 | 30.262 | 28.596 | 26.474 | 26.617 | 28.561 | 30.464 |
| 小麦24 | 29.282 | 26.781 | 22.514 | 22.508 | 27.164 | 29.28 |
| 水稻1 | 36.410 | 33.566 | 32.714 | 32.644 | 35.778 | 35.514 |
| 水稻4 | 33.456 | 30.522 | 29.495 | 29.514 | 32.59 | 32.471 |
表5
| 0mMEDTA | 3mMEDTA | 6mMEDTA | 7.5mMEDTA | 10mMEDTA | 15mMEDTA | |
| 小麦4 | 30.262 | 26.284 | 24.505 | 24.277 | 27.456 | 36.192 |
| 小麦24 | 29.282 | 23.949 | 20.891 | 20.677 | 26.901 | 28.672 |
| 水稻1 | 36.410 | 33.640 | 32.818 | 32.735 | 34.713 | 35.652 |
| 水稻4 | 33.456 | 29.560 | 28.063 | 28.341 | 31.909 | 33.572 |
根据表4和表5以及图3和图4的检测结果可知，6mM～7.5mMEDTA或EGTA对金属离子可以起到清除作用。
3、PEG和甘露醇对杂质的清除效果
将小麦和水稻cDNA稀释3倍的cDNA模板中加入提前配置的1％的蛋白质类杂质，使用擎科TSE501为荧光定量的预混液。qPCR体系包括：预混液：10μL，cDNA模板：1～2μL，0～20％浓度的PEG或甘露醇1μL，上下游引物各0.4μL(引物见表1)，水添加至20μL。qPCR程序根据TSE501说明书进行，加入PEG的结果如表6和图5所示。加入甘露醇的检测结果如表7和图6所示。
表6
| 0％PEG | 3％PEG | 5％PEG | 10％PEG | 20％PEG | |
| 小麦4 | 26.262 | 25.151 | 23.433 | 23.301 | 28.517 |
| 小麦24 | 24.282 | 23.433 | 22.14 | 22.603 | 27.69 |
| 水稻1 | 33.410 | 32.264 | 26.123 | 27.138 | 23.121 |
| 水稻4 | 30.456 | 27.257 | 27.138 | 26.59 | 31.903 |
表7
根据表6和表7以及图5和图6的检测结果可知，5％～10％的PEG或甘露醇对蛋白质可以起到清除作用。
实施例2
本实施例提供了一种MIX试剂，其组分包括：
2％NP-40、0.1％SDS或BSA、0.5U/μL热敏dsDNase酶、250mMTris8.3、100mMNH4Ac、22.5mMMgAc2、250mMKAc、7.5mMEGTA、2.5mM～5mMdNTP、0.02mM逆转录引物、50mMDTT或TCEP、6.5U/μL RNasin、0.01g/L明胶、10U/μL耐高温逆转录酶RTSTO、26％甘油、5％PEG6000和无RNA酶水；
其中，逆转录引物包括随机引物和T20VN；
随机引物的序列为：NNNNNN。
特异性引物的序列为：
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
本实施例提供了一种逆转录反应方法，包括逆转录反应程序：
裂解和去基因组的温度为37℃，恒温10min，逆转录的温度为55℃，反应时间为10min，酶失活的温度为92℃，反应时间为5s，4℃保存。
本实施例基于上述MIX试剂和反应程序，通过调整配方中各组分及其浓度、调整配方pH、调整裂解时间、逆转录反应温度、酶失活温度等，进行植物样本cDNA的合成，结果如下所示。
1、逆转录酶RTSTO的逆转录优势
分别使用MMLV和RTSTO配制MIX，将不同植物的叶片加入到提前配置的MIX中：MIX4μL，水16μL，再加1mg叶片，进行37℃，恒温10min，55℃，10min，92℃，5s处理得到最后的cDNA模板。使用擎科TSE501为荧光定量的预混液。qPCR体系包括：预混液：10μL，模板：1～2μL，上下游引物各0.4μL，水添加至20μL。qPCR程序根据TSE501说明书进行，结果如表8和图7所示。
表8
| 逆转录酶 | 引物1 | 引物2 | 引物3 | 引物4 | 引物5 | 引物6 | 引物7 |
| MMLV | 23.721 | 27.689 | 31.1 | 30.528 | 26.575 | 23.017 | 15.904 |
| RTSTO | 20.377 | 25.961 | 26.448 | 26.999 | 22.159 | 22.661 | 14.729 |
根据表8和图7的检测结果可知，RTSTO逆转录效果好于MMLV。
2、逆转录酶RTSTO的稳定性优势
分别使用MMLV和RTSTO配制MIX，分别将其在37℃保存3～10天，将分别保存不同天数的MIX试剂同时进行实验：MIX4μL，水16μL，再加1mg叶片，进行37℃，恒温10min，55℃，10min，92℃，5s处理得到最后的cDNA模板。使用擎科TSE501为荧光定量的预混液。qPCR体系包括：预混液：10μL，cDNA模板：1～2μL，上下游引物各0.4μL(引物见表1)，水添加至20μL。qPCR程序根据TSE501说明书进行，结果如表9以及图8和图9所示。
表9
根据表9图8的结果可知，RTSTO稳定性好于MMLV。
3、pH对逆转录效果的影响
按配方配制MIX试剂，并将MIX试剂调制为不同pH(7.8～8.8)，将不同pH的MIX试剂同时进行实验：MIX4μL，水16μL，再加1mg叶片，进行37℃，恒温10min，55℃，10min，92℃，5s处理得到最后的cDNA模板。使用擎科TSE501为荧光定量的预混液。qPCR体系包括：预混液：10μL，cDNA模板：1～2μL，上下游引物各0.4μL(引物见表1)，水添加至20μL。qPCR程序根据TSE501说明书进行，结果如表10和图10所示。
表10
| pH7.8 | pH8.0 | pH8.3 | pH8.6 | pH8.8 | |
| 水稻2 | 24.942 | 24.887 | 24.977 | 24.823 | 24.8765 |
| 水稻3 | 22.5675 | 22.1595 | 22.1095 | 22.5185 | 22.31 |
| 番茄1 | 20.762 | 19.2325 | 19.343 | 20.1655 | 19.768 |
| 番茄3 | 27.8265 | 26.7665 | 27.132 | 27.517 | 27.2965 |
| 番茄11 | 28.4095 | 27.186 | 27.306 | 27.4075 | 27.2165 |
| 小麦2 | 21.8575 | 21.4855 | 21.525 | 21.8155 | 21.7515 |
| 小麦4 | 34.4655 | 32.2595 | 32.414 | 32.0455 | 32.146 |
| 小麦6 | 28.2015 | 27.414 | 27.576 | 27.458 | 27.309 |
根据表10和图10的检测结果可知，pH值为7.8时逆转录效果较差，pH值在8.0～8.8范围内逆转录差异不大。
4、pH对稳定性的影响
按上述配方配制MIX试剂，并将MIX试剂调制为不同pH(7.8～8.8)，将不同pH的MIX试剂分别在37℃保存3～7天，将分别保存不同天数的MIX试剂同时进行实验：MIX4μL，水16μL，再加1mg叶片，进行37℃，恒温10min，55℃，10min，92℃，5s处理得到最后的cDNA模板。使用擎科TSE501为荧光定量的预混液。qPCR体系包括：预混液：10μL，cDNA模板：1～2μL，上下游引物各0.4μL(引物见表1)，水添加至20μL。qPCR程序根据TSE501说明书进行，结果如表11以及图11和图12所示。
表11
根据表11以及图11和图12的检测结果可知，pH值为8.8时MIX试剂稳定性较差，pH为7.8～8.6的MIX试剂稳定性差异不大，故综合逆转录效果和稳定性，将pH范围定为8.0～8.6。
5、DTT和TCEP对稳定性的影响
在上述配方中加入不同浓度的DTT或TCEP，分别配制为MIX试剂，将不同植物的叶片加入到提前配置的MIX试剂中：MIX4μL，水16μL，再加1mg叶片，进行37℃，恒温10min，55℃，10min，92℃，5s处理得到最后的cDNA模板。使用擎科TSE501为荧光定量的预混液。qPCR体系包括：预混液：10μL，cDNA模板：1～2μL，上下游引物各0.4μL(引物见表1)，水添加至20μL。qPCR程序根据TSE501说明书进行，结果如表12～13和图13～16所示。
表12
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表13
根据表12～13和图13～16的检测结果可知，DTT或TCEP在20mM～50mM对稳定性有大幅提升。
6、基于逆转录效果筛选BSA、DTT、SDS和PEG最佳浓度组合
将前期检验能发挥作用的添加剂按不同的比例分别配制为不同的MIX试剂，具体如表14和15所示。将不同植物的叶片加入到提前配置的MIX试剂中：MIX4μL，水16μL，再加1mg叶片，进行37℃，恒温10min，55℃，10min，92℃，5s处理得到最后的cDNA模板。并使用传统方案分别经过提取RNA和逆转录得到cDNA模板同时进行实验，使用擎科TSE501为荧光定量的预混液。qPCR体系包括：预混液：10μL，cDNA模板：1-2μL，上下游引物各0.4μL(引物见表1)，水添加至20μL。qPCR程序根据TSE501说明书进行，结果如表16以及图17所示。
表14
| 因素 | EGTA | DTT | PEG | SDS |
| 浓度1+ | A:6mM | C:20mM | E:5％ | G:0.1％ |
| 浓度2- | B:7.5mM | D:50mM | F:10％ | H:0.4％ |
表15
| 方案 | BSA | DTT | PEG | SDS |
| 1 | A | C | E | G |
| 2 | A | C | F | H |
| 3 | A | D | E | H |
| 4 | A | D | F | G |
| 5 | B | C | E | H |
| 6 | B | C | F | G |
| 7 | B | D | E | G |
| 8 | B | D | F | H |
表16
| 引物 | 方案1 | 方案2 | 方案3 | 方案4 | 方案5 | 方案6 | 方案7 | 方案8 | 传统方案 |
| 油菜1 | 21.1385 | 21.8405 | 21.7545 | 20.8295 | 21.6365 | 20.987 | 20.9065 | 21.587 | 21.7905 |
| 油菜3 | 26.7655 | 26.9125 | 27.078 | 26.711 | 26.9055 | 26.792 | 26.45 | 27.0805 | 27.0125 |
| 油菜6 | 17.993 | 18.617 | 18.73 | 18.1065 | 18.3665 | 18.231 | 17.886 | 18.41 | 18.88 |
| 拟南芥4 | 20.3525 | 20.451 | 20.7485 | 20.293 | 20.8385 | 20.2645 | 20.162 | 20.656 | 20.8485 |
| 拟南芥8 | 25.002 | 26.1375 | 26.2755 | 24.93 | 26.168 | 25.194 | 24.9615 | 25.994 | 26.268 |
| 拟南芥9 | 26.3875 | 26.5235 | 26.6025 | 25.9995 | 26.1705 | 25.9995 | 25.9005 | 26.165 | 26.3205 |
根据表16以及图17的检测结果可知，方案1、4、6、7的逆转录效果较好。
7、基于稳定性筛选BSA、DTT、SDS和PEG最佳浓度组合
将前期检验逆转录效果较好的4个MIX试剂(方案1、4、6、7)，将4个MIX试剂分别在37℃保存3～7天，将保存不同天数的MIX试剂同时进行实验。将不同植物的叶片加入到提前配置的MIX试剂中：MIX4μL，水16μL，再加1mg叶片，进行37℃，恒温10min，55℃，10min，92℃，5s处理得到最后的cDNA模板。使用擎科TSE501为荧光定量的预混液。qPCR体系包括：预混液：10μL，cDNA模板：1～2μL，上下游引物各0.4μL(引物见表1)，水添加至20μL。qPCR程序根据TSE501说明书进行，结果如表17和图18～19所示。
表17
根据表17和图18～19的检测结果可知，4个方案稳定性均较好，但方案7的稳定性最好，故通过方案7进行后续的验证。
8、探究MIX的最适裂解时间
根据前期检验逆转录效果和稳定性效果最好的方案7配制MIX试剂，将不同植物的叶片加入到提前配置的MIX试剂中：MIX4μL，水16μL，再加1mg叶片，进行37℃，分别恒温5min～1h，55℃，10min，92℃，5s处理得到最后的cDNA模板。使用擎科TSE501为荧光定量的预混液。qPCR体系包括：预混液：10μL，cDNA模板：1～2μL，上下游引物各0.4μL(引物见表1)，水添加至20μL。qPCR程序根据TSE501说明书进行，结果如表18和图20所示。
表18
根据表18和图20的结果可知，裂解时间为10min～30min较为合适。
9、探究MIX的逆转录温度
根据前期检验逆转录效果和稳定性效果最好的方案7配制MIX试剂，将不同植物的叶片加入到提前配置的MIX试剂中：MIX4μL，水16μL，再加1mg叶片，进行37℃，分别恒温10min，50～65℃，10min，92℃，5s处理得到最后的cDNA模板。使用擎科TSE501为荧光定量的预混液。qPCR体系包括：预混液：10μL，cDNA模板：1～2μL，上下游引物各0.4μL(引物见表1)，水添加至20μL。qPCR程序根据TSE501说明书进行，结果如表19和图21所示。
表19
| 温度 | 水稻1 | 水稻2 | 水稻3 | 油菜1 | 油菜3 | 油菜6 | 拟南芥4 | 拟南芥8 | 拟南芥9 |
| 50℃ | 28.0655 | 27.388 | 24.023 | 21.375 | 31.014 | 25.714 | 29.700 | 23.216 | 23.114 |
| 55℃ | 28.064 | 27.835 | 23.965 | 21.741 | 31.241 | 26.179 | 28.933 | 23.377 | 23.191 |
| 60℃ | 28.014 | 27.885 | 24.465 | 21.641 | 31.441 | 26.379 | 29.033 | 23.427 | 23.291 |
| 65℃ | 31.345 | 32.809 | 31.360 | 29.547 | 33.345 | 31.345 | 31.809 | 30.360 | 31.547 |
根据表19和图21的检测结果可知，逆转录温度为50℃～60℃较为合适。
10、探究MIX的逆转录时间
根据前期检验逆转录效果和稳定性效果最好的方案7配制MIX试剂，将不同植物的叶片加入到提前配置的MIX试剂中：MIX4μL，水16μL，再加1mg叶片，进行37℃，分别恒温10min，55℃，5～30min，92℃，5s处理得到最后的cDNA模板。使用擎科TSE501为荧光定量的预混液。qPCR体系包括：预混液：10μL，cDNA模板：1～2μL，上下游引物各0.4μL(引物见表1)，水添加至20μL。qPCR程序根据TSE501说明书进行，结果如表20和图22所示。
表20
根据表20和图22的检测结果可知，逆转录时间为5min～20min较为合适。
11、探究MIX的灭活时间
将前期检验逆转录效果和稳定性效果最好的方案7进行配制，将不同植物的叶片加入到提前配置的MIX中：MIX4μL，水16μL，再加1mg叶片，进行37℃，分别恒温10min，55℃，10min，80～92℃，5s～30s处理得到最后的cDNA模板。使用擎科TSE501为荧光定量的预混液。qPCR体系包括：预混液：10μL，cDNA模板：1～2μL，上下游引物各0.4μL(引物见表1)，水添加至20μL。qPCR程序根据TSE501说明书进行，结果如表21和图23所示。
表21
根据表21和图23的检测结果可知，酶失活温度为85℃～92℃较为合适，时间为5s～30s较为合适。
上述检测结果说明本实施例的MIX试剂可以清除裂解后产生的杂质提高cDNA纯度，提升逆转录产物的稳定性，从而大幅提高逆转录效果。
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种逆转录试剂盒，其特征在于，包括用于混合于同一反应体系使用的裂解试剂、RNA提纯试剂、逆转录试剂和稳定试剂；其中，所述裂解试剂用于裂解植物细胞，所述RNA提纯试剂用于减少反应体系中植物细胞裂解产生的基因组杂质，所述逆转录试剂用于逆转录植物细胞中的RNA得到逆转录产物，所述稳定试剂用于稳定逆转录试剂及其逆转录产物。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒满足以下条件(1)～(4)中的至少一个：
(1)所述裂解试剂包括NP-40和RNasin；
(2)所述RNA提纯试剂包括多酚除杂试剂、DNA除杂试剂、金属盐抑制试剂和蛋白除杂试剂中的至少一种；
可选地，所述多酚除杂试剂包括十二烷基硫酸钠、聚乙二醇、BSA、聚乙烯吡咯烷酮、β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸和二硫苏糖醇中的至少一种；
可选地，所述DNA除杂试剂包括热敏dsDNase酶；
可选地，所述金属盐抑制试剂包括EGTA、EDTA、IDHA和DTPA中的至少一种；
可选地，所述蛋白除杂试剂包括十二烷基硫酸钠、聚乙二醇、甘露醇、氯仿、异硫氰酸胍；
(3)所述逆转录试剂包括逆转录缓冲试剂、dNTPs、耐高温逆转录酶和逆转录引物中的至少一种；
可选地，所述逆转录缓冲试剂的pH值为8.0～8.6；
可选地，逆转录缓冲试剂包括Tris、NH4Ac、MgAc2和KAc；
可选地，所述耐高温逆转录酶包括转录酶RTSTO；
(4)所述稳定试剂包括DTT、TCEP、甘油和明胶中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，以所述试剂盒中各试剂混合后的总质量计，各试剂的浓度满足以下条件(1)～(15)中的至少一个：
(1)所述裂解试剂中NP-40的质量百分浓度为1％～3％；
(2)所述裂解试剂中RNasin的工作浓度为5U/μL～25U/μL；
(3)所述多酚除杂试剂的质量百分浓度为0.1％～0.4％；
(4)所述蛋白除杂试剂的质量百分浓度为5％～10％；
(5)所述DNA除杂试剂中热敏dsDNase酶的工作浓度为工作0.5U/μL～2.5U/μL；
(6)所述金属盐抑制试剂的工作浓度为6mM～7.5mM；
(7)所述逆转录缓冲试剂中NH4Ac的工作浓度为50mM～100mM；
(8)所述逆转录缓冲试剂中MgAc2的工作浓度为15mM～22.5mM；
(9)所述逆转录缓冲试剂中KAc的工作浓度为200mM～250mM；
(10)所述逆转录试剂中的逆转录引物的工作浓度为0.0125mM～0.025mM；
(11)所述逆转录试剂中dNTPs的工作浓度为2.5mM～5mM；
(12)所述逆转录试剂中耐高温逆转录酶的工作浓度为5U/μL～25U/μL；
(13)所述逆转录试剂中DTT或TCEP的工作浓度为20mM～50mM；
(14)所述稳定试剂中明胶的工作浓度为0.01g/L～0.05g/L；
(15)所述稳定试剂中甘油的质量百分浓度为20％～30％。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述逆转录引物包括随机引物和特异性引物，随机引物可随机合成小片段cDNA，所述特异性引物可合成全长片段cDNA；
可选地，所述随机引物的序列为：NNNNNN；
可选地，特异性引物的序列为：
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN。
5.一种逆转录方法，其特征在于，采用权利要求1～4任一项所述的逆转录试剂盒与植物样本在同一反应体系中混合进行cDNA合成反应。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述cDNA合成反应的时间为15min～20min。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述cDNA合成反应包括不同反应阶段：裂解除杂反应、逆转录反应和酶失活反应，所述不同反应阶段分别在不同温度下进行。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述不同反应阶段满足以下条件(1)～(3)中的至少一个：
(1)所述裂解除杂反应的反应温度为37℃，恒温反应时间为10min～30min；
(2)所述逆转录反应的反应温度为50℃～60℃，反应时间为5min～20min；
(3)所述酶失活反应的反应温度为85℃～92℃，反应时间为5s～30s。
9.根据权利要求5～8任一项所述的方法，其特征在于，所述植物样本包括植物叶片样本。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述植物包括小麦、拟南芥、油菜、水稻和番茄中的至少一种。
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