CN116103279A - 一种裂解剂、组合物的用途、核酸释放方法和裂解红细胞方法 - Google Patents

一种裂解剂、组合物的用途、核酸释放方法和裂解红细胞方法 Download PDF

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张晓妮
周书雄
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Abstract

本发明公开一种裂解剂、组合物的用途、核酸释放方法和裂解红细胞方法，按体积份计，该裂解剂包括以下组分：N‑decyl‑N 0.1‑5％，Triton x‑1000.1‑5％，NP‑40 0.1‑5％，0.01‑1M缓冲剂；其中，所述缓冲剂的pH值为4.0‑8.5。本发明的技术方案裂解样本的同时，减少对扩增的抑制。

Description

一种裂解剂、组合物的用途、核酸释放方法和裂解红细胞方法
技术领域
本发明涉及裂解剂技术领域，特别涉及一种裂解剂、组合物的用途、核酸释放方法和裂解红细胞方法。
背景技术
核酸是一种由核苷酸组成的大分子物质，是组成生命最基本的物质之一。在生物分子检测实验中，提取核酸是较为重要的实验环节。随着核酸提取技术的进步，常规的人源样本核酸提取方法已经从酚氯仿法等传统方法迭代至如今磁珠提取法。和传统方法相比，磁珠法提取的核酸具有操作上更简单的优点，可实现高通量提取，在分子检测领域被广泛使用。磁珠法提取虽然操作简单，但仍需要经过裂解、结合、纯化、洗脱四个步骤。而现实中，许多使用场景希望进一步缩短检测时间。
核酸释放剂是一种可以快速裂解样本并释放核酸的试剂，裂解后产物无需进行纯化操作，可以直接用于扩增反应。目前已在病原微生物检测领域已有一些使用，但由于其抑制剂效果，在液体活检、伴随诊断等NGS等领域应用较少。相比于磁珠法等有纯化步骤的提取方法，核酸释放剂裂解的核酸一般纯度比较差。其中，为了加强裂解效果，许多核酸释放剂中还会添加胍盐、十二烷基磺酸钠等等烈性变性成分，这些成分对下游分子实验的活性成分产生抑制。
而常见的样品自身也带有内源性抑制成分，如血红素、血红蛋白、多糖、核酸酶、免疫球蛋白、胆红素等，这些物质均对后续的扩增实验具有抑制作用。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种裂解剂、组合物的用途、核酸释放方法和裂解红细胞方法，旨在裂解样本的同时，减少对扩增的抑制。
为实现上述目的，本发明提出的裂解剂，按体积份计，所述裂解剂包括以下组分：N-decyl-N 0.1-5％，Triton x-100 0.1-5％，NP-40 0.1-5％，0.01-1M缓冲剂；其中，所述缓冲剂的pH值为4.0-8.5。
在一实施例中，按体积份计，N-decyl-N 0.1-1％，Triton x-100 0.1-1.8％，NP-40 0.1-0.4％，0.01-0.5M缓冲剂。
在一实施例中，所述缓冲剂包括Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液中的一种。
在一实施例中，所述裂解剂还包括Betaine和/或增溶剂。
在一实施例中，按体积份计，Betaine 1-20％；和/或，按体积份计，增溶剂5-15％；和/或，所述增溶剂包括PEG 400、PEG600、PEG800、PEG1000、PEG2000中的一种。
在一实施例中，所述裂解剂还包括10-100mM氯化镁和10-100mM氯化钾。
本发明还提出一种组合物在裂解血液、血浆、血清、唾液、组织匀浆、细胞匀浆、病毒的用途，按体积份计，所述组合物包括以下组分：N-decyl-N0.1-5％，Triton x-100 0.1-5％，NP-40 0.1-5％，0.01-1M缓冲剂；其中，所述缓冲剂的pH值为4.0-8.5。
在一实施例中，所述组合物释放RNA时，所述缓冲剂的pH值为4.0-7.0；所述组合物释放DNA时，所述缓冲剂的pH值为6.5-8.5。
本发明还提出一种核酸释放方法，应用上述的裂解剂，该核酸释放方法包括以下步骤：
样本和裂解剂混合，得到混合液A；其中，所述样本和裂解剂的体积份数为1-5∶1
将混合液A在70-100℃条件下裂解，所述裂解时间为2-20分钟。
本发明还提出一种裂解红细胞方法，采用上述包括10-100mM氯化镁和10-100mM氯化钾的裂解剂，所述缓冲剂的pH值为6.5-8.5，该核酸释放方法包括以下步骤：
样本和裂解剂混合，得到混合液B；其中，所述样本和裂解剂的体积份数为1-3∶1；
将混合液B静置裂解，所述裂解时间为0.25-2分钟。
本发明技术方案通过N-decyl-N、Triton x-100和NP-40，并采用相应的浓度，从而快速裂解样本，破坏包裹核酸样品的细胞结构(膜结构及组蛋白)，使样品的核酸可以迅速释放，在裂解样本的同时，由于不含有胍盐、SDS等强抑制组分，减少了对后续扩增的抑制。并且，该裂解剂的N-decyl-N、Triton x-100和NP-40可以进一步溶解核酸结合蛋白，达到彻底裂解的效果。另外，特定比例的N-decyl-N、Triton x-100和NP-40具有加强聚合酶活性的作用，利于后续的扩增反应，且裂解后无需纯化，可直接用于下游反应，简化核酸的扩增操作，缩短了检测时间。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为一实施例全血的红细胞裂解后红色透明澄清状态的图片；
图2为一实施例中红细胞裂解后高速离心获得白细胞沉淀的图片；
图3为实施例1中试验1的扩增曲线图；
图4为实施例2中试验1的荧光定量扩增曲线图；
图5为实施例1中试验2-3和对比1-2的扩增曲线图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提出一种裂解剂。
在本发明实施例中，按体积份计，该裂解剂包括以下组分：N-decyl-N0.1-5％，Triton x-100 0.1-5％，NP-40 0.1-5％，0.01-1M缓冲剂；其中，所述缓冲剂的pH值为4.0-8.5。
本发明技术方案通过N-decyl-N、Triton x-100和NP-40，并采用相应的浓度，从而快速裂解样本，破坏包裹核酸样品的细胞结构(膜结构及组蛋白，可以理解的是，该膜结构包括细胞膜、核膜和病毒的包膜)，使样品的核酸可以迅速释放，在裂解样本的同时，由于不含有胍盐、SDS等强抑制组分，减少了对后续扩增的抑制。并且，该裂解剂的N-decyl-N、Triton x-100和NP-40可以进一步溶解核酸结合蛋白，达到彻底裂解的效果。另外，特定比例的N-decyl-N、Triton x-100和NP-40具有加强聚合酶活性的作用，利于后续的扩增反应，且裂解后无需纯化，可直接用于下游反应，简化核酸的扩增操作，缩短了检测时间。
进一步地，在一实施例中，按体积份计，该裂解剂包括以下组分：N-decyl-N0.1-1％，Triton x-100 0.1-1.8％，NP-40 0.1-0.4％，0.01-0.5M缓冲剂。
具体的，N-decyl-N(N-dimethyldecan-1-aminum chloride)，即双癸基二甲基氯化铵，为淡黄色透明液体，易溶于水和有机溶剂，化学性质稳定。N-decyl-N是一种两性离子洗涤剂，对天然状态膜蛋白具有增溶作用，可以溶解细胞膜和核膜，对样品进行裂解，从而快速释放核酸。
具体的，Triton x-100即聚乙二醇辛基苯基醚，是无色或几乎无色透明粘稠液体，能溶于水、甲苯、二甲苯和乙醇，不溶于石油醚，常用于纺织工业各工序中，如匀染、煮洗，可作石油工业破乳剂、金属等工业的清洗剂。Triton x-100是一种非离子型表面活性剂，属于温和型表面活性剂，可以溶解蛋白和膜结构，从而使样本的核酸得到释放。
具体的，NP-40(Nonidet P 40)，即乙基苯基聚乙二醇，是一种很温和的非离子型去垢剂，与蛋白结合力强，用于防止物质分子疏水间相互作用，确保蛋白的充分溶解和结构稳定，尤其用于膜蛋白的非变性条件下的溶解。该NP-40可以溶解蛋白，破坏膜结构，从而裂解样品，快速释放样品的核酸，以便核酸的提取和扩增。
N-decyl-N、Triton x-100、NP-40均为表面活性剂，是本申请裂解剂的主要裂解成分，可以快速彻底裂解细胞，从而释放核酸。该裂解剂未使用胍盐、SDS等抑制组分，采用的N-decyl-N、Triton x-100和NP-40均为非抑制型组分，可以加强聚合酶活性的作用，同时控制组分浓度，不但达到减少对下游实验(如扩增)的抑制效果，还促进了聚合酶活性，利于后续扩增反应的进行。
具体的，缓冲剂可以维持裂解剂的pH值，具有缓冲pH的作用，同时能够稳定样品释放出的核酸，以避免核酸的降解，维持了核酸的浓度和纯度，保证后续核酸检测分析等操作的准确性。
该缓冲剂有多种，在一实施例中，所述缓冲剂包括Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液中的一种。在一实施例中，所述缓冲剂包括Tris-HCl缓冲液。Tris-HCl缓冲液可以是0.01-1M，Tris-HCl缓冲液的pH值为4.0-8.5，根据裂解样品核酸的类型，可以调节Tris-HCl缓冲液的pH值。
在一实施例中，所述裂解剂释放RNA时，所述缓冲剂的pH值为4.0-7.0；和/或，所述裂解剂释放DNA时，所述缓冲剂的pH值为6.5-8.5。也就是说，当裂解样品释放的核酸为RNA，Tris-HCl缓冲液的pH值可以为4.0-7.0；当裂解样品释放的核酸为DNA，Tris-HCl缓冲液的pH值可以为6.5-8.5。进一步地，在一实施例中，裂解剂释放RNA时，Tris-HCl缓冲液(10mM)的pH值可以为5.0；和/或，裂解剂释放DNA时，Tris-HCl缓冲液(10mM)的pH值可以为8.0。
除了上述组分，在一实施例中，所述裂解剂还包括Betaine和/或增溶剂。该Betaine又叫甜菜碱，是一种两性表面活性剂，它与阴离子、阳离子、非离子表面活性剂均有优良的配伍性能，能够与增强本申请裂解剂中其它成分效果，具有极佳的协同增效作用。Betaine性质温和，具有良好的抗静电性、杀菌性、防腐性，易于生物降解等优良特性。该裂解剂中，Betaine主要用于解除由血液来源的样本中血红蛋白对下游的抑制。并且，Betaine有助于扩增时聚合酶的活性加强，对某些复杂二级结构(CG区)扩增起到增强作用。在一实施例中，按体积份计，Betaine 1-20％。进一步地，在一实施例中，按体积份计，Betaine10％。
该增溶剂具有广泛相容性，是很好的溶剂，有利于组分的溶解及作用的发挥。在一实施例中，按体积份计，增溶剂5-15％。该增溶剂有多种，在一实施例中，所述增溶剂包括PEG 400、PEG600、PEG800、PEG1000、PEG2000中的一种。以PEG 400为例，PEG 400是一类低分子量聚乙二醇表面活性剂，一定浓度PEG对聚合酶抑制无影响，使用PEG 400可加强生物样本与裂解剂混合程度，其次，PEG 400“抢夺”水分子，能够破坏蛋白质分子表面的水化层，对于生物样本裂解后的变性蛋白及杂质有一定的聚沉和去除效果，同时5％-15％ PEG 400可以缓解血液成分、植物多糖对扩增的抑制。进一步地，在一实施例中，按体积份计，PEG 4005％。
在一实施例中，所述裂解剂还包括10-100mM氯化镁和10-100mM氯化钾。氯化镁和氯化钾是两种无机盐，可以螯合样本保存液中的EDTA，减少下游实验抑制效果，避免除样品自身携带的抑制成分和裂解液中的抑制成分外，样品保存管带来的外源性抑制作用。其次，低浓度的氯化镁和氯化钾可以改变细胞的渗透压有助于细胞破裂，一定程度上可增强裂解作用、增强实验效率。除此之外，镁离子对酶活性具有一定的激活作用，可以作为扩增实验中逆转录酶或者DNA聚合酶的活性增强剂，从而促进后续的实验。进一步地，在一实施例中，所述裂解剂包括60mM氯化镁和60mM氯化钾。
该裂解液通过N-decyl-N、Triton x-100和NP-40溶解蛋白和生物膜脂质，使细胞通透，同时，裂解液包括低浓度的氯化镁和氯化钾，可以改变细胞的渗透压以破碎细胞膜，如红细胞。
本发明还提出一种组合物在裂解血液、血浆、血清、唾液、组织匀浆、细胞匀浆、病毒的用途，该组合物可以参照上述的裂解剂，由于本组合物采用了上述所有实施例的全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。其中，按体积份计，所述组合物包括以下组分：N-decyl-N 0.1-5％，Triton x-100 0.1-5％，NP-40 0.1-5％，0.01-1M缓冲剂；其中，所述缓冲剂的pH值为4.0-8.5。
在一实施例中，所述组合物用于裂解样品，该样品包括血液、血浆、血清、唾液、组织匀浆、细胞匀浆、病毒。可以理解的是该血液可以为全血，也可以为浓缩血液样本。通过组合物对样品的裂解，使得样品释放核酸，以便进行后续的扩增或提取实验等等。释放的核酸可以作为模板进行直接扩增实验，适用于NGS、PCR等下游实验，同时添加辅助盐类成分减少扩增的抑制作用，核酸得率高，操作简单。
在一实施例中，所述组合物释放RNA时，所述缓冲剂的pH值为4.0-7.0；和/或，所述组合物释放DNA时，所述缓冲剂的pH值为6.5-8.5。
本发明还提出一种核酸释放方法，采用上述的裂解剂，该核酸释放方法包括以下步骤：
S1、样本和裂解剂混合，得到混合液A；其中，所述样本和裂解剂的体积份数为1-5∶1
S2、将混合液A在70-100℃条件下裂解，所述裂解时间为2-20分钟。
具体而言，该核酸释放方法中，释放的是样品的核酸，即DNA或RNA。在步骤S1中，样品与裂解剂混合的体积份数为1-5∶1，也就是说，加入的样品体积大，裂解剂的体积小，从而尽可能地保证裂解时的原液(样品)核酸浓度不被过多稀释，避免后续扩增实验等对核酸有高浓度要求，进一步便于后续的实验，缩短实验时间，提高实验效率。在一实施例中，样品与裂解剂混合的体积份数为1-3∶1。
将样本和裂解剂混合后得到的混合液A在高温下进行裂解，使得样品的核酸释放出来。在一实施例中，混合液A在95℃条件下裂解10分钟。样品裂解后，可以经过离心后，从而获取含有核酸的液体，该裂解液可以直接作为扩增裂解剂使用。如，离心后取上层上清液用于PCR反应。如果样品释放的核酸浓度过高，可用分子生物级纯水稀释数倍用于下游反应。
该核酸释放方法将样本和本裂解剂混合后，通过70-100℃的高温彻底裂解细胞，高温让细胞结构物理变性，可以使蛋白质等生物大分子变性失活，进而使细胞结构被破坏。其中，N-decyl-N、Triton x-100和NP-40可以进一步溶解核酸结合蛋白，达到彻底裂解的效果，裂解后只需简单掌上离心，取澄清上清即可以用于下游实验。除了快速裂解样品，该裂解剂还减轻了保存液对下游扩增抑制的功能。
本申请的裂解剂选用了多种温和型表面活性剂组合作为主效成分，对扩增抑制极小，并且由于组分浓度设置，对聚合酶扩增有一定的促进作用。可以用于直接扩增使用时，通过低浓度的温和裂解环境，加上高温变性蛋白的方法，在充分释放核酸的同时减少内源性、外源性抑制剂对下游实验的影响，实现数分钟内快速裂解样本释放核酸的效果，可以用于病原微生物、液体活检等领域，产物适用NGS、PCR平台。
本发明还提出一种裂解红细胞方法，采用含有氯化镁和氯化钾的裂解剂，所述裂解剂用于裂解红细胞，所述缓冲剂的pH值为6.5-8.5，该核酸释放方法包括以下步骤：
S3、样本和裂解剂混合，得到混合液B；其中，所述样本和裂解剂的体积份数为1-3∶1；
S4、将混合液B静置裂解，所述裂解时间为0.25-2分钟。
具体的，该裂解红细胞方法用于裂解红细胞，对其他的细胞结构无影响。当缓冲剂包括Tris-HCl缓冲液时，Tris-HCl缓冲液的pH 8.0。在步骤S3中，该样本和裂解剂的体积份数为1-3∶1，裂解剂的用量比样品小，从而避免样品被过多的稀释。该实施例中，样品可以是全血，也可以是浓缩血液，通过裂解液裂解样品，从而使红细胞破裂。
样品与裂解剂混合均匀，得到混合液B，然后常温下静置裂解，裂解时间为0.25-2分钟，从而达到裂解红细胞的作用。请参见图1，裂解后，混合液B呈红色透明澄清状态，请参见图2，高速离心可将白细胞离心至底，以便进行分离。在一实施例中，将全血/浓缩血液和本发明试剂按照1:1的比例混合均匀，在常温下静置0.5min，即可达到裂解红细胞的作用。
由于血液中红细胞含量最多，且需要大量核酸提取时，为了得到更纯的核酸，首先会去掉红细胞，以免影响白细胞基因组的提取和清洗效果。核酸提取的方法可以是柱提法、磁珠法，也可以采用本申请的裂解液进行裂解后提取。当红细胞裂解后，可以将混合物B放置在70-100℃条件下裂解，裂解时间为2-20分钟，从而裂解含有核酸的细胞膜，以释放核酸，然后可以通过简单的离心提取核酸。
当该裂解液还包括PEG 400和Betaine，PEG 400和Betaine在裂解红细胞时对白细胞结构的稳定性起到了支持作用。该裂解液具有裂解红细胞速度快、核酸得率高的特点。
下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：唾液样本裂解后用于qPCR扩增。
采用同一个唾液样本，用本申请的裂解液裂解和离心提取，以及采用磁珠法核酸提取，得到的提取物同时进行qPCR扩增。相对于磁珠法，对比本试剂裂解剂的裂解性能和对下游扩增的抑制效果。
在试验1中，按体积份计，使用的裂解液包括以下组分：1M Tris-HCl(pH8.0)0.05M，Triton X-100 1.80％，N-decyl-N 1.00％，NP-40 0.4％，Betaine5％，PEG 4005％，2M MgCl2 60mM，2M KCl 60mM。
(1)裂解液裂解提取：取厦门致善唾液DNA样本采集管中的唾液样本45μL，将样本和本申请的裂解剂(释放DNA)按照3:1的体积份数混合均匀，得到混合物A；置于95℃条件，裂解10分钟后取出，简单离心，留用上清液，终反应液(混合物A)总体积60μL。重复三次，得到A1组提取液，实验编号为A1组1、A1组2、A1组3。
(2)磁珠法核酸提取：取上述反应相同唾液样本45μL，使用天根磁珠法通用型基因组DNA提取试剂盒提取核酸作为对照，最终回收体积60μL。重复三次，得到B组提取液，实验编号为B组1、B组2、B组3。
质控：分别取1μL A组1、A组2、A组3上清液，分别取1μL B组1、B组2、B组3洗脱液，使用Invitrogen QUBIT 4.0及配套定量试剂对其进行dsDNA定量。结果如表1。
表1核酸浓度检测结果
编号 A1组/ng/μL B组/ng/μL
1 7.2 6.0
2 7.4 6.7
3 6.8 6.3
上述A1组1、2、3号与B组1、2、3号，分别取5μL，因浓度过高，使用无核酸酶水稀释5000倍进行扩增测试。此外，另取A1组1号5μL，用本申请的裂解液稀释500倍，混合均匀后进行扩增反应，实验编号为C组1。
扩增试剂使用诺唯赞Universal SYBR qPCR Master Mix，操作按照说明书执行，扩增靶点为人管家基因GAPDH，引物合成于生工生物，设计如下：
Primer F：5'-CACCGTCAAGGCTGAGAAC
Primer R：5'-GGTGAAGACGCCAGTGGA。
使用Bioer FQD-96a进行荧光定量，扩增曲线见图3，扩增结果见表2。
表2PCR扩增Ct值
编号 A1组 B组 C组
1 29.08 30.91 25.7
2 28.48 30.79 /
3 29.84 30.19 /
根据表1和表2可知，从裂解后的核酸浓度质控可以看出，本申请裂解剂和对照试剂(磁珠法)裂解效果相当。参见图3，从扩增曲线可以看出，A1、C两组的荧光强度上升趋势与对照B组一致，证明本申请裂解剂裂解后的核酸可以用于直接扩增，且该裂解剂几乎无抑制效果。而A1组与B组的扩增CT值接近，证明了本申请裂解剂的核酸裂解方法与磁珠法提取一致性好，核酸释放充分。
同样地，分别采用以下试验2、试验3和对比1、对比2的裂解液进行上述的(1)裂解液裂解提取和(2)磁珠法核酸提取，分别得到A2组、A3组、对1组和对2组的核酸浓度和PCR扩增的Ct值，见表3-表4。
在试验2中，按体积份计，使用的裂解液包括以下组分：1M Tris-HCl(pH8.0)0.1M，Triton X-100 1.0％，N-decyl-N 0.5％，NP-40 0.2％，Betaine 2.5％，PEG 400 4％，2MMgCl2 60mM，2M KCl 60mM。
在试验3中，按体积份计，使用的裂解液包括以下组分：1M Tris-HCl(pH8.0)0.1M，Triton X-100 1.80％，N-decyl-N 0.1％，NP-40 0.6％，Betaine2.5％，PEG 400 5％，2MMgCl2 60mM，2M KCl 60mM。
在对比1中，按体积份计，使用的裂解液包括以下组分：1M Tris-HCl(pH8.0)0.1M，Triton X-100 6.0％，N-decyl-N 6.0％，NP-40 6.0％，Betaine 2.5％，PEG 400 4％，2MMgCl2 60mM，2M KCl 60mM。
在对比2中，按体积份计，使用的裂解液包括以下组分：1M Tris-HCl(pH8.0)0.1M，Triton X-100 0.05％，N-decyl-N 0.05％，NP-40 0.05％，Betaine2.5％，PEG 400 4％，2MMgCl2 60mM，2M KCl 60mM。
表3核酸浓度检测结果
Figure BDA0004008559660000111
表4PCR扩增Ct值
编号 B组 A2组 A3组 对1组 对2组
1 30.91 30.79 28.1 / 33.54
根据表3和表4，A2组和A3组裂解得到的核酸浓度与常规检测磁珠法的B组的相差不大，本申请裂解剂与对照试剂(磁珠法-B组)裂解效果相当，甚至A3组的裂解效果更佳；对1组的裂解效果与B组的相差不大，对2组获取的核酸明显偏低，其裂解效果较差。
图5为A2组、A3组、B组和对2组的扩增曲线图，从该扩增曲线可以看出，A2组、A3组的荧光强度上升趋势与对照B组一致。结合表4，虽然对1组的裂解效果与本申请的裂解剂(A2组、A3组)、对照B组的相差不大，但是由于过高的组分浓度对PCR扩增产生了抑制效果，无法直接用于PCR扩增，所以没有Ct值。在图5中，A2组、A3组与B组的扩增Ct值接近，进一步证明了本申请裂解剂的核酸裂解方法与磁珠法提取一致性好，核酸得到了充分释放。
实施例2：全血样本裂解后进行基因分型检测。
一例全血样本，该全血样本来源于深圳海普洛斯医学检验实验室，经streck采血管收集并长期存放于-80℃冰箱，该血液样本经二代测序检验明确了一个吸烟成瘾性相关的CHRNA3基因上rs1051730位点的等位基因型GG，该基因的多态性通常为G/T碱基。使用本申请的裂解剂释放全血核酸，并用qPCR检测该位点，对直接扩增效果进行验证。
取上述血液样本45μL，将样本和下述的裂解剂(裂解DNA)按照3:1的比例混合均匀，置于95℃条件，裂解10分钟后取出，简单离心，留用上清液，终反应液(混合液A)总体积60μL。扩增试剂使用诺唯赞Taq Pro HS Universal U+Probe Master Mix，操作按照说明书执行，靶点为CHRNA基因rs1051730，G碱基探针为FAM通道，T碱基探针为HEX通道，内参为人管家基因GAPDH。使用Roche
Figure BDA0004008559660000121
480II进行荧光定量，扩增曲线见图4。
其中，在试验1中，按体积份计，使用的裂解液包括以下组分：1M Tris-HCl(pH8.0)0.05M，Triton X-100 1.80％，N-decyl-N 1.00％，NP-40 0.4％，Betaine5％，PEG 4005％，2M MgCl2 60mM，2M KCl 60mM。
在试验2中，按体积份计，使用的裂解液包括以下组分：1M Tris-HCl(pH8.0)0.1M，Triton X-100 1.0％，N-decyl-N 0.5％，NP-40 0.2％，Betaine 2.5％，PEG 400 4％，2MMgCl2 60mM，2M KCl 60mM。
在试验3中，按体积份计，使用的裂解液包括以下组分：1M Tris-HCl(pH8.0)0.1M，Triton X-100 1.80％，N-decyl-N 0.1％，NP-40 0.6％，Betaine2.5％，PEG 400 5％，2MMgCl2 60mM，2M KCl 60mM。
在对比1中，按体积份计，使用的裂解液包括以下组分：1M Tris-HCl(pH8.0)0.1M，Triton X-100 6.0％，N-decyl-N 6.0％，NP-40 6.0％，Betaine 2.5％，PEG 400 4％，2MMgCl2 60mM，2M KCl 60mM。
在对比2中，按体积份计，使用的裂解液包括以下组分：1M Tris-HCl(pH8.0)0.1M，Triton X-100 0.05％，N-decyl-N 0.05％，NP-40 0.05％，Betaine2.5％，PEG 400 4％，2MMgCl2 60mM，2M KCl 60mM。
结果判读规则为：只有FAM通道起峰为GG基因型，只有HEX通道起峰为TT型，两个通道都起峰为G/T杂合子。图4为试验1的荧光定量扩增曲线图，根据qPCR扩增结果可知，该样本的CHRNA基因rs1051730位点基因型为GG，与二代测序检测结果一致；同样地，试验2、试验3、对比2的位点基因型均为GG，而对比1在荧光定量扩增曲线图上无法显现。由此证明，本申请的裂解剂可以用于SNP检测，且检测结果准确可靠。同样地，本申请的裂解剂可以用液体活检领域，在快速释放核酸同时保证了结果准确性。
实施例3：裂解全血中裂解红细胞。
(1)取新鲜的全血样本300μL，加入试验1的裂解剂300μL，将全血样品和本申请裂解剂的体积份数按照1:1的比例混合均匀，在常温下静置裂解0.5min。裂解后，混合液呈红色透明澄清状态，通过高速离心后获得白细胞沉淀。重复上述实验3次。
其中，在试验1中，按体积份计，使用的裂解液包括以下组分：1M Tris-HCl(pH8.0)0.05M，Triton X-100 1.80％，N-decyl-N 1.00％，NP-40 0.4％，Betaine5％，PEG 4005％，2M MgCl2 60mM，2M KCl 60mM。
(2)取相同的等体积的全血样本若干份，分别用两家国内某知名供应商的商品化红细胞裂解液进行裂解，按照说明书进行裂解操作，并重复上述实验3次。
本申请裂解剂裂解红细胞后得到白细胞D1组、供应商1裂解红细胞后得到白细胞E组与供应商2裂解红细胞后得到白细胞F组。使用相同的方法同时进行后续的核酸提取实验，其中，该相同方法可以是“商品化核酸提取试剂盒”或者“天根磁珠法通用型基因组DNA提取试剂盒”。最终，得到三种红细胞裂解剂裂解后的基因组核酸，使用Invitrogen QUBIT4.0及配套定量试剂对其进行dsDNA定量，检测结果见表5。
表5核酸含量检测结果
编号 D1组/μg E组/μg F组/μg
重复1 13.68 10.20 9.95
重复2 13.39 10.57 10.06
重复3 13.59 10.20 9.88
根据表5可知，采用本申请裂解剂裂解红细胞后，得到白细胞D1组；白细胞E组和白细胞F组是采用市售的商品对全血中的红细胞进行裂解得到。针对同一份全血样品，将得到的三组白细胞进行核酸提取，白细胞D1组得到的核酸含量为13.39-13.68μg，而白细胞E组和白细胞F组得到的核酸含量最多仅为10.57μg。由此可知，本申请裂解剂裂解红细胞具有更优的裂解效果，核酸得率更高。
同样地，分别采用以下试验2、试验3和对比1、对比2进行本实施例的裂解红细胞方法裂解后，分别得到D2组、D3组、对3组和对4组。然后进行核酸提取，结果见表6。
表6核酸含量检测结果
Figure BDA0004008559660000141
由表6可知，裂解红细胞后，D2组和D3组的核酸含量结果分别是12.08-12.88μg，明显高于市售的裂解红细胞的裂解液，而对3组和对4组裂解红细胞后，其核酸含量远远低于本申请的裂解液和市售的裂解液，可能是对3组和对4组裂解红细胞的效果不佳，影响了白细胞核酸的提取。由此，进一步说明了本申请裂解剂裂解红细胞具有更优的裂解效果，核酸得率更高。
以上所述仅为本发明的可选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种裂解剂，其特征在于，按体积份计，所述裂解剂包括以下组分：N-decyl-N 0.1-5％，Triton x-100 0.1-5％，NP-40 0.1-5％，0.01-1M缓冲剂；
其中，所述缓冲剂的pH值为4.0-8.5。
2.如权利要求1所述的裂解剂，其特征在于，按体积份计，N-decyl-N0.1-1％，Tritonx-100 0.1-1.8％，NP-40 0.1-0.4％，0.01-0.5M缓冲剂。
3.如权利要求2所述的裂解剂，其特征在于，所述缓冲剂包括Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液中的一种。
4.如权利要求1至3中任意一项所述的裂解剂，其特征在于，所述裂解剂还包括Betaine和/或增溶剂。
5.如权利要求4所述的裂解剂，其特征在于，按体积份计，Betaine 1-20％；和/或，
按体积份计，增溶剂5-15％；和/或，
所述增溶剂包括PEG 400、PEG600、PEG800、PEG1000、PEG2000中的一种。
6.如权利要求1至3中任意一项所述的裂解剂，其特征在于，所述裂解剂还包括10-100mM氯化镁和10-100mM氯化钾。
7.一种组合物在裂解血液、血浆、血清、唾液、组织匀浆、细胞匀浆、病毒的用途，其特征在于，按体积份计，所述组合物包括以下组分：N-decyl-N0.1-5％，Triton x-100 0.1-5％，NP-40 0.1-5％，0.01-1M缓冲剂；其中，所述缓冲剂的pH值为4.0-8.5。
8.如权利要求7所述的组合物在裂解血液、血浆、血清、唾液、组织匀浆、细胞匀浆、病毒的用途，其特征在于，所述组合物释放RNA时，所述缓冲剂的pH值为4.0-7.0；和/或，
所述组合物释放DNA时，所述缓冲剂的pH值为6.5-8.5。
9.一种核酸释放方法，采用如权利要求1至6中任意一项所述的裂解剂，其特征在于，包括以下步骤：
样本和裂解剂混合，得到混合液A；其中，所述样本和裂解剂的体积份数为1-5∶1
将混合液A在70-100℃条件下裂解，所述裂解时间为2-20分钟。
10.一种裂解红细胞方法，采用如权利要求6所述的裂解剂，所述缓冲剂的pH值为6.5-8.5，其特征在于，包括以下步骤：
样本和裂解剂混合，得到混合液B；其中，所述样本和裂解剂的体积份数为1-3∶1；
将混合液B静置裂解，所述裂解时间为0.25-2分钟。
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