CN102884186A - 合成cDNA的方法 - Google Patents

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Abstract

一种合成cDNA的方法，其特征在于，制备不需要热灭活脱氧核糖核酸内切酶或去除脱氧核糖核酸内切酶即可使脱氧核糖核酸内切酶不表现出其活性的反应溶液，并进行反转录反应，其中所述反应溶液含有处理过的样品和反转录酶，所述处理过的样品如下形成：用脱氧核糖核酸内切酶处理包含RNA和DNA的样品，以降解所述样品中的DNA。本发明的用于合成cDNA的方法和试剂盒可广泛地用于基因工程领域。

Description

合成cDNA的方法
技术领域
本发明涉及可用于合成cDNA的方法和可用于合成cDNA的试剂盒。
背景技术
为了阐明生命现象，非常重要的是分析各种基因的mRNA分子。通过RNA依赖性的DNA聚合酶（换而言之，反转录酶）的发现，使得使用RNA作为模板来合成cDNA的反转录反应成为可能，从而在分析mRNA分子的方法中取得显著进步。使用反转录酶来分析mRNA分子的方法，现在已经变成涉及基因的研究中的一种基本实验方法。使用通过反转录反应合成的cDNA作为模板的、用于扩增DNA片段的PCR方法被称作RT-PCR方法。所述RT-PCR方法被用于克隆从mRNA衍生出的cDNA，或用于制造cDNA文库，且也可用作检查特定RNA的表达状态的方法。
但是，在用于cDNA合成的样品中污染有DNA的情况下，可能会扩增编码RNA的DNA上的区域或拟基因，因而难以选择性地仅得到使用RNA作为模板合成的DNA。为了抑制由样品中的污染DNA衍生出的扩增产物的生成，采用下述的方法：在反转录反应过程中使用核苷酸类似物和会降低Tm值的化合物的方法(专利公开1)，包括使用脱氧核糖核酸内切酶(在下文中，可以称作endoDNase)诸如脱氧核糖核酸酶I (在下文中，可以称作DNA酶I)降解样品中的DNA并在之后进行反转录反应的方法等。
在用DNA酶I降解样品中的DNA后进行反转录反应时，为了抑制cDNA的降解，通常在反转录反应之前通过热处理、苯酚/氯仿萃取等灭活或去除所述DNA酶I。但是，已知的是，苯酚/氯仿萃取是复杂的，且在有二价金属离子（它们是DNA酶I的反应所必需的）存在下的热处理会导致RNA的水解。尽管还提出了DNA酶I和反转录酶同时起作用的方法(专利公开2和3)，DNA酶I也会降解DNA/RNA杂交物中的DNA，使得以此方式通过反转录反应合成的cDNA遭受DNA酶I的降解。
专利公开
专利公开1:  WO 99/09213
专利公开2:  日本专利公开号2005-304396
专利公开3:  WO 2006/103039。
发明内容
本发明要解决的问题
本发明要解决的问题是提供一种合成cDNA的方法，所述方法能够简单地且方便地抑制由样品中的污染DNA衍生出的扩增产物的生成。
解决问题的方式
发明人已经发现，可以制备这样的反应溶液组合物：其中endoDNase不表现出活性，且反转录酶表现出活性，且进一步，基于所述发现，已经完成了可以解决上述问题的与合成cDNA的方法和用于合成cDNA的试剂盒有关的本发明。
具体地，本发明涉及：
[1] 一种合成cDNA的方法，其特征在于，制备不需要热灭活脱氧核糖核酸内切酶或去除脱氧核糖核酸内切酶即可使脱氧核糖核酸内切酶不表现出其活性的反应溶液，并进行反转录反应，
其中所述反应溶液含有处理过的样品和反转录酶，所述处理过的样品如下形成：用脱氧核糖核酸内切酶处理包含RNA和DNA的样品，以降解所述样品中的DNA；
[2] 根据[1]所述的方法，其中所述方法包括下述步骤(a)至(c)：
(a) 得到组合物，所述组合物包含含有RNA和DNA的样品和脱氧核糖核酸内切酶；
(b) 在足以降解所述样品中的DNA的条件下，用脱氧核糖核酸内切酶处理在步骤(a)中得到的组合物；和
(c) 将添加剂和反转录酶加入在步骤(b)中处理过的组合物中，以制备使脱氧核糖核酸内切酶不表现出其活性的反应溶液，并使用反转录酶进行反转录反应；
[3] 根据[1]所述的方法，其中所述脱氧核糖核酸内切酶是脱氧核糖核酸酶I；
[4] 根据[1]所述的方法，其中所述反转录酶是从莫洛尼鼠白血病病毒衍生出的反转录酶；
[5] 根据[2]所述的方法，其中所述添加剂是选自还原剂、一价阳离子和其盐中的至少一种；
[6] 根据[5]所述的方法，其中所述一价阳离子是铵离子；
[7] 一种扩增cDNA的方法，所述方法包括下述步骤：使用根据在[1]至[6]中任一项所定义的方法合成的cDNA作为模板，进行基因扩增方法；和
[8] 一种用于[1]至[7]中任一项所定义的方法中的试剂盒，所述试剂盒包含：(A)脱氧核糖核酸内切酶、(B)缓冲剂、(C)反转录酶和(D)添加剂，其用于制备使所述反转录酶表现出其活性，且使所述脱氧核糖核酸内切酶不表现出其活性的反转录反应用组合物。
发明效果
根据本发明，使得在可操作性、定量等方面优良的cDNA合成成为可能，该合成能够抑制由样品中的污染DNA衍生出的扩增产物的生成。
附图说明
图1是显示实施例2中的琼脂糖凝胶电泳的结果的图。
图2是显示实施例8中的实时PCR的结果的图。
具体实施方式
本发明的合成cDNA的方法的特征在于，制备不需要热灭活脱氧核糖核酸内切酶或去除脱氧核糖核酸内切酶即可使脱氧核糖核酸内切酶不表现出其活性的反应溶液，并进行反转录反应，
其中所述反应溶液含有处理过的样品和反转录酶，所述处理过的样品如下形成：用脱氧核糖核酸内切酶处理包含RNA和DNA的样品，以降解所述样品中的DNA。
常规地，在包括使用endoDNase降解样品中的DNA然后进行反转录反应的方法中，需要在反转录反应之前，热灭活所述endoDNase或去除所述endoDNase，但是本发明的方法不需要这些操作。换而言之，根据本发明，在用endoDNase降解样品中的DNA和反转录反应之间，不需要进行在60℃或更高温度的热处理或特定组分的分离操作。因此，在本发明的说明书中，短语“热灭活脱氧核糖核酸内切酶(endoDNase)”表示在60℃或更高温度热处理含有endoDNase的样品，短语“去除脱氧核糖核酸内切酶(endoDNase)”表示从含有endoDNase的样品中分离endoDNase，短语“不需要热灭活脱氧核糖核酸内切酶或去除脱氧核糖核酸内切酶”是指不进行上述操作。
虽然不将本发明具体地限于此，但本发明的方法中使用的样品可以是含有RNA的样品，且包括，例如，含有RNA和DNA的样品。具体地，所述样品包括源于活体的样品诸如细胞、组织或血液；借助于众所周知的方法通过处理样品得到的含有核酸的样品；和可能含有生物体的样品，诸如食物、土壤或废水。借助于众所周知的方法通过处理源于活体的样品得到的含有核酸的样品的一个实例包括，例如，从细胞破碎物得到的样品或通过其分级分离得到的样品；富含样品中的总RNA或特定RNA分子的样品，例如，富含mRNA的那些样品，等等，且所述样品可以是污染有DNA的样品。
在本发明的说明书中，脱氧核糖核酸内切酶(endoDNase)是指以内切形式切断DNA链的酶。可用于本发明中的endoDNase优选地包括双链DNA特异性endoDNase，更优选地包括，例如，序列非特异性内切核酸酶诸如DNA酶I或虾DNA酶，或序列特异性内切核酸酶诸如限制性酶。
所述处理过的样品（其中所述样品中的DNA被endoDNase降解）没有特别限制，只要所述样品保持在使样品中的DNA被endoDNase降解的条件下即可，本领域普通技术人员能够根据endoDNase或样品适当地制备所述样品。尽管没有具体地将本发明限于此，在使用DNA酶I作为endoDNase的情况下，所述保持条件是这样的条件：优选地在20℃至45℃保持10秒至12小时，更优选地在25℃至44℃保持30秒至1小时，甚至更优选地在30℃至43℃保持1分钟至30分钟。
可用于本发明中的反转录酶可以是这样的酶：其具有反转录活性，换而言之，使用RNA作为模板合成与其互补的DNA的活性，且所述反转录酶包括，例如，从病毒衍生出的反转录酶，诸如从莫洛尼鼠白血病病毒衍生出的反转录酶(MMLV-衍生的反转录酶)和从禽髓母细胞白血病病毒衍生出的反转录酶(AMV-衍生的反转录酶)；从真细菌衍生出的反转录酶，诸如从属于芽孢杆菌属的嗜热细菌衍生出的DNA聚合酶(Bca DNA聚合酶等等)，和从属于栖热菌属的细菌衍生出的具有反转录活性和DNA依赖性的DNA聚合酶活性的DNA聚合酶(Tth DNA聚合酶等等)。在本发明中，优选地使用从病毒衍生出的反转录酶，且更优选地使用MMLV-衍生的反转录酶。另外，天然存在的酶或重组酶可以在本发明中用作反转录酶，且还可以使用这样的反转录酶：在使所述反转录酶具有反转录活性的范围内，对天然存在的氨基酸序列进行修饰。
在本发明的说明书中,短语“使所述脱氧核糖核酸内切酶不表现出其活性的反应溶液”是指“其中所述脱氧核糖核酸内切酶不表现出DNA降解活性的反应溶液”。所述反应溶液是指，例如，这样的反应溶液：甚至当含有40 μg/mL牛胸腺DNA的反应溶液在有8 U/mL DNA酶I（TAKARA BIO INC.）（在产品上指示的滴度）存在下在25℃保持10分钟时，其在260 nm的吸光度也没有实质性变化。
使endoDNase不表现出其活性的反应溶液含有所述处理过的样品和反转录酶，且可以如下制备：例如，在用endoDNase降解样品中的DNA以后，将添加剂、反转录酶和其它组分加入反应溶液中，以制备其中endoDNase不表现出DNA降解活性的组合物。换而言之，包括下述步骤的方法是本发明方法的一个优选实施方案：(a)得到包含样品和脱氧核糖核酸内切酶的组合物；(b)在足以降解所述样品中的DNA的条件下，用脱氧核糖核酸内切酶处理在步骤(a)中得到的组合物；和(c)将添加剂和反转录酶加入在步骤(b)中处理过的组合物中，以制备使脱氧核糖核酸内切酶不表现出其活性的反应溶液，并进行反转录反应。
优选地，在上述步骤(a)中含有样品和脱氧核糖核酸内切酶的组合物进一步含有：缓冲剂诸如Tris-HCl、二价金属离子诸如镁离子或锰离子和还原剂诸如二硫苏糖醇(在下文中，可以称作DTT)。可以在表现出在下一步骤(b)中用endoDNase降解样品中的DNA的活性的范围内，基于酶学性质（诸如endoDNase的反应性质或稳定性）或实验来适当地选择缓冲剂、二价金属离子和还原剂的种类或浓度。优选地设定所述种类或浓度，使得endoDNase表现出高活性，并表现出高稳定性。例如，在使用DNA酶I作为endoDNase的情况下，可以设定缓冲剂的种类或浓度，使得其加入会产生endoDNase的接近最佳pH，且能够调节反应溶液的pH至5-10的范围内的种类或浓度是优选的。另外，可以设定还原剂的种类或浓度，使得endoDNase表现出高稳定性；例如，在使用DNA酶I作为endoDNase的情况下，优选地，所述组合物含有浓度为1 mM或更高且小于5 mM的DTT。
在上述步骤(b)中足以用脱氧核糖核酸内切酶降解所述样品中的DNA的条件没有特别限制，只要温度和时间的条件是这些的条件：在所述条件下降解DNA时，从样品中的DNA衍生出的产物不能实质性地确认，本领域普通技术人员可以根据endoDNase或样品适当地设定条件。尽管没有具体地将本发明限于此，在使用DNA酶I作为endoDNase的情况下，优选地举例在20℃至45℃保持10秒至12小时的条件，更优选地举例在25℃至44℃保持30秒至1小时的条件，甚至更优选地举例在30℃至43℃保持1分钟至30分钟的条件。
在上述步骤(c)中的添加剂包括选自还原剂、一价阳离子和其盐中的至少一种。所述添加剂可以用于本发明中，例如，以含有添加剂的水溶液（优选地含有添加剂的缓冲液）的形式。用于上述缓冲液中的缓冲剂的种类或浓度没有特别限制，只要可以将反应溶液调至希望的pH，通过其加入能够将反应溶液的pH改变至可用于反转录反应中的反转录酶的接近最佳pH的种类或浓度是优选的。尽管没有具体地将本发明限于此，上述缓冲剂包括Good氏缓冲剂诸如Tris-HCl。上述还原剂包括，例如，硫醇还原剂诸如DTT或2-巯基乙醇。另外，上述一价阳离子包括铵离子和碱金属离子诸如钾离子、锂离子和钠离子和其盐，例如，可以使用硫酸铵或氯化钾。使用的还原剂、一价阳离子或其盐的种类或量没有特别限制，只要在添加了添加剂的组合物中所述endoDNase不表现出其活性，且反转录酶有效地起作用即可，本领域普通技术人员能够根据本说明书的公开内容适当地做出决定。尽管没有具体地将本发明限于此，在所述endoDNase是DNA酶I的情况下，在所述组合物（其中所述endoDNase不表现出其活性，且所述反转录酶有效地起作用）中的组分包括：例如，硫酸铵、DTT和氯化钾。所述组合物中的硫酸铵的浓度优选地包括5 mM或更高，更优选地包括10-30 mM，甚至更优选地包括14-28 mM。另外，DTT的浓度优选地包括5 mM或更高，更优选地包括11-30 mM，甚至更优选地包括12-20 mM。另外，氯化钾的浓度优选地包括1 mM或更高，更优选地包括3-30 mM，甚至更优选地包括5-20 mM。具体地，作为在所述组合物中的终浓度，混合上述添加剂，使得所述组合物优选地含有5 mM或更高的硫酸铵、5 mM或更高的DTT和1 mM或更高的氯化钾，更优选地含有10-30 mM硫酸铵、11-30 mM DTT和3-30 mM氯化钾，甚至更优选地含有14-28 mM硫酸铵、11-30 mM DTT和5-20 mM氯化钾，甚至更优选地含有14-28 mM硫酸铵、12-20 mM DTT和5-20 mM氯化钾。
另外，上述添加剂可以以缓冲剂的形式用于制备如下制备的反转录反应溶液：混合反转录反应必需的组分，诸如反转录酶、缓冲剂、寡核苷酸引物和dNTP。考虑到操作和反转录酶的稳定性，下述实施方案是优选的：所述缓冲液含有除了反转录酶以外的反转录反应必需的组分，且仅仅单独地向其中加入反转录酶。
反转录反应的条件没有特别限制，只要所述条件足以合成与模板RNA互补的引物延伸链。足以合成与模板RNA互补的引物延伸链的条件没有特别限制，温度条件优选地是25℃至60℃，更优选地是30℃至50℃。另外，反应时间优选地是5-120分钟，更优选地是15-60分钟。另外，在反转录反应以后，可以在灭活反转录酶的条件下，温育所述反应溶液。用于灭活反转录酶的条件包括，例如，在85℃持续5秒的条件。
本发明的扩增cDNA的方法包括下述步骤：使用根据本发明的合成cDNA的方法合成的cDNA作为模板，进行基因扩增反应。在使用cDNA作为模板的核酸扩增中，可以使用本领域众所周知的基因扩增方法，诸如PCR方法、ICAN方法、LAMP方法或SDA方法。例如，在核酸扩增中使用PCR方法的情况下，可以应用一般的PCR条件，所述扩增如下进行：例如，通过包括将双链模板DNA解离成单链(变性)，将引物退火至单链模板DNA，和由所述引物合成互补链(延伸)的3个步骤的反应，或通过包括2步反应的反应，其中在上述的3步反应中，在相同温度进行引物的退火和延伸，称作“穿梭PCR”[“PCR Ho Saizensen (Front Line of PCR Method),”“(Tanpakushitsu Kakusan Koso (Proteins, Nucleic Acids and Enzymes)”Supplement, 41(5), 425-428 (1996)]。作为PCR方法，可以使用实时PCR，其能够用嵌入染料、FRET-标记的探针等等监测核酸扩增。
本发明的试剂盒是用于本发明的合成cDNA的方法或本发明的扩增cDNA的方法中的试剂盒，且所述试剂盒含有：(A)脱氧核糖核酸内切酶、(B)缓冲剂、(C)反转录酶和(D)添加剂，其用于制备使所述反转录酶表现出其活性，且使所述脱氧核糖核酸内切酶不表现出其活性的反转录反应用组合物。上述缓冲剂(B)可以含有endoDNase的反应必需的二价金属离子等等。另外，所述添加剂(D)可以含有使用反转录酶的反转录反应必需的寡核苷酸引物或dNTP。
实施例
在下文中将通过实施例具体地描述本发明，但是无意将本发明的范围限于所述实施例。
实施例1. 用于抑制EndoDNase活性的反应组成的研究-1
制备了5种20 μL反应溶液(反应溶液1-5)，它们含有5 U DNA酶I [重组DNA酶I (无RNA酶), TAKARA BIO INC.]、200 ng小鼠基因组DNA和在表1中列出的组分。另外，制备了5种20 μL反应溶液，它们具有与上述相同的组成，但是不含有DNA酶I。在这里，将反应溶液1设定为，每种组分的浓度是DNA酶I的标准反应溶液组成的一半，将反应溶液2设定为，具有接近反转录酶的最佳pH的pH，且含有dNTP，所述dNTP用作反转录酶的底物。将这些反应溶液在37℃温育15分钟，然后在85℃温育5秒。接着，根据实时PCR（其中将Rsp18基因区域用作靶向序列），定量在每种反应溶液中剩余的基因组DNA的量。在这里，在实时PCR中，使用SYBR Premix ExTaq (Perfect Real Time, TAKARA BIO INC.)，并使用下述引物作为引物对：由序列表的SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列组成的引物，和由序列表的SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列组成的引物。
[表1]
Figure 636654DEST_PATH_IMAGE001
在表2中，显示了根据实时PCR的基因组DNA的定量结果和在每种反应溶液组成中的基因组DNA的降解的抑制率。如表2所示，与反应溶液1（其中在反应溶液中的基因组DNA被完全降解）不同，在反应溶液3-5（它们是向其中加入了KCl或(NH4)2SO4的反应溶液，或其中增加了DTT浓度的反应溶液）中发现了DNA降解的抑制效果。具体地，在反应溶液4（向其中加入了(NH4)2SO4）和反应溶液5（其中增加了DTT浓度）中发现了DNA降解的高抑制效果。在这里，根据下式计算降解的抑制率：
抑制率(%) = 含有DNA酶I的反应溶液中的DNA的量/不含DNA酶I的反应溶液中的DNA的量×100
[表2]
  反应溶液1 反应溶液2 反应溶液3 反应溶液4 反应溶液5
DNA酶I (-) 216 ng 152 ng 188 ng 163 ng 140 ng
DNA酶I (+) 0 g 2.97 ng 5.43 ng 116 ng 119 ng
抑制率 0% 2% 3% 71% 85%
实施例2. 用于抑制EndoDNase活性的反应组成的研究-2
为了构建完全抑制endoDNase活性的反应组成，制备了6种20 μL反应溶液(反应溶液1-6)，它们含有5 U DNA酶I (TAKARA BIO INC.)、200 ng小鼠基因组DNA和在表3中列出的组分。另外，制备了6种20 μL反应溶液，它们具有相同的组成，但是不含DNA酶I。将这些反应溶液在37℃温育15分钟，然后在85℃温育5秒。接着，对每种反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳，从而确认DNA酶I对小鼠基因组DNA的降解。
[表3]
Figure 451026DEST_PATH_IMAGE002
电泳结果显示在图1中。如图1所示，在反应溶液1和2的组成中，通过DNA酶I的作用，基因组DNA的条带完全消失。另一方面，在反应溶液3和4的组成中，在有DNA酶I存在下，基因组DNA的条带没有完全消失，且可以确认模糊的电泳图像。从该内容可以确认，在反应溶液3和4中，DNA酶I活性被抑制。另外，由于在反应溶液4中抑制程度更大，因此可以确认(NH4)2SO4会以浓度依赖性的方式抑制DNA酶I活性。此外，在反应溶液5和6的组成中，甚至在有DNA酶I存在下，基因组DNA的条带根本不变化，所以可以确认，在这些反应溶液中，DNA酶I活性被完全抑制。从该内容可以确认，除了加入KCl和(NH4)2SO4或增加DTT浓度以外，调节Mg浓度可以进一步抑制DNA酶I活性。上述结果提示，可能如下进行另一个酶反应，而无需DNA酶I的作用：例如，在反应溶液1的组成中，用DNA酶I降解DNA，并加入单独制备的添加剂，从而具有成为反应溶液5或6的组成的终浓度。
实施例3. DNA酶活性的确认
在具有实施例2的表3的反应溶液2所列出的组分的反应溶液（在其中确认了DNA酶I对基因组DNA的降解）中，和在具有实施例2的表3的反应溶液5所列出的组分的反应溶液（在其中没有发现基因组DNA的降解）中，测量了DNA酶I的DNA酶活性。在这里，在下文中显示的DNA酶的活性单位是这样的：使用牛胸腺DNA作为底物，在1分钟内使反应溶液在OD 260的吸光度增加0.001的酶量，被定义为1 U。
首先，制备具有1 mL总体积的溶液，所述溶液含有：在表3的反应溶液2或5中列出的组分、100 μL DNA酶I (TAKARA BIO INC.，在产品上指示的滴度= 5 U/ μL)的60倍稀释液、和40 μg牛胸腺DNA，每分钟测量该溶液的吸光度(OD 260)，同时在25℃保持该溶液10分钟。结果，发现具有表3的反应溶液2所列出的组分的反应溶液具有39 U/ μL 稀释前的DNA酶I的活性(在产品上指示的滴度= 5 U/ μL)。另一方面，在表3的反应溶液5中列出的组分中，没有发现吸光度的变化。
接着，每分钟测量含有表3的反应溶液5所列出的组分、50 μL DNA酶I (5 U/ μL)和40 μg牛胸腺DNA的1-mL溶液的吸光度(OD 260)，同时在25℃保持该溶液10分钟。结果，在具有表3的反应溶液5所列出的组分的反应溶液中，没有发现吸光度的变化。
如上所述，与在产品上指示的滴度相比，具有表3的反应溶液2所列出的组分的反应溶液表现出约8倍的活性。另一方面，甚至在以测量具有表3的反应溶液2所列出的组分的反应溶液的活性时的30倍用量使用DNA酶I时，具有表3的反应溶液5所列出的组分的反应溶液也具有低于检测限的活性。从上述内容可以确认，在具有表3的反应溶液5所列出的组分的反应溶液中，DNA酶I的活性被完全抑制。
实施例4. 在反应组成中有DNA酶I存在下的反转录反应-1，DNA酶I没有表现出作用
在具有实施例2的表3的反应溶液5所列出的组分的反应溶液和具有实施例2的表3的反应溶液6所列出的组分的反应溶液中，在用反转录酶进行反转录反应的情况下，通过下述方法确认了反应溶液中的DNA酶I在cDNA合成中的影响。
制备具有10 μL总体积的混合溶液，所述混合溶液含有：由2 μg/ μL系列稀释至20 pg/ μL的1 μL-小鼠肝总RNA溶液、10 U RNA酶抑制剂(TAKARA BIO INC.)、在表3的反应溶液2中列出的组分和5 U DNA酶I。另外，制备除了不含DNA酶I以外具有与上述相同组成的10 μL-混合溶液。将这些混合溶液在42℃温育2分钟，然后在混合的同时，分别向其中加入各自10 μL量的含有下述物质的溶液：200 U PrimeScript(注册商标) RTase (TAKARA BIO INC)、20 U RNA酶抑制剂(TAKARA BIO INC.)、含有50 pmol寡dT引物和100 pmol随机6聚体的100 mM Tris-HCl (pH 9.2)、20 mM KCl、20 mM DTT、1 mM dNTP、或28 mM或56 mM (NH4)2SO4。换而言之，在DNA酶处理以后，将含有反转录酶的上述溶液加入混合溶液中，从而使得除了反转录酶、DNA酶I、RNA酶抑制剂和引物以外的组分的终浓度是在表3的反应溶液5中列出的那些组分或在表3的反应溶液6中列出的组分。接着，在37℃条件下进行反转录反应15分钟，然后在85℃条件下灭活反转录酶5秒。通过实时PCR（其中使用Rsp18基因区域作为靶向序列），评价在反转录反应以后合成的cDNA的量。在这里，在实时PCR中，使用SYBR Premix ExTaq (Perfect Real Time, TAKARA BIO INC.)，并使用下述引物作为引物对：由序列表的SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列组成的引物，和由序列表的SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列组成的引物。
实时PCR的结果显示在表4中。如表4所示，在有或没有DNA酶I存在下，Ct值没有差异。从所述结果可以确认，在具有表3的反应溶液5所列出的组分的反应溶液中，和在具有表3的反应溶液6所列出的组分的反应溶液中，DNA酶I不会影响反转录酶的cDNA合成。
[表4]
Figure 444128DEST_PATH_IMAGE003
实施例5. 在反应组成中有DNA酶I存在下的反转录反应-2，DNA酶I没有表现出作用
将在反应组成中有DNA酶I存在下（DNA酶I没有表现出作用）用反转录酶合成的cDNA的量，与用不含DNA酶I的标准反转录反应组成合成的cDNA的量进行了对比。
制备具有10 μL总体积的混合溶液，所述混合溶液含有：由2 μg/ μL系列稀释至20 pg/ μL的1 μL小鼠肝总RNA溶液、在实施例2的表3的反应溶液2中描述的组分和5 U DNA酶I。将该混合溶液在42℃温育2分钟，然后在混合的同时，向其中加入10 μL量的含有下述物质的溶液：200 U PrimeScript(注册商标) RTase (TAKARA BIO INC.)、20 U RNA酶抑制剂(TAKARA BIO INC.)、含有50 pmol寡dT引物和100 pmol随机6聚体的100 mM Tris-HCl (pH 9.2)、20 mM KCl、20 mM DTT、1 mM dNTP和28 mM (NH4)2SO4。换而言之，在DNA酶处理以后，将含有反转录酶的上述溶液加入混合溶液中，从而使得除了反转录酶、DNA酶I、RNA酶抑制剂和引物以外的组分的终浓度是在实施例2的表3的反应溶液5中列出的那些。接着，在37℃条件下进行反转录反应15分钟，然后在85℃条件下灭活反转录酶5秒。
另一方面，不含DNA酶I的标准反转录反应组成是具有10 μL总体积的反应溶液，其含有：1 μL由2 μg/ μL系列稀释至20 pg/ μL的小鼠肝总RNA溶液、200 U PrimeScript(注册商标) RTase (TAKARA BIO INC.)、20 U RNA酶抑制剂(TAKARA BIO INC.)、50 pmol寡dT引物和100 pmol随机6聚体、50 mM Tris-HCl (pH 8.3)、75 mM KCl和3 mM MgCl2。使用该反应溶液，在37℃条件下进行反转录反应15分钟，然后在85℃条件下灭活反转录酶5秒。
使用实时PCR（其中使用Rsp18基因区域作为靶向序列），评价在反转录反应以后合成的cDNA的量。在这里，在实时PCR中，使用SYBR Premix ExTaq (Perfect Real Time, TAKARA BIO INC.)，并使用下述引物作为引物对：由序列表的SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列组成的引物，和由序列表的SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列组成的引物。
实时PCR的结果显示在表5中。如表5所示，根据本发明的方法通过实时RT-PCR得到的Ct值与通过常规的标准实时RT-PCR得到的Ct值几乎一致。从上述内容确认，本发明的方法能够有效地进行反转录反应，同时完全抑制DNA酶I对cDNA合成产物的降解。
[表5]
Figure 711161DEST_PATH_IMAGE004
实施例6. 在反应组成中有DNA酶I存在下的反转录反应-3，DNA酶I没有表现出作用
将通过本发明的合成cDNA的方法得到的合成cDNA的量，与根据常规合成cDNA的方法（包括用DNA酶I降解样品中的DNA，然后热灭活DNA酶I）得到的合成cDNA的量进行了对比。
制备具有10 μL总体积的混合溶液，所述混合溶液含有：从2 μg/ μL系列稀释至20 pg/ μL的1 μL小鼠肝总RNA溶液、在实施例2的表3的反应溶液2中描述的组分和5 U DNA酶I。将该混合溶液在42℃温育2分钟，然后在混合的同时，向其中加入10 μL量的含有下述物质的溶液：200 U PrimeScript(注册商标) RTase (TAKARA BIO INC.)、20 U RNA酶抑制剂(TAKARA BIO INC.)、含有50 pmol寡dT引物和100 pmol随机6聚体的100 mM Tris-HCl (pH 9.2)、20 mM KCl、20 mM DTT、1 mM dNTP和28 mM (NH4)2SO4。换而言之，在DNA酶处理以后，将含有反转录酶的上述溶液加入混合溶液中，从而使得除了反转录酶、DNA酶I、RNA酶抑制剂和引物以外的组分的终浓度是在实施例2的表3的反应溶液5中列出的那些。接着，在37℃条件下进行反转录反应15分钟，然后在85℃条件下灭活反转录酶5秒。
另一方面，在常规合成cDNA的方法（其中热灭活DNA酶I）中，制备具有10 μL总体积的混合溶液，所述混合溶液含有：1 μL从2 μg/ μL系列稀释至20 pg/ μL的小鼠肝总RNA溶液、在实施例2的表3的反应溶液1中列出的组分和5 U DNA酶I，并在42℃温育该混合溶液2分钟，然后在95℃温育10分钟，以热灭活DNA酶I。在混合的同时，向其中加入10 μL量的含有下述物质的溶液：200 U PrimeScript(注册商标) RTase (TAKARA BIO INC.)、20 U RNA酶抑制剂(TAKARA BIO INC.)、50 pmol寡dT引物、100 pmol随机6聚体、100 mM Tris-HCl (pH 8.3)、300 mM KCl、12 mM MgCl2和1 mM dNTP。换而言之，在DNA酶处理和DNA酶的热灭活处理以后，将含有反转录酶的上述溶液加入混合溶液中，以得到具有标准反转录反应组成的组合物。接着，在37℃条件下进行反转录反应15分钟，然后在85℃条件下灭活反转录酶5秒。
通过实时PCR（其中使用Rsp18基因区域作为靶向序列），评价在反转录反应以后合成的cDNA的量。在这里，在实时PCR中，使用SYBR Premix ExTaq (Perfect Real Time, TAKARA BIO INC.)，并使用下述引物作为引物对：由序列表的SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列组成的引物，和由序列表的SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列组成的引物。
实时PCR的结果显示在表6中。如表6所示，发现与通过根据本发明的方法的实时RT-PCR得到的Ct值相比，在使用通过常规合成cDNA的方法（包括降解样品中的DNA，然后热灭活DNA酶I）得到的cDNA作为模板的情况下的Ct值延迟了2个循环左右。认为该延迟的原因是，在热灭活DNA酶I时，用作cDNA合成模板的RNA的降解。本发明的实施例确认了本发明的合成cDNA的方法（其中不需要热灭活DNA酶I）的有用性。
[表6]
Figure 582165DEST_PATH_IMAGE005
实施例7. 本发明方法中的基因组DNA的降解
通过下述方法，确认了通过进行本发明的合成cDNA的方法对样品中的DNA的降解。
首先，制备了具有10 μL总体积的混合溶液，所述混合溶液含有：1 μL 200 ng/ μL小鼠基因组DNA溶液、10 U RNA酶抑制剂(TAKARA BIO INC.)、在表3的反应溶液2中列出的组分和5 U DNA酶I。另外，制备除了不含DNA酶I以外具有与上述相同组成的10 μL-混合溶液。将这些混合溶液在42℃温育2分钟，然后在混合的同时，向其中加入10 μL量的含有下述物质的溶液：20 U RNA酶抑制剂(TAKARA BIO INC.)、含有50 pmol寡dT引物和100 pmol随机6聚体的100 mM Tris-HCl (pH 9.2)、20 mM KCl、20 mM DTT、1 mM dNTP和28 mM (NH4)2SO4。换而言之，在DNA酶处理以后，将上述溶液加入混合溶液中，从而使得除了DNA酶I、RNA酶抑制剂和引物以外的组分的终浓度是在表3的反应溶液5中列出的那些组分。接着，在37℃进行反应15分钟，然后在85℃保持5秒。通过40个循环的实时PCR（其中使用Rsp18基因区域作为靶向序列），评价在反应以后剩余的小鼠基因组DNA的量。在这里，在实时PCR中，使用SYBR Premix ExTaq (Perfect Real Time, TAKARA BIO INC.)，并使用下述引物作为引物对：由序列表的SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列组成的引物，和由序列表的SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列组成的引物。
作为实时PCR的结果，在使用不含DNA酶I的混合溶液的情况下，Ct值是22.68，而在使用含有DNA酶I的混合溶液的情况下，根本没有确认到扩增产物。从所述结果确认，本发明的合成cDNA的方法能够避免从样品中的污染DNA衍生出的扩增产物的生成。
实施例8. 根据本发明方法的cDNA合成的效率
将根据本发明方法的cDNA合成的效率与根据DNA酶I和反转录酶同时起作用的方法的cDNA合成效率进行了对比。
(1)     模板RNA
使用从2 μg/ μL系列稀释至20 pg/ μL的小鼠肝总RNA溶液作为模板，在所述溶液中，去除了基因组DNA，并根据总RNA提取试剂盒NucleoSpin(注册商标) RNA II (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG)的标准方案进行了纯化。
(2)根据DNA酶I和反转录酶同时起作用的方法的cDNA合成
制备了具有20 μL总体积的混合溶液，所述混合溶液含有：1 μL上述模板RNA溶液、在实施例2的表3的反应溶液1中列出的组分、0.5 mM dNTP、200 U PrimeScript(注册商标) RTase (TAKARA BIO INC.)、20 U RNA酶抑制剂(TAKARA BIO INC.)、50 pmol寡dT引物、100 pmol随机6聚体和5 U DNA酶I，其中模板RNA在每种混合溶液中具有不同的浓度，共有6种混合溶液。另外，通过加入1 μL无菌蒸馏水来替代模板RNA溶液，制备混合溶液。作为对照，还制备了除了不含有DNA酶I以外具有与上述相同组成的20 μL-混合溶液。对于如此制备的每种混合溶液，在37℃条件下进行反转录反应15分钟，然后在85℃条件下灭活反转录酶5秒。
(3)根据本发明方法的cDNA合成
制备了具有10 μL总体积的混合溶液，所述混合溶液含有：1 μL在上述(1)中描述的模板RNA溶液、在实施例2的表3的反应溶液2中列出的组分和5 U DNA酶I，其中模板RNA在每种混合溶液中具有不同的浓度，共有6种混合溶液。另外，通过加入1 μL无菌蒸馏水来替代模板RNA溶液，制备混合溶液。作为对照，还制备了除了不含有DNA酶I以外具有与上述相同组成的10 μL-混合溶液。将如此制备的混合溶液在42℃温育2分钟，然后在混合的同时向其中加入含有下述物质的10 μL-溶液：200 U PrimeScript(注册商标) RTase (TAKARA BIO INC.)、20 U RNA酶抑制剂(TAKARA BIO INC.)、含有50 pmol寡dT引物和100 pmol随机6聚体的100 mM Tris-HCl (pH 9.2)、20 mM KCl、20 mM DTT、1 mM dNTP和28 mM (NH4)2SO4。换而言之，在DNA酶处理以后，将含有反转录酶的上述溶液加入混合溶液中，从而使得除了反转录酶、DNA酶I、RNA酶抑制剂和引物以外的组分的终浓度是在实施例2的表3的反应溶液5中列出的那些组分(反应溶液的终体积：20 μL)。接着，在37℃下进行反转录反应15分钟，然后在85℃条件下灭活反转录酶5秒。
(4) 使用实时PCR评价合成的cDNA的量
使用实时PCR（其中使用Rsp18基因区域作为靶向序列），评价了在上述(2)和(3)中得到的合成的cDNA的量。在这里，在实时PCR中，使用SYBR Premix ExTaq (Perfect Real Time, TAKARA BIO INC.)，并使用下述引物作为引物对：由序列表的SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列组成的引物，和由序列表的SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列组成的引物。实时PCR的结果显示在表7和图2中。在表7和图2中，“(3)”显示了其中使用实时PCR评价根据上述(3)得到的合成的cDNA的量的结果，“(2)”显示了其中使用实时PCR评价根据上述(2)得到的合成的cDNA的量的结果。
[表7]
Figure 251044DEST_PATH_IMAGE006
如表7和图2所示，在DNA酶I和反转录同时起作用的方法中，换而言之，在方法(2)的DNA酶(+)中，DNA酶降低了合成的cDNA的量，所以Ct值增加。其原因包括：DNA酶对在反转录反应中合成的cDNA的降解。另一方面，在本发明的方法中，没有发现DNA酶对cDNA合成的影响。
产业实用性
本发明的用于合成cDNA的方法和试剂盒可广泛地用于基因工程领域。
序列表说明
SEQ ID NO: 1；用于扩增小鼠Rsp18基因的cDNA片段的引物。
SEQ ID NO: 2；用于扩增小鼠Rsp18基因的cDNA片段的引物。
                         序列表
 
<110>  TAKARA BIO INC.
 
<120>  合成cDNA的方法
 
<130>  11-013-PCTJP
 
<150>  JP 2010-111595
<151>  2010-05-14
 
<160>  2    
 
<170>  PatentIn 3.5版
 
<210>  1
<211>  23
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  用于扩增小鼠Rsp18基因的cDNA片段的引物.
 
<400>  1
ttctggccaa cggtctagac aac                                               23
 
 
<210>  2
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  用于扩增小鼠Rsp18基因的cDNA片段的引物.
 
<400>  2
ccagtggtct tggtgtgctg a                                                 21

Claims (8)

1.一种合成cDNA的方法，其特征在于，制备不需要热灭活脱氧核糖核酸内切酶或去除脱氧核糖核酸内切酶即可使脱氧核糖核酸内切酶不表现出其活性的反应溶液，并进行反转录反应，
其中所述反应溶液含有处理过的样品和反转录酶，所述处理过的样品如下形成：用脱氧核糖核酸内切酶处理包含RNA和DNA的样品，以降解所述样品中的DNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括下述步骤(a)至(c)：
(a) 得到组合物，所述组合物包含含有RNA和DNA的样品和脱氧核糖核酸内切酶；
(b) 在足以降解所述样品中的DNA的条件下，用脱氧核糖核酸内切酶处理在步骤(a)中得到的组合物；和
(c) 将添加剂和反转录酶加入在步骤(b)中处理过的组合物中，以制备使脱氧核糖核酸内切酶不表现出其活性的反应溶液，并使用反转录酶进行反转录反应。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述脱氧核糖核酸内切酶是脱氧核糖核酸酶I。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述反转录酶是从莫洛尼鼠白血病病毒衍生出的反转录酶。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述添加剂是选自还原剂、一价阳离子和其盐中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述一价阳离子是铵离子。
7.一种扩增cDNA的方法，所述方法包括下述步骤：使用根据权利要求1-6中任一项所定义的方法合成的cDNA作为模板，进行基因扩增反应。
8.一种用于权利要求1-7中任一项所定义的方法中的试剂盒，所述试剂盒包含下述的(A)至(D)：
(A)脱氧核糖核酸内切酶，
(B)缓冲剂，
(C)反转录酶，和
(D)添加剂，其用于制备使所述反转录酶表现出其活性，且使所述脱氧核糖核酸内切酶不表现出其活性的反转录反应用组合物。
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