CN111733213A - 反转录反应液及制备cDNA的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了反转录反应液及制备cDNA的方法。本发明所提出的反转录反应液和制备cDNA的方法，反转录时可同时去除RNA样品中的残留基因组DNA，反转录反应操作简便、反应快速、反应效果好、可重复性高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的，本发明涉及一种反转录反应液及一种制备cDNA的方法。
背景技术
基因表达与调控的分析与检测是现代分子生物学和医学研究领域中的重要课题。近年来随着基因表达调控分析检测技术的发展，相关的检测技术也越来越多，比如：原位杂交、Northern杂交、RNA酶保护实验、基因芯片分析、实时定量PCR分析以及反转录PCR分析(RT-PCR)等。其中的RT-PCR分析由于操作简单，检测mRNA水平灵敏，被认为是检测基因表达的主要手段之一。RT-PCR是一种将反转录(Reverse Transcription；RT)反应和PCR(Polymerase Chain Reaction)反应组合在一起的检测技术。其中的RT(反转录)反应是RT-PCR技术的关键，它是以mRNA为模板，在反转录酶的作用下合成与模板mRNA互补的DNA即cDNA的过程。
cDNA的合成和克隆技术已经成为当今分子生物学研究的重要手段。合成cDNA第一链的方法离不开依赖RNA的DNA聚合酶(反转录酶)的作用。目前非常常用且已经商品化的反转录酶有禽类成髓细胞病毒(AMV)反转录酶和鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶这两种。通常情况下，RT反应过程由3个步骤组成：首先通过高温将RNA模板的二级结构打开；其次通过反转录酶催化反转录反应；最后通过高温对反转录酶进行灭活，以保证后续PCR过程的顺利进行。由此可知传统方法下的RT反应步骤较为繁琐。
另外，由于提取RNA的过程中势必会将样品中的DNA同时提出，而残留的DNA会在后续的PCR检测反应中干扰RNA反转录产物cDNA的检测效果。对于这种基因组DNA，一般可以通过两种方法来去除：一种是在RNA提取过程中加一步DNA消化步骤；另一种是在RNA的反转录过程中加一步DNA的消化步骤。但是由于RNA本身的稳定性不佳，极易降解，因此无论上述的哪种基因组DNA去除方法都会增加RNA提取或者反转录过程中的操作步骤，变相的增加了RNA降解的风险，使得操作流程复杂化的同时，降低了RNA的反转录效果。因此如果能将基因组DNA的去除反应和RNA的反转录反应相整合，使得在RNA反转录反应进行的同时来完成基因组DNA的去除过程，那么就可以实现既简化了反转录的操作步骤又提高了RNA的反转录效果的目的。
所以，如何进一步简化RNA的反转录步骤并提高cDNA的合成效率仍有待进一步开发。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
反转录常规的操作流程需要3个不同的反应温度(42℃，65℃和95℃)，且反应体系配制过程复杂，容易出错，另外，整个操作过程需要近2个小时的操作和反应时间，而且，如果需要添加基因组DNA的去除步骤，那么还会增加操作步骤和操作时间，因此，常规操作流程比较耗时费力。所以，常规的反转录反应，不但会给实验操作者带来不便，而且越来越不能满足基因分析的高速、高通量的需求。
目前一些商品化试剂盒中不乏可同时去除基因组DNA和反转录且反应快速和操作简便的产品，但是去除基因组和反转录效果一般，重复性不好，很难得到推广。
基于上述问题，在本发明中，发明人提出了一种可同时去除基因组DNA的反转录反应液，以此反转录反应液对RNA样品进行反转录处理，可同时去除基因组DNA和进行RNA的反转录，且时间仅为15分钟，基因组DNA去除彻底，反转录反应效果佳，重复性好。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种反转录反应液。根据本发明的实施例，所述反转录反应液包括：0.1～0.3摩尔/升三羟甲基氨基甲烷；40～60毫摩尔/升硫酸铵；8～12毫摩尔/升氯化镁；0.1～0.3摩尔/升氯化钾；2～4毫摩尔/升二硫苏糖醇；0.5～0.8摩尔/升氯化钙；100～300毫摩尔/升海藻糖；脱氧核苷三磷酸(包括dATP，dTTP，dGTP和dCTP)各1～3毫摩尔/升；5～20微摩尔/升的Oligo-dT15引物；30～60微摩尔/升的随机引物；25～75个单位/微升的鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶；1.5～3个单位/微升的RNA酶抑制剂；0.2～1.0个单位/微升的DNA酶Ⅰ(DNaseⅠ)；1.5％～3％(体积体积比)甘油；以及余量的水。根据本发明的实施例，利用本发明所提出的反转录反应液进行反转录，反转录时可同时去除RNA样品中的残留基因组DNA，反转录反应操作简便、反应快速、反应效果好、可重复性高。
根据本发明的实施例，上述反转录反应液还可以具有下列附加技术特征之一：
根据本发明的实施例，所述Oligo-dT15引物的序列为TTTTTTTTTTTTTTT。
根据本发明的实施例，所述随机引物的序列为NNNNNN。其中，N表示A、T、C、G任一碱基，所述随机引物由包含6个任意连续重复碱基的序列组成。
根据本发明的实施例，所述反转录反应液的pH为8.0～9.0。pH为8.0～9.0时，MMLV反转录酶利用RNA模板合成cDNA时活性高、效率高。根据本发明的实施例，优选反转录反应液的pH为8.8。发明人发现，在pH为8.8的条件下，在反转录过程中，既能使得DNA酶Ⅰ(DNaseI)发挥最大功能，又最大限度的发挥MMLV反转录酶利用RNA模板合成cDNA的活性，兼顾了去除残留基因组的功能和反转录的功能。利用本发明实施例的反转录反应液进行反转录，反转录反应速度进一步提高、反应效果和可重复性进一步提高。
根据本发明的实施例，所述反转录反应液的DNaseⅠ的浓度为0.2～1.0个单位/微升。在研发过程中，发明人发现，如果要将基因组去除功能与反转录功能在反转录过程中整合，就要考虑到DNaseⅠ对反转录的影响，只要表现在两个方面，一方面DNaseⅠ会对反应体系中的反转录引物进行切割，影响反转录效率，另一方面DNaseⅠ会降解新反转录出来的cDNA，从而影响反转录产量。对于本发明中所涉及的反应液而言，DNaseⅠ用量的用量是基于发明人对多方面问题的认识，才筛选出来的。发明人发现，当DNaseⅠ的浓度为0.2～1.0个单位/微升时，在反转录过程中，DNaseⅠ既可以去除残留基因组DNA，又不会对反转录反应液中引物(单链DNA)的有效浓度和刚合成的cDNA造成损失，可以实现去除基因组过程和反转录过程在一管内同时进行，简便了反转录流程，提高了反转录效果。
根据本发明的实施例，优选反转录反应液中的DNaseⅠ的浓度为0.5个单位/微升，可最大限度的去除残留基因组DNA，同时也最大限度地发挥了MMLV反转录酶利用RNA模板合成cDNA的活性。利用本发明实施例的反转录反应液进行反转录，反转录反应速度，基因组DNA去除效果和方便性进一步提高、反应效果和可重复性也进一步提高。
根据本发明的实施例，所述反转录反应液的随机引物的浓度为30～60微摩尔/升；Oligo-dT15引物的浓度为5～20微摩尔/升。在研发过程中，发明人发现，上述两种反转录引物的有效浓度对反转录效率影响显著，由于本发明中涉及的反转录反应液中包含DNaseⅠ，而DNaseⅠ又会降解上述两种反转录引物，因此，对本反应液而言，两种反转录引物的添加量较常规反转录反应液而言大大增加，有效抑制了DNaseⅠ对随机引物的降解反应，保证反转录反应中反转录引物的有效浓度。发明人发现，随机引物的浓度为30～60微摩尔/升；Oligo-dT15引物的浓度为5～20微摩尔/升的情况下，可以保证即使反转录反应液中存在DNaseⅠ，也不会对随机引物和Oligo-dT15引物的有效浓度造成损失，从另一个方面保证了去除基因组过程和反转录过程在一管内同时进行的可行性。
根据本发明的实施例，优选随机引物的浓度为50微摩尔/升，Oligo-dT15引物的浓度为12.5微摩尔/升时，最大限度的发挥了MMLV反转录酶利用RNA模板合成cDNA的活性，因此，利用本发明实施例的反转录反应液进行反转录，反转录反应速度、反应效果和可重复性进一步提高。
根据本发明的实施例，所述氯化钾的用量是0.2摩尔/升，所述硫酸铵的用量是50毫摩尔/升，所述二硫苏糖醇的用量是3毫摩尔/升，所述氯化钙的用量是0.65毫摩尔/升，所述海藻糖的用量是200毫摩尔/升；所述甘油的用量是2.7％。发明发现，如果要将基因组去除步骤和反转录步骤在反转录过程中整合，反应液中的阳离子种类和配比，保护剂的添加比例就要同时满足上述两种反应。根据本发明的实施例，在上述氯化钾、硫酸铵、二硫苏糖醇、氯化钙、海藻糖和甘油的用量下，利用本发明实施例的反转录反应液进行反转录，其基因组去除效果、反转录反应速度、反应效果和可重复性得到更进一步显著提高。
在本发明的第二方面，本发明提出了前面所述的反转录反应液在反转录处理中的用途。根据本发明的实施例，利用本发明所提出的反转录反应液进行反转录，反转录反应操作简便，可在反转录处理过程同时实现RNA样本中残留基因组DNA的有效去除、反应快速、反应效果好、可重复性高。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种制备cDNA的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：利用前面所述的反转录反应液对RNA样本进行反转录处理，以便获得所述cDNA。根据本发明的实施例，本发明提出的制备cDNA的方法具有和本发明提出的反转录反应液相同的效果和优点，即本发明提出的制备cDNA的方法，可在实现有效去除RNA样本中残留基因组DNA的同时，快速实现cDNA的获得，且反应快速、效果好、可重复性高。
根据本发明的实施例，上述制备cDNA的方法还可以具有下列附加技术特征之一：
根据本发明的实施例，所述反转录处理(含RNA样本中残留基因组DNA去除过程)是在42摄氏度的条件下进行15分钟。常规反转录处理所需时间是60～65分钟，本发明所提出的制备cDNA的方法是15分钟，反应快速。
根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)将所述RNA样品、水和所述反转录反应液混合，以便获得反应混合物，其中，基于10纳克～2微克的所述RNA样本，所述反转录反应液的用量为4微升，所述水的用量用于将所述反应混合物的体积调剂至20微升；以及(2)将步骤(1)所得反应混合液进行所述反转录处理(含RNA样本中残留基因组DNA去除过程)，以便获得所述cDNA。根据本发明的实施例，本发明所提出的制备cDNA的方法，可在RNA反转录的过程中同时实现RNA样本中残留基因组DNA的有效去除，且反应快速、反应效果好、可重复性高的特点。
根据本发明的实施例，所述水是去离子水。去离子水可防止RNase对RNA的降解、防止水中离子对反应体系的干扰以及避免非特异性产物的生成。因此，反转录处理过程中使用去离子水进一步提高了本发明提出的制备cDNA方法的稳定性和可重复性。
根据本发明的实施例，所述混合是在4摄氏度下进行的。在4摄氏度下进行混合处理，保证了RNA样品的稳定和反应体系中反转录酶的稳定。因此，混合处理在4摄氏度下进行保证了本发明所提出的制备cDNA的方法的稳定性和可靠性进一步提高。
附图说明
图1是根据本发明实施例10的通过本发明提出的制备cDNA的方法制备的cDNA进行荧光定量PCR的检测图；
图2是根据本发明实施例10的通过常规反转录方法制备的cDNA进行荧光定量PCR的检测图；
图3是根据本发明实施例12的通过本发明提出的制备cDNA的方法和常规反转录方法制备的cDNA分别进行PCR检测，然后将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳的电泳结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
反转录常规的操作流程需要3个不同的反应温度，且反应体系配制过程复杂，整个操作过程需要近2个小时的操作和反应时间，耗时费力；如果再加上残留基因组的去除步骤，那么会变得更加的繁复和耗时，并且目前一些商品化试剂盒反应效果一般，重复性不好。
基于上述问题，在本发明中，发明人提出了一种操作简便，反应快速的反转录反应液，以此反转录反应液对RNA样品进行反转录处理的过程中同时实现了对RNA样本中残留基因组的去除，整个反转录过程所需时间仅为15分钟，反转录反应效果佳，重复性好。
反转录反应液
在本发明的第一方面，本发明提出了一种反转录反应液。根据本发明的实施例，所述反转录反应液包括：0.1～0.3摩尔/升三羟甲基氨基甲烷；40～60毫摩尔/升硫酸铵；8～12毫摩尔/升氯化镁；0.1～0.3摩尔/升氯化钾；2～4毫摩尔/升二硫苏糖醇；0.5～0.8摩尔/升氯化钙；100～300毫摩尔/升海藻糖；脱氧核苷三磷酸各1～3毫摩尔/升；5～20微摩尔/升的Oligo-dT15引物；30～60微摩尔/升的随机引物；25～75个单位/微升的鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶；1.5～3个单位/微升的RNA酶抑制剂；0.2～1.0个单位/微升的DNA酶Ⅰ(DNaseⅠ)；1.5％～3％(体积体积比)甘油；以及余量的水。
发明人发现，反转录反应液中加入100～300毫摩尔/升海藻糖和1.5％～3％甘油可以很好地保护反转录酶、DNaseⅠ、RNase抑制剂和超纯dNTPs的作用，使得反转录反应液在-20℃条件下冻存6个月，且反复冻融30次的情况下依然具有高活性。同时，发明人惊奇地发现，反转录反应液中加入40～60毫摩尔/升硫酸铵和0.1～0.3摩尔/升氯化钾，铵根离子和钾离子的配比，即可以保证反转录引物与模板RNA的特异且快速的结合，使得反转录反应高效进行，又可以使得DNaseⅠ正常发挥效果，去除残留基因组的同时，不会对反转录造成影响。反转录反应液中加入2～4毫摩尔/升二硫苏糖醇(DTT)，起到了增加反转录酶反应速率的作用。最后，发明人惊奇地发现，在反转录反应液中加入0.2～1.0个单位/微升的DNA酶Ⅰ(DNaseⅠ)和高浓度的反转录引物(5～20微摩尔/升的Oligo-dT15引物；30～60微摩尔/升的随机引物)的情况下，既可以实现降解RNA样品中残留的基因组DNA的目的，又不会对反转录反应液中的反转录引物的有效浓度造成影响，同时也不会对新反转录合成的cDNA造成损伤。使得基因组去除反应和反转录反应可以在一管内同时进行，且效果稳定，反转录效果良好。
根据本发明的实施例，利用本发明所提出的反转录反应液进行反转录，反转录反应操作简便、反应快速、反应效果好、可重复性高。
根据本发明的实施例，所述反转录反应液的pH为8.0～9.0。pH为8.0～9.0时，MMLV反转录酶利用RNA模板合成cDNA时活性高、效率高。根据本发明的实施例，优选反转录反应液的pH为8.8，由于反转录反应液兼具残留基因组去除功能和反转录功能两个方面，因此反应液的pH环境是需要照顾到这两个方面的，实验结果表明，pH为8.8的情况下，既能使得DNA酶Ⅰ发挥最大功能，又最大限度的发挥了MMLV反转录酶利用RNA模板合成cDNA的活性。利用本发明实施例的反转录反应液进行反转录，反转录反应速度进一步提高、反应效果和可重复性进一步提高。
根据本发明的实施例，所述反转录反应液的DNaseⅠ的浓度为0.2～1.0个单位/微升。将基因组去除步骤与反转录步骤整合的情况，需要考虑DNaseⅠ对反转录的影响，影响主要体现在两个方面：一方面DNaseⅠ会对反应体系中的反转录引物进行切割，影响反转录效率；另一方面DNaseⅠ会降解新反转录出来的cDNA，从而影响反转录产量。因此，对于本发明中涉及的反应液而言，DNaseⅠ用量的筛选是需要照顾多方面因素的。当DNaseⅠ的浓度为0.2～1.0个单位/微升时，在反转录过程中，DNaseⅠ既可以去除残留基因组DNA，又不会对反转录反应液中的引物(单链DNA)的有效浓度和刚合成的cDNA造成损失，可以实现去除基因组过程和反转录过程在一管内同时进行，简便了反转录流程，提高了反转录效果。
根据本发明的实施例，优选反转录反应液中的DNaseⅠ的浓度为0.5个单位/微升，可最大限度的去除残留基因组DNA，同时也最大限度地发挥了MMLV反转录酶利用RNA模板合成cDNA的活性。利用本发明实施例的反转录反应液进行反转录，反转录反应速度，基因组DNA去除效果和方便性进一步提高、反应效果和可重复性也进一步提高。
根据本发明的实施例，所述反转录反应液的随机引物的浓度为30～60微摩尔/升；Oligo-dT15引物的浓度为5～20微摩尔/升。两种反转录引物的有效浓度对反转录效率来说至关重要。由于本发明中涉及的反转录反应液中包含DNaseⅠ，而DNaseⅠ会降解上述两种反转录引物，因此，对本反应液而言，两种反转录引物的添加量较常规反转录反应液而言是大大增加的，目的是为了抑制DNaseⅠ对随机引物的降解反应，保证反转录反应中反转录引物的有效浓度。随机引物的浓度为30～60微摩尔/升；Oligo-dT15引物的浓度为5～20微摩尔/升的情况下，可以保证即使反转录反应液中存在DNaseⅠ，也不会对随机引物和Oligo-dT15引物的有效浓度造成损失，从另一个方面保证了去除基因组过程和反转录过程在一管内同时进行的可行性。
根据本发明的实施例，优选随机引物的浓度为50微摩尔/升，Oligo-dT15引物的浓度为12.5微摩尔/升时，最大限度的发挥了MMLV反转录酶利用RNA模板合成cDNA的活性，因此，利用本发明实施例的反转录反应液进行反转录，反转录反应速度、反应效果和可重复性进一步提高。
根据本发明的实施例，所述氯化钾的用量是0.2摩尔/升，所述硫酸铵的用量是50毫摩尔/升，所述二硫苏糖醇的用量是3毫摩尔/升，所述氯化钙的用量是0.65毫摩尔/升，所述海藻糖的用量是200毫摩尔/升；所述甘油的用量是2.7％。对于将基因组去除步骤整合至反转录步骤中的本反转录反应液而言，反应液中的阳离子种类和配比，保护剂的添加比例也是要同时照顾到两种反应的，因此，在上述氯化钾、硫酸铵、二硫苏糖醇、氯化钙、海藻糖和甘油的用量下，利用本发明实施例的反转录反应液进行反转录，其基因组去除效果、反转录反应速度、反应效果和可重复性得到更进一步显著提高。
制备cDNA的方法
在本发明的另一方面，本发明提出了一种制备cDNA的方法。根据本发明的实施例，包括：利用前面所述的反转录反应液对RNA样本进行反转录处理，以便获得所述cDNA。
根据本发明的实施例，所述反转录处理是在42摄氏度的条件下进行15分钟。
本发明所提出的制备cDNA的方法化四步反应(基因组去除步骤；RNA高级结构打开步骤；反转录反应步骤和酶热失活步骤)为一步反应，将将近两个小时的反应时间缩短为15分钟。此方法与常规方法相比，不但省去了起初的残留基因组DNA的消化步骤，RNA模板的预变性过程和最后的反转录酶变性过程，而且节省了至少70％的反转录时间。大大节省了实验操作者的操作时间。根据本发明的实施例，本发明提出的制备cDNA的方法具有反转录反应快速、效果好、可重复性高的特点。
根据本发明的实施例，所述反转录处理进一步包括：(1)将所述RNA样品、水和所述反转录反应液混合，以便获得反应混合物，其中，基于10纳克～2微克的所述RNA样本，所述反转录反应液的用量为4微升，所述水的用量用于将所述反应混合物的体积调剂至20微升；以及(2)将步骤(1)所得反应混合液进行所述反转录处理，以便获得所述cDNA。本发明提出的一种制备cDNA的方法中，简化7种组分为1种组分，即用5×反转录反应液代替了常规操作方法中的如下7种成分：反转录缓冲液、反转录引物、反转录酶、超纯dNTPs、RNase抑制剂、DNaeⅠ和DNaeⅠ反应缓冲液，实验者在进行反转录操作过程中无需分步单独添加上述7种成分、水和RNA，而是只需要加入水、5×反转录反应液和适量RNA即可。该方法不但大大节约了实验人员的操作时间，而且避免了多次分步操作所导致的样品间交叉污染的可能性，使得反转录结果更加准确可靠，极大的方便了规模化操作的科研人员。因此，本发明所提出的制备cDNA的方法具有操作简便、反应快速的特点。
根据本发明的实施例，上述水是去离子水。去离子水可避免水中RNase对RNA的降解、避免水中离子对反应体系的干扰以及避免非特异性产物的生成。因此，反转录处理过程中使用去离子水进一步提高了本发明提出的制备cDNA方法的稳定性和可重复性。
根据本发明的实施例，所述混合是在4摄氏度下进行的。在4摄氏度下进行混合处理，保证了RNA样品的稳定和反应体系中反转录酶的稳定。因此，混合处理在4摄氏度下进行保证了本发明所提出的制备cDNA的方法的稳定性和可靠性进一步提高。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过采购获得的常规产品。
在本发明的实施例中，所用的TIANScriptⅡcDNA第一链合成试剂盒，FastKingcDNA第一链合成试剂盒，SuperReal PreMix(SYBR Green)荧光定量检测试剂盒和TIANSeqHiFi Amplification Mix均由天根生化科技(北京)有限公司提供。所用引物探针由美国英俊公司合成。
实施例1
利用四种不同pH值的5×反转录反应液进行人类RNA的反转录，并通过后续的定量PCR检测来确定5×反转录反应液的最适pH值。
一、人RNA的反转录：
1、pH8.0反转录反应液进行人RNA的反转录：
(1)在冰上进行如下操作：在200微升的离心管中配制反转录反应体系，加入的组分包括：5×反转录反应液-1(4微升)、1微克的RNA、去离子水补足至20微升。
其中5×反转录反应液-1配方为：0.2摩尔/升三羟甲基氨基甲烷；50毫摩尔/升硫酸铵；10毫摩尔/升氯化镁；0.2摩尔/升氯化钾；3毫摩尔/升二硫苏糖醇；0.65摩尔/升氯化钙；200毫摩尔/升海藻糖；脱氧核苷三磷酸各2.5毫摩尔/升；12.5微摩尔/升的Oligo-dT15引物；50微摩尔/升的随机引物；40个单位/微升的鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶；2个单位/微升的RNA酶抑制剂；0.5个单位/微升的DNA酶Ⅰ(DNaseⅠ)；2.7％(体积体积比)甘油；调节反转录反应液的pH值为8.0，并最终用去离子水定容至1毫升。
(2)将步骤(1)的反转录反应体系彻底混匀，简短离心，并将上述反应液于42度下孵育15分钟。此时反转录反应完成。将得到的cDNA置于冰上备用。
(3)将上述所得人cDNA进行荧光定量检测。
2、pH8.3反转录反应液进行人RNA的反转录：
(1)在冰上进行如下操作：在200微升的离心管中配制反转录反应体系，加入的组分包括：5×反转录反应液-2(4微升)、1微克的RNA、去离子水补足至20微升。
其中5×反转录反应液-2配方为：0.2摩尔/升三羟甲基氨基甲烷；50毫摩尔/升硫酸铵；10毫摩尔/升氯化镁；0.2摩尔/升氯化钾；3毫摩尔/升二硫苏糖醇；0.65摩尔/升氯化钙；200毫摩尔/升海藻糖；脱氧核苷三磷酸各2.5毫摩尔/升；12.5微摩尔/升的Oligo-dT15引物；50微摩尔/升的随机引物；40个单位/微升的鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶；2个单位/微升的RNA酶抑制剂；0.5个单位/微升的DNA酶Ⅰ(DNaseⅠ)；2.7％(体积体积比)甘油；调节反转录反应液的pH值为8.3，并最终用去离子水定容至1毫升。
(2)将步骤(1)的反转录反应体系彻底混匀，简短离心，并将上述反应液于42度下孵育15分钟。此时反转录反应完成。将得到的cDNA置于冰上备用。
(3)将上述所得人cDNA进行荧光定量检测。
3、pH8.8反转录反应液进行人RNA的反转录：
(1)在冰上进行如下操作：在200微升的离心管中配制反转录反应体系，加入的组分包括：5×反转录反应液-3(4微升)、1微克的RNA、去离子水补足至20微升。
其中5×反转录反应液-3配方为：0.2摩尔/升三羟甲基氨基甲烷；50毫摩尔/升硫酸铵；10毫摩尔/升氯化镁；0.2摩尔/升氯化钾；3毫摩尔/升二硫苏糖醇；0.65摩尔/升氯化钙；200毫摩尔/升海藻糖；脱氧核苷三磷酸各2.5毫摩尔/升；12.5微摩尔/升的Oligo-dT15引物；50微摩尔/升的随机引物；40个单位/微升的鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶；2个单位/微升的RNA酶抑制剂；0.5个单位/微升的DNA酶Ⅰ(DNaseⅠ)；2.7％(体积体积比)甘油；调节反转录反应液的pH值为8.8，并最终用去离子水定容至1毫升。
(2)将步骤(1)的反转录反应体系彻底混匀，简短离心，并将上述反应液于42度下孵育15分钟。此时反转录反应完成。将得到的cDNA置于冰上备用。
(3)将上述所得人cDNA进行荧光定量检测。
4、pH9.0反转录反应液进行人RNA的反转录：
(1)在冰上进行如下操作：在200微升的离心管中配制反转录反应体系，加入的组分包括：5×反转录反应液-4(4微升)、1微克的RNA、去离子水补足至20微升。
其中5×反转录反应液-3配方为：0.2摩尔/升三羟甲基氨基甲烷；50毫摩尔/升硫酸铵；10毫摩尔/升氯化镁；0.2摩尔/升氯化钾；3毫摩尔/升二硫苏糖醇；0.65摩尔/升氯化钙；200毫摩尔/升海藻糖；脱氧核苷三磷酸各2.5毫摩尔/升；12.5微摩尔/升的Oligo-dT15引物；50微摩尔/升的随机引物；40个单位/微升的鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶；2个单位/微升的RNA酶抑制剂；0.5个单位/微升的DNA酶Ⅰ(DNaseⅠ)；2.7％(体积体积比)甘油；调节反转录反应液的pH值为9.0，并最终用去离子水定容至1毫升。
(2)将步骤(1)的反转录反应体系彻底混匀，简短离心，并将上述反应液于42度下孵育15分钟。此时反转录反应完成。将得到的cDNA置于冰上备用。
(3)将上述所得人cDNA进行荧光定量检测。
二、对反转录所得cDNA进行荧光定量检测：
对通过上述四种pH反转录反应液所获得cNDA分别进行荧光定量检测。
以实施例1中四种反转录液反转录得到的cDNA为模板，分别用相同的内参基因的引物进行检测，所用的定量PCR试剂为：天根生化科技(北京)有限公司的SuperReal PreMix(SYBR Green)荧光定量检测试剂盒。
其中内参基因(扩增片段大小121bp)引物序列为：
上游引物如SEQ ID NO：1所示，
SEQ ID NO：1 5’-GGTTTCGAAGTGGTGGTCTTG-3’，
下游引物如SEQ ID NO：2所示，
SEQ ID NO：2 5’-CCTGCCCCAATCCCTTTATT-3’。
荧光定量PCR的检测体系为：10微升2×SuperReal PreMix(含SYBR)、0.4微升50×ROX Reference Dye、1微升内参基因的上游引物(5微摩尔/升)、1微升内参基因的下游引物(5微摩尔/升)、2微升cDNA模板、最后用去离子水将PCR反应体系补足至20微升。
阴性对照的PCR反应体系与待测样品的PCR反应体系区别在：将模板cDNA更换为去离子水。
试剂全部加好后，瞬时离心，将所有试剂收集到管底。
cDNA模板为四种pH值反转录反应液分别反转录所得cDNA，经过去离子水稀释得到。浓度为：10纳克/微升。
本实施例中荧光定量PCR实验使用ABI 7500Fast定量PCR仪进行。具体的荧光定量PCR的反应程序如下：
预变性条件为：95摄氏度15分钟；PCR循环程序为：95摄氏度10秒，60摄氏度30秒，循环40次；最后将反应体系冷却至室温(25摄氏度)。
三、检测结果：
四种pH值试剂制备的cDNA进行荧光定量PCR检测，具体的CT值(每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数)如表1所示。
表1：
| 反转录反应液对应pH值 | 8.0 | 8.3 | 8.8 | 9.0 |
| CT值 | 20.57 | 19.91 | 19.62 | 20.88 |
阴性对照的CT值均为未检测。
通过上表数据可知，pH8.8的试剂所对应的CT值最低，因此，可确定5×反转录反应液的最适pH值为8.8。
实施例2
利用三种不同铵、钾离子配比的5×反转录反应液进行人类RNA的反转录，并通过后续的定量PCR检测来确定5×反转录反应液的最适铵、钾离子浓度。
一、人RNA的反转录：
1、在冰上进行如下操作：在200微升的离心管中配制反转录反应体系，加入的组分包括：5×反转录反应液(4微升)、1微克的RNA、去离子水补足至20微升。
其中不同铵、钾离子配比的5×反转录反应液中除氯化钾和硫酸铵以外的配方相同，具体为：0.2摩尔/升三羟甲基氨基甲烷；10毫摩尔/升氯化镁；3毫摩尔/升二硫苏糖醇；0.65摩尔/升氯化钙；200毫摩尔/升海藻糖；脱氧核苷三磷酸各2.5毫摩尔/升；12.5微摩尔/升的Oligo-dT15引物；50微摩尔/升的随机引物；40个单位/微升的鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶；2个单位/微升的RNA酶抑制剂；0.5个单位/微升的DNA酶Ⅰ(DNaseⅠ)；2.7％(体积体积比)甘油；调节反转录反应液的pH值为8.8，并最终用去离子水定容至1毫升。而不同铵、钾配比如表2所示。
表2：
2、将步骤1的反转录反应体系彻底混匀，简短离心，并将上述反应液于42度下孵育15分钟。此时反转录反应完成。将得到的cDNA置于冰上备用。
3、将上述所得人cDNA进行荧光定量检测。
二、对反转录所得cDNA进行荧光定量检测：
对通过上述三种不同试剂所获得cNDA分别进行荧光定量检测。
以实施例2中三种反转录试剂反转录得到的cDNA为模板，分别用相同的内参基因的引物进行检测，所用的定量PCR试剂为：天根生化科技(北京)有限公司的SuperRealPreMix(SYBR Green)荧光定量检测试剂盒。
其中内参基因(扩增片段大小121bp)引物序列为：
上游引物如SEQ ID NO：1所示，
SEQ ID NO：1 5’-GGTTTCGAAGTGGTGGTCTTG-3’，
下游引物如SEQ ID NO：2所示，
SEQ ID NO：2 5’-CCTGCCCCAATCCCTTTATT-3’。
荧光定量PCR的检测体系为：10微升2×SuperReal PreMix(含SYBR)、0.4微升50×ROX Reference Dye、1微升内参基因的上游引物(5微摩尔/升)、1微升内参基因的下游引物(5微摩尔/升)、2微升cDNA模板、最后用去离子水将PCR反应体系补足至20微升。
阴性对照的PCR反应体系与待测样品的PCR反应体系区别在：将模板cDNA更换为去离子水。
试剂全部加好后，瞬时离心，将所有试剂收集到管底。
cDNA模板为三种不同铵、钾离子配伍试剂分别反转录所得cDNA，经过去离子水稀释得到。浓度为：10纳克/微升。
本实施例中荧光定量PCR实验使用ABI 7500Fast定量PCR仪进行。具体的荧光定量PCR的反应程序如下：
预变性条件为：95摄氏度15分钟；PCR循环程序为：95摄氏度10秒，60摄氏度30秒，循环40次；最后将反应体系冷却至室温(25摄氏度)。
三、检测结果：
三种不同铵、钠离子配方的反转录反应液制备的cDNA进行荧光定量PCR检测，具体的CT值(每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数)如表3所示。
表3：
| 5×反转录反应液编号 | 5 | 6 | 7 |
| CT值 | 20.47 | 19.45 | 20.23 |
阴性对照的CT值均为未检测。
通过上表数据可知，6号试剂所对应的CT值最低，因此，可确定5×反转录反应液的最适铵、钾离子配方为：50毫摩尔/升硫酸铵【(NH4)2SO4】和0.2摩尔/升氯化钠(KCl)。
实施例3
利用六种不同DNA酶Ⅰ(DNaseⅠ)添加量的5×反转录反应液进行人类RNA的反转录，和人类基因组DNA消化反应，并通过后续的定量PCR检测来判断反转录效果和基因组DNA消化效果，进而确定5×反转录反应液的最适DNA酶Ⅰ添加量。
一、人RNA的反转录：
1、在冰上进行如下操作：在200微升的离心管中配制反转录反应体系，加入的组分包括：5×反转录反应液(4微升)、1微克的RNA、去离子水补足至20微升。
其中不同DNA酶Ⅰ添加量的5×反转录反应液中除DNA酶Ⅰ以外的配方相同，具体为：0.2摩尔/升三羟甲基氨基甲烷；50毫摩尔/升硫酸铵；10毫摩尔/升氯化镁；0.2摩尔/升氯化钾；3毫摩尔/升二硫苏糖醇；0.65摩尔/升氯化钙；200毫摩尔/升海藻糖；脱氧核苷三磷酸各2.5毫摩尔/升；12.5微摩尔/升的Oligo-dT15引物；50微摩尔/升的随机引物；40个单位/微升的鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶；2个单位/微升的RNA酶抑制剂；2.7％(体积体积比)甘油；调节反转录反应液的pH值为8.8，并最终用去离子水定容至1毫升。而不同DNA酶Ⅰ的添加量如表4所示。
表4：
2、将步骤1的反转录反应体系彻底混匀，简短离心，并将上述反应液于42度下孵育15分钟。此时反转录反应完成。将得到的cDNA置于冰上备用。
3、将上述所得人cDNA进行荧光定量检测。
二、人基因组DNA消化
1、在冰上进行如下操作：在200微升的离心管中配制反转录反应体系，加入的组分包括：5×反转录反应液(4微升)、5个梯度的基因组DNA(分别为：500纳克，200纳克，100纳克，50纳克和10纳克)、去离子水补足至20微升。
其中不同DNA酶Ⅰ添加量的5×反转录反应液中除DNA酶Ⅰ以外的配方相同，具体为：0.2摩尔/升三羟甲基氨基甲烷；50毫摩尔/升硫酸铵；10毫摩尔/升氯化镁；0.2摩尔/升氯化钾；3毫摩尔/升二硫苏糖醇；0.65摩尔/升氯化钙；200毫摩尔/升海藻糖；脱氧核苷三磷酸各2.5毫摩尔/升；12.5微摩尔/升的Oligo-dT15引物；50微摩尔/升的随机引物；40个单位/微升的鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶；2个单位/微升的RNA酶抑制剂；2.7％(体积体积比)甘油；调节反转录反应液的pH值为8.8，并最终用去离子水定容至1毫升。而不同DNA酶Ⅰ的添加量如表4所示。
2、将步骤1的反应体系彻底混匀，简短离心，并将上述反应液于42度下孵育15分钟。将得到的产物置于冰上备用。
3、将上述所得的消化产物进行荧光定量检测。
三、对反转录所得cDNA和DNA消化产物进行荧光定量检测：
对通过上述六种不同试剂所获得cDNA和不同梯度的DNA消化产物分别进行荧光定量检测。
以实施例3中六种反转录试剂反转录得到的cDNA和不同梯度的DNA消化产物为模板，分别用相同的内参基因的引物进行检测，所用的定量PCR试剂为：天根生化科技(北京)有限公司的SuperReal PreMix(SYBR Green)荧光定量检测试剂盒。
其中内参基因(扩增片段大小121bp)引物序列为：
上游引物如SEQ ID NO：1所示，
SEQ ID NO：1 5’-GGTTTCGAAGTGGTGGTCTTG-3’，
下游引物如SEQ ID NO：2所示，
SEQ ID NO：2 5’-CCTGCCCCAATCCCTTTATT-3’。
荧光定量PCR的检测体系为：10微升2×SuperReal PreMix(含SYBR)、0.4微升50×ROX Reference Dye、1微升内参基因的上游引物(5微摩尔/升)、1微升内参基因的下游引物(5微摩尔/升)、2微升cDNA模板或者DNA消化产物、最后用去离子水将PCR反应体系补足至20微升。
阴性对照的PCR反应体系与待测样品的PCR反应体系区别在：将模板更换为去离子水。
阳性对照的PCR反应体系与待测样品的PCR反应体系区别在：将模板更换为未处理的基因组DNA，上样量为20纳克。
试剂全部加好后，瞬时离心，将所有试剂收集到管底。
cDNA模板为六种不同DNA酶Ⅰ添加量试剂分别反转录所得cDNA，经过去离子水稀释得到。浓度为：10纳克/微升。
DNA消化产物为六种不同DNA酶Ⅰ添加量试剂分别消化不同量的DNA的产物，经过去离子水稀释10倍得到。
本实施例中荧光定量PCR实验使用ABI 7500Fast定量PCR仪进行。具体的荧光定量PCR的反应程序如下：
预变性条件为：95摄氏度15分钟；PCR循环程序为：95摄氏度10秒，60摄氏度30秒，循环40次；最后将反应体系冷却至室温(25摄氏度)。
三、检测结果：
六种不同DNA酶Ⅰ添加量试剂制备的cDNA进行荧光定量PCR检测，具体的CT值(每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数)如表5所示。
表5：
| 5×反转录反应液编号 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 |
| CT值 | 20.18 | 20.02 | 19.33 | 19.62 | 19.98 | 20.51 |
阴性对照的CT值均为未检测。
六种不同DNA酶Ⅰ添加量试剂消化的DNA产物进行荧光定量PCR检测，具体的CT值(每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数)如表6所示：
表6：
备注：阳性对照是指没有添加NDase I的对照样品；阴性对照是指：确认添加了只够量的DNase I的对照样本。
通过上述表5和表6的数据可知，在反转录效果方面，10号试剂所对应的CT值最低；在DNA消化效果方面，5个梯度的DNA投入量下，10号试剂均可以消化完全。因此，可确定5×反转录反应液中DNA酶Ⅰ的最适添加量为0.5单位/微升。
实施例4
DNA酶Ⅰ要发挥生物学活性，需要添加氯化钙。本实施例中利用四种不同氯化钙添加量的5×反转录反应液进行进行人类RNA的反转录，和人类基因组DNA消化反应，并通过后续的定量PCR检测来判断反转录效果和基因组DNA消化效果，进而确定5×反转录反应液的最适氯化钙添加量。
一、人RNA的反转录：
1、在冰上进行如下操作：在200微升的离心管中配制反转录反应体系，加入的组分包括：5×反转录反应液(4微升)、1微克的RNA、去离子水补足至20微升。
其中不同氯化钙添加量的5×反转录反应液中除氯化钙以外的配方相同，0.2摩尔/升三羟甲基氨基甲烷；50毫摩尔/升硫酸铵；10毫摩尔/升氯化镁；0.2摩尔/升氯化钾；3毫摩尔/升二硫苏糖醇；200毫摩尔/升海藻糖；脱氧核苷三磷酸各2.5毫摩尔/升；12.5微摩尔/升的Oligo-dT15引物；50微摩尔/升的随机引物；40个单位/微升的鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶；2个单位/微升的RNA酶抑制剂；0.5个单位/微升的DNA酶Ⅰ(DNaseⅠ)；2.7％(体积体积比)甘油；调节反转录反应液的pH值为8.8，并最终用去离子水定容至1毫升。而不同氯化钙的添加量如表7所示。
表7：
2、将步骤1的反转录反应体系彻底混匀，简短离心，并将上述反应液于42度下孵育15分钟。此时反转录反应完成。将得到的cDNA置于冰上备用。
3、将上述所得人cDNA进行荧光定量检测。
二、人基因组DNA消化
1、在冰上进行如下操作：在200微升的离心管中配制反转录反应体系，加入的组分包括：5×反转录反应液(4微升)、5个梯度的基因组DNA(分别为：500纳克，200纳克，100纳克，50纳克和10纳克)、去离子水补足至20微升。
其中不同氯化钙添加量的5×反转录反应液中除氯化钙以外的配方相同，0.2摩尔/升三羟甲基氨基甲烷；50毫摩尔/升硫酸铵；10毫摩尔/升氯化镁；0.2摩尔/升氯化钾；3毫摩尔/升二硫苏糖醇；200毫摩尔/升海藻糖；脱氧核苷三磷酸各2.5毫摩尔/升；12.5微摩尔/升的Oligo-dT15引物；50微摩尔/升的随机引物；40个单位/微升的鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶；2个单位/微升的RNA酶抑制剂；0.5个单位/微升的DNA酶Ⅰ(DNaseⅠ)；2.7％(体积体积比)甘油；调节反转录反应液的pH值为8.8，并最终用去离子水定容至1毫升。而不同氯化钙的添加量如表7所示。
2、将步骤1的反应体系彻底混匀，简短离心，并将上述反应液于42度下孵育15分钟。将得到的产物置于冰上备用。
3、将上述所得的消化产物进行荧光定量检测。
三、对反转录所得cDNA和DNA消化产物进行荧光定量检测：
对通过上述四种不同试剂所获得cDNA和不同梯度的DNA消化产物分别进行荧光定量检测。
以实施例4中四种反转录试剂反转录得到的cDNA和不同梯度的DNA消化产物为模板，分别用相同的内参基因的引物进行检测，所用的定量PCR试剂为：天根生化科技(北京)有限公司的SuperReal PreMix(SYBR Green)荧光定量检测试剂盒。
其中内参基因(扩增片段大小121bp)引物序列为：
上游引物如SEQ ID NO：1所示，
SEQ ID NO：1 5’-GGTTTCGAAGTGGTGGTCTTG-3’，
下游引物如SEQ ID NO：2所示，
SEQ ID NO：2 5’-CCTGCCCCAATCCCTTTATT-3’。
荧光定量PCR的检测体系为：10微升2×SuperReal PreMix(含SYBR)、0.4微升50×ROX Reference Dye、1微升内参基因的上游引物(5微摩尔/升)、1微升内参基因的下游引物(5微摩尔/升)、2微升cDNA模板或者DNA消化产物、最后用去离子水将PCR反应体系补足至20微升。
阴性对照的PCR反应体系与待测样品的PCR反应体系区别在：将模板更换为去离子水。
阳性对照的PCR反应体系与待测样品的PCR反应体系区别在：将模板更换为未处理的基因组DNA，上样量为20纳克。
试剂全部加好后，瞬时离心，将所有试剂收集到管底。
cDNA模板为四种不同氯化钙添加量试剂分别反转录所得cDNA，经过去离子水稀释得到。浓度为：10纳克/微升。
DNA消化产物为四种不同氯化钙添加量试剂分别消化不同量的DNA的产物，经过去离子水稀释10倍得到。
本实施例中荧光定量PCR实验使用ABI 7500Fast定量PCR仪进行。具体的荧光定量PCR的反应程序如下：
预变性条件为：95摄氏度15分钟；PCR循环程序为：95摄氏度10秒，60摄氏度30秒，循环40次；最后将反应体系冷却至室温(25摄氏度)。
三、检测结果：
四种不同氯化钙添加量试剂制备的cDNA进行荧光定量PCR检测，具体的CT值(每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数)如表8所示。
表8：
| 5×反转录反应液编号 | 14 | 15 | 16 | 17 |
| CT值 | 20.18 | 19.22 | 19.43 | 19.62 |
阴性对照的CT值为未检测。
四种不同氯化钙添加量试剂消化的DNA产物进行荧光定量PCR检测，具体的CT值(每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数)如表9所示。
表9：
通过上述表8和表9的数据可知，在反转录效果方面，15号试剂所对应的CT值最低；且在DNA消化效果方面，5个梯度的DNA投入量下，15号试剂均可以消化完全。因此，可确定5×反转录反应液中氯化钙的最适添加量为0.65毫摩尔/升。
实施例5
利用五种不同Oligo-dT15引物(引物序列：TTTTTTTTTTTTTTT)添加量的5×反转录反应液进行人类RNA的反转录，并通过后续的定量PCR检测来确定5×反转录反应液的最适Oligo-dT15引物添加量。
一、人RNA的反转录：
1、在冰上进行如下操作：在200微升的离心管中配制反转录反应体系，加入的组分包括：5×反转录反应液(4微升)、1微克的RNA、去离子水补足至20微升。
其中不同Oligo-dT15引物添加量的5×反转录反应液中除Oligo-dT15引物以外的配方相同，具体为：0.2摩尔/升三羟甲基氨基甲烷；50毫摩尔/升硫酸铵；10毫摩尔/升氯化镁；0.2摩尔/升氯化钾；3毫摩尔/升二硫苏糖醇；0.65摩尔/升氯化钙；200毫摩尔/升海藻糖；脱氧核苷三磷酸各2.5毫摩尔/升；50微摩尔/升的随机引物；40个单位/微升的鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶；2个单位/微升的RNA酶抑制剂；0.5个单位/微升的DNA酶Ⅰ(DNaseⅠ)；2.7％(体积体积比)甘油；调节反转录反应液的pH值为8.8，并最终用去离子水定容至1毫升。而不同Oligo-dT15引物的添加量如表10所示。
表10：
2、将步骤1的反转录反应体系彻底混匀，简短离心，并将上述反应液于42度下孵育15分钟。此时反转录反应完成。将得到的cDNA置于冰上备用。
3、将上述所得人cDNA进行荧光定量检测。
二、对反转录所得cDNA进行荧光定量检测：
对通过上述五种不同试剂所获得cNDA分别进行荧光定量检测。
以实施例5中五种反转录试剂反转录得到的cDNA为模板，分别用相同的内参基因的引物进行检测，所用的定量PCR试剂为：天根生化科技(北京)有限公司的SuperRealPreMix(SYBR Green)荧光定量检测试剂盒。
其中内参基因(扩增片段大小121bp)引物序列为：
上游引物如SEQ ID NO：1所示，
SEQ ID NO：1 5’-GGTTTCGAAGTGGTGGTCTTG-3’，
下游引物如SEQ ID NO：2所示，
SEQ ID NO：2 5’-CCTGCCCCAATCCCTTTATT-3’。
荧光定量PCR的检测体系为：10微升2×SuperReal PreMix(含SYBR)、0.4微升50×ROX Reference Dye、1微升内参基因的上游引物(5微摩尔/升)、1微升内参基因的下游引物(5微摩尔/升)、2微升cDNA模板、最后用去离子水将PCR反应体系补足至20微升。
阴性对照的PCR反应体系与待测样品的PCR反应体系区别在：将模板cDNA更换为去离子水。
试剂全部加好后，瞬时离心，将所有试剂收集到管底。
cDNA模板为五种不同反转录促进剂添加量试剂分别反转录所得cDNA，经过去离子水稀释得到。浓度为：10纳克/微升。
本实施例中荧光定量PCR实验使用ABI 7500 Fast定量PCR仪进行。具体的荧光定量PCR的反应程序如下：
预变性条件为：95摄氏度15分钟；PCR循环程序为：95摄氏度10秒，60摄氏度30秒，循环40次；最后将反应体系冷却至室温(25摄氏度)。
三、检测结果：
五种不同Oligo-dT15引物添加量试剂制备的cDNA进行荧光定量PCR检测，具体的CT值(每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数)如表11所示：
表11：
| 5×反转录反应液编号 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 |
| CT值 | 21.88 | 19.85 | 19.25 | 19.27 | 19.31 |
阴性对照的CT值均为未检出。
通过上表数据可知，20号试剂所对应的CT值最低，因此，可确定5×反转录反应液中Oligo-dT15引物的最适添加量为：12.5微摩尔/升。
实施例6
利用四种不同随机引物(引物序列：NNNNNN)添加量的5×反转录反应液进行人类RNA的反转录，并通过后续的定量PCR检测来确定5×反转录反应液的最适随机引物添加量。
一、人RNA的反转录：
1、在冰上进行如下操作：在200微升的离心管中配制反转录反应体系，加入的组分包括：5×反转录反应液(4微升)、1微克的RNA、去离子水补足至20微升。
其中不同随机引物添加量的5×反转录反应液中除随机引物以外的配方相同，具体为：0.2摩尔/升三羟甲基氨基甲烷；50毫摩尔/升硫酸铵；10毫摩尔/升氯化镁；0.2摩尔/升氯化钾；3毫摩尔/升二硫苏糖醇；0.65摩尔/升氯化钙；200毫摩尔/升海藻糖；脱氧核苷三磷酸各2.5毫摩尔/升；12.5微摩尔/升的Oligo-dT15引物；40个单位/微升的鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶；2个单位/微升的RNA酶抑制剂；0.5个单位/微升的DNA酶Ⅰ(DNaseⅠ)；2.7％(体积体积比)甘油；调节反转录反应液的pH值为8.8，并最终用去离子水定容至1毫升。而不同随机引物的添加量如表12所示。
表12：
2、将步骤1的反转录反应体系彻底混匀，简短离心，并将上述反应液于42度下孵育15分钟。此时反转录反应完成。将得到的cDNA置于冰上备用。
3、将上述所得人cDNA进行荧光定量检测。
二、对反转录所得cDNA进行荧光定量检测：
对通过上述四种不同试剂所获得cNDA分别进行荧光定量检测。
以实施例6中四种反转录试剂反转录得到的cDNA为模板，分别用相同的内参基因的引物进行检测，所用的定量PCR试剂为：天根生化科技(北京)有限公司的SuperRealPreMix(SYBR Green)荧光定量检测试剂盒。
其中内参基因(扩增片段大小121bp)引物序列为：
上游引物如SEQ ID NO：1所示，
SEQ ID NO：1 5’-GGTTTCGAAGTGGTGGTCTTG-3’，
下游引物如SEQ ID NO：2所示，
SEQ ID NO：2 5’-CCTGCCCCAATCCCTTTATT-3’。
荧光定量PCR的检测体系为：10微升2×SuperReal PreMix(含SYBR)、0.4微升50×ROX Reference Dye、1微升内参基因的上游引物(5微摩尔/升)、1微升内参基因的下游引物(5微摩尔/升)、2微升cDNA模板，最后用去离子水将PCR反应体系补足至20微升。
阴性对照的PCR反应体系与待测样品的PCR反应体系区别在：将模板cDNA更换为去离子水。
试剂全部加好后，瞬时离心，将所有试剂收集到管底。
cDNA模板为四种不同随机引物添加量试剂分别反转录所得cDNA，经过去离子水稀释得到。浓度为：10纳克/微升。
本实施例中荧光定量PCR实验使用ABI 7500Fast定量PCR仪进行。具体的荧光定量PCR的反应程序如下：
预变性条件为：95摄氏度15分钟；PCR循环程序为：95摄氏度10秒，60摄氏度30秒，循环40次；最后将反应体系冷却至室温(25摄氏度)。
三、检测结果：
四种不同随机引物添加量试剂制备的cDNA进行荧光定量PCR检测，具体的CT值(每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数)如表13所示。
表13：
| 5×反转录反应液编号 | 23 | 24 | 25 | 26 |
| CT值 | 21.88 | 20.85 | 19.25 | 19.27 |
阴性对照的CT值均为未检出。
通过上表数据可知，25号试剂所对应的CT值最低，因此，可确定5×反转录反应液中随机引物的最适添加量为：50微摩尔/升。
实施例7
本实施例主要分析随机引物序列的组成对反转录效果的影响。利用四种序列组成不同的随机引物(引物序列和引物添加量详见表14)配制的5×反转录反应液进行人类RNA的反转录，并通过后续的定量PCR检测来确定5×反转录反应液的最适随机引物序列。
一、人RNA的反转录：
1、在冰上进行如下操作：在200微升的离心管中配制反转录反应体系，加入的组分包括：5×反转录反应液(4微升)、1微克的RNA、去离子水补足至20微升。
其中不同随机引物序列的5×反转录反应液中除随机引物以外的配方相同，具体为：0.2摩尔/升三羟甲基氨基甲烷；50毫摩尔/升硫酸铵；10毫摩尔/升氯化镁；0.2摩尔/升氯化钾；3毫摩尔/升二硫苏糖醇；0.65摩尔/升氯化钙；200毫摩尔/升海藻糖；脱氧核苷三磷酸各2.5毫摩尔/升；12.5微摩尔/升的Oligo-dT15引物；40个单位/微升的鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶；2个单位/微升的RNA酶抑制剂；0.5个单位/微升的DNA酶Ⅰ(DNaseⅠ)；2.7％(体积体积比)甘油；调节反转录反应液的pH值为8.8，并最终用去离子水定容至1毫升。而不同随机引物的序列和添加量如表14所示。
表14：
2、将步骤1的反转录反应体系彻底混匀，简短离心，并将上述反应液于42度下孵育15分钟。此时反转录反应完成。将得到的cDNA置于冰上备用。
3、将上述所得人cDNA进行荧光定量检测。
二、对反转录所得cDNA进行荧光定量检测：
对通过上述四种不同试剂所获得cNDA分别进行荧光定量检测。
以实施例7中四种反转录试剂反转录得到的cDNA为模板，分别用相同的内参基因的引物进行检测，所用的定量PCR试剂为：天根生化科技(北京)有限公司的SuperRealPreMix(SYBR Green)荧光定量检测试剂盒。
其中内参基因(扩增片段大小121bp)引物序列为：
上游引物如SEQ ID NO：1所示，
SEQ ID NO：1 5’-GGTTTCGAAGTGGTGGTCTTG-3’，
下游引物如SEQ ID NO：2所示，
SEQ ID NO：2 5’-CCTGCCCCAATCCCTTTATT-3’。
荧光定量PCR的检测体系为：10微升2×SuperReal PreMix(含SYBR)、0.4微升50×ROX Reference Dye、1微升内参基因的上游引物(5微摩尔/升)、1微升内参基因的下游引物(5微摩尔/升)、2微升cDNA模板、最后用去离子水将PCR反应体系补足至20微升。
阴性对照的PCR反应体系与待测样品的PCR反应体系区别在：将模板cDNA更换为去离子水。
试剂全部加好后，瞬时离心，将所有试剂收集到管底。
cDNA模板为四种不同随机引物序列试剂分别反转录所得cDNA，经过去离子水稀释得到。浓度为：10纳克/微升。
本实施例中荧光定量PCR实验使用ABI 7500Fast定量PCR仪进行。具体的荧光定量PCR的反应程序如下：
预变性条件为：95摄氏度15分钟；PCR循环程序为：95摄氏度10秒，60摄氏度30秒，循环40次；
最后将反应体系冷却至室温(25摄氏度)。
三、检测结果：
四种不同随机引物序列试剂制备的cDNA进行荧光定量PCR检测，具体的CT值(每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数)如表15所示。
表15：
| 5×反转录反应液编号 | 27 | 28 | 29 | 30 |
| CT值 | 21.88 | 19.45 | 20.65 | 20.77 |
阴性对照的CT值均为未检出。
通过上表数据可知，28号试剂所对应的CT值最低，因此，可确定5×反转录反应液中最适的随机引物序列为Random6。
实施例8
利用四种不同反转录促进剂(二硫苏糖醇)添加量的5×反转录反应液进行人类RNA的反转录，并通过后续的定量PCR检测来确定5×反转录反应液的最适反转录促进剂添加量。
一、人RNA的反转录：
1、在冰上进行如下操作：在200微升的离心管中配制反转录反应体系，加入的组分包括：5×反转录反应液(4微升)、1微克的RNA、去离子水补足至20微升。
其中不同反转录促进剂(二硫苏糖醇)添加量的5×反转录反应液中除二硫苏糖醇以外的配方相同，具体为：0.2摩尔/升三羟甲基氨基甲烷；50毫摩尔/升硫酸铵；10毫摩尔/升氯化镁；0.2摩尔/升氯化钾；0.65摩尔/升氯化钙；200毫摩尔/升海藻糖；脱氧核苷三磷酸各2.5毫摩尔/升；12.5微摩尔/升的Oligo-dT15引物；50微摩尔/升的随机引物；40个单位/微升的鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶；2个单位/微升的RNA酶抑制剂；0.5个单位/微升的DNA酶Ⅰ(DNaseⅠ)；2.7％(体积体积比)甘油；调节反转录反应液的pH值为8.8，并最终用去离子水定容至1毫升。而不同反转录促进剂的添加量如表16所示。
表16：
2、将步骤1的反转录反应体系彻底混匀，简短离心，并将上述反应液于42度下孵育15分钟。此时反转录反应完成。将得到的cDNA置于冰上备用。
3、将上述所得人cDNA进行荧光定量检测。
二、对反转录所得cDNA进行荧光定量检测：
对通过上述四种不同试剂所获得cNDA分别进行荧光定量检测。
以实施例8中四种反转录试剂反转录得到的cDNA为模板，分别用相同的内参基因的引物进行检测，所用的定量PCR试剂为：天根生化科技(北京)有限公司的SuperRealPreMix(SYBR Green)荧光定量检测试剂盒。
其中内参基因(扩增片段大小121bp)引物序列为：
上游引物如SEQ ID NO：1所示，
SEQ ID NO：1 5’-GGTTTCGAAGTGGTGGTCTTG-3’，
下游引物如SEQ ID NO：2所示，
SEQ ID NO：2 5’-CCTGCCCCAATCCCTTTATT-3’。
荧光定量PCR的检测体系为：10微升2×SuperReal PreMix(含SYBR)、0.4微升50×ROX Reference Dye、1微升内参基因的上游引物(5微摩尔/升)、1微升内参基因的下游引物(5微摩尔/升)、2微升cDNA模板、最后用去离子水将PCR反应体系补足至20微升。
阴性对照的PCR反应体系与待测样品的PCR反应体系区别在：将模板cDNA更换为去离子水。
试剂全部加好后，瞬时离心，将所有试剂收集到管底。
cDNA模板为四种不同反转录促进剂添加量试剂分别反转录所得cDNA，经过去离子水稀释得到。浓度为：10纳克/微升。
本实施例中荧光定量PCR实验使用ABI 7500Fast定量PCR仪进行。具体的荧光定量PCR的反应程序如下：
预变性条件为：95摄氏度15分钟；PCR循环程序为：95摄氏度10秒，60摄氏度30秒，循环40次；最后将反应体系冷却至室温(25摄氏度)。
三、检测结果：
四种不同反转录促进剂添加量试剂制备的cDNA进行荧光定量PCR检测，具体的CT值(每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数)如表17所示。
表17：
| 5×反转录反应液编号 | 31 | 32 | 33 | 34 |
| CT值 | 20.88 | 19.65 | 19.35 | 19.88 |
阴性对照的CT值为未检测。
通过上表数据可知，33号试剂所对应的CT值最低，因此，可确定5×反转录反应液中添加反转录促进剂是有作用的且最适添加量为：3毫摩尔/升二硫苏糖醇(DTT)。
实施例9
对两种添加与不添加稳定剂(海藻糖/甘油)的5×反转录反应液进行反复冻融30次处理及-20℃冻存6个月处理，并进行人类RNA的反转录，并通过后续的定量PCR检测来验证有无稳定剂对5×反转录反应液稳定性的影响。
一、人RNA的反转录：
1、在冰上进行如下操作：在200微升的离心管中配制反转录反应体系，加入的组分包括：4×反转录反应液(4微升)、1微克的RNA、去离子水补足至20微升。
其中两种是否添加稳定剂的5×反转录反应液中除稳定剂以外的配方相同，具体为：0.2摩尔/升三羟甲基氨基甲烷；50毫摩尔/升硫酸铵；10毫摩尔/升氯化镁；0.2摩尔/升氯化钾；3毫摩尔/升二硫苏糖醇；0.65摩尔/升氯化钙；脱氧核苷三磷酸各2.5毫摩尔/升；12.5微摩尔/升的Oligo-dT15引物；50微摩尔/升的随机引物；40个单位/微升的鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶；2个单位/微升的RNA酶抑制剂；0.5个单位/微升的DNA酶Ⅰ(DNaseⅠ)；调节反转录反应液的pH值为8.8，并最终用去离子水定容至1毫升。而稳定剂的加入与否及加入量如表18所示。
表18：
另外，对两种添加与不添加稳定剂的5×反转录反应液的稳定性检测处理如表19所示。
表19：
2、将步骤1的6种反转录反应体系彻底混匀，简短离心，并将上述反应液于42度下孵育15分钟。此时反转录反应完成。将得到的cDNA置于冰上备用。
3、将上述所得人cDNA进行荧光定量检测。
二、对反转录所得cDNA进行荧光定量检测
对通过上述6种不同试剂所获得cNDA分别进行荧光定量检测。
以实施例9中6种反转录反应液反转录得到的cDNA为模板，分别用相同的内参基因的引物进行检测，所用的定量PCR试剂为：天根生化科技(北京)有限公司的SuperRealPreMix(SYBR Green)荧光定量检测试剂盒。
其中内参基因(扩增片段大小121bp)引物序列为：
上游引物如SEQ ID NO：1所示，
SEQ ID NO：1 5’-GGTTTCGAAGTGGTGGTCTTG-3’，
下游引物如SEQ ID NO：2所示，
SEQ ID NO：2 5’-CCTGCCCCAATCCCTTTATT-3’。
荧光定量PCR的检测体系为：10微升2×SuperReal PreMix(含SYBR)、0.4微升50×ROX Reference Dye、1微升内参基因的上游引物(5微摩尔/升)、1微升内参基因的下游引物(5微摩尔/升)、2微升cDNA模板、最后用去离子水将PCR反应体系补足至20微升。
阴性对照的PCR反应体系与待测样品的PCR反应体系区别在：将模板cDNA更换为去离子水。
试剂全部加好后，瞬时离心，将所有试剂收集到管底。
cDNA模板为6种不同处理试剂分别反转录所得cDNA，经过去离子水稀释得到。浓度为：10纳克/微升。
本实施例中荧光定量PCR实验使用ABI 7500Fast定量PCR仪进行。具体的荧光定量PCR的反应程序如下：
预变性条件为：95摄氏度15分钟；PCR循环程序为：95摄氏度10秒，60摄氏度30秒，循环40次；最后将反应体系冷却至室温(25摄氏度)。
三、检测结果：
6种不同处理试剂制备的cDNA进行荧光定量PCR检测，具体的CT值(每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数)如表20所示。
表20：
阴性对照的CT值为未检测。
通过上表数据可知：35号试剂经稳定性检测处理后，反转录效果与未处理相比下降很大；而36号试剂处理与否其反转录效果基本不变。因此，通过本实施例可知，对于本发明所述5×反转录反应液而言，添加稳定剂是必须的，且稳定剂的最适添加量为：200毫摩尔/升海藻糖和2.7％(体积体积比)的甘油。
实施例10
分别用本发明方法与常规反转录方法进行人RNA的反转录，然后对反转录所得cDNA进行荧光定量检测。
一、人RNA反转录：
1、本发明方法进行人RNA的反转录：
(1)在冰上进行如下操作：在200微升的离心管中配制反转录反应体系，加入的组分包括：5×反转录反应液(4微升)、1微克的RNA、去离子水补足至20微升。
其中5×反转录反应液配方为：0.2摩尔/升三羟甲基氨基甲烷；50毫摩尔/升硫酸铵；10毫摩尔/升氯化镁；0.2摩尔/升氯化钾；3毫摩尔/升二硫苏糖醇；0.65摩尔/升氯化钙；200毫摩尔/升海藻糖；脱氧核苷三磷酸各2.5毫摩尔/升；12.5微摩尔/升的Oligo-dT15引物；50微摩尔/升的随机引物；40个单位/微升的鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶；2个单位/微升的RNA酶抑制剂；0.5个单位/微升的DNA酶Ⅰ(DNaseⅠ)；2.7％(体积体积比)甘油；调节反转录反应液的pH值为8.8，并最终用去离子水定容至1毫升。
(2)将步骤(1)的反转录反应体系彻底混匀，简短离心，并将上述反应液于42度下孵育15分钟。此时反转录反应完成。将得到的cDNA置于冰上备用。
(3)将上述所得人cDNA进行荧光定量检测。
2、常规反转录方法进行人RNA的反转录
本次常规反转录操作应用TIANScript cDNA第一链合成试剂盒进行，具体步骤如下所示：
(1)在冰上进行如下操作：在200微升的离心管中配制如下反转录反应体系，加入的组分包括：1微克的RNA、2微升的Oligo-dT引物(引物浓度为10微摩尔/升)和2微升超纯dNTPs(4种脱氧核苷三磷酸的浓度均为2.5毫摩尔/升)，最后用去离子水补足体积至14.5微升。
(2)将步骤(1)所得反转录反应体系彻底混匀，简短离心，并将上述反应体系放于70摄氏度下孵育5分钟，然后置于冰上至少2分钟。
(3)在步骤(2)反应体系中继续加入如下反转录组分：4微升5×反转录缓冲液、0.5微升RNasin和1微升MMLV反转录酶，用去离子水补足体积至20微升。
(4)将步骤(3)所得混合液彻底混匀，简短离心，并将上述混合液放于42摄氏度中孵育60分钟。
(5)将步骤(4)所得混合液放于95摄氏度下，加热5分钟，终止反应，置于冰上备用。
(6)将步骤(5)所得cDNA进行荧光定量检测。
二、对反转录所得cDNA进行荧光定量检测：
对本发明方法和常规方法所获得cNDA分别进行荧光定量检测。
以实施例10中两种反转录方法得到的cDNA为模板，分别用相同的内参基因的引物进行检测，所用的定量PCR试剂为：天根生化科技(北京)有限公司的SuperReal PreMix(SYBR Green)荧光定量检测试剂盒。
其中内参基因(扩增片段大小121bp)引物序列为：
上游引物如SEQ ID NO：1所示，
SEQ ID NO：1 5’-GGTTTCGAAGTGGTGGTCTTG-3’，
下游引物如SEQ ID NO：2所示，
SEQ ID NO：2 5’-CCTGCCCCAATCCCTTTATT-3’。
荧光定量PCR的检测体系为：10微升2×SuperReal PreMix(含SYBR)、0.4微升50×ROX Reference Dye、1微升内参基因的上游引物(5微摩尔/升)、1微升内参基因的下游引物(5微摩尔/升)、2微升不同浓度的cDNA模板，最后用去离子水将PCR反应体系补足至20微升。
阴性对照的PCR反应体系与待测样品的PCR反应体系区别在：将模板cDNA更换为去离子水。
试剂全部加好后，瞬时离心，将所有试剂收集到管底。
cDNA模板为本发明方法和常规方法分别反转录所得cDNA，经过梯度稀释。两种反转录方法所得的cDNA均选取5个浓度梯度点：10纳克/微升、1纳克/微升、100皮克/微升、10皮克/微升和1皮克/微升。
本实施例中荧光定量PCR实验使用ABI 7500Fast定量PCR仪进行。具体的荧光定量PCR的反应程序如下：
预变性条件为：95摄氏度15分钟；PCR循环程序为：95摄氏度10秒，60摄氏度30秒，循环40次；最后将反应体系冷却至室温(25摄氏度)。
三、检测结果：
(1)本发明方法和常规反转录方法制备的cDNA进行荧光定量PCR检测，具体的CT值(每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数)如下：
本发明方法反转录所得cDNA的各浓度梯度点对应的CT值为：20纳克cDNA的CT值为18.92；2纳克cDNA的CT值为22.13；200皮克cDNA的CT值为25.50；20皮克cDNA的CT值为28.74；2皮克cDNA的CT值为31.99；阴性对照的CT值为未检出。
常规方法反转录所得cDNA的浓度点与CT的关系为：20纳克cDNA的CT值为19.47；2纳克cDNA的CT值为22.85；200皮克cDNA的CT值为26.24；20皮克cDNA的CT值为29.75；2皮克cDNA的CT值为32.91；阴性对照的CT值为未检出。
(2)本发明方法和常规方法反转录的cDNA进行荧光定量PCR检测，扩增曲线如图1和图2所示，其中图1是通过本发明方法以人的RNA为模板进行反转录反应，反转录所获得的cDNA再进行荧光定量的检测图，其中的5条“S”曲线分别代表5个浓度梯度的cDNA的定量扩增曲线；图2是通过常规反转录方法以人的RNA为模板进行反转录反应，反转录所获得的cDNA再进行荧光定量的检测图，其中的5条“S”曲线分别代表5个浓度梯度的cDNA的定量扩增曲线。
由图1和图2可以看出，本发明方法和常规方法反转录制备的cDNA，cDNA的量和质量方面本发明方法的效果要更优一些，用于后续实验，如荧光定量PCR检测，检测效果也要优于常规方法，更为关键的是本发明方法在实验操作方面却简化了很多。
实施例11
分别用本发明方法与分步法去基因组DNA的反转录方法进行人基因组DNA的消化反应，然后对反应产物进行荧光定量检测。
一、人基因组DNA的消化反应：
1、本发明方法进行人基因组DNA的消化反应：
(1)在冰上进行如下操作：在200微升的离心管中配制反转录反应体系，加入的组分包括：5×反转录反应液(4微升)、5个梯度的基因组DNA(分别为：500纳克，200纳克，100纳克，50纳克和10纳克)、去离子水补足至20微升。
其中5×反转录反应液配方为：0.2摩尔/升三羟甲基氨基甲烷；50毫摩尔/升硫酸铵；10毫摩尔/升氯化镁；0.2摩尔/升氯化钾；3毫摩尔/升二硫苏糖醇；0.65摩尔/升氯化钙；200毫摩尔/升海藻糖；脱氧核苷三磷酸各2.5毫摩尔/升；12.5微摩尔/升的Oligo-dT15引物；50微摩尔/升的随机引物；40个单位/微升的鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶；2个单位/微升的RNA酶抑制剂；0.5个单位/微升的DNA酶Ⅰ(DNaseⅠ)；2.7％(体积体积比)甘油；调节反转录反应液的pH值为8.8，并最终用去离子水定容至1毫升。
(2)将步骤(1)的反转录反应体系彻底混匀，简短离心，并将上述反应液于42度下孵育15分钟。此时反转录反应完成。将得到的cDNA置于冰上备用。
(3)将上述所得基因组消化反应产物进行荧光定量检测。
2、分步方法进行人基因组DNA的消化反应
本次分步法操作应用FastKing cDNA第一链合成试剂盒进行，具体步骤如下所示：
(1)在冰上进行如下操作：在200微升的离心管中配制如下反转录反应体系，加入的组分包括：5×g DNA Buffer(4微升)(包含DNase I)、5个梯度的基因组DNA(分别为：500纳克，200纳克，100纳克，50纳克和10纳克)、去离子水补足至10微升。
(2)将步骤(1)所得反转录反应体系彻底混匀，简短离心，并将上述反应体系放于42摄氏度下孵育3分钟，然后置于冰上。
(3)在步骤(2)反应体系中继续加入如下反转录组分：2微升10×King RT Buffer、1微升FastKing RT Enzyme Mix和2微升FQ-RT Primer Mix，用去离子水补足体积至20微升。
(4)将步骤(3)所得混合液彻底混匀，简短离心，并将上述混合液放于42摄氏度中孵育15分钟。
(5)将步骤(4)所得混合液放于95摄氏度下，加热3分钟，终止反应，置于冰上备用。
(6)将步骤(5)所得基因组DNA消化产物进行荧光定量检测。
二、对反转录所得cDNA进行荧光定量检测：
对本发明方法和常规方法所获得cNDA分别进行荧光定量检测。
以实施例5中两种反转录方法得到的cDNA为模板，分别用相同的内参基因的引物进行检测，所用的定量PCR试剂为：天根生化科技(北京)有限公司的SuperReal PreMix(SYBR Green)荧光定量检测试剂盒。
其中内参基因(扩增片段大小121bp)引物序列为：
上游引物如SEQ ID NO：1所示，
SEQ ID NO：1 5’-GGTTTCGAAGTGGTGGTCTTG-3’，
下游引物如SEQ ID NO：2所示，
SEQ ID NO：2 5’-CCTGCCCCAATCCCTTTATT-3’。
荧光定量PCR的检测体系为：10微升2×SuperReal PreMix(含SYBR)、0.4微升50×ROX Reference Dye、1微升内参基因的上游引物(5微摩尔/升)、1微升内参基因的下游引物(5微摩尔/升)、2微升DNA消化后模板、最后用去离子水将PCR反应体系补足至20微升。
阴性对照的PCR反应体系与待测样品的PCR反应体系区别在：将消化产物更换为去离子水。
阳性对照的PCR反应体系与待测样品的PCR反应体系区别在：将消化产物更换为未处理的人基因组DNA，具体加入量为20纳克。
试剂全部加好后，瞬时离心，将所有试剂收集到管底。
DNA消化产物需用去离子水稀释10倍后再作为模板使用。
本实施例中荧光定量PCR实验使用ABI 7500Fast定量PCR仪进行。具体的荧光定量PCR的反应程序如下：
预变性条件为：95摄氏度15分钟；PCR循环程序为：95摄氏度10秒，60摄氏度30秒，循环40次；最后将反应体系冷却至室温(25摄氏度)。
三、检测结果：
具体实验结果如表21所示。
表21：
由表21可以看出，本发明方法和分步法反转录试剂在基因组DNA去除效果方面相当，但关键的是本发明方法在实验操作方面却简化了很多。
实施例12
分别用本发明的方法与常规反转录方法进行人RNA的反转录，然后用反转录所得cDNA进行普通PCR检测。
一、人RNA反转录：
1、本发明方法进行人RNA的反转录：
(1)在冰上进行如下操作：在200微升的离心管中配制反转录反应体系，加入的组分包括：5×反转录反应液、1微克的RNA、去离子水补足至20微升。
其中5×反转录反应液配方为：0.2摩尔/升三羟甲基氨基甲烷；50毫摩尔/升硫酸铵；10毫摩尔/升氯化镁；0.2摩尔/升氯化钾；3毫摩尔/升二硫苏糖醇；0.65摩尔/升氯化钙；200毫摩尔/升海藻糖；脱氧核苷三磷酸各2.5毫摩尔/升；12.5微摩尔/升的Oligo-dT15引物；50微摩尔/升的随机引物；40个单位/微升的鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶；2个单位/微升的RNA酶抑制剂；0.5个单位/微升的DNA酶Ⅰ(DNaseⅠ)；2.7％(体积体积比)甘油；调节反转录反应液的pH值为8.8，并最终用去离子水定容至1毫升。
(2)将步骤(1)所得反转录反应体系彻底混匀，简短离心，并将上述反应体系于42度下孵育15分钟。此时反转录反应完成。将得到的cDNA置于冰上备用。
(3)将上述所得人cDNA进行普通PCR检测。
2、常规反转录方法进行人RNA的反转录
本实施例中常规反转录操作应用TIANScript cDNA第一链合成试剂盒进行，具体步骤如下所示：
(1)在冰上进行如下操作：在200微升的离心管中配制如下体系，加入的组分包括：1微克的RNA、2微升的Oligo-dT引物(引物浓度为10微摩尔/升)和2微升超纯dNTPs(4种脱氧核苷三磷酸的浓度均为2.5毫摩尔/升)，最后用去离子水补足体积至14.5微升。
(2)将步骤(1)所得反应体系彻底混匀，简短离心，并将上述反应体系放于70摄氏度下孵育5分钟，然后置于冰上至少2分钟。
(3)向步骤(2)所得反应混合物中继续加入如下反转录组分：4微升5×反转录缓冲液、0.5微升RNasin和1微升MMLV反转录酶，用去离子水补足体积至20微升。
(4)将步骤(3)所得混合液彻底混匀，简短离心，并将上述混合液放于42摄氏度中孵育60分钟。
(5)将步骤(4)所得混合液放于95摄氏度下，加热5分钟，终止反应，得cDNA，置于冰上备用。
(6)将上述所得cDNA进行普通PCR检测。
二、对反转录所得cDNA进行普通PCR检测：
对本发明方法和常规方法所获得的cNDA分别进行普通PCR检测：
以实施例12中两种反转录方法得到的cDNA为模板，分别用不同长度片段基因的上游引物和下游引物进行检测，用天根生化科技(北京)有限公司的TIANSeq HiFiAmplification Mix进行普通PCR检测：
其中不同长度片段的引物信息为：
引物1(扩增片段大小3000bp)-上游引物如SEQ ID NO：3所示，下游引物如SEQ IDNO：4所示，
SEQ ID NO：3 5’-CAAGCATCTGCGTCGTCTTC-3’,
SEQ ID NO：4 5’-GGGAACACTGCCATTACCCA-3’；
引物2(扩增片段大小4600bp)-上游引物如SEQ ID NO：5所示，下游引物如SEQ IDNO：6所示，
SEQ ID NO：5 5’-CTGGGATCTGCATGAACGGG-3’
SEQ ID NO：6 5’-CGCAGCGATAGGAACCATCT-3’；
引物3(扩增片段大小6700bp)-上游引物如SEQ ID NO：7所示，下游引物如SEQ IDNO：8所示，
SEQ ID NO：7 5’-ACGGGCTTACTAATGACCAC-3’,
SEQ ID NO：8 5’-GGGAACACTGCCATTACCCA-3’。
普通PCR的检测体系为：25微升2×HiFi Amplification Mix；5微升不同长度片段的引物1/引物2/引物3的上游引物(5微摩尔/升)、2.5微升不同长度片段的引物1/引物2/引物3的下游引物(5微摩尔/升)、2微升cDNA模板(浓度为100纳克)、最后用去离子水将PCR反应体系补足至50微升。试剂全部加好后，瞬时离心，将所有试剂收集到管底。
用Biometra PCR仪器进行普通PCR检测的反应程序如下。预变性条件为：94摄氏度2分钟；PCR循环程序为：98摄氏度10秒，60摄氏度30秒，68摄氏度3分钟，循环35次；补充延伸程序为：68摄氏度5分钟；最后将反应体系冷却至室温(25摄氏度)。
三、检测结果：
将本发明的方法和常规方法反转录所得cDNA进行普通PCR检测，PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳图如图3所示。
由图3可以看出，本发明方法和常规方法反转录制备的cDNA，cDNA的量和质量没有显著差异，用于后续实验，如PCR检测，检测效果没有差异。但本发明方法，在实验操作方面却简化了很多。
实施例13
用本发明方法和市场上主流反转录产品分别对多个物种的RNA的进行反转录以及对人基因组DNA进行消化反应，然后对反转录所得cDNA和DNA消化产物进行荧光定量检测。
一、市场上主流反转录产品的选择
选取市场上主流的反转录产品，在这些产品中，有一些应用的是常规方法，同时也有一些应用的是快速方法，具体产品信息及其在实验过程中所涉及操作细节如表22所示：
表22：
二、多个物种RNA的分别反转录：
1、本发明方法进行的反转录：
(1)在冰上进行如下操作：在200微升的离心管中配制反转录反应体系，加入的组分包括：5×反转录反应液(5微升)、1微克特定物种的RNA、去离子水补足至20微升。
其中5×反转录反应液配方为：0.2摩尔/升三羟甲基氨基甲烷；50毫摩尔/升硫酸铵；10毫摩尔/升氯化镁；0.2摩尔/升氯化钾；3毫摩尔/升二硫苏糖醇；0.65摩尔/升氯化钙；200毫摩尔/升海藻糖；脱氧核苷三磷酸各2.5毫摩尔/升；12.5微摩尔/升的Oligo-dT15引物；50微摩尔/升的随机引物；40个单位/微升的鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶；2个单位/微升的RNA酶抑制剂；0.5个单位/微升的DNA酶Ⅰ(DNaseⅠ)；2.7％(体积体积比)甘油；调节反转录反应液的pH值为8.8，并最终用去离子水定容至1毫升。
其中特定物种的RNA分别为：人类RNA，玉米RNA，大肠杆菌RNA和大鼠RNA。
(2)将步骤(1)的每个特定物种RNA的反转录反应体系彻底混匀，简短离心，并将上述反应液于42度下孵育15分钟。此时反转录反应完成。将得到的cDNA置于冰上备用。
(3)将上述所得的多个特定物种的cDNA进行荧光定量检测。
2、其他产品的反转录操作
除本发明产品以外的反转录操作分别严格按照其说明书进行，但是，为了保证与本发明产品具有可比性，本发明产品与其他产品所用的特定物种的RNA模板的量是完全相同的。
反转录结束后，将各个产品所得cDNA进行荧光定量检测。
二、人基因组DNA消化
1、本发明方法
(1)、在冰上进行如下操作：在200微升的离心管中配制反转录反应体系，加入的组分包括：5×反转录反应液(4微升)、5个梯度的基因组DNA(分别为：500纳克，200纳克，100纳克，50纳克和10纳克)、去离子水补足至20微升。
其中5×反转录反应液配方为：0.2摩尔/升三羟甲基氨基甲烷；50毫摩尔/升硫酸铵；10毫摩尔/升氯化镁；0.2摩尔/升氯化钾；3毫摩尔/升二硫苏糖醇；0.65摩尔/升氯化钙；200毫摩尔/升海藻糖；脱氧核苷三磷酸各2.5毫摩尔/升；12.5微摩尔/升的Oligo-dT15引物；50微摩尔/升的随机引物；40个单位/微升的鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶；2个单位/微升的RNA酶抑制剂；0.5个单位/微升的DNA酶Ⅰ(DNaseⅠ)；2.7％(体积体积比)甘油；调节反转录反应液的pH值为8.8，并最终用去离子水定容至1毫升。。
(2)、将步骤1的反应体系彻底混匀，简短离心，并将上述反应液于42度下孵育15分钟。将得到的产物置于冰上备用。
(3)、将上述所得的消化产物进行荧光定量检测。
2、其他产品的基因组DNA消化操作
除本发明产品以外的其他产品的基因组DNA消化反应分别严格按照其说明书进行，但是，为了保证与本发明产品具有可比性，本发明产品与其他产品所用的DNA模板的量是完全相同的。
消化反应结束后，将各个产品所得消化产物进行荧光定量检测。
三、对反转录所得cDNA进行荧光定量检测：
对本发明方法和其他产品所获得cNDA分别进行荧光定量检测。
以实施例13中5种反转录方法/产品得到的cDNA为模板，分别用5种不同基因的引物进行检测，所用的定量PCR试剂为：天根生化科技(北京)有限公司的SuperReal PreMix(SYBR Green)荧光定量检测试剂盒。
其中5种基因引物序列如下：
引物1(扩增片段大小108bp，针对物种为人类)-上游引物如SEQ ID NO：9所示，下游引物如SEQ ID NO：10所示，
SEQ ID NO：9 5’-GGCACCCAGCACAATGAAG-3’,
SEQ ID NO：10 5’-GCCGATCCACACGGAGTACT-3’；
引物2(扩增片段大小124bp，针对物种为人类)-上游引物如SEQ ID NO：11所示，下游引物如SEQ ID NO：12所示，
SEQ ID NO：11 5’-CGGGCTGGTGTTTCGGGAGTGTC-3’
SEQ ID NO：12 5’-GCCCGTTGCTGGACTGGATTATC-3’；
引物3(扩增片段大小137bp，针对物种为玉米)-上游引物如SEQ ID NO：13所示，下游引物如SEQ ID NO：14所示，
SEQ ID NO：13 5’-ATGAAGCCATGTACAACTCCA-3’,
SEQ ID NO：14 5’-AAGTGCAGTAATCTCCTTGCTC-3’。
引物4(扩增片段大小119bp，针对物种为大肠杆菌)-上游引物如SEQ ID NO：15所示，下游引物如SEQ ID NO：16所示，
SEQ ID NO：15 5’-CTAACACATGCAAGTCGAACGGTA-3’,
SEQ ID NO：16 5’-ACCGTTTCCAGTAGTTATCCCC-3’；
引物5(扩增片段大小114bp，针对物种为大鼠)-上游引物如SEQ ID NO：17所示，下游引物如SEQ ID NO：18所示，
SEQ ID NO：17 5’-AGCCATGTACGTAGCCATCCA-3’
SEQ ID NO：18 5’-TCTCCGGAGTCCATCACAATG-3’；
荧光定量PCR的检测体系为：10微升2×SuperReal PreMix(含SYBR)、0.4微升50×ROX Reference Dye、1微升检测基因的上游引物(5微摩尔/升)、1微升检测基因的下游引物(5微摩尔/升)、2微升特定物种的cDNA模板、最后用去离子水将PCR反应体系补足至20微升。
阴性对照的PCR反应体系与待测样品的PCR反应体系区别在：将模板cDNA更换为去离子水。
试剂全部加好后，瞬时离心，将所有试剂收集到管底。
cDNA模板为本发明方法和市场上主流反转录产品反转录所得的特定物种的cDNA，经过稀释，最终浓度为：10纳克/微升。
本实施例中荧光定量PCR实验使用ABI 7500Fast定量PCR仪进行。具体的荧光定量PCR的反应程序如下：
预变性条件为：95摄氏度15分钟；PCR循环程序为：95摄氏度10秒，60摄氏度30秒，循环40次；最后将反应体系冷却至室温(25摄氏度)。
四、对DNA消化产物进行荧光定量检测：
对本发明方法和其他产品的DNA消化产物分别进行荧光定量检测。
以实施例13中5种方法/产品催化的DNA消化产物为模板，分别用相同的内参基因的引物进行检测，所用的定量PCR试剂为：天根生化科技(北京)有限公司的SuperRealPreMix(SYBR Green)荧光定量检测试剂盒。
其中内参基因(扩增片段大小121bp)引物序列为：
上游引物如SEQ ID NO：1所示，
SEQ ID NO：1 5’-GGTTTCGAAGTGGTGGTCTTG-3’，
下游引物如SEQ ID NO：2所示，
SEQ ID NO：2 5’-CCTGCCCCAATCCCTTTATT-3’。
荧光定量PCR的检测体系为：10微升2×SuperReal PreMix(含SYBR)、0.4微升50×ROX Reference Dye、1微升内参基因的上游引物(5微摩尔/升)、1微升内参基因的下游引物(5微摩尔/升)、2微升cDNA模板或者DNA消化产物、最后用去离子水将PCR反应体系补足至20微升。
阴性对照的PCR反应体系与待测样品的PCR反应体系区别在：将模板更换为去离子水。
阳性对照的PCR反应体系与待测样品的PCR反应体系区别在：将模板更换为未处理的基因组DNA，加入量为20纳克。
试剂全部加好后，瞬时离心，将所有试剂收集到管底。
DNA消化产物需要先稀释10倍后再作为模板使用。
本实施例中荧光定量PCR实验使用ABI 7500Fast定量PCR仪进行。具体的荧光定量PCR的反应程序如下：
预变性条件为：95摄氏度15分钟；PCR循环程序为：95摄氏度10秒，60摄氏度30秒，循环40次；最后将反应体系冷却至室温(25摄氏度)。
五、检测结果：
针对本发明方法和市场上主流反转录产品反转录所得的特定物种的cDNA进行荧光定量PCR检测，具体的CT值(每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数)对比如表23所示。
表23：
针对本发明方法和市场上主流反转录产品消化基因组DNA进行荧光定量PCR检测，具体的CT值(每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数)对比如表24所示。
表24：
通过表23和表24的结果可以得到如下结论：
1、本发明方法可以适用于常用的科研物种RNA反转录实验，具有RNA普适性；
2、在RNA反转录效果方面和基因组去除效果方面，与其他市场上主流反转录产品相比，本发明方法在实验效果方面相当甚至更优；
3、在实验操作方面，本发明方法操作简洁，优于所有对比产品。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 天根生化科技（北京）有限公司
<120> 反转录反应液及制备cDNA的方法
<130> PIDC3190692
<160> 18
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 上游引物序列
<400> 1
ggtttcgaag tggtggtctt g 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 下游引物序列
<400> 2
cctgccccaa tccctttatt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物1（扩增片段大小3000 bp）上游引物
<400> 3
caagcatctg cgtcgtcttc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物1（扩增片段大小3000 bp）下游引物
<400> 4
gggaacactg ccattaccca 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物2（扩增片段大小4600 bp）上游引物
<400> 5
ctgggatctg catgaacggg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物2（扩增片段大小4600 bp）下游引物
<400> 6
cgcagcgata ggaaccatct 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物3（扩增片段大小6700 bp）上游引物
<400> 7
acgggcttac taatgaccac 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物3（扩增片段大小6700 bp）下游引物
<400> 8
gggaacactg ccattaccca 20
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物1（扩增片段大小108 bp，针对物种为人类）-上游引物
<400> 9
ggcacccagc acaatgaag 19
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物1（扩增片段大小108 bp，针对物种为人类）-下游引物
<400> 10
gccgatccac acggagtact 20
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物2（扩增片段大小124 bp，针对物种为人类）-上游引物
<400> 11
cgggctggtg tttcgggagt gtc 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物2（扩增片段大小124 bp，针对物种为人类）-下游引物
<400> 12
gcccgttgct ggactggatt atc 23
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物3（扩增片段大小137 bp，针对物种为玉米）-上游引物
<400> 13
atgaagccat gtacaactcc a 21
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物3（扩增片段大小137 bp，针对物种为玉米）-下游引物
<400> 14
aagtgcagta atctccttgc tc 22
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物4（扩增片段大小119 bp，针对物种为大肠杆菌）-上游引物
<400> 15
ctaacacatg caagtcgaac ggta 24
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物4（扩增片段大小119 bp，针对物种为大肠杆菌）-下游引物
<400> 16
accgtttcca gtagttatcc cc 22
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物5（扩增片段大小114 bp，针对物种为大鼠）-上游引物
<400> 17
agccatgtac gtagccatcc a 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物5（扩增片段大小114 bp，针对物种为大鼠）-下游引物
<400> 18
tctccggagt ccatcacaat g 21
Claims (11)
1.一种反转录反应液，其特征在于，所述反转录反应液包括：
0.1～0.3摩尔/升三羟甲基氨基甲烷；
40～60毫摩尔/升硫酸铵；
8～12毫摩尔/升氯化镁；
0.1～0.3摩尔/升氯化钾；
2～4毫摩尔/升二硫苏糖醇；
0.5～0.8毫摩尔/升氯化钙；
100～300毫摩尔/升海藻糖；
脱氧核苷三磷酸各1～3毫摩尔/升；
5～20微摩尔/升的Oligo-dT15引物；
30～60微摩尔/升的随机引物；
25～75个单位/微升的鼠白血病病毒反转录酶；
1.5～3个单位/微升的RNA酶抑制剂；
0.2～1.0个单位/微升的DNA酶Ⅰ；
1.5％～3％甘油；以及
余量的水。
2.根据权利要求1所述的反转录反应液，其特征在于，所述反转录反应液的pH为8.0～9.0，优选的，所述pH为8.8。
3.根据权利要求1所述的反转录反应液，其特征在于，所述反转录反应液中的DNaseⅠ的浓度为0.5个单位/微升。
4.根据权利要求1所述的反转录反应液，其特征在于，所述反转录反应液中的Oligo-dT15引物的浓度为12.5微摩尔/升；
优选地，所述反转录反应液中的随机引物的浓度为50微摩尔/升；
优选地，所述随机引物的序列为NNNNNN。
5.根据权利要求1所述的反转录反应液，其特征在于，所述氯化钾的用量是0.2摩尔/升，所述硫酸铵的用量是50毫摩尔/升，所述二硫苏糖醇的用量是3毫摩尔/升，所述氯化钙的用量是0.65毫摩尔/升，所述海藻糖的用量是200毫摩尔/升；所述甘油的用量是2.7％。
6.权利要求1～5任一项所述的反转录反应液在反转录处理中的用途。
7.一种制备cDNA的方法，其特征在于，包括：
利用权利要求1～5任一项所述的反转录反应液对RNA样本进行反转录处理，以便获得所述cDNA。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述反转录处理是在42摄氏度的条件下进行15分钟。
9.根据权利要求8所述的反转录方法，其特征在于，进一步包括：
(1)将所述RNA样品、水和所述反转录反应液混合，以便获得反应混合物，其中，基于10纳克～2微克的所述RNA样本，所述反转录反应液的用量为4微升，所述水的用量用于将所述反应混合物的体积调剂至20微升；以及
(2)将步骤(1)所得反应混合液进行所述反转录处理，以便进行快速反转录并获得cDNA。
10.根据权利要求9所述的反转录方法，其特征在于，所述水是去离子水。
11.根据权利要求10所述的反转录方法，其特征在于，所述混合是在4摄氏度下进行的。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20201002 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |