CN105713899B - 反转录反应液及制备cDNA的方法 - Google Patents

反转录反应液及制备cDNA的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105713899B
CN105713899B CN201610176594.0A CN201610176594A CN105713899B CN 105713899 B CN105713899 B CN 105713899B CN 201610176594 A CN201610176594 A CN 201610176594A CN 105713899 B CN105713899 B CN 105713899B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cdna
reverse transcription
reaction liquid
transcription reaction
inverse
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610176594.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105713899A (zh
Inventor
张双宇
刘玉方
李晓晨
孙克非
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tiangen Biotech Beijing Co Ltd
Original Assignee
Tiangen Biotech Beijing Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tiangen Biotech Beijing Co Ltd filed Critical Tiangen Biotech Beijing Co Ltd
Priority to CN201610176594.0A priority Critical patent/CN105713899B/zh
Publication of CN105713899A publication Critical patent/CN105713899A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105713899B publication Critical patent/CN105713899B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids

Landscapes

  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提出了一种反转录反应液及其一种制备cDNA的方法。本发明所提出的反转录反应液和利用该反转录反应液制备cDNA的方法，具有操作简便、反应快速、反应效果好、可重复性高的优点。

Description

反转录反应液及制备cDNA的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的，本发明涉及一种反转录反应液及一种制备cDNA的方法。
背景技术
基因表达与调控的分析与检测是现代分子生物学和医学研究领域中的重要课题。近年来随着基因表达调控分析检测技术的发展，相关的检测技术也越来越多，比如：原位杂交、Northern杂交、RNA酶保护实验、基因芯片分析、实时定量PCR分析以及反转录PCR分析(RT-PCR)等。其中的RT-PCR分析由于操作简单，检测mRNA水平灵敏，被认为是检测基因表达的主要手段之一。RT-PCR是一种将反转录(Reverse Transcription；RT)反应和PCR(Polymerase Chain Reaction)反应组合在一起的检测技术。其中的RT(反转录)反应是RT-PCR技术的关键，它是以mRNA为模板，在反转录酶的作用下合成与模板mRNA互补的DNA即cDNA的过程。
cDNA的合成和克隆技术已经成为当今分子生物学研究的重要手段。合成cDNA第一链的方法离不开依赖RNA的DNA聚合酶(反转录酶)的作用。目前非常常用且已经商品化的反转录酶有禽类成髓细胞病毒(AMV)反转录酶和鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶这两种。通常情况下，RT反应过程由3个步骤组成：首先通过高温将RNA模板的二级结构打开；其次通过反转录酶催化反转录反应；最后通过高温对反转录酶进行灭活，以保证后续PCR过程的顺利进行。
然而，如何进一步提高cDNA的合成效率仍有待进一步开发。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
反转录常规的操作流程需要3个不同的反应温度，且反应体系配制过程复杂，容易出错，另外，整个操作过程需要近2个小时的操作和反应时间，耗时费力。所以，常规的反转录反应，不但会给实验操作者带来不便，而且越来越不能满足基因分析的高速、高通量的需求。
目前一些商品化试剂盒中不乏反应快速和操作简便的产品，但是反应效果一般，重复性不好，很难得到推广。
基于上述问题，在本发明中，发明人提出了一种操作简便，反应快速的反转录反应液，以此反转录反应液对RNA样品进行反转录处理所需时间仅为15分钟，反转录反应效果佳，重复性好。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种反转录反应液。根据本发明的实施例，所述反转录反应液包括：0.1～0.3摩尔/升三羟甲基氨基甲烷；30～50毫摩尔/升硫酸铵；6～10毫摩尔/升氯化镁；0.2～0.4摩尔/升氯化钠；2～4毫摩尔/升二硫苏糖醇；100～300毫摩尔/升海藻糖；0.001％～0.005％(质量体积比)明胶；1～3毫摩尔/升的乙二醇双四乙酸；脱氧核苷三磷酸各1～3毫摩尔/升；5～20微摩尔/升的Oligo-dT15引物；10～30微摩尔/升的随机引物；25～75个单位/微升的鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶；1.5～2.1个单位/微升的RNA酶抑制剂；0.5％～1％(体积比)甘油；以及余量的水。根据本发明的实施例，利用本发明所提出的反转录反应液进行反转录，反转录反应操作简便、反应快速、反应效果好、可重复性高。
根据本发明的实施例，上述反转录反应液还可以具有下列附加技术特征之一：
根据本发明的实施例，所述反转录反应液的pH为8.0～8.8。pH为8.0～8.8时，MMLV反转录酶利用RNA模板合成cDNA时活性高、效率高。根据本发明的实施例，优选反转录反应液的pH为8.3，最大限度的发挥了MMLV反转录酶利用RNA模板合成cDNA的活性，因此，利用本发明实施例的反转录反应液进行反转录，反转录反应速度进一步提高、反应效果和可重复性进一步提高。
根据本发明的实施例，所述氯化钠的用量是0.3摩尔/升，所述硫酸铵的用量是40毫摩尔/升，所述二硫苏糖醇的用量是3毫摩尔/升，所述乙二醇双四乙酸的用量是1.6毫摩尔/升，所述明胶的用量是0.002％(质量体积比)，所述甘油的用量是1％(体积比)。在上述氯化钠、硫酸铵、二硫苏糖醇、乙二醇双四乙酸、明胶和甘油的用量下，利用本发明实施例的反转录反应液进行反转录，反转录反应速度、反应效果和可重复性的到更进一步显著提高。
在本发明的第二方面，本发明提出了前面所述的反转录反应液在RNA样本的反转录处理中的用途。根据本发明的实施例，利用本发明所提出的反转录反应液进行反转录，反转录反应操作简便、反应快速、反应效果好、可重复性高。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种制备cDNA的方法。根据本发明的实施例，包括：利用前面所述的反转录反应液对RNA样本进行反转录处理，以便获得所述cDNA。根据本发明的实施例，本发明提出的制备cDNA的方法具有和本发明提出的反转录反应液相同的效果和优点，即本发明提出的反转录反应快速、效果好、可重复性高。
根据本发明的实施例，上述制备cDNA的方法还可以具有下列附加技术特征之一：
根据本发明的实施例，所述反转录处理是在42摄氏度的条件下进行15分钟。常规反转录处理所需时间是60～65分钟，本发明所提出的制备cDNA的方法是15分钟，反应快速。
根据本发明的实施例，所述反转录处理进一步包括：(1)将所述RNA样品、水和所述反转录反应液混合，以便获得反应混合物，其中，基于50纳克～2微克的所述RNA样本，所述反转录反应液的用量为5微升，所述水的用量用于将所述反应混合物的体积调剂至20微升；以及(2)将步骤(1)所得反应混合液进行所述反转录处理，以便获得所述cDNA。根据本发明的实施例，本发明所提出的制备cDNA的方法具有反应快速、反应效果好、可重复性高的特点。
根据本发明的实施例，所述水是去离子水。去离子水可防止RNase对RNA的降解、防止水中离子对反应体系的干扰以及避免非特异性产物的生成。因此，反转录处理过程中使用去离子水进一步提高了本发明提出的制备cDNA方法的稳定性和可重复性。
根据本发明的实施例，所述混合是在4摄氏度下进行的。在4摄氏度下进行混合处理，保证了RNA样品的稳定和反应体系中反转录酶的稳定。因此，混合处理在4摄氏度下进行保证了本发明所提出的制备cDNA的方法的稳定性和可靠性进一步提高。
附图说明
图1是根据本发明实施例1的通过本发明提出的制备cDNA的方法制备的cDNA进行荧光定量PCR的检测图；
图2是根据本发明实施例1的通过常规反转录方法制备的cDNA进行荧光定量PCR的检测图；以及
图3是根据本发明实施例2的通过本发明提出的制备cDNA的方法和常规反转录方法制备的cDNA分别进行PCR检测，然后将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳的电泳结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
反转录常规的操作流程需要3个不同的反应温度，且反应体系配制过程复杂，整个操作过程需要近2个小时的操作和反应时间，耗时费力；并且目前一些商品化试剂盒反应效果一般，重复性不好。
基于上述问题，在本发明中，发明人提出了一种操作简便，反应快速的反转录反应液，以此反转录反应液对RNA样品进行反转录处理所需时间仅为15分钟，反转录反应效果佳，重复性好。
反转录反应液
在本发明的第一方面，本发明提出了一种反转录反应液。根据本发明的实施例，所述反转录反应液包括：0.1～0.3摩尔/升三羟甲基氨基甲烷；30～50毫摩尔/升硫酸铵；6～10毫摩尔/升氯化镁；0.2～0.4摩尔/升氯化钠；2～4毫摩尔/升二硫苏糖醇；100～300毫摩尔/升海藻糖；0.001％～0.005％(质量体积比)明胶；1～3毫摩尔/升的乙二醇双四乙酸；脱氧核苷三磷酸各1～3毫摩尔/升；5～20微摩尔/升的Oligo-dT15引物；10～30微摩尔/升的随机引物；25～75个单位/微升的鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶；1.5～2.1个单位/微升的RNA酶抑制剂；0.5％～1％(体积比)甘油；以及余量的水。
发明人发现，反转录反应液中加入100～300毫摩尔/升海藻糖、0.5％～1％(体积比)甘油和0.001％～0.005％(质量体积比)明胶，可以很好地保护反转录酶、RNase抑制剂和超纯dNTPs的作用，使得反转录反应液在-20℃条件下冻存6个月，且反复冻融30次的情况下依然具有高活性。同时，发明人惊奇地发现，反转录反应液中加入30～50毫摩尔/升硫酸铵和0.2～0.4摩尔/升氯化钠，铵根离子和钠离子的配比，保证了反转录引物与模板RNA的特异且快速的结合。反转录反应液中加入2～4毫摩尔/升二硫苏糖醇(DTT)，起到了增加反转录酶反应速率的作用。最后，发明人惊奇地发现，反转录反应液中加入1～3毫摩尔/升的乙二醇双四乙酸(EGTA)，则起到了对反应液中镁离子进行自动调节的作用，使得反应液中镁离子的浓度可以在反转录的不同反应阶段时刻保持在最优水平，以促进反转录反应的快速进行。
根据本发明的实施例，利用本发明所提出的反转录反应液进行反转录，反转录反应操作简便、反应快速、反应效果好、可重复性高。
根据本发明的实施例，所述反转录反应液的pH为8.0～8.8。pH为8.0～8.8时MMLV反转录酶利用RNA模板合成cDNA时活性高、效率高。根据本发明的实施例，本发明所提出的反转录反应液的pH为8.3时，最大限度的发挥了MMLV反转录酶利用RNA模板合成cDNA的活性，因此，利用本发明所提出的反转录反应液进行反转录，反转录反应快速、反应效果好、可重复性高。
根据本发明的具体实施例，氯化钠的用量为0.3摩尔/升，硫酸铵的用量为40毫摩尔/升，二硫苏糖醇的用量为3毫摩尔/升，乙二醇双四乙酸的用量为1.6毫摩尔/升，明胶的用量为0.002％(质量体积比)，甘油的用量为1％(体积比)。在上述氯化钠、硫酸铵、二硫苏糖醇、乙二醇双四乙酸、明胶和甘油的用量下，利用本发明实施例的反转录反应液进行反转录，反转录反应速度、反应效果和可重复性得到更进一步显著提高。
制备cDNA的方法
在本发明的另一方面，本发明提出了一种制备cDNA的方法。根据本发明的实施例，包括：利用前面所述的反转录反应液对RNA样本进行反转录处理，以便获得所述cDNA。根据本发明的实施例，所述反转录处理是在42摄氏度的条件下进行15分钟。本发明所提出的制备cDNA的方法化三步反应为一步反应，将近两个小时的反应时间缩短为15分钟。此方法与常规方法相比，不但省去了起初的RNA模板的预变性过程和组后的反转录酶变性过程，而且节省了至少70％的反转录时间。大大节省了实验操作者的操作时间。根据本发明的实施例，本发明提出的制备cDNA的方法具有反转录反应快速、效果好、可重复性高的特点。
根据本发明的实施例，所述反转录处理进一步包括：(1)将所述RNA样品、水和所述反转录反应液混合，以便获得反应混合物，其中，基于50纳克～2微克的所述RNA样本，所述反转录反应液的用量为5微升，所述水的用量用于将所述反应混合物的体积调剂至20微升；以及(2)将步骤(1)所得反应混合液进行所述反转录处理，以便获得所述cDNA。本发明提出的一种制备cDNA的方法中，简化7种组分为3种组分，即用4×反转录反应液代替了常规操作方法中的如下6种成分：分别为水、反转录缓冲液、反转录引物、反转录酶、超纯dNTPs和RNase抑制剂，实验者在进行反转录操作过程中无需分步单独添加上述6种成分和RNA，而是只需要加入水、4×反转录反应液和适量RNA即可。该方法不但大大节约了实验人员的操作时间，而且避免了多次分步操作所导致的样品间交叉污染的可能性，使得反转录结果更加准确可靠，极大的方便了规模化操作的科研人员。因此，本发明所提出的制备cDNA的方法具有操作简便、反应快速的特点。
根据本发明的实施例，上述水是去离子水。去离子水可避免水中RNase对RNA的降解、避免水中离子对反应体系的干扰以及避免非特异性产物的生成。因此，反转录处理过程中使用去离子水进一步提高了本发明提出的制备cDNA方法的稳定性和可重复性。
根据本发明的实施例，所述混合是在4摄氏度下进行的。在4摄氏度下进行混合处理，保证了RNA样品的稳定和反应体系中反转录酶的稳定。因此，混合处理在4摄氏度下进行保证了本发明所提出的制备cDNA的方法的稳定性和可靠性进一步提高。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过采购获得的常规产品。
在本发明的实施例中，所用的TIANScript cDNA第一链合成试剂盒，SuperRealPreMix(SYBR Green)荧光定量检测试剂盒和Fast HiFidelity PCR Kit普通PCR检测试剂盒均由天根生化科技(北京)有限公司提供。所用引物探针由美国英俊公司合成。
实施例1
利用三种不同pH值的4×反转录反应液进行人类RNA的反转录，并通过后续的定量PCR检测来确定4×反转录反应液的最适pH值。
一、人RNA的反转录：
1、pH8.0反转录反应液进行人RNA的反转录：
(1)在冰上进行如下操作：在200微升的离心管中配制反转录反应体系，加入的组分包括：4×反转录反应液-1(5微升)、1微克的RNA、去离子水补足至20微升。
其中4×反转录反应液-1配方为：0.2摩尔/升三羟甲基氨基甲烷(Tris)、40毫摩尔/升硫酸铵【(NH4)2SO4】、8毫摩尔/升氯化镁(MgCl2)、0.3摩尔/升氯化钠(NaCl)、3毫摩尔/升二硫苏糖醇(DTT)、100毫摩尔/升海藻糖、0.002％明胶、1.6毫摩尔/升的乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)、4种超纯脱氧核苷三磷酸(dNTPs)各2毫摩尔/升、10微摩尔/升的Oligo-dT15引物、20微摩尔/升的Random随机引物、32个单位/微升的毫摩尔/升LV反转录酶、1.6个单位/微升的RNA酶抑制剂(RNasin)、1％甘油、调节反转录反应液的pH值为8.0，并最终用去离子水定容至1毫升。
(2)将步骤(1)的反转录反应体系彻底混匀，简短离心，并将上述反应液于42度下孵育15分钟。此时反转录反应完成。将得到的cDNA置于冰上备用。
(3)将上述所得人cDNA进行荧光定量检测。
2、pH8.3反转录反应液进行人RNA的反转录：
(1)在冰上进行如下操作：在200微升的离心管中配制反转录反应体系，加入的组分包括：4×反转录反应液-2(5微升)、1微克的RNA、去离子水补足至20微升。
其中4×反转录反应液-2配方为：0.2摩尔/升三羟甲基氨基甲烷(Tris)、40毫摩尔/升硫酸铵【(NH4)2SO4】、8毫摩尔/升氯化镁(MgCl2)、0.3摩尔/升氯化钠(NaCl)、3毫摩尔/升二硫苏糖醇(DTT)、100毫摩尔/升海藻糖、0.002％明胶、1.6毫摩尔/升的乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)、4种超纯脱氧核苷三磷酸(dNTPs)各2毫摩尔/升、10微摩尔/升的Oligo-dT15引物、20微摩尔/升的Random随机引物、32个单位/微升的毫摩尔/升LV反转录酶、1.6个单位/微升的RNA酶抑制剂(RNasin)、1％甘油、调节反转录反应液的pH值为8.3，并最终用去离子水定容至1毫升。
(2)将步骤(1)的反转录反应体系彻底混匀，简短离心，并将上述反应液于42度下孵育15分钟。此时反转录反应完成。将得到的cDNA置于冰上备用。
(3)将上述所得人cDNA进行荧光定量检测。
3、pH8.8反转录反应液进行人RNA的反转录：
(1)在冰上进行如下操作：在200微升的离心管中配制反转录反应体系，加入的组分包括：4×反转录反应液-3(5微升)、1微克的RNA、去离子水补足至20微升。
其中4×反转录反应液-3配方为：0.2摩尔/升三羟甲基氨基甲烷(Tris)、40毫摩尔/升硫酸铵【(NH4)2SO4】、8毫摩尔/升氯化镁(MgCl2)、0.3摩尔/升氯化钠(NaCl)、3毫摩尔/升二硫苏糖醇(DTT)、100毫摩尔/升海藻糖、0.002％明胶、1.6毫摩尔/升的乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)、4种超纯脱氧核苷三磷酸(dNTPs)各2毫摩尔/升、10微摩尔/升的Oligo-dT15引物、20微摩尔/升的Random随机引物、32个单位/微升的毫摩尔/升LV反转录酶、1.6个单位/微升的RNA酶抑制剂(RNasin)、1％甘油、调节反转录反应液的pH值为8.8，并最终用去离子水定容至1毫升。
(2)将步骤(1)的反转录反应体系彻底混匀，简短离心，并将上述反应液于42度下孵育15分钟。此时反转录反应完成。将得到的cDNA置于冰上备用。
(3)将上述所得人cDNA进行荧光定量检测。
二、对反转录所得cDNA进行荧光定量检测：
对通过上述三种pH反转录反应液所获得cNDA分别进行荧光定量检测。
以实施例1中三种反转录液反转录得到的cDNA为模板，分别用相同的内参基因的引物进行检测，所用的定量PCR试剂为：天根生化科技(北京)有限公司的SuperReal PreMix(SYBR Green)荧光定量检测试剂盒。
其中内参基因(扩增片段大小121bp)引物序列为：
上游引物如SEQ ID NO：1所示，
SEQ ID NO：1 5’-GGTTTCGAAGTGGTGGTCTTG-3’，
下游引物如SEQ ID NO：2所示，
SEQ ID NO：2 5’-CCTGCCCCAATCCCTTTATT-3’。
荧光定量PCR的检测体系为：10微升2×SuperReal PreMix(含SYBR)、0.4微升50×ROX Reference Dye、1微升内参基因的上游引物(5微摩尔/升)、1微升内参基因的下游引物(5微摩尔/升)、2微升cDNA模板、最后用去离子水将PCR反应体系补足至20微升。
阴性对照的PCR反应体系与待测样品的PCR反应体系区别在：将模板cDNA更换为去离子水。
试剂全部加好后，瞬时离心，将所有试剂收集到管底。
cDNA模板为三种pH值反转录反应液分别反转录所得cDNA，经过去离子水稀释得到。浓度为：10纳克/微升。
本实施例中荧光定量PCR实验使用ABI 7500Fast定量PCR仪进行。具体的荧光定量PCR的反应程序如下：
预变性条件为：95摄氏度15分钟；PCR循环程序为：95摄氏度10秒，60摄氏度30秒，循环40次；最后将反应体系冷却至室温(25摄氏度)。
三、检测结果：
三种pH值试剂制备的cDNA进行荧光定量PCR检测，具体的CT值(每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数)如表1所示：
表1
反转录反应液对应pH值 8.0 8.3 8.8
CT值 17.52 16.88 18.01
阴性对照的CT值为36.87。
通过上表数据可知，pH8.3的试剂所对应的CT值最低，因此，可确定4×反转录反应液的最适pH值为8.3。
实施例2
利用三种不同铵、钠离子配比的4×反转录反应液进行人类RNA的反转录，并通过后续的定量PCR检测来确定4×反转录反应液的最适铵、钠离子浓度。
一、人RNA的反转录：
1、在冰上进行如下操作：在200微升的离心管中配制反转录反应体系，加入的组分包括：4×反转录反应液(5微升)、1微克的RNA、去离子水补足至20微升。
其中不同铵、钠离子配比的4×反转录反应液中除氯化钠和硫酸铵以外的配方相同，具体为：0.2摩尔/升三羟甲基氨基甲烷(Tris)、8毫摩尔/升氯化镁(MgCl2)、3毫摩尔/升二硫苏糖醇(DTT)、100毫摩尔/升海藻糖、0.002％明胶、1.6毫摩尔/升的乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)、4种超纯脱氧核苷三磷酸(dNTPs)各2毫摩尔/升、10微摩尔/升的Oligo-dT15引物、20微摩尔/升的Random随机引物、32个单位/微升的毫摩尔/升LV反转录酶、1.6个单位/微升的RNA酶抑制剂(RNasin)、1％甘油、调节反转录反应液的pH值为8.3，并最终用去离子水定容至1毫升。而不同铵、钠配比如表2所示：
表2
2、将步骤1的反转录反应体系彻底混匀，简短离心，并将上述反应液于42度下孵育15分钟。此时反转录反应完成。将得到的cDNA置于冰上备用。
3、将上述所得人cDNA进行荧光定量检测。
二、对反转录所得cDNA进行荧光定量检测：
对通过上述三种不同试剂所获得cNDA分别进行荧光定量检测。
以实施例2中三种反转录试剂反转录得到的cDNA为模板，分别用相同的内参基因的引物进行检测，所用的定量PCR试剂为：天根生化科技(北京)有限公司的SuperRealPreMix(SYBR Green)荧光定量检测试剂盒。
其中内参基因(扩增片段大小121bp)引物序列为：
上游引物如SEQ ID NO：1所示，
SEQ ID NO：1 5’-GGTTTCGAAGTGGTGGTCTTG-3’，
下游引物如SEQ ID NO：2所示，
SEQ ID NO：2 5’-CCTGCCCCAATCCCTTTATT-3’。
荧光定量PCR的检测体系为：10微升2×SuperReal PreMix(含SYBR)、0.4微升50×ROX Reference Dye、1微升内参基因的上游引物(5微摩尔/升)、1微升内参基因的下游引物(5微摩尔/升)、2微升cDNA模板、最后用去离子水将PCR反应体系补足至20微升。
阴性对照的PCR反应体系与待测样品的PCR反应体系区别在：将模板cDNA更换为去离子水。
试剂全部加好后，瞬时离心，将所有试剂收集到管底。
cDNA模板为三种不同铵钠离子配伍试剂分别反转录所得cDNA，经过去离子水稀释得到。浓度为：10纳克/微升。
本实施例中荧光定量PCR实验使用ABI 7500Fast定量PCR仪进行。具体的荧光定量PCR的反应程序如下：
预变性条件为：95摄氏度15分钟；PCR循环程序为：95摄氏度10秒，60摄氏度30秒，循环40次；最后将反应体系冷却至室温(25摄氏度)。
三、检测结果：
三种不同铵、钠离子配方的反转录反应液制备的cDNA进行荧光定量PCR检测，具体的CT值(每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数)如表3所示：
表3
4×反转录反应液编号 4 5 6
CT值 18.47 16.90 18.23
阴性对照的CT值为37.96。
通过上表数据可知，5号试剂所对应的CT值最低，因此，可确定4×反转录反应液的最适铵、钠离子配方为：40毫摩尔/升硫酸铵【(NH4)2SO4】和0.3摩尔/升氯化钠(NaCl)。
实施例3
利用四种不同反转录促进剂(DTT/EGTA)添加量的4×反转录反应液进行人类RNA的反转录，并通过后续的定量PCR检测来确定4×反转录反应液的最适反转录促进剂添加量。
一、人RNA的反转录：
1、在冰上进行如下操作：在200微升的离心管中配制反转录反应体系，加入的组分包括：4×反转录反应液(5微升)、1微克的RNA、去离子水补足至20微升。
其中不同反转录促进剂添加量的4×反转录反应液中除DTT和EGTA以外的配方相同，具体为：0.2摩尔/升三羟甲基氨基甲烷(Tris)、40毫摩尔/升硫酸铵【(NH4)2SO4】、8毫摩尔/升氯化镁(MgCl2)、0.3摩尔/升氯化钠(NaCl)、100毫摩尔/升海藻糖、0.002％明胶、4种超纯脱氧核苷三磷酸(dNTPs)各2毫摩尔/升、10微摩尔/升的Oligo-dT15引物、20微摩尔/升的Random随机引物、32个单位/微升的毫摩尔/升LV反转录酶、1.6个单位/微升的RNA酶抑制剂(RNasin)、1％甘油、调节反转录反应液的pH值为8.3，并最终用去离子水定容至1毫升。而不同反转录促进剂的添加量如表4所示：
表4
2、将步骤1的反转录反应体系彻底混匀，简短离心，并将上述反应液于42度下孵育15分钟。此时反转录反应完成。将得到的cDNA置于冰上备用。
3、将上述所得人cDNA进行荧光定量检测。
二、对反转录所得cDNA进行荧光定量检测：
对通过上述四种不同试剂所获得cNDA分别进行荧光定量检测。
以实施例2中四种反转录试剂反转录得到的cDNA为模板，分别用相同的内参基因的引物进行检测，所用的定量PCR试剂为：天根生化科技(北京)有限公司的SuperRealPreMix(SYBR Green)荧光定量检测试剂盒。
其中内参基因(扩增片段大小121bp)引物序列为：
上游引物如SEQ ID NO：1所示，
SEQ ID NO：1 5’-GGTTTCGAAGTGGTGGTCTTG-3’，
下游引物如SEQ ID NO：2所示，
SEQ ID NO：2 5’-CCTGCCCCAATCCCTTTATT-3’。
荧光定量PCR的检测体系为：10微升2×SuperReal PreMix(含SYBR)、0.4微升50×ROX Reference Dye、1微升内参基因的上游引物(5微摩尔/升)、1微升内参基因的下游引物(5微摩尔/升)、2微升cDNA模板、最后用去离子水将PCR反应体系补足至20微升。
阴性对照的PCR反应体系与待测样品的PCR反应体系区别在：将模板cDNA更换为去离子水。
试剂全部加好后，瞬时离心，将所有试剂收集到管底。
cDNA模板为四种不同反转录促进剂添加量试剂分别反转录所得cDNA，经过去离子水稀释得到。浓度为：10纳克/微升。
本实施例中荧光定量PCR实验使用ABI 7500Fast定量PCR仪进行。具体的荧光定量PCR的反应程序如下：
预变性条件为：95摄氏度15分钟；PCR循环程序为：95摄氏度10秒，60摄氏度30秒，循环40次；最后将反应体系冷却至室温(25摄氏度)。
三、检测结果：
四种不同反转录促进剂添加量试剂制备的cDNA进行荧光定量PCR检测，具体的CT值(每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数)如表5所示：
表5
4×反转录反应液编号 7 8 9 10
CT值 20.47 18.90 18.40 16.92
阴性对照的CT值为38.66。
通过上表数据可知，10号试剂所对应的CT值最低，因此，可确定4×反转录反应液中添加反转录促进剂是有作用的且最适添加量为：3毫摩尔/升二硫苏糖醇(DTT)和1.6毫摩尔/升的乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)。
实施例4
对两种添加与不添加稳定剂(海藻糖/明胶/甘油)的4×反转录反应液进行反复冻融30次处理及-20℃冻存6个月处理，并进行人类RNA的反转录，并通过后续的定量PCR检测来验证有无稳定剂对4×反转录反应液稳定性的影响。
一、人RNA的反转录：
1、在冰上进行如下操作：在200微升的离心管中配制反转录反应体系，加入的组分包括：4×反转录反应液(5微升)、1微克的RNA、去离子水补足至20微升。
其中两种是否添加稳定剂的4×反转录反应液中除稳定剂以外的配方相同，具体为：0.2摩尔/升三羟甲基氨基甲烷(Tris)、40毫摩尔/升硫酸铵【(NH4)2SO4】、8毫摩尔/升氯化镁(MgCl2)、0.3摩尔/升氯化钠(NaCl)、3毫摩尔/升二硫苏糖醇(DTT)、1.6毫摩尔/升的乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)、4种超纯脱氧核苷三磷酸(dNTPs)各2毫摩尔/升、10微摩尔/升的Oligo-dT15引物、20微摩尔/升的Random随机引物、32个单位/微升的毫摩尔/升LV反转录酶、1.6个单位/微升的RNA酶抑制剂(RNasin)、调节反转录反应液的pH值为8.3，并最终用去离子水定容至1毫升。而稳定剂的加入与否及加入量如表6所示：
表6
另外，对两种添加与不添加稳定剂的4×反转录反应液的稳定性检测处理如表7所示：
表7
2、将步骤1的6种反转录反应体系彻底混匀，简短离心，并将上述反应液于42度下孵育15分钟。此时反转录反应完成。将得到的cDNA置于冰上备用。
3、将上述所得人cDNA进行荧光定量检测。
二、对反转录所得cDNA进行荧光定量检测：
对通过上述6种不同试剂所获得cNDA分别进行荧光定量检测。
以实施例2中6种反转录反应液反转录得到的cDNA为模板，分别用相同的内参基因的引物进行检测，所用的定量PCR试剂为：天根生化科技(北京)有限公司的SuperRealPreMix(SYBR Green)荧光定量检测试剂盒。
其中内参基因(扩增片段大小121bp)引物序列为：
上游引物如SEQ ID NO：1所示，
SEQ ID NO：1 5’-GGTTTCGAAGTGGTGGTCTTG-3’，
下游引物如SEQ ID NO：2所示，
SEQ ID NO：2 5’-CCTGCCCCAATCCCTTTATT-3’。
荧光定量PCR的检测体系为：10微升2×SuperReal PreMix(含SYBR)、0.4微升50×ROX Reference Dye、1微升内参基因的上游引物(5微摩尔/升)、1微升内参基因的下游引物(5微摩尔/升)、2微升cDNA模板、最后用去离子水将PCR反应体系补足至20微升。
阴性对照的PCR反应体系与待测样品的PCR反应体系区别在：将模板cDNA更换为去离子水。
试剂全部加好后，瞬时离心，将所有试剂收集到管底。
cDNA模板为6种不同处理试剂分别反转录所得cDNA，经过去离子水稀释得到。浓度为：10纳克/微升。
本实施例中荧光定量PCR实验使用ABI 7500Fast定量PCR仪进行。具体的荧光定量PCR的反应程序如下：
预变性条件为：95摄氏度15分钟；PCR循环程序为：95摄氏度10秒，60摄氏度30秒，循环40次；最后将反应体系冷却至室温(25摄氏度)。
三、检测结果：
6种不同处理试剂制备的cDNA进行荧光定量PCR检测，具体的CT值(每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数)如表8所示：
表8
阴性对照的CT值为38.66。
通过上表数据可知，11号试剂经稳定性检测处理后，反转录效果与未处理相比下降很大；而12号试剂处理与否其反转录效果基本不变。因此，通过本实施例可知，对于本发明所述4×反转录反应液而言，添加稳定剂是必须的，且稳定剂的最适添加量为：100毫摩尔/升海藻糖、0.002％(质量体积比)的明胶和1％(体积体积比)的甘油。
实施例5
分别用本发明方法与常规反转录方法进行人RNA的反转录，然后对反转录所得cDNA进行荧光定量检测。
一、人RNA反转录：
1、本发明方法进行人RNA的反转录：
(1)在冰上进行如下操作：在200微升的离心管中配制反转录反应体系，加入的组分包括：4×反转录反应液(5微升)、1微克的RNA、去离子水补足至20微升。
其中4×反转录反应液配方为：0.2摩尔/升三羟甲基氨基甲烷(Tris)、40毫摩尔/升硫酸铵【(NH4)2SO4】、8毫摩尔/升氯化镁(MgCl2)、0.3摩尔/升氯化钠(NaCl)、3毫摩尔/升二硫苏糖醇(DTT)、100毫摩尔/升海藻糖、0.002％明胶、1.6毫摩尔/升的乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)、4种超纯脱氧核苷三磷酸(dNTPs)各2毫摩尔/升、10微摩尔/升的Oligo-dT15引物、20微摩尔/升的Random随机引物、32个单位/微升的毫摩尔/升LV反转录酶、1.6个单位/微升的RNA酶抑制剂(RNasin)、1％甘油、调节反转录反应液的pH值为8.3，并最终用去离子水定容至1毫升。
(2)将步骤(1)的反转录反应体系彻底混匀，简短离心，并将上述反应液于42度下孵育15分钟。此时反转录反应完成。将得到的cDNA置于冰上备用。
(3)将上述所得人cDNA进行荧光定量检测。
2、常规反转录方法进行人RNA的反转录
本次常规反转录操作应用TIANScript cDNA第一链合成试剂盒进行，具体步骤如下所示：
(1)在冰上进行如下操作：在200微升的离心管中配制如下反转录反应体系，加入的组分包括：1微克的RNA、2微升的Oligo-dT引物(引物浓度为10微摩尔/升)和2微升超纯dNTPs(4种脱氧核苷三磷酸的浓度均为2.5毫摩尔/升)，最后用去离子水补足体积至14.5微升。
(2)将步骤(1)所得反转录反应体系彻底混匀，简短离心，并将上述反应体系放于70摄氏度下孵育5分钟，然后置于冰上至少2分钟。
(3)在步骤(2)反应体系中继续加入如下反转录组分：4微升5×反转录缓冲液、0.5微升RNasin和1微升MMLV反转录酶，用去离子水补足体积至20微升。
(4)将步骤(3)所得混合液彻底混匀，简短离心，并将上述混合液放于42摄氏度中孵育60分钟。
(5)将步骤(4)所得混合液放于95摄氏度下，加热5分钟，终止反应，置于冰上备用。
(6)将步骤(5)所得cDNA进行荧光定量检测。
二、对反转录所得cDNA进行荧光定量检测：
对本发明方法和常规方法所获得cNDA分别进行荧光定量检测。
以实施例5中两种反转录方法得到的cDNA为模板，分别用相同的内参基因的引物进行检测，所用的定量PCR试剂为：天根生化科技(北京)有限公司的SuperReal PreMix(SYBR Green)荧光定量检测试剂盒。
其中内参基因(扩增片段大小121bp)引物序列为：
上游引物如SEQ ID NO：1所示，
SEQ ID NO：1 5’-GGTTTCGAAGTGGTGGTCTTG-3’，
下游引物如SEQ ID NO：2所示，
SEQ ID NO：2 5’-CCTGCCCCAATCCCTTTATT-3’。
荧光定量PCR的检测体系为：10微升2×SuperReal PreMix(含SYBR)、0.4微升50×ROX Reference Dye、1微升内参基因的上游引物(5微摩尔/升)、1微升内参基因的下游引物(5微摩尔/升)、2微升不同浓度的cDNA模板、最后用去离子水将PCR反应体系补足至20微升。
阴性对照的PCR反应体系与待测样品的PCR反应体系区别在：将模板cDNA更换为去离子水。
试剂全部加好后，瞬时离心，将所有试剂收集到管底。
cDNA模板为本发明方法和常规方法分别反转录所得cDNA，经过梯度稀释。两种反转录方法所得的cDNA均选取5个浓度梯度点：10纳克/微升、1纳克/微升、100皮克/微升、10皮克/微升和1皮克/微升。
本实施例中荧光定量PCR实验使用ABI 7500Fast定量PCR仪进行。具体的荧光定量PCR的反应程序如下：
预变性条件为：95摄氏度15分钟；PCR循环程序为：95摄氏度10秒，60摄氏度30秒，循环40次；最后将反应体系冷却至室温(25摄氏度)。
三、检测结果：
(1)本发明方法和常规反转录方法制备的cDNA进行荧光定量PCR检测，具体的CT值(每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数)如下：
本发明方法反转录所得cDNA的各浓度梯度点对应的CT值为：20纳克cDNA的CT值为16.93；2纳克cDNA的CT值为20.34；200皮克cDNA的CT值为24.07；20皮克cDNA的CT值为27.81；2皮克cDNA的CT值为31.56；阴性对照的CT值为37.38。
常规方法反转录所得cDNA的浓度点与CT的关系为：20纳克cDNA的CT值为17.10；2纳克cDNA的CT值为20.50；200皮克cDNA的CT值为24.0；20皮克cDNA的CT值为27.56；2皮克cDNA的CT值为31.21；阴性对照的CT值为36.19。
(2)本发明方法和常规方法反转录的cDNA进行荧光定量PCR检测，扩增曲线如图1和图2所示，其中图1是通过本发明方法以人的RNA为模板进行反转录反应，反转录所获得的cDNA再进行荧光定量的检测图，其中的5条“S”曲线分别代表5个浓度梯度的cDNA的定量扩增曲线；图2是通过常规反转录方法以人的RNA为模板进行反转录反应，反转录所获得的cDNA再进行荧光定量的检测图，其中的5条“S”曲线分别代表5个浓度梯度的cDNA的定量扩增曲线。
由图1和图2可以看出，本发明方法和常规方法反转录制备的cDNA，cDNA的量和质量没有显著差异，用于后续实验，如荧光定量PCR检测，检测效果没有差异。但本发明方法在实验操作方面却简化了很多。
实施例6
分别用本发明的方法与常规反转录方法进行人RNA的反转录，然后用反转录所得cDNA进行普通PCR检测。
一、人RNA反转录：
1、本发明方法进行人RNA的反转录：
(1)在冰上进行如下操作：在200微升的离心管中配制反转录反应体系，加入的组分包括：4×反转录反应液、1微克的RNA、去离子水补足至20微升。
其中4×反转录反应液配方为：0.2摩尔/升三羟甲基氨基甲烷(Tris)、40毫摩尔/升硫酸铵【(NH4)2SO4】、8毫摩尔/升氯化镁(MgCl2)、0.3摩尔/升氯化钠(NaCl)、3毫摩尔/升二硫苏糖醇(DTT)、100毫摩尔/升海藻糖、0.002％明胶、1.6毫摩尔/升的乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)、4种超纯脱氧核苷三磷酸(dNTPs)各2毫摩尔/升、10微摩尔/升的Oligo-dT15引物、20微摩尔/升的Random随机引物、32个单位/微升的毫摩尔/升LV反转录酶、1.6个单位/微升的RNA酶抑制剂(RNasin)、1％甘油、调节反转录反应液的pH值为8.3，并最终用去离子水定容至1毫升。
(2)将步骤(1)所得反转录反应体系彻底混匀，简短离心，并将上述反应体系于42度下孵育15分钟。此时反转录反应完成。将得到的cDNA置于冰上备用。
(3)将上述所得人cDNA进行普通PCR检测。
2、常规反转录方法进行人RNA的反转录
本实施例中常规反转录操作应用TIANScript cDNA第一链合成试剂盒进行，具体步骤如下所示：
(1)在冰上进行如下操作：在200微升的离心管中配制如下体系，加入的组分包括：1微克的RNA、2微升的Oligo-dT引物(引物浓度为10微摩尔/升)和2微升超纯dNTPs(4种脱氧核苷三磷酸的浓度均为2.5毫摩尔/升)，最后用去离子水补足体积至14.5微升。
(2)将步骤(1)所得反应体系彻底混匀，简短离心，并将上述反应体系放于70摄氏度下孵育5分钟，然后置于冰上至少2分钟。
(3)向步骤(2)所得反应混合物中继续加入如下反转录组分：4微升5×反转录缓冲液、0.5微升RNasin和1微升MMLV反转录酶，用去离子水补足体积至20微升。
(4)将步骤(3)所得混合液彻底混匀，简短离心，并将上述混合液放于42摄氏度中孵育60分钟。
(5)将步骤(4)所得混合液放于95摄氏度下，加热5分钟，终止反应，得cDNA，置于冰上备用。
(6)将上述所得cDNA进行普通PCR检测。
二、对反转录所得cDNA进行普通PCR检测：
对本发明方法和常规方法所获得的cNDA分别进行普通PCR检测：
以实施例6中两种反转录方法得到的cDNA为模板，分别用不同长度片段基因的上游引物和下游引物进行检测，用天根生化科技(北京)有限公司的Fast HiFidelity PCRKit进行普通PCR检测：
其中不同长度片段的引物信息为：
引物1(扩增片段大小3000bp)-上游引物如SEQ ID NO：3所示，下游引物如SEQ IDNO：4所示，
SEQ ID NO：3 5’-CAAGCATCTGCGTCGTCTTC-3’,
SEQ ID NO：4 5’-GGGAACACTGCCATTACCCA-3’；
引物2(扩增片段大小4600bp)-上游引物如SEQ ID NO：5所示，下游引物如SEQ IDNO：6所示，
SEQ ID NO：5 5’-CTGGGATCTGCATGAACGGG-3’
SEQ ID NO：6 5’-CGCAGCGATAGGAACCATCT-3’；
引物3(扩增片段大小6700bp)-上游引物如SEQ ID NO：7所示，下游引物如SEQ IDNO：8所示，
SEQ ID NO：7 5’-ACGGGCTTACTAATGACCAC-3’,
SEQ ID NO：8 5’-GGGAACACTGCCATTACCCA-3’。
普通PCR的检测体系为：4微升5×Fast HiFidelity PCR缓冲液；0.6微升FastHiFidelity DNA聚合酶；1.6微升不同长度片段的引物1/引物2/引物3的上游引物(5微摩尔/升)、1.6微升不同长度片段的引物1/引物2/引物3的下游引物(5微摩尔/升)、2微升cDNA模板(浓度为100纳克)、最后用去离子水将PCR反应体系补足至20微升。试剂全部加好后，瞬时离心，将所有试剂收集到管底。
用Biometra PCR仪器进行普通PCR检测的反应程序如下。预变性条件为：94摄氏度2分钟；PCR循环程序为：94摄氏度15秒，60摄氏度10秒，68摄氏度30秒，循环35次；补充延伸程序为：68摄氏度5分钟；最后将反应体系冷却至室温(25摄氏度)。
三、检测结果：
将本发明的方法和常规方法反转录所得cDNA进行普通PCR检测，PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳图如图3所示。
由图3可以看出，本发明方法和常规方法反转录制备的cDNA，cDNA的量和质量没有显著差异，用于后续实验，如PCR检测，检测效果没有差异。但本发明方法，在实验操作方面却简化了很多。
实施例7
用本发明方法和市场上主流反转录产品分别对多个物种的RNA的进行反转录，然后对反转录所得cDNA进行荧光定量检测。
一、市场上主流反转录产品的选择
选取市场上主流的反转录产品，在这些产品中，有一些应用的是常规方法，同时也有一些应用的是快速方法，具体产品信息及其在实验过程中所涉及操作细节如表9所示：
表9
二、多个物种RNA的分别反转录：
1、本发明方法进行的反转录：
(1)在冰上进行如下操作：在200微升的离心管中配制反转录反应体系，加入的组分包括：4×反转录反应液(5微升)、1微克特定物种的RNA、去离子水补足至20微升。
其中4×反转录反应液配方为：0.2摩尔/升三羟甲基氨基甲烷(Tris)、40毫摩尔/升硫酸铵【(NH4)2SO4】、8毫摩尔/升氯化镁(MgCl2)、0.3摩尔/升氯化钠(NaCl)、3毫摩尔/升二硫苏糖醇(DTT)、100毫摩尔/升海藻糖、0.002％明胶、1.6毫摩尔/升的乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)、4种超纯脱氧核苷三磷酸(dNTPs)各2毫摩尔/升、10微摩尔/升的Oligo-dT15引物、20微摩尔/升的Random随机引物、32个单位/微升的毫摩尔/升LV反转录酶、1.6个单位/微升的RNA酶抑制剂(RNasin)、1％甘油、调节反转录反应液的pH值为8.3，并最终用去离子水定容至1毫升。
其中特定物种的RNA分别为：人类RNA，玉米RNA，大肠杆菌RNA和大鼠RNA。
(2)将步骤(1)的每个特定物种RNA的反转录反应体系彻底混匀，简短离心，并将上述反应液于42度下孵育15分钟。此时反转录反应完成。将得到的cDNA置于冰上备用。
(3)将上述所得的多个特定物种的cDNA进行荧光定量检测。
2、其他产品的反转录操作
除本发明产品以外的反转录操作分别严格按照其说明书进行，但是，为了保证与本发明产品具有可比性，本发明产品与其他产品所用的特定物种的RNA模板的量是完全相同的。
反转录结束后，将各个产品所得cDNA进行荧光定量检测。
二、对反转录所得cDNA进行荧光定量检测：
对本发明方法和其他产品所获得cNDA分别进行荧光定量检测。
以实施例7中9种反转录方法/产品得到的cDNA为模板，分别用5种不同基因的引物进行检测，所用的定量PCR试剂为：天根生化科技(北京)有限公司的SuperReal PreMix(SYBR Green)荧光定量检测试剂盒。
其中5种基因引物序列如下：
引物1(扩增片段大小108bp，针对物种为人类)-上游引物如SEQ ID NO：9所示，下游引物如SEQ ID NO：10所示，
SEQ ID NO：9 5’-GGCACCCAGCACAATGAAG-3’,
SEQ ID NO：10 5’-GCCGATCCACACGGAGTACT-3’；
引物2(扩增片段大小124bp，针对物种为人类)-上游引物如SEQ ID NO：11所示，下游引物如SEQ ID NO：12所示，
SEQ ID NO：11 5’-CGGGCTGGTGTTTCGGGAGTGTC-3’
SEQ ID NO：12 5’-GCCCGTTGCTGGACTGGATTATC-3’；
引物3(扩增片段大小137bp，针对物种为玉米)-上游引物如SEQ ID NO：13所示，下游引物如SEQ ID NO：14所示，
SEQ ID NO：13 5’-ATGAAGCCATGTACAACTCCA-3’,
SEQ ID NO：14 5’-AAGTGCAGTAATCTCCTTGCTC-3’。
引物4(扩增片段大小119bp，针对物种为大肠杆菌)-上游引物如SEQ ID NO：15所示，下游引物如SEQ ID NO：16所示，
SEQ ID NO：15 5’-CTAACACATGCAAGTCGAACGGTA-3’,
SEQ ID NO：16 5’-ACCGTTTCCAGTAGTTATCCCC-3’；
引物5(扩增片段大小114bp，针对物种为大鼠)-上游引物如SEQ ID NO：17所示，下游引物如SEQ ID NO：18所示，
SEQ ID NO：17 5’-AGCCATGTACGTAGCCATCCA-3’
SEQ ID NO：18 5’-TCTCCGGAGTCCATCACAATG-3’；
荧光定量PCR的检测体系为：10微升2×SuperReal PreMix(含SYBR)、0.4微升50×ROX Reference Dye、1微升检测基因的上游引物(5微摩尔/升)、1微升检测基因的下游引物(5微摩尔/升)、2微升特定物种的cDNA模板、最后用去离子水将PCR反应体系补足至20微升。
阴性对照的PCR反应体系与待测样品的PCR反应体系区别在：将模板cDNA更换为去离子水。
试剂全部加好后，瞬时离心，将所有试剂收集到管底。
cDNA模板为本发明方法和市场上主流反转录产品反转录所得的特定物种的cDNA，经过稀释，最终浓度为：10纳克/微升。
本实施例中荧光定量PCR实验使用ABI 7500Fast定量PCR仪进行。具体的荧光定量PCR的反应程序如下：
预变性条件为：95摄氏度15分钟；PCR循环程序为：95摄氏度10秒，60摄氏度30秒，循环40次；最后将反应体系冷却至室温(25摄氏度)。
三、检测结果：
针对本发明方法和市场上主流反转录产品反转录所得的特定物种的cDNA进行荧光定量PCR检测，具体的CT值(每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数)对比如表10所示：
表10
通过上表结果我们可以得到如下结论：
1、本发明方法可以适用于常用的科研物种RNA反转录实验，具有RNA普适性；
2、与其他市场上主流反转录产品相比，本发明方法在实验效果方面相当甚至更优；
3、在实验操作方面，本发明方法优于所有对比产品。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (7)

1.一种反转录反应液，其特征在于，所述反转录反应液包括：
0.1～0.3摩尔/升三羟甲基氨基甲烷；
40毫摩尔/升硫酸铵；
6毫摩尔/升～10毫摩尔/升氯化镁；
0.3摩尔/升氯化钠；
3毫摩尔/升二硫苏糖醇；
100～300毫摩尔/升海藻糖；
质量体积百分数为0.002％的明胶；
1.6毫摩尔/升的乙二醇双四乙酸；
脱氧核苷三磷酸各1～3毫摩尔/升；
5～20微摩尔/升的Oligo-dT15引物；
10～30微摩尔/升的随机引物；
25～75个单位/微升的鼠白血病病毒反转录酶；
1.5～2.1个单位/微升的RNA酶抑制剂；
1体积％甘油；以及
余量的水；
所述反转录反应液的pH为8.3。
2.权利要求1所述的反转录反应液在RNA样本的反转录处理中的用途。
3.一种制备cDNA的方法，其特征在于，包括：
利用权利要求1所述的反转录反应液对RNA样本进行反转录处理，以便获得所述cDNA。
4.根据权利要求3所述的制备cDNA的方法，其特征在于，所述反转录处理是在42摄氏度的条件下进行15分钟。
5.根据权利要求4所述的制备cDNA的方法，其特征在于，进一步包括：
(1)将所述RNA样品、水和所述反转录反应液混合，以便获得反应混合物，其中，基于50纳克～2微克的所述RNA样本，所述反转录反应液的用量为5微升，所述水的用量用于将所述反应混合物的体积调剂至20微升；以及
(2)将步骤(1)所得反应混合液进行所述反转录处理，以便获得所述cDNA。
6.根据权利要求5所述的制备cDNA的方法，其特征在于，所述水是去离子水。
7.根据权利要求6所述的制备cDNA的方法，其特征在于，所述混合是在4摄氏度下进行的。
CN201610176594.0A 2016-03-24 2016-03-24 反转录反应液及制备cDNA的方法 Active CN105713899B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610176594.0A CN105713899B (zh) 2016-03-24 2016-03-24 反转录反应液及制备cDNA的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610176594.0A CN105713899B (zh) 2016-03-24 2016-03-24 反转录反应液及制备cDNA的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105713899A CN105713899A (zh) 2016-06-29
CN105713899B true CN105713899B (zh) 2018-09-25

Family

ID=56159218

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610176594.0A Active CN105713899B (zh) 2016-03-24 2016-03-24 反转录反应液及制备cDNA的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105713899B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108949937A (zh) * 2018-07-16 2018-12-07 翌圣生物科技（上海）有限公司 一步法rt-pcr预混试剂
CN111733213A (zh) * 2019-03-25 2020-10-02 天根生化科技（北京）有限公司 反转录反应液及制备cDNA的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN105713899A (zh) 2016-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0975806B1 (en) Compositions and methods for reverse transcriptase-polymerase chain reaction (rt-pcr)
US10301675B2 (en) Compositions and methods for reducing inhibition of RT-PCR
CN111020031A (zh) 序列特异性阻断剂结合特定pcr程序检测肿瘤基因突变的方法
CN107523642A (zh) 一种多重逆转录聚合酶链式反应检测试剂缓冲液及其应用
US20140199699A1 (en) Compositions and Methods for RT-PCR
CN112176076B (zh) 一种与山羊生长性状相关的nfat5基因分子标记及其应用
CN105907734B (zh) Taq DNA聚合酶、PCR反应液及其应用
CN105713899B (zh) 反转录反应液及制备cDNA的方法
WO2023217291A1 (zh) 一种聚合酶突变体及其应用
EP3498861A1 (en) Rna reverse transcription amplification method
CN103789414B (zh) 17个x染色体短串联重复序列的复合扩增试剂盒
Kubista et al. RNA quality matters
WO2022246783A1 (zh) 鉴别或辅助鉴别哺乳动物物种的探针组合物及其试剂盒与应用
CN110863034B (zh) 快速提取牛血液DNA进行β-酪蛋白基因型检测的方法
CN112831547B (zh) 一种用于高GC片段扩增的qPCR添加剂及扩增方法
O’Connell et al. Quantitative measurement of mRNA expression by competitive RT-PCR
Cho-Vega et al. Combined laser capture microdissection and serial analysis of gene expression from human tissue samples
US9200314B2 (en) Synthetic siRNA detection method
US20210054443A1 (en) Method for quickly homogenizing circular dna samples
CN105695575A (zh) 55个snp位点多色荧光复合检测的方法及试剂盒
CN106222164B (zh) 利用转座子酶进行体外核酸单向扩增的方法、组合物和试剂盒
CN112251519A (zh) 鉴定呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的特异性引物和探针、试剂盒及方法
CN111733213A (zh) 反转录反应液及制备cDNA的方法
LU505779B1 (en) Establishment of a Visual LAMP Assay for Mycobacterium tuberculosis in Bovine Milk
Saal et al. Laser‐assisted microdissection applied to frozen surgical pathologic specimens–methodological aspects on RT‐PCR

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant