CN110229809A - 一种Rochel反转录试剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种Rochel反转录试剂及其制备方法，具体涉及细胞生物科技领域，包括去离子水、EASY Dilution for Real Time PCR、gDNA Eraser、5x gDNA Eraser Buffer、RNase抑制剂和基因引物，所述基因引物包括端粒酶反转录酶、酸甘油醛脱氢酶、碱性磷酸酶、核心结合因子、骨涎蛋白、骨钙素、骨桥素和Ⅰ型胶原蛋白。本发明通过设有多种组合基因引物，便于骨质细胞繁殖，应用过程中反转录速度快，且成活率高，生长率好，有利于牙周膜再生治疗研究，生产过程中无菌处理，并采用低温储存，反转录试剂质量好，储备时间长，能够满足DNA生物合成需要。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生物科技领域，更具体地说，本发明涉及一种Rochel反转录试剂及其制备方法。
背景技术
牙周膜是连接牙骨质和牙槽骨的结缔组织，牙周膜细胞(periodontal ligamentcells，PDLCs)中有多种细胞群体，主要有成纤维细胞，成牙骨质细胞，造骨细胞，内皮细胞，Malaseez上皮细胞，破骨细胞等。近年来的研究发现PDLCs有类似间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)功能的细胞，能在体外分化为成骨细胞，脂肪细胞及神经样细胞，使牙周组织的再生成为可能,遗憾的是牙周膜的再生机制尚不明晰。牙周膜的再生研究方面,主要受限于原代PDLCs的传代培养会降低细胞的分化潜能，并失去原代特性,比如,不同代数牙周膜的成骨分化能力差异非常大。所以建立与原代PDLCs表型和生长特性相同,并能稳定传代的PDLCs细胞系，对牙周膜再生机制的研究提供细胞平台,有着重大的意义。
构建保留原代细胞特征的稳定的人PDLCs细胞系存在诸多难点。Kamata等人通过共转染hTERT和人乳头状瘤细胞病毒16成功构建了人PDLCs系，可是这些细胞失去了钙化潜能。通过导入各种抑癌基因以期构建稳定的细胞系时，细胞的形态，生长状态都可能发生改变。而人端粒反转转录酶(Human telomerase reverse transcriptase,hTERT)是细胞内正常基因，诱导端粒长度伸长并延伸体细胞的复制寿命，相对于传统的永生化基因，端粒酶转染建立的细胞系是正常细胞而非转化细胞，具有正常的核型和生长速度。
通过慢病毒过表达hTERT可以构建PDLCs细胞系，但hTERT基因片段大，重组病毒的滴度不高，表达hTERT效率低，效果不理想。而重组腺病毒是比较高效和可靠的重组病毒表达系统之一，其病毒滴度高，可以更有效地介导hTERT的表达。
因此，发明一种Rochel反转录试剂及其制备方法来表达hTERT，对研究牙周膜再生治疗方面很有必要。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的实施例提供一种Rochel反转录试剂及其制备方法，通过设有多种组合基因引物，端粒酶反转录酶、酸甘油醛脱氢酶、碱性磷酸酶、核心结合因子、骨涎蛋白、骨钙素、骨桥素和Ⅰ型胶原蛋白，便于骨质细胞繁殖，RNA反转录cDNA错误率低，应用过程中反转录速度快，且成活率高，生长率好，有利于牙周膜再生治疗研究。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种Rochel反转录试剂，其中所使用的主料按重量计包括：去离子水2-3ml、EASY Dilution for Real Time PCR1-2ml、gDNAEraser0.1-0.3ml、5x gDNA Eraser Buffer0.2-0.4ml、RNase抑制剂0.03-0.05ml和基因引物0.3-0.5ml，所述基因引物包括端粒酶反转录酶0.05-0.1ml、酸甘油醛脱氢酶0.05-0.1ml、碱性磷酸酶0.04-0.06ml、核心结合因子0.04-0.06ml、骨涎蛋白0.03-0.05ml、骨钙素0.03-0.05ml、骨桥素0.02-0.04ml和Ⅰ型胶原蛋白0.02-0.04ml。
优选的，所述基因引物中各引物序列具体如下：
端粒酶反转录酶：F:5’-TCTGGGATGCGAACGGGC-3’；R:5’-TCCGGCTCAGGGGCAGC-3’；
磷酸甘油醛脱氢酶:F:5’-GGAGTCCACTGGCGTCTTC-3’；R:5’–GCTGATGATCTTGAGGCTGTTG-3’
端粒酶反转录酶：F:5’-CTCGTTGACACCTGGAAGAGCTTCAAACCG-3’,R:5’-GGTCCGTCACGTTGTTCCTGTTCAGC-3’；
核心结合因子：F:5’-CACTATCCAGCCACCTTTAC-3’，R:5’-ATCAGCGTCAACATC-3’；
骨涎蛋白:F:5’-CATAGCCATCGTATCCTTGTCCT-3’,R:5’–CTATGGAGAGGACGCCACGCCTGG-3’；
骨钙素：F：5’-GCAGAGTCCAGCAAAGGGTG-3’，R：5’-GTCAGCAACTCGTCACAG-3’；
骨桥素:F:5’-CCAAGTAAGTCCAACGAAAG-3’,R:5’-GGTGATGTCCTCGTCTGTA-3’；
Ⅰ型胶原蛋白:F:5’-AGGGCTCCAACGAGATCGAGATCCG-3’,R:5’-TACAGGAAGCAGACAGGGCCAACGTCG-3’。
一种Rochel反转录试剂的制备方法，具体操作步骤为：
步骤一：使用干热灭菌法处理RNA实验专用玻璃容器，并使用0.1％的DEPC处理去离子水后对去离子水进行高温高压灭菌；
步骤二：将步骤一中制备的去离子水加入玻璃容器，并按比例加入EASY Dilutionfor Real Time PCR、gDNA Eraser、5x gDNA Eraser Buffer和RNase抑制剂搅拌均匀，制得稀释溶剂；
步骤三：在步骤二中制备的稀释溶剂中按比例加入端粒酶反转录酶、酸甘油醛脱氢酶、碱性磷酸酶、核心结合因子、骨涎蛋白、骨钙素、骨桥素和Ⅰ型胶原蛋白轻轻搅拌，混合均匀后2000rpm离心20-30s，制得Rochel反转录试剂半成品；
步骤四：将步骤三中制备的Rochel反转录试剂半成品脱泡处理，利用超声波空化除泡，并对除泡后的反转录试剂保温处理，得到Rochel反转录试剂成品；
步骤五：取经过灭菌处理且无核酸酶的0.2ml离心管，使用注射器将步骤四得到的Rochel反转录试剂成品均匀注射到多个离心管内真空分装，并及时将分装好的Rochel反转录试剂低温存储。
优选的，所述步骤一中RNA实验专用玻璃容器加热温度设置为180-190℃，所述加热时间设置为50-60min。
优选的，所述步骤二中5x gDNA Eraser Buffer使用前用Vortex震荡混匀，并使用离心机离心后使用。
优选的，所述步骤四中保温处理设置为分级升温处理，处理方式具体为：
先将反转录试剂在35-37℃环境下保温静置，保温时间设置为45-60min，再将温度缓慢升至68-70℃环境下保温静置，保温时间设置为10-15min。
优选的，所述步骤五中注射器使用一次性注射器，存储环境温度设置为-30--20℃，所述Rochel反转录试剂的整个制备过程采用无菌环境。
本发明的技术效果和优点：
1、通过设有多种组合基因引物，端粒酶反转录酶、酸甘油醛脱氢酶、碱性磷酸酶、核心结合因子、骨涎蛋白、骨钙素、骨桥素和Ⅰ型胶原蛋白，便于骨质细胞繁殖，RNA反转录cDNA错误率低，应用过程中反转录速度快，且成活率高，生长率好，有利于牙周膜再生治疗研究；
2、通过本方案的五个步骤制备反转录试剂，方法简单高效，而且生产过程中无菌处理，并采用低温储存，制备的反转录试剂质量好，储备时间长，能够满足DNA生物合成需要，便于推广使用。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
本发明提供了一种Rochel反转录试剂，其中所使用的主料按重量计包括：去离子水2ml、EASY Dilution for Real Time PCR1ml、gDNA Eraser0.1ml、5x gDNA EraserBuffer0.2ml、RNase抑制剂0.03ml和基因引物0.3ml，所述基因引物包括端粒酶反转录酶0.05ml、酸甘油醛脱氢酶0.05ml、碱性磷酸酶0.04ml、核心结合因子0.04ml、骨涎蛋白0.03ml、骨钙素0.03ml、骨桥素0.02ml和Ⅰ型胶原蛋白0.02ml；
进一步的，所述基因引物中各引物序列具体如下：
端粒酶反转录酶：F:5’-TCTGGGATGCGAACGGGC-3’；R:5’-TCCGGCTCAGGGGCAGC-3’；
磷酸甘油醛脱氢酶:F:5’-GGAGTCCACTGGCGTCTTC-3’；R:5’–GCTGATGATCTTGAGGCTGTTG-3’
端粒酶反转录酶：F:5’-CTCGTTGACACCTGGAAGAGCTTCAAACCG-3’,R:5’-GGTCCGTCACGTTGTTCCTGTTCAGC-3’；
核心结合因子：F:5’-CACTATCCAGCCACCTTTAC-3’，R:5’-ATCAGCGTCAACATC-3’；
骨涎蛋白:F:5’-CATAGCCATCGTATCCTTGTCCT-3’,R:5’–CTATGGAGAGGACGCCACGCCTGG-3’；
骨钙素：F：5’-GCAGAGTCCAGCAAAGGGTG-3’，R：5’-GTCAGCAACTCGTCACAG-3’；
骨桥素:F:5’-CCAAGTAAGTCCAACGAAAG-3’,R:5’-GGTGATGTCCTCGTCTGTA-3’；
Ⅰ型胶原蛋白:F:5’-AGGGCTCCAACGAGATCGAGATCCG-3’,R:5’-TACAGGAAGCAGACAGGGCCAACGTCG-3’；
一种Rochel反转录试剂的制备方法，具体操作步骤为：
步骤一：使用干热灭菌法处理RNA实验专用玻璃容器，加热温度设置为180℃，所述加热时间设置为50min，并使用0.1％的DEPC处理去离子水后对去离子水进行高温高压灭菌；
步骤二：将步骤一中制备的去离子水加入玻璃容器，并按比例加入EASY Dilutionfor Real Time PCR、gDNA Eraser、5x gDNA Eraser Buffer和RNase抑制剂搅拌均匀，制得稀释溶剂，5x gDNA Eraser Buffer使用前用Vortex震荡混匀，并使用离心机离心后使用；
步骤三：在步骤二中制备的稀释溶剂中按比例加入端粒酶反转录酶、酸甘油醛脱氢酶、碱性磷酸酶、核心结合因子、骨涎蛋白、骨钙素、骨桥素和Ⅰ型胶原蛋白轻轻搅拌，混合均匀后2000rpm离心20s，制得Rochel反转录试剂半成品；
步骤四：将步骤三中制备的Rochel反转录试剂半成品脱泡处理，利用超声波空化除泡，并对除泡后的反转录试剂保温处理，保温处理设置为分级升温处理，处理方式具体为：先将反转录试剂在35℃环境下保温静置，保温时间设置为45min，再将温度缓慢升至68℃环境下保温静置，保温时间设置为10min得到Rochel反转录试剂成品；
步骤五：取经过灭菌处理且无核酸酶的0.2ml离心管，使用注射器将步骤四得到的Rochel反转录试剂成品均匀注射到多个离心管内真空分装，注射器使用一次性注射器，所述Rochel反转录试剂的整个制备过程采用无菌环境，并及时将分装好的Rochel反转录试剂低温存储，存储环境温度设置为-30℃。
本实施例中制备的Rochel反转录试剂纯净度高，无杂质和细菌滋生，质地均匀，存储时间长，另外本实施例中对制备的Rochel反转录试剂进行RNA反转录测试，结果显示：42℃环境DNA去除反应时间为2.5min，37℃和85℃反转录反应时间为16.1min，总计用时18.6min，反应完成一段时间后cDNA存活率为90.2％，对PCR扩增量测量显示扩增1kpg。
实施例2：
本发明提供了一种Rochel反转录试剂，其中所使用的主料按重量计包括：去离子水2.5ml、EASY Dilution for Real Time PCR1.5ml、gDNA Eraser0.2ml、5x gDNA EraserBuffer0.3ml、RNase抑制剂0.04ml和基因引物0.4ml，所述基因引物包括端粒酶反转录酶0.08ml、酸甘油醛脱氢酶0.07ml、碱性磷酸酶0.05ml、核心结合因子0.05ml、骨涎蛋白0.04ml、骨钙素0.04ml、骨桥素0.03ml和Ⅰ型胶原蛋白0.03ml；
进一步的，所述基因引物中各引物序列具体如下：
端粒酶反转录酶：F:5’-TCTGGGATGCGAACGGGC-3’；R:5’-TCCGGCTCAGGGGCAGC-3’；
磷酸甘油醛脱氢酶:F:5’-GGAGTCCACTGGCGTCTTC-3’；R:5’–GCTGATGATCTTGAGGCTGTTG-3’
端粒酶反转录酶：F:5’-CTCGTTGACACCTGGAAGAGCTTCAAACCG-3’,R:5’-GGTCCGTCACGTTGTTCCTGTTCAGC-3’；
核心结合因子：F:5’-CACTATCCAGCCACCTTTAC-3’，R:5’-ATCAGCGTCAACATC-3’；
骨涎蛋白:F:5’-CATAGCCATCGTATCCTTGTCCT-3’,R:5’–CTATGGAGAGGACGCCACGCCTGG-3’；
骨钙素：F：5’-GCAGAGTCCAGCAAAGGGTG-3’，R：5’-GTCAGCAACTCGTCACAG-3’；
骨桥素:F:5’-CCAAGTAAGTCCAACGAAAG-3’,R:5’-GGTGATGTCCTCGTCTGTA-3’；
Ⅰ型胶原蛋白:F:5’-AGGGCTCCAACGAGATCGAGATCCG-3’,R:5’-TACAGGAAGCAGACAGGGCCAACGTCG-3’；
一种Rochel反转录试剂的制备方法，具体操作步骤为：
步骤一：使用干热灭菌法处理RNA实验专用玻璃容器，加热温度设置为185℃，所述加热时间设置为55min，并使用0.1％的DEPC处理去离子水后对去离子水进行高温高压灭菌；
步骤二：将步骤一中制备的去离子水加入玻璃容器，并按比例加入EASY Dilutionfor Real Time PCR、gDNA Eraser、5x gDNA Eraser Buffer和RNase抑制剂搅拌均匀，制得稀释溶剂，5x gDNA Eraser Buffer使用前用Vortex震荡混匀，并使用离心机离心后使用；
步骤三：在步骤二中制备的稀释溶剂中按比例加入端粒酶反转录酶、酸甘油醛脱氢酶、碱性磷酸酶、核心结合因子、骨涎蛋白、骨钙素、骨桥素和Ⅰ型胶原蛋白轻轻搅拌，混合均匀后2000rpm离心25s，制得Rochel反转录试剂半成品；
步骤四：将步骤三中制备的Rochel反转录试剂半成品脱泡处理，利用超声波空化除泡，并对除泡后的反转录试剂保温处理，保温处理设置为分级升温处理，处理方式具体为：先将反转录试剂在36℃环境下保温静置，保温时间设置为48min，再将温度缓慢升至69℃环境下保温静置，保温时间设置为13min得到Rochel反转录试剂成品；
步骤五：取经过灭菌处理且无核酸酶的0.2ml离心管，使用注射器将步骤四得到的Rochel反转录试剂成品均匀注射到多个离心管内真空分装，注射器使用一次性注射器，所述Rochel反转录试剂的整个制备过程采用无菌环境，并及时将分装好的Rochel反转录试剂低温存储，存储环境温度设置为-25℃。
对比实施例1，本实施例中制备的Rochel反转录试剂纯净度高，无杂质和细菌滋生，质地均匀，存储时间长，另外本实施例中对制备的Rochel反转录试剂进行RNA反转录测试，结果显示：42℃环境DNA去除反应时间为2.0min，37℃和85℃反转录反应时间为15.2min，总计用时17.2min，反应完成一段时间后cDNA存活率为95.6％，对PCR扩增量测量显示扩增3kpg。
实施例3：
本发明提供了一种Rochel反转录试剂，其中所使用的主料按重量计包括：去离子水3ml、EASY Dilution for Real Time PCR2ml、gDNA Eraser0.3ml、5x gDNA EraserBuffer0.4ml、RNase抑制剂0.05ml和基因引物0.5ml，所述基因引物包括端粒酶反转录酶0.1ml、酸甘油醛脱氢酶0.1ml、碱性磷酸酶0.06ml、核心结合因子0.06ml、骨涎蛋白0.05ml、骨钙素0.05ml、骨桥素0.04ml和Ⅰ型胶原蛋白0.04ml；
进一步的，所述基因引物中各引物序列具体如下：
端粒酶反转录酶：F:5’-TCTGGGATGCGAACGGGC-3’；R:5’-TCCGGCTCAGGGGCAGC-3’；
磷酸甘油醛脱氢酶:F:5’-GGAGTCCACTGGCGTCTTC-3’；R:5’–GCTGATGATCTTGAGGCTGTTG-3’
端粒酶反转录酶：F:5’-CTCGTTGACACCTGGAAGAGCTTCAAACCG-3’,R:5’-GGTCCGTCACGTTGTTCCTGTTCAGC-3’；
核心结合因子：F:5’-CACTATCCAGCCACCTTTAC-3’，R:5’-ATCAGCGTCAACATC-3’；
骨涎蛋白:F:5’-CATAGCCATCGTATCCTTGTCCT-3’,R:5’–CTATGGAGAGGACGCCACGCCTGG-3’；
骨钙素：F：5’-GCAGAGTCCAGCAAAGGGTG-3’，R：5’-GTCAGCAACTCGTCACAG-3’；
骨桥素:F:5’-CCAAGTAAGTCCAACGAAAG-3’,R:5’-GGTGATGTCCTCGTCTGTA-3’；
Ⅰ型胶原蛋白:F:5’-AGGGCTCCAACGAGATCGAGATCCG-3’,R:5’-TACAGGAAGCAGACAGGGCCAACGTCG-3’；
一种Rochel反转录试剂的制备方法，具体操作步骤为：
步骤一：使用干热灭菌法处理RNA实验专用玻璃容器，加热温度设置为190℃，所述加热时间设置为60min，并使用0.1％的DEPC处理去离子水后对去离子水进行高温高压灭菌；
步骤二：将步骤一中制备的去离子水加入玻璃容器，并按比例加入EASY Dilutionfor Real Time PCR、gDNA Eraser、5x gDNA Eraser Buffer和RNase抑制剂搅拌均匀，制得稀释溶剂，5x gDNA Eraser Buffer使用前用Vortex震荡混匀，并使用离心机离心后使用；
步骤三：在步骤二中制备的稀释溶剂中按比例加入端粒酶反转录酶、酸甘油醛脱氢酶、碱性磷酸酶、核心结合因子、骨涎蛋白、骨钙素、骨桥素和Ⅰ型胶原蛋白轻轻搅拌，混合均匀后2000rpm离心30s，制得Rochel反转录试剂半成品；
步骤四：将步骤三中制备的Rochel反转录试剂半成品脱泡处理，利用超声波空化除泡，并对除泡后的反转录试剂保温处理，保温处理设置为分级升温处理，处理方式具体为：先将反转录试剂在37℃环境下保温静置，保温时间设置为60min，再将温度缓慢升至70℃环境下保温静置，保温时间设置为15min得到Rochel反转录试剂成品；
步骤五：取经过灭菌处理且无核酸酶的0.2ml离心管，使用注射器将步骤四得到的Rochel反转录试剂成品均匀注射到多个离心管内真空分装，注射器使用一次性注射器，所述Rochel反转录试剂的整个制备过程采用无菌环境，并及时将分装好的Rochel反转录试剂低温存储，存储环境温度设置为-20℃。
对比实施例1和2，本实施例中制备的Rochel反转录试剂纯净度高，无杂质和细菌滋生，质地均匀，存储时间长，另外本实施例中对制备的Rochel反转录试剂进行RNA反转录测试，结果显示：42℃环境DNA去除反应时间为2.1min，37℃和85℃反转录反应时间为15.3min，总计用时17.4min，反应完成一段时间后cDNA存活率为94.5％，对PCR扩增量测量显示扩增3kpg。
根据实施例1-3得出下表：
由上表可知，实施例2中原材料比例适中，加工温度和时间适中，实施例2的加工工艺生产出的Rochel反转录试剂性能最佳，在实际使用中的反应时间最短，反转录最快，另外，能够保证cDNA存活率的最大成活率，PCR扩增量有保证，便于获得优质PDLCs细胞系研究群落，提高hTERT表达效率。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种Rochel反转录试剂，其特征在于：其中所使用的主料按重量计包括：去离子水2-3ml、EASY Dilution for Real Time PCR 1-2ml、gDNA Eraser 0.1-0.3ml、5 x gDNAEraser Buffer 0.2-0.4ml、RNase抑制剂0.03-0.05ml和基因引物0.3-0.5ml，所述基因引物包括端粒酶反转录酶0.05-0.1ml、酸甘油醛脱氢酶0.05-0.1ml、碱性磷酸酶0.04-0.06ml、核心结合因子0.04-0.06ml、骨涎蛋白0.03-0.05ml、骨钙素0.03-0.05ml、骨桥素0.02-0.04ml和Ⅰ型胶原蛋白0.02-0.04ml。
2.根据权利要求1所述的一种Rochel反转录试剂，其特征在于：所述基因引物中各引物序列具体如下：
端粒酶反转录酶：F:5’-TCTGGGATGCGAACGGGC-3’；R:5’-TCCGGCTCAGGGGCAGC-3’；
磷酸甘油醛脱氢酶:F:5’-GGAGTCCACTGGCGTCTTC-3’；R:5’–GCTGATGATCTTGAGGCTGTTG-3’
端粒酶反转录酶：F:5’-CTCGTTGACACCTGGAAGAGCTTCAAACCG-3’,R:5’-GGTCCGTCACGTTGTTCCTGTTCAGC-3’；
核心结合因子：F:5’-CACTATCCAGCCACCTTTAC-3’，R:5’-ATCAGCGTCAACATC-3’；
骨涎蛋白:F:5’-CATAGCCATCGTATCCTTGTCCT-3’,R:5’–CTATGGAGAGGACGCCACGCCTGG-3’；
骨钙素：F：5’-GCAGAGTCCAGCAAAGGGTG-3’，R：5’-GTCAGCAACTCGTCACAG-3’；
骨桥素:F:5’-CCAAGTAAGTCCAACGAAAG-3’,R:5’-GGTGATGTCCTCGTCTGTA-3’；
Ⅰ型胶原蛋白:F:5’-AGGGCTCCAACGAGATCGAGATCCG-3’,R:5’-TACAGGAAGCAGACAGGGCCAACGTCG-3’。
3.一种Rochel反转录试剂的制备方法，其特征在于：具体操作步骤为：
步骤一：使用干热灭菌法处理RNA实验专用玻璃容器，并使用0.1％的DEPC处理去离子水后对去离子水进行高温高压灭菌；
步骤二：将步骤一中制备的去离子水加入玻璃容器，并按比例加入EASY Dilution forReal Time PCR、gDNA Eraser、5 x gDNA Eraser Buffer和RNase抑制剂搅拌均匀，制得稀释溶剂；
步骤三：在步骤二中制备的稀释溶剂中按比例加入端粒酶反转录酶、酸甘油醛脱氢酶、碱性磷酸酶、核心结合因子、骨涎蛋白、骨钙素、骨桥素和Ⅰ型胶原蛋白轻轻搅拌，混合均匀后2000rpm离心20-30s，制得Rochel反转录试剂半成品；
步骤四：将步骤三中制备的Rochel反转录试剂半成品脱泡处理，利用超声波空化除泡，并对除泡后的反转录试剂保温处理，得到Rochel反转录试剂成品；
步骤五：取经过灭菌处理且无核酸酶的0.2ml离心管，使用注射器将步骤四得到的Rochel反转录试剂成品均匀注射到多个离心管内真空分装，并及时将分装好的Rochel反转录试剂低温存储。
4.根据权利要求3所述的一种Rochel反转录试剂的制备方法，其特征在于：所述步骤一中RNA实验专用玻璃容器加热温度设置为180-190℃，所述加热时间设置为50-60min。
5.根据权利要求3所述的一种Rochel反转录试剂的制备方法，其特征在于：所述步骤二中5 x gDNA Eraser Buffer使用前用Vortex震荡混匀，并使用离心机离心后使用。
6.根据权利要求3所述的一种Rochel反转录试剂的制备方法，其特征在于：所述步骤四中保温处理设置为分级升温处理，处理方式具体为：
先将反转录试剂在35-37℃环境下保温静置，保温时间设置为45-60min，再将温度缓慢升至68-70℃环境下保温静置，保温时间设置为10-15min。
7.根据权利要求3所述的一种Rochel反转录试剂的制备方法，其特征在于：所述步骤五中注射器使用一次性注射器，存储环境温度设置为-30--20℃，所述Rochel反转录试剂的整个制备过程采用无菌环境。
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| CN201910534645.6A Pending CN110229809A (zh) | 2019-06-20 | 2019-06-20 | 一种Rochel反转录试剂及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110229809A (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102884186A (zh) * | 2010-05-14 | 2013-01-16 | 宝生物工程株式会社 | 合成cDNA的方法 |
-
2019
- 2019-06-20 CN CN201910534645.6A patent/CN110229809A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102884186A (zh) * | 2010-05-14 | 2013-01-16 | 宝生物工程株式会社 | 合成cDNA的方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
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| 孙贵军: "腺病毒介导的过表达hTERT牙周膜细胞系的建立及成骨能力初探", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》 * |
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| 百度文库: "primescript rt reagent kit with gDNA Eraser(perfect real time)说明", 《HTTPS://WENKU.BAIDU.COM/VIEW/7F5E81DDEEFDC8D377EE3261.HTML》 * |
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